Khảo sát hiệu quả của chế phẩm siagnpsocts đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM
Si/AgNPs/OCTS ĐỐI VỚI KHẢ NĂNG
KHÁNG NẤM IN VITRO VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH
SINH TRƯỞNG TRÊN MẦM ĐẬU NÀNH

Sinh viên thực hiện :

Ngô Quang Tú

MSSV

:

1411527830

GVHD

:

PGS.TS. Lê Quang Luân
ThS. Trần Lệ Trúc Hà

TP. HCM, 2020

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM
Si/AgNPs/OCTS ĐỐI VỚI KHẢ NĂNG
KHÁNG NẤM IN VITRO VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH
SINH TRƯỞNG TRÊN MẦM ĐẬU NÀNH

Sinh viên thực hiện

: Ngô Quang Tú

Mã số sinh viên

: 1411527830

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS. Lê Quang Luân
ThS. Trần Lệ Trúc Hà

TP. HCM, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Khoa Công nghệ Sinh học

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Ngô Quang Tú

MSSV: 1411527830

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Lớp: 14DSH02

1. Đầu đề luận văn:
Khảo sát hiệu quả của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS đối với khả năng kháng nấm in
vitro và khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành
2. Mục tiêu
- Xác định được hiệu lực kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum
gloeosporioides và Fusarium oxysporum theo độ pha loãng của chế phẩm

Si/AgNPs/OCTS;
- Đánh giá được khả năng kích thích nảy mầm, sinh trưởng phát triển của hạt đậu
nành của chế phẩm;
- Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nảy mầm của hạt
đậu nành.
3. Nội dung:
-

Xác định hiệu lực kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides
và Fusarium oxysporum của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS;

-

Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của chế phẩm trên mầm đậu nành;

-

Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nảy mầm của hạt
đậu nành.
4. Thời gian thực hiện: tháng 03/2020 đến tháng 9/2020
5. Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Lê Quang Luân
Người hướng dẫn phụ: ThS.Trần Lệ Trúc Hà

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn.
Khoa/Bộ môn
(Ký và ghi rõ họ tên)

TP. HCM, ngày…… tháng……năm20…
Cán bộ hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện khoá luận này, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của
Thầy (cô), gia đình, anh chị,... Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Ban chủ nhiệm khoa Cơng
nghệ Sinh học cùng tồn thể thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học
tập tại trường.
Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chí Minh hỗ trợ tồn bộ kinh phí và máy
móc, trang thiết bị để tơi có thể hồn thành đề tài nghiên cứu.
Thầy PGS.TS. Lê Quang Luân, trưởng phịng CNSH Vật Liệu và Nano, Trung
tâm Cơng nghệ sinh học Tp. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để em được thực hiện đề
tài tốt nghiệp.
Cô Trần Lệ Trúc Hà Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.
ThS. Nguyễn Xuân Tuấn và anh (chị) phòng CNSH Vật Liệu & Nano đã giúp đỡ
em trong suốt thời gian vừa qua.
Đồng thời xin gửi lời tri ân tới gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện thuận lợi giúp
đỡ tơi hồn thành khố luận trong thời gian qua.

Ngơ Quang Tú
Khoa Cơng nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
MỤC LỤC....................................................................................................................... ii

TÓM TẮT........................................................................................................................v
SUMMARY.................................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU.......................................................................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................x
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 1
1.1 Giới thiệu về silica...................................................................................................... 1
1.1.1 Silica.........................................................................................................................1
1.1.2 Cấu trúc của silica....................................................................................................1
1.1.3 Ứng dụng của silica................................................................................................. 2
1.2 Giới thiệu về chitosan và oligochitosan..................................................................... 2
1.2.1 Chitosan................................................................................................................... 2
1.2.2 Oligochitosan........................................................................................................... 3
1.2.3 Vai trò của oligochitosan.........................................................................................4
1.3 Tổng quan về chitinase............................................................................................... 4
1.4 Giới thiệu về nano bạc................................................................................................ 5
1.4.1 Tổng quan về nano bạc............................................................................................5
1.4.2 Tính chất của AgNPs............................................................................................... 5
1.5 Cơ chế gắn AgNPs lên vi hạt silica sử dụng chitosan làm chất ổn định................... 6
1.6 Độc tính của silica, nano bạc và oligochitosan.......................................................... 7
ii


1.7 Tổng quan về nấm.......................................................................................................8
1.7.1 Nấm Rhizoctonia solani...........................................................................................8
1.7.2 Nấm Fusarium oxysporum...................................................................................... 9
1.7.3 Nấm Colletotrichum gloeosporioides................................................................... 10
1.8 Đậu tương DT84....................................................................................................... 11
1.9 Tình hình nghiên cứu trong và người nước..............................................................12

