Nghiên cứu nhân giống cây hoa dạ yến thảo (petunia hybrida) in vitro

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HOA
DẠ YẾN THẢO (Petunia hybrida) IN VITRO

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thu Thủy

MSSV

: 1711547297

GVHD

: ThS. Đỗ Tiến Vinh
ThS. Mai Thị Phương Hoa

TP. HCM, 2020


ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HOA
DẠ YẾN THẢO (Petunia hybrida) IN VITRO

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thu Thủy

MSSV

: 1711547297

GVHD

: ThS. Đỗ Tiến Vinh
ThS. Mai Thị Phương Hoa

TP. HCM, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Khoa Công nghệ Sinh học

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Nguyễn Thị Thu Thủy

MSSV: 1711547297

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Lớp: 17DSH1A

1. Đầu đề luận văn:
Nghiên cứu nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in vitro
2. Mục tiêu
Xác định được thành phần khống và chất điều hịa sinh trưởng thích hợp để
nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in vitro
3. Nội dung:
− Khảo sát thành phần mơi trường khống thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển
của cây hoa Dạ Yến Thảo.
− Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của cây hoa Dạ
Yến Thảo.
− Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng của auxin đến quá trình hình thành rễ
của cây hoa Dạ Yến Thảo.
4. Thời gian thực hiện: tháng 6/2020 đến tháng 9/2020
5. Người hướng dẫn chính: ThS. Đỗ Tiến Vinh
Người hướng dẫn phụ: ThS. Mai Thị Phương Hoa
Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn.

TP. HCM, ngày…… tháng……năm 20…
Khoa/Bộ môn

Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)

ThS. Đỗ Tiến Vinh


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh
học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn tơi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây hoa Dạ Yến
Thảo (Petunia hybrida) in vitro”.
Để hồn thành q trình nghiên cứu và hồn thiện khóa luận này tơi xin trân
trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy - Đỗ Tiến Vinh và cô - Mai Thị Phương Hoa giảng viên khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành và anh Võ
Thanh Truyền đã tận tình giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn em.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn anh chị khóa trước và những người thân, bạn bè đã
ln bên tơi, động viên tơi hồn thành khóa học và bài khóa luận này.

Nguyễn Thị Thu Thủy
Khoa Cơng nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
TÓM TẮT .................................................................................................................... iv
SUMMARY ....................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... ix
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................1
1.1 Tổng quan cây Dạ Yến Thảo .....................................................................................1
1.1.1 Phân loại .................................................................................................................1
1.1.2 Đặc điểm hình thái..................................................................................................1
1.1.3 Đặc điểm phân bố ...................................................................................................2
1.1.4 Giá trị kinh tế ..........................................................................................................2
1.2 Phương pháp nhân giống ...........................................................................................3
1.2.1 Kỹ thuật nhân giống truyền thống ..........................................................................3
1.2.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro ...................................................................................4
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy ..........................................................................5
1.3.1 Yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro. ............................................................5
1.3.2 Chất điều hịa sinh trưởng ....................................................................................11
1.4 Các cơng trình nghiên cứu trong nước và ngồi nước ............................................13
1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới ...............................................................13
1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................................15
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................17
ii


2.1 Nơi thực hiện ...........................................................................................................17

2.2 Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................17
2.3 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................17
2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống đến sự
sinh trưởng và phát triển của cây Dạ Yến Thảo ............................................................18
2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng
tạo chồi của cây Dạ Yến Thảo .......................................................................................19
2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình
thành rễ của Dạ Yến Thảo .............................................................................................20
2.4 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ....................................................................21
2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu ...............................................................................21
2.4.2 Xử lý số liệu .........................................................................................................21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................22
3.1 Kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống đến
sự sinh trưởng và phát triển của cây Dạ Yến Thảo .......................................................22
3.2 Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả
năng tạo chồi của cây Dạ Yến Thảo ..............................................................................24
3.3 Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình
thành rễ của Dạ Yến Thảo .............................................................................................27
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................................30
1. Kết luận......................................................................................................................30
2. Đề nghị ......................................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................31
PHỤ LỤC .....................................................................................................................33

iii


TÓM TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in
vitro” được thực hiện từ tháng 06/2020 đến tháng 09/2020 tại Phịng thí nghiệm ni

cấy mơ thực vật khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành với
mục tiêu xác định được thành phần khống và chất điều hịa sinh trưởng thích hợp để
nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in vitro
Đề tài có ba nội dung: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống
đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa Dạ Yến Thảo. Khảo sát ảnh hưởng nồng
độ của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của cây hoa Dạ Yến Thảo.
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành rễ của cây hoa Dạ
Yến Thảo. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên
Kết quả đạt được:
1. Mơi trường MS thích hợp để nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo in vitro
2. Mơi trường thích hợp để tạo chồi của cây hoa Dạ Yến Thảo: MS bổ sung BA
0,25 mg/l, đường 30 g/l, agar 8 g/l
3. Mơi trường thích hợp cho sự hình thành rễ của cây Dạ Yến Thảo: MS bổ sung
NAA 1 mg/l, đường 30 g/l, agar 8 g/l