1.9.1 Các nghiên cứu trong nước....................................................................................12
1.9.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài................................................................................ 12
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................14
2.1 Nơi thực hiện............................................................................................................ 14
2.2 Nội dung nghiên cứu................................................................................................ 14
2.3 Hóa chất và thiết bị................................................................................................... 14
2.3.1 Hóa chất................................................................................................................. 14
2.3.2 Thiết bị................................................................................................................... 15
2.4 Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 15
2.4.1 Xác định hiệu lực kháng nấm theo nồng độ được sử dụng của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS............................................................................................................. 15
2.4.2 Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của chế phẩm trên mầm đậu nành.....17
2.4.3 Khảo sát hoạt tính của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nãy mầm của hạt
đậu nành.......................................................................................................................... 18
2.4.3.1 Thu nhận enzyme chitinase từ rễ mầm đậu nành...............................................18
2.4.3.2 Xác định hoạt tính enzyme chitinase..................................................................18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 20
3.1 Hoạt tính kháng nấm của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS.............................................20
3.1.1 Khả năng ức chế Rhizoctonia solani của chế phẩm..............................................20

iii


3.1.2 Hoạt tính kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS

........................................................................................................ 22

3.1.3 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS...... 24
3.2 Khả sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm

Si/AgNPs/OCTS............................................................................................................. 25
3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm theo
thời gian nảy mầm.......................................................................................................... 25
3.2.2 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm dựa
trên khối lượng đậu nành................................................................................................ 26
3.2.3 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm dựa
trên hoạt độ của enzyme chitinase..................................................................................25
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................30
PHỤ LỤC.......................................................................................................................33

iv


TÓM TẮT
Chế phẩm Si/AgNPs/OCTS được chế tạo bằng phương pháp bức xạ dựa trên sự
tạo thành nano bạc được gắn trên vi hạt silica sử dụng oligochitosan làm chất ổn định
với mục đích chế tạo phân bón lá để gia tăng hiệu quả kháng nấm bệnh dựa trên hiệu
ứng kích kháng bệnh trên cây trồng. Khóa luận “Khảo sát hiệu quả của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh
trưởng trên mầm đậu nành” được thực hiện từ tháng 03/2020 đến tháng 9/2020 tại
phịng Cơng nghệ Sinh học Vật liệu và Nano, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp. Hồ
Chí Minh với mục tiêu xác định khả năng kháng nấm bệnh, kích thích tăng trưởng và
tăng hoạt tính của enzyme chitinase trên mầm đậu nành của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS.
Đề tài bao gồm ba nội dung: Xác định hiệu quả kháng nấm Rhizoctonia solani,
Colletotrichum

gloeosporioides

và

Fusarium

oxysporum

của

chế

phẩm

Si/AgNPs/OCTS; Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của chế phẩm trên hạt đậu
nành nảy mầm; Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nảy
mầm của hạt đậu nành.
Sau 6 tháng ngiên cứu, kết quả đạt được như sau:
1. Hiệu lực kháng nấm của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trên mơi trường PGA có
độ pha lỗng 50 lần cho hiệu quả kháng nấm cao nhất là 83,56% đối với nấm
Rhizoctonia solani, 79,52% đối với nấm Colletotrichum gloeosporioides và
70,04% đối với nấm Fusarium oxysporum.
2. Ở nghiệm thức bổ sung chế phẩm có độ pha lỗng 454 lần cho kết quả tốt
nhất, cụ thể tăng hơn 1,5 - 1,7 lần ở tiêu chỉ lệ nảy mầm và tốc độ nảy mầm, từ
3,5 đến gần 5 lần ở tiêu chí khối lượng thân và rễ đậu tươi lẫn sau sấy khô và
giảm 5,3 lần ở thời gian nảy mầm trong ngày.
3. Hoạt tính enzyme chitinase của nghiệm thức có độ pha lỗng 454 lần có
hoạt độ là 18,06 U/ml cao nhất trong tất cả các mẫu, tăng 33,5 lần so với mẫu
đối chứng sử dụng nước cất vô trùng.

v

SUMMARY
Si/AgNPs/OCTS product is made from radiation based on silica microparticles
mounted on silver nanoparticles using oligochitosan as stabilizer with the purpose of
foliar fertilizer formation to increase antifungal effect based on an anti-pathogenic
effect in plants.The topic includes three contents: Determination of antifungal effects
of Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum of
Si/AgNPs/OCTS preparations; Evaluate the growth stimulant ability of soybean sprout
inoculants; Investigation of the activity of in vitro chitinase enzyme in soybean seed
germination.
The study includes three contents: determination of antifungal effects of
Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum of
Si/AgNPs/OCTS product; evaluation of the product's ability to stimulate growth on
sprouted soybeans and investigation of the activity of in vitro chitinase enzyme in
soybean seed germination.
Results achieved after 6 months of study:
1.

The antifungal effect of Si/AgNP/OCTS product on PGA had 50 - fold

dilution gave the highest antifungal effect of 83.56% for Rhizoctonia solani,
79.52% for Colletotrichum gloeosporioides and 70.04% for Fusarium
oxysporum.
2.

The best results were given in the treatment of a product with a

concentration of 454 - fold dilution, specifically increasing by 1,5 to 1,7 times
in the germination rate and germination rate, from 3,5 to 5 times in the weight
of stems and roots of fresh beans and after drying and decreased 5,3 times at

germination time of day.
3.

The chitinase enzyme activity of the 454 - fold dilution treatment with

the highest activity of 18,06 U/ml in all samples increased by 33,5 times
compared to the control using sterile distilled water.