iv


SUMMARY
Subject: "Research on propagation of Petunia hybrida in vitro" was conducted
from May 2020 to September 2020 at the Laboratory of Plant Tissue Culture, Faculty
of Biotechnology, University Nguyen Tat Thanh study with the goal of determining
the composition of minerals and growth regulators suitable for multiplication of
Petunia hybrida in vitro.
The topic has three contents: Investigating the effect of mineral medium
components on the growth and development of Petunia hybrida. Investigating the
effect of concentration of growth regulators on bud-forming ability of Petunia hybrida.
Investigating the effect of content of auxin on rooting process of Petunia hybrida. The
experiments were arranged in a completely randomized design
Result:

1. MS medium is suitable for multiplication of Petunia hybrida in vitro
2. Suitable medium for growing shoot of Petunia hybrida: MS supplemented
with BA 0.25 mg /l, sugar 30 g /l, agar 8 g /l
3. The suitable medium for growing root of Petunia hybrida: MS supplemented
with NAA 1 mg /l, sugar 30 g /l, agar 8 g /l

v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hoa Dạ Yến Thảo ............................................................................................1
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quan nội dung nghiên cứu ..........................................................18
Hình 3.1 Chồi cây hoa Dạ Yến Thảo sau 20 ngày ni cấy trên các mơi trường khống
.......................................................................................................................................23
Hình 3.2 Chồi Dạ Yến Thảo sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
BA, kinetin....................................................................................................................26
Hình 3.3 Chồi cây Dạ Yến Thảo sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS
có bổ sung auxin ........................................................................................................29

vi


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống đến sự sinh trưởng
và phát triển của cây Dạ Yến Thảo ...............................................................................19
Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của
cây Dạ Yến Thảo ...........................................................................................................20
Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành rễ của
cây Dạ Yến Thảo ...........................................................................................................21
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh

trưởng và phát triển của cây Dạ Yến Thảo ....................................................................22
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo
chồi của cây Dạ Yến Thảo.............................................................................................25
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành
rễ của cây Dạ Yến Thảo ................................................................................................28

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BA

Benzylaminopurin benzyl adenin

IAA

β-indol - acetic acid

IBA

indol - 3 - acetic acid

NAA

α - Naphthaleneacetic acid

SAS

Statistical Analysis Systems

MS

Môi trường Murashige & Skoog – 1926

NT

Nghiệm thức

MT

Môi trường

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) hay còn gọi là Dã Yên Thảo, thuộc họ Cà
(Solanaceae). Là loài cây bản địa của các nước có khí hậu nhiệt đới ở khu vực miền
nam Châu Mỹ. Đây là loại cây thân thảo chịu nhiệt, hoa nở liên tục đợt này đến đợt
khác, hoa có nhiều màu sắc và kiểu dáng cây phong phú. Dạ Yến Thảo thường được
trồng trong các chậu trang trí trong khuôn viên ngôi nhà làm cho căn nhà thêm rực rỡ
với ưu điểm màu sắc hoa phong phú Dạ Yến Thảo mang lại rất nhiều sự lựa chọn cho
người tiêu dùng.
Hiện nay Dạ Yến Thảo được trồng từ hạt. Tuy nhiên giá bán hạt giống cây hoa từ
1.000 - 3.000 đ/hạt tùy loại hoa đơn, kép hay khảm. Mặc khác, tỉ lệ nảy mầm của hạt
tương đối thấp chỉ khoảng 60%. Ngồi ra, Dạ Yến Thảo cịn có thể nhân giống bằng
phương pháp giâm cành. Tuy nhiên, cây giâm cành có sức sống yếu hơn cây gieo bằng
hạt và nhanh tàn.
Nuôi cấy mô là phương pháp áp dụng nhân giống khá phổ biến. Nhân giống

bằng kĩ thuật nuôi cấy mơ có thể tăng số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn,
chất lượng cây con đồng đều và giữ được đặc tính ưu việt của cây mẹ, giá thành cây
con thấp, kiểm soát được mầm bệnh. Phương pháp nhân giống cây trồng bằng nuôi
cấy mô in vitro được xem là một trong những phương pháp hữu ích nhất để giảm chi
phí sản xuất, nâng cao năng suất cây trồng chủ động nguồn giống không phụ thuộc
điều kiện tự nhiên. Để q trình ni cấy mơ diễn ra thuận lợi thì vai trị của yếu tố
tham gia điều khiển q trình tạo chồi và ra rễ ở cây Dạ Yến Thảo như chất điều hòa
sinh trưởng như đa lượng, vi lượng trong môi trường nuôi cấy mô cần được nghiên
cứu và làm rõ. Vì vậy, quá trình nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo có ý nghĩa
thiết thực.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in vitro”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định được thành phần khống và chất điều hịa sinh trưởng thích hợp để
nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in vitro.
ix