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu trúc mạng của silica vơ định hình và tinh thể................................... 1
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan.................................................................. 2
Hình 1.3 Cơ chế diệt vi khuẩn của AgNPs thông qua các tương tác với protein và
nucleic acid............................................................................................................... 6
Hình 1.4 Các cơ chế tác động của AgNPs đến vi sinh vật......................................6
Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo AgNPs gắn trên vi hạt SiO2.....................................7
Hình 1.6 Nấm Rhizoctonia solani............................................................................8
Hình 1.7 Nấm Fusarium oxysporum....................................................................... 9
Hình 1.8 Nấm Colletotrichum gloeosporioides.................................................... 11
Hình 3.1 Đường kính tăng trưởng của nấm Rhizoctonia solani trên môi trường bổ
sung chế phẩm theo độ pha lỗng khác nhau.........................................................20
Hình 3.2 Ảnh hưởng của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS đến hiệu lực kháng nấm
sau 52 giờ nuôi cấy trên mơi trường PGA............................................................. 21
Hình 3.3 Đường kính tăng trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides trên
mơi trường PGA có bổ sung chế phẩm theo độ pha lỗng khác nhau...................22
Hình 3.4 Nấm C.gloeosporioides sau 168 giờ ni cấy trên mơi trường có bổ
sung chế phẩm Si/AgNPs/OCTS............................................................................23
Hình 3.5 Nấm Fusarium oxysporum sau 144 giờ ni cấy trên mơi trường PGA

có............................................................................................................................. 24
Hình 3.6 Đường kính tăng trưởng của nấm Fusarium oxysporum trên mơi trường
PGA có bổ sung chế phẩm theo độ pha lỗng khác nhau......................................24
Hình 3.7 Sinh trưởng và phát triển của hạt đậu nành trên giá thể có bổ sung chế
phẩm Si/AgNPs/OCTS ở các độ pha lỗng khác nhau..........................................25
Hình 3.8 Đậu nành sau 144 giờ phát triển trên giá thể bơng gịn có bổ sung chế
phẩm ở các độ pha loãng khác nhau.......................................................................26
vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm...15
Bảng 2.2 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm
Colletotrichum gloeosporioides............................................................................. 16
Bảng 2.3 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm
Fusarium oxysporum.............................................................................................. 16
Bảng 2.4 Khảo sát sự kích thích nảy mầm của chế phẩm..................................... 17
Bảng 2.5 Sơ đồ phản ứng cho thử nghiệm enzyme...............................................19
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS đến hiệu lực kháng nấm
Rhizoctonia solani.................................................................................................. 21
Bảng

3.2

Ảnh

hưởng

của

chế

phẩm

đến

hiệu

lực

kháng

nấm

Colletotrichum gloeosporioides............................................................................. 23
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chế phẩm đến hiệu lực kháng nấm Fusarium
oxysporum............................................................................................................... 25
Bảng 3.4 Chỉ số tăng trưởng của hạt đậu nành đã bổ sung chế phẩm...................27
Bảng 3.5 Hoạt lực của enzyme chitinase được đo trên máy ELISA.........................
.................................................................................................................................28

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AgNPs

Nano bạc

Ag+

Ion bạc

CTS

Chitosan

OCTS

Oligochitosan

Mw

Khối lượng phân tử

Si/AgNPs/CTS

Chế phẩm nano silica gắn nano bạc sử dụng
oligochitosan làm chất ổn định

PGA

Môi trường potato glucose agar

R. Solani

Nấm Rhizoctonia solani

Fusarium sp

Nấm Fusarium oxysporum

C. Gloeosporioides

Nấm Colletotrichum gloeosporioides

TL

Tỉ lệ

KL

Khối lượng

TLNM

Tỉ lệ nảy mầm

TGNM

Thời gian nảy mầm

TĐNM

Tốc độ nảy mầm

Cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam là nước có nền nơng nghiệp phát triển mạnh nhờ điều kiện và khí hậu
tương đối thuận lợi. Số liệu thống kê từ Tổng cục Hải quan năm 2018, xuất khẩu mặt
hàng rau củ quả Việt Nam đạt 3,52 tỷ USD; tăng 10,8% so với năm 2017. Đậu nành
có nguồn gốc ở Đông Nam Á, tuy nhiên Mỹ là nước có diện tích trồng là 45% và đạt
55% sản lượng của thế giới, một số nước có lượng sản xuất đậu nành lớn khác
như Brasil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây đậu nành là cây thực
phẩm có truyền thống lâu đời, cung cấp protein chủ yếu cho con người, là thành phần
không thể thiếu trong mỗi bữa ăn. Diện tích trồng đậu nành ở Việt Nam vẫn còn thấp,
chỉ đủ cung cấp cho khoảng 8 – 10% nhu cầu thị trường và dự kiến tới năm 2015 2020, Việt Nam thiếu hụt tới 3,5 – 4,0 triệu tấn/năm nên nhu cầu sản xuất đậu nành
trong nước là rất cần thiết. Tuy vậy, hiện nay các dịch bệnh như lở cổ rễ do nấm
Rhizoctonia solani, bệnh héo rũ, chết vàng xanh do nấm Fusarium sp và một số loại
cơn trùng chích hút gây thiệt hại lớn đến năng xuất và khơng có một biện pháp sinh
học nào tỏ ra có hiệu quả trong việc phịng trừ bệnh.
Những năm gần đây vật liệu sinh học và công nghệ nano đang được xem là một
vật liệu quan trọng của khoa học tương lai, đã và đang phát triển rất nhanh. Vật liệu
nano được đánh giá vượt trội với khả năng ứng dụng cao và đa dạng trong nhiều lĩnh
vực như thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, … Đây là loại vật liệu thu hút được sự quan
tâm của nhiều nhà khoa học do các tính chất nổi trội mà nó mang lại như có khả năng
kháng khuẩn, kháng nấm cao. Trong đó có thể kể đến như silica được chế tạo từ vỏ
trấu đang được quan tâm rộng rãi như là một nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ nông nghiệp,
nano silica tăng cường khả năng chống xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh vào tế bào

thực vật thông qua cơ chế tăng cường hoạt động của các enzyme chitinase, peroxidase,
polyphenoloxydase, hạn chế q trình chích hút của cơn trùng bằng cách tăng cường
độ cứng của vách tế bào… Nano bạc được biết đến là một tác nhân có khả năng kháng
khuẩn, kháng nấm và kháng virus cao. Chitosan có khả năng kháng khuẩn, ức chế nấm,
cịn oligochitosan là sản phẩm từ chitosan được cắt mạch và có khối lượng phân tử
thấp với khả năng tăng cường sinh trưởng, nâng cao sức chống chịu trên thực vật.
x


Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả kháng nấm bệnh gây hại đặc trưng trên cây
đậu nành và khảo sát khả năng tăng cường sinh trưởng trên hạt đậu nành nảy mầm của
phân bón lá Si/AgNPs/OCTS. Từ đây đề tài “Khảo sát hiệu quả của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh
trưởng trên mầm đậu nành” được thực hiện.
2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định được hiệu lực kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum
gloeosporioides và Fusarium oxysporum theo nồng độ sử dụng chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS;
-

Đánh giá được khả năng tăng cường nảy mầm đậu nành của chế phẩm theo
nồng độ sử dụng;

- Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nảy mầm của
hạt đậu nành.

xi


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về silica
1.1.1 Silica
Silica hay silicon dioxide (SiO2) là một oxit kim loại nhóm IV, xuất hiện tự nhiên
ở cả dạng tinh thể và vơ định hình . Silica là thành phần chính trong vỏ trái đất, kết
hợp các oxit khác như magie, nhôm, canxi, sắt tạo thành khoáng silicat trộn lẫn trong
đất đá.
Cách đây hàng triệu năm, silica ở dạng thạch anh đã được tách ra từ đá silicat
bằng phương pháp rửa với nước. Một số nơi trên trái đất silica tồn tại ở dạng vơ định
hình như khống opan.
Các phân tử khơng tồn tại ở dạng đơn lẻ mà liên kết lại với nhau thành phân tử
rất lớn. Silica có hai dạng cấu trúc là dạng tinh thể và vơ định hình. Trong tự nhiên
silica tồn tại chủ yếu ở dạng tinh thể hoặc vi tinh thể (thạch anh, triđimit, cristobalit,
cancedoan, đá mã não), đa số silica tổng hợp nhân tạo đều được tạo ra ở dạng bột hoặc
dạng keo và có cấu trúc vơ định hình (silica colloidal).
1.1.2 Cấu trúc của silica

Hình 1.1 Cấu trúc mạng của silica vơ định hình và tinh thể

Silica cấu trúc vơ định hình có hình thức trái với silica tinh thể được xác định
thông qua sự sắp xếp ngẫu nhiên các đơn vị phân tử. Silica vơ định hình có kích thước
nhỏ, hoạt tính cao, diện tích bề mặt lớn. Vì vậy, silica vơ định hình có nhiều ứng dụng.
Các dạng khác nhau của silica tinh thể là : thạch anh, tridymite, cristobalite,
1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
keatite, coesite, stishovite và moganite. Dạng silica phong phú nhất là thạch anh α và
thuật ngữ thạch anh thường được sử dụng thay cho thuật ngữ silica tinh thể chung1.

1.1.3 Ứng dụng của silica
Silica có khả năng hạn chế sự xâm nhiễm của vi sinh vật bao gồm: nấm, vi khuần,
virus và tuyến trùng với 3 cơ chế chính:
- Silica là thành phần tham gia trong cấu trúc vách tế bào, biểu bì. Sự có mặt
của silica làm tăng cường độ cứng cáp, đàn hồi của tế bào từ đó kháng lại sự
xâm nhiễm của vi sinh học gây hại 2 .
- Silica còn thúc đẩy quá trình hình thành các hợp chết thứ cấp có tác dụng tiệu
diệt và ức chế q trình xâm nhiễm của vi sinh vật gây hại như salicylic acid
(SA), jasmonic acid (JA), and ethylene (ET)3.
- Silica tham gia vào quá trình tương tác giữa vật chủ và mầm bệnh, kích thích
sự hoạt động của các gen liên quan đến sự hình thành cơ chế phịng chống vi
sinh vật xâm nhiễm thông qua một loại các phản ứng sinh lý, sinh hóa và
truyền tín hiệu thực vật 3.
1.2 Giới thiệu về chitosan và oligochitosan
1.2.1 Chitosan