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan cây Dạ Yến Thảo
1.1.1 Phân loại
Giới

: Thực vật

Ngành : Magnoliophyta
Bộ

: Solanales

Họ

: Solanaceae

Chi

: Petunia

Lồi

: Petunia Hybrida

Hình 1.1 Hoa Dạ Yến Thảo

Dạ Yến Thảo là cây thân mềm, là loại cây dễ trồng, nở nhiều hoa và rất phong
phú về màu sắc. Cây phù hợp trồng trong chậu treo trang trí trước thềm nhà hoặc trồng
trong các bồn hoa trong sân. Thuộc lồi thực vật có hoa trong họ Cà (Solanaceae), có
nguồn gốc từ các nước miền Nam Châu Mỹ, hiện nay Dạ Yến Thảo đã phổ biến khắp
thế giới với hàng trăm giống lai 1. Là loài cây chịu nhiệt, ưa sáng, hoa này sẽ điểm tô
cho ban công nhà thêm tươi tắn, đặc sắc nhất là thân cây và hoa có một lớp lơng tơ bao
phủ thật mềm mại, ấn tượng và tao nhã.
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Cây hoa Dạ Yến Thảo là cây thân cỏ, sống hằng năm, cây cao 15 - 30 cm. Thân
mềm phủ đầy lơng dính, nhánh cây được phân ra từ các nách lá, một nách lá có thể
phân nhiều nhánh. Lá đơn, mọc cách mặt trên và mặt dưới của lá có lớp lơng phủ mịn,
mép ngun khơng răng cưa, màu xanh bóng. Hoa nhỏ, đơn độc mọc ở nách lá, trên
một cọng dài 2 - 3 cm, đài hoa cao 1 - 2,5 cm. Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở
phần dưới của ống vành. Cánh đài hợp ở gốc, còn lải ở quả, cánh tràng hợp thành ống

loe rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy. Quả nang hai mảnh, nhiều hạt 2.
Tốc độ sinh trưởng của hoa Dạ Yến Thảo nhanh. Hoa có dạng hình phễu, nhưng
các dạng hoa Dạ Yến Thảo lai có hình dáng đa dạng và phong phú hơn nhiều. Ví dụ
như hoa cánh đơn, hoa kép với mép có viền và sợn sóng, mép nhúng hình cung nhọn ở
giữa. Hoa có thể có sọc, đốm, hoặc viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như
1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng, vàng, cam. Dạ Yến Thảo rũ hồng
đậm có mùi thơm dịu dàng, khi chạm lá cuống hoa sẽ thấy hơi dính.
Là lồi cây nhất niên thường nở hoa vào mùa hè. Dạ Yến Thảo ưa sáng, sẽ trở
nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm vừa
phải, có thể sống trong điều kiện hơi khơ nhưng khơng thích ứng với điều kiện ngập
úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, khơng chịu được nhiệt độ quá lạnh hay
quá nóng. Dạ Yến Thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất
màu mỡ, đất có pH từ 6,0 - 7,0.
Dạ Yến Thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúng liều lượng,
không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ sinh và duy
trì ẩm độ thích hợp. Ngoài ra, Dạ Yến Thảo thường bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do
vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắn phá. Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến
cây như làm biến dạng lá, cây chậm phát triển, hoa khơng có màu và hình dạng thay
đổi, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có
khi kết dính thành cụm 3.
1.1.3 Đặc điểm phân bố
Hoa Dạ Yến Thảo thuộc chi 35 của một lồi thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ
với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae). Cây hoa Dạ Yến
Thảo có nguồn gốc từ các miền Nam Châu Mỹ, hiện nay được trồng rộng rãi ở các bãi
cỏ, các khu đất rộng, vườn hoa khắp nước ta. Ở miền Bắc, hoa nở vào hè dịp thu, còn
ở miền Nam, hoa nở vào dịp Tết. Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm Hồng

Hộ (2000) cây có tên Dã Yên Thảo theo Trần Hợp (2000) có tên là cây Hoa Cà. Đây là
một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều lồi khác của chi Petunia, ví như P. axillaris
BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống dẹp, màu trắng hoặc P. virolace Lindl.
(Vilolet - flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà
vườn từ lồi