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan là một polymer tự nhiên được hình thành từ N-deacetyl hóa chitin,
mang điện tích dương, khơng có độc tính, có khả năng phân hủy sinh học, và tương
hợp sinh học. Thuật ngữ chitosan được dùng khi hàm lượng nitơ cao hơn 7% khối
lượng phân tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60%. Sự khác biệt cơ bản của chitin và
chitosan là khá năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid lỗng, chitosan hịa tan
2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
nhiều trong các dung dịch pH thấp cịn chitin hầu như khơng tan. Chitosan được điều
chế bằng cách deacetyl hóa chitin thu dược từ vỏ tôm và cua.
Thuật ngữ chitosan được dùng khi hàm lượng nitơ cao hơn 7% khối lượng phân

tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60%. Sự khác biệt cơ bản của chitin và chitosan là khả
năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid lỗng, chitosan hịa tan nhiều trong các
dung dịch pH thấp cịn chitin hầu như khơng tan. Chitosan được điều chế bằng cách
deacetyl hóa chitin thu được từ vỏ tơm và cua. Việc tạo ra nhóm amin từ
acetamindideoxy carbohydrate có thể thực hiện được trong các điều kiện acid và kiềm
nhưng một số trở ngại về mặt lập thể có thể gây cản trở phản ứng. Nhiều nỗ lực đã
được đưa ra nhưng nhóm N-acetyl khơng thể loại bỏ bằng acid nếu không kèm theo sự
thủy phân mạch polysaccharide 4.
1.2.2 Oligochitosan
Oligochitosan là sản phẩm từ chitosan được cắt mạch và có khối lượng phân tử
thấp. Cho đến nay, nhiều phương pháp chế tạo oligochitosan đã được sử dụng sử dụng
bao gồm:
- Phương pháp siêu âm 5.
- Phương pháp sử dụng tác nhân hóa học 4.
- Phương pháp dùng tác nhân sinh học sử dụng các enzyme 6.
- Phương pháp vi sóng 7.
- Phương pháp chiếu xạ (tia y-Co-60, electron beam) 8.
Cắt mạch chitosan bằng phương pháp hóa học được cho là phương pháp đơn giản
nhất. Tuy nhiên, phương pháp này thường gặp bất lợi do quá trình cắt mạch thường
kèm theo sự thay đổi cấu trúc của chitosan và các chất thải tồn dư sau quá trình cắt
mạch gây hại tới mơi trường và khó kiểm sốt được Mw chitosan như mong muốn. Do
vậy phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp sinh học sử dụng
enzyme để cắt mạch. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng enzyme để thủy phân chitosan chế
tạo oligochitosan ứng dụng cho cây trồng. Phương pháp này cũng cho thấy một số
nhược điểm như phải sử dụng enzyme đặc hiệu nên chi phí cao, q trình này được
thích hợp bởi nhiệt độ tối ưu cũng như thời gian phản ứng.

3

Chương 1. Tổng quan tài liệu
Gần đây, khi công nghệ bức xạ được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi hơn.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy phương pháp bức xạ có nhiều ưu điểm như chế tạo sản
phẩm có độ tinh sạch cao, dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân tử oligochitosan, không
làm ảnh hưởng tới cấu trúc của sản phẩm, chi phí thấp, an tồn mơi trường và dễ sản
xuất ở quy mơ cơng nghiệp.
1.2.3 Vai trị của oligochitosan
Oligochitosan là một chất điều hòa miễn dịch thực vật mạnh, kích hoạt miễn dịch
bẩm sinh thực vật, bao gồm: nhận thức tín hiệu, truyền tín hiệu gen và protein phản
ứng, gây ra sự tích tụ các chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đến phòng thủ. Tác dụng
của oligochitosan trên thực vật tương tự như vắc-xin nói chung tác động lên người và
động vật 9.
1.3 Tổng quan về chitinase
Chitinase xúc tác quá trình thủy phân chitin, một homopolymer mạch thẳng của
β-1,4 liên kết N-acetylglucosamine (GlcNAC), và là chất tạo màng sinh học phong
phú thứ hai trong tự nhiên sau cellulose. Khơng có cơ chất nào cho nhóm enzym này
được xác định trong thực vật, trong khi chitin thường là một thành phần của thành tế
bào nấm và bộ xương ngoài của động vật chân đốt bao gồm nhiều mầm bệnh và sâu
bệnh quan trọng. Do đó, chitinase trong thực vật sẽ phát triển như một cơ chế bảo vệ
chống lại những kẻ thù này. Hầu hết các chitinase thực vật thuộc nhóm endochtinase
thủy phân ngẫu nhiên các polyme chitin 10 .
Nhiều loại chitinase khác nhau được tinh chế từ các nguồn thực vật khác nhau
với sự cải tiến về đặc tính của chúng đã được khám phá chi tiết. Cùng với đó, các
chitinase tinh khiết cũng cho thấy hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ chống lại nấm gây
bệnh và nấm khơng gây bệnh ở cây. Ngồi ra, chúng cịn tham gia vào các quá trình
tăng trưởng và phát triển như trong q trình chín của trái cây, tham gia vào quá
trình chết tế bào, hoạt động như các protein lưu trữ canxi liên kết các ion canxi với
dung lượng cao 11 .

4

Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.4 Giới thiệu về nano bạc
1.4.1 Tổng quan về nano bạc
Nano bạc (AgNPs) là những hạt bạc có kích thước từ 0,1 đến 100 nm. AgNPs
thường ở dưới dạng dung dịch keo với các chất ổn định là polymer giúp cho các hạt
bạc không bị kết tụ. Bạc có kích thước nano thể hiện một số đặc tính ưu việt so với bạc
bình thường, đó là một kháng sinh tự nhiên có khả năng phịng ngừa sự truyền nhiễm
và vơ hiệu hố các enzyme trọng yếu tham gia trao đổi oxy của vi khuẩn, virus và vi
nấm, từ đó phá hủy màng tế bào của vi sinh vật. Vi khuẩn khơng thể có bất k khả
năng miễn dịch nào đối với bạc. Trong tự nhiên bạc khơng độc, khơng dị ứng, khơng
tích tụ và vơ hại với cả động vật hoang dã và môi trường.
AgNPs là một ứng dụng hoàn thiện của khoa học và cơng nghệ nano đối với bạc
để tăng tính năng diệt khuẩn, sát trùng và khử mùi, được ứng dụng trong sản xuất rau
sạch. Các hạt nano có kích thước siêu nhỏ làm cho các hạt có diện tích bề mặt lớn cân
đối với khối lượng của chúng. Kích thước nano cho phép bạc tương tác dễ dàng với
các hạt khác và tăng hiệu quả kháng khuẩn. Hiệu quả này lớn tới mức 1 gam AgNPs
có thể tạo tính chất kháng khuẩn tới hàng trăm mét vng chất nền 12.
1.4.2 Tính chất của AgNPs
Công nghệ nano đã tạo ra được những hạt bạc có kích thước nano có đặc tính
sinh học cao, độc tính thấp. Ngồi ra, AgNPs cịn có thể làm tăng hoạt động chuyển
hoá của tế bào dẫn đến sự tăng tốc độ tăng trưởng của thực vật.
Một số giả thuyết cho rằng, AgNPs có khả năng kháng khuẩn là do tính chất hóa
học của các ion Ag+. Ion này gây ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế
bào làm tê liệt vi khuẩn nhờ vào sự liên kết mạnh với peptidoglycan, thành phần cấu
tạo nên thành tế bào của vi khuẩn. Nếu các ion bạc được loại ra khỏi tế bào ngay sau
đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Mặt khác, do động vật
khơng có thành tế bào, vì vậy chúng ta khơng bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion
này 13,14.

Ngồi ra cũng có nghiên cứu cho rằng AgNPs có thể điều chỉnh việc truyền tín
hiệu trong vi sinh vật. Sự phosphoryl hóa protein trong cytosol của vi khuẩn làm ảnh
hưởng đến sự truyền tải tín hiệu của vi khuẩn và sự phosphoryl hóa này thường xảy ra
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu
ở vị trí của gốc tyrosine của peptide dẫn đến ức chế truyền dẫn tín hiệu và do đó ngăn
chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn 13.

Hình 1.3 Cơ chế diệt vi khuẩn của AgNPs thơng qua các tương tác với protein và

nucleic acid

Hình 1.4 Các cơ chế tác động của AgNPs đến vi sinh vật

1.5 Cơ chế gắn AgNPs lên vi hạt silica sử dụng chitosan làm chất ổn định
Ag+ được khử thành Ago chủ yếu bằng electron solvát (e-aq) và gốc tự do
hydrogen (H) được hình thành từ phản ứng xạ ly các phân tử nước có mặt trong dung
dịch. Ngồi ra, gốc tự do hydroxyl (OH) hình thành trong phản ứng xạ ly nước có thể
phản ứng với các alcohol như etanol, metanol, isopropanol, v.v. tạo thành các gốc tự
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu
do hydroxyalkyl cũng góp phần vào phản ứng khử Ag+ ở dạng cụm (Ag+ ion clusters)
thàng cụm Ago (Ago clusters) 15.

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo AgNPs gắn trên vi hạt SiO2

Trong khi đó, khi có mặt của hệ keo SiO2 (được tạo thành do các hạt mang diện
tích âm) các hạt Ag+ đễ dàng được hấp thu lên trên bề mặt của hạt SiO2, và khi chiếu
xạ Ag+ trên bề mặt hạt SiO2 sẽ bị khử như phản ứng ở trên tạo thành các clusters kim
loại bao quanh các hạt SiO2.
Hơn nữa, do có mặt của chitosan trong dung dịch khi đi chiếu xạ, vi hạt SiO2 đã
được gắn bạc sẽ được gắn trên mạch của chitosan đồng thời chitosan sẽ bị cắt mạch
tạo thành oligochitosan và cuối cùng tạo thành hệ ổn định đồng nhất Si/AgNPs/CTS.
1.6 Độc tính của silica, nano bạc và oligochitosan
Hầu hết lượng nano silica được hấp thụ qua đường uống đều được đào thải qua
đường nước tiểu (70 - 80%) và 7- 8% qua đường phân. Một hàm hàm lượng nhỏ của
silica được tích lũy trong gan, thận, lá lách sau 6 giờ cho uống. Các thí nghiệm trên
người cũng cho thấy khơng có tác dụng phụ quan sát thấy trên các tình nguyện viên
khi uống oligochitosan với nồng độ 4,5 g/ngày (đối với nam) và 2,5 g/ngày đối với nữ
sau 12 ngày sử dụng liên tục

16

. Không quan sát thấy độc tính cấp khi sử dụng 6,75

g/ngày đối với cả nam và nữ trong vòng 12 tuần sử dụng oligochitosan 17,11.
Có nhiều ý kiến trái chiều về độc tính của AgNPs nói riêng và nano kim loại
nặng nói chung. Hầu hết các thí nghiệm trên in vitro chỉ ra rằng AgNPs có độc tính rất
cao đối với tế bào thử nghiệm. Tuy vậy các kết quả nghiên cứu trên in vivo lại cho kết
7


Chương 1. Tổng quan tài liệu
quả ngược lại. Các kết quả nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng AgNPs được bài tiết hầu
hết ra khỏi cơ thể bằng đường phân (90 – 99,6% tùy loại động vật). Cụ thể, trên chuột
nhắt là 99,6 và 98% đối với chuột lớn; 90% đối với chó và 94% đối với khỉ18. AgNPs

(kích thước hạt bạc khoảng 60 nm) hồn tồn khơng gây đột biến gen chuột sau 28
ngày quan sát19.
1.7 Tổng quan về nấm
1.7.1 Nấm Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani là một loại nấm gây bệnh phổ biến trên thực vật và phân bố
trên tồn thế giới, được mơ tả lần đầu tiên vào năm 1858 do Julius Kuhn thực hiện khi
quan sát một loại nấm trên khoai tây. R. solani thường tồn tại trong đất và gây bệnh
trên nhiều loại cây trồng khác nhau, nhưng đặc biệt là các cây thân thảo. Các loại bệnh
chủ yếu là thối cổ rễ, thối rễ, v.v. Thường tấn công vào giai đoạn phát triển ban đầu
của cây.
Nấm R. solani khơng tạo ra bào tử vơ tính mà chỉ thỉnh thoảng tạo ra hệ thống vơ
tính (bào tử đảm). Tự nhiên, R. solani sinh sản bằng hình thức vơ tính, tồn tại chủ yếu
dưới dạng sợi nấm sinh dưỡng hay hạch nấm.
Phân loại :
Giới Nấm
Nghành Basidiomycota
Lớp Agaricomycetes
Bộ Cantharellales
Họ Ceratobasidiaceae
Chi Rhizoctonia
Lồi R. solani
Hình 1.6 Nấm Rhizoctonia solani

Ở giai đoạn vơ tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khu cịn non thì
khơng màu, khi đã già thì chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa
8


Chương 1. Tổng quan tài liệu
bào, có đường kính từ 8 - 13 µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi

thắt lại và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh. Nấm sinh trưởng thích hợp ở
nhiệt độ 25 - 30°C, dưới 10°C và trên 38°C làm nấm ngừng sinh trưởng. Hạch nấm
thành nhiều ở nhiệt độ 30 - 32°C. Nấm có thể phát triển trong phạm vi pH rộng từ 3,4
đến 9,2 hợp nhất là ở độ pH 6 - 7. R. solani có thể được lưu trữ trong ống nghiệm chứa
môi trường PGA ở nhiệt độ phòng (25 - 30°C) từ 6 - 12 tháng20.
R. solani có 3 loại sợi: sợi nấm bị (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate
hyphae) và tế bào dạng chuỗi (moniloid cells). Lúc già, các tế bào tách ra và biến
thành thạch. Hạch nấm khi cịn non có màu trăng ngà nhưng khi già hạch có màu thay
đổi từ nâu đến xám, trên vỏ hạch có lơng. Đường kính hạch nấm từ 1 - 6 mm. Hạch
nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi đã già thì có thể nổi lên trên tế bào
ngồi hạch trở nên rỗng .R. solani phổ biến ở nhiều nơi và có thể gây bệnh cho 180
loại cây thuộc 60 họ thực vật khác nhau. Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi
nhiệt độ 23-31°C, nhiệt độ thích hợp 27°C, ẩm độ tương ứng từ 70 - 100% 21.
1.7.2 Nấm Fusarium oxysporum

Hình 1.7 Nấm Fusarium oxysporum

Nấm Fusarium oxysporum là nấm gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ
phận, đặc biệt là bộ phận gốc và rễ cây. Nấm Fusarium sp. đã được nghiên cứu từ đầu
thế kỷ XIX. Bệnh héo vàng cà chua được mô tả đầu tiên do Massee. G. E ở Anh năm
1895. Đây là căn bệnh nghiêm trọng trên cây cà chua đối với các nước trên thế giới.
Bệnh héo do Fusarium sp. thường liên hệ với tuyến trùng nốt sưng, nấm xâm nhiễm
vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây ra. Theo Binder và Hutchinson (1959), cà
9


Chương 1. Tổng quan tài liệu
chua bị bệnh héo vàng do Fusarium sp. sẽ chết nhanh và thiệt hại lớn khi cùng bị
tuyến trùng (Meloidogine incognita) xâm nhập vì tuyến trùng làm giảm tính chống
bệnh cà chua đối với nấm Fusarium oxysporum.

Nấm phát triển mạnh, màu sắc thay đổi từ màu trắng đến tím violet, tản nấm
thường sinh sắc tố màu hồng đến màu tím đậm. Bào tử lớn, trong suốt, có nhiều ngăn,
bào tử hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân. Dạng bào tử nhỏ, hình thành
trên cành bào phân sinh đơn nhánh ngắn thường không có ngăn ngang, đơi khi có một
ngăn. Một số lồi Fusarium sp. có bào tử nhỏ, bào tử hậu và quả thể hoặc khơng có
bào tử hậu. Hậu bào tử thường thành trên mẫu phân lập sau 3 - 6 tuần nuôi cấy trên bề
mặt thạc của môi trường PGA.
Sợi nấm và hậu bào chỉ xuất hiện trong mạch xylem mà khơng hình thành bên
ngồi mạch. Sau khi xâm nhiễm, nấm làm cho bó mạch chuyển sang màu xám hoặc
nâu đen, lá cây bị độc tố nấm tiết ra làm tắc bó mạch. Điều này làm cho cây bị mất
chức năng quang hợp và dẫn đến cây chết.
Fusarium sp. có 2 giai đoạn trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích cực và giai đoạn
tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ). Với điều kiện thích hợp, mơi trường có đầy đủ chất
dinh dưỡng, nấm sẽ sinh trưởng tích cực. Ngược lại, khi gặp điều kiện bất lợi, lượng
dinh dưỡng đất cịn ít, thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc này các lồi
Fusarium sẽ hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào tử hậu. Do đó, nhằm đảm bảo sự tồn
tại của chúng trong thời gian dài, chúng sẽ sử dụng cường độ hô hấp và nguồn dinh
dưỡng dự trữ được tích lũy trong hệ sợi nấm ở mức thấp nhất. Một số lồi khơng sinh
bào tử hậu thì chúng sẽ tiếp tục tồn tại băng cách làm chậm lại các hoạt động hoại sinh
hay ký sinh trong cơ thể vật chủ. Vì thế, sau khi thu hoạch mùa với cây bị bệnh do
Fusarium thì khả năng trong đất cịn sót lại Fusarium là rất cao.
1.7.3 Nấm Colletotrichum gloeosporioides
Nấm Colletotrichum gloeosporioides thuộc giới nấm, lớp Sodariomycetes, bộ
phyllachorales trong họ phyllachoraceae và thuộc chi Colletotrichum. Cành bào tử
thành hình trên vết bệnh các long gai trịn và dài, khơng đều, màu nâu thường nhẹ ở
góc và thon nhọn nhẹ ở đỉnh. Tản nấm trong mơi trường PGA có màu trắng sáng xám
đến xám đậm, quả thể mở hình thành lẻ hoặc tập trung thành đám, hình cầu hoặc hình
10

Chương 1. Tổng quan tài liệu
quả lê với kích thước khoảng 85-350 micromet. Chủng nấm C. Gloeosporioides phát
triển tốt nhất vào mùa mưa có độ ẩm khơng khí và nhiệt độ cao.

Hình 1.8 Nấm Colletotrichum gloeosporioides

Bệnh thán thư, do nấm C. gloeosporioides gây ra, là bệnh sau thu hoạch phổ biến
và nghiệm trọng nhất của nhiều loại trái cây nhiệt đới bao gồm xoài, đu đủ, thanh long
và bơ. C. gloeosporioides gây bệnh trên cây xồi từ khi cịn non đến ngày thu hoạch,
vết bệnh lúc đầu là những đốm nhỏ hình trịn có màu nâu hoặc nâu đen sau đó lan dần
ra, nhiều đốm kết hợp với nhau thành những đốm lớn lõm vào phần thịt quả làm cho
thịt quả bị thối. Đối với xoài và đu đủ, bệnh được kiểm soát theo lối truyền thống bằng
thuốc diệt nấm hóa học tổng hợp và xử lý nước nóng. Tuy nhiên, khi trái cây thu
hoạch được xử lý bằng thuốc diệt nấm, khả năng tiếp xúc trực tiếp của y cịn với
chúng ta và thuốc có khả năng kháng trong mấm bệnh sẽ cao hơn8.
1.8 Đậu tương DT84
Giống đậu tương DT84 được công nhận là giống Quốc gia năm 1995. Giống DT
84 là giống cao sản có tính thích ứng rộng, dễ trồng. Giống có hạt trịn hơi dài, màu vỏ
vàng sáng, rốn hạt màu nâu nhạt. Giống có năng suất cao : 1,9 - 2 tấn hạt/ha, phẩm
chất hạt đậu ăn ngon. Thời gian sinh trưởng từ trồng đến thu hoạch là 85 – 95 ngày,
cây cao TB 50-60cm. DT 84 là giống chịu nhiệt trung bình, thích hợp cho cả 3 vụ : vụ
xuân: từ 5/2-10/3, vụ hè: từ 25/5 - 30/6 và vụ đông: Từ 15/8 - 5/10. Có thể trồng trên
nhiều loại đất khác nhau như đất bãi cao, đất chuyên màu, đất ven đồi, thích hợp nhất
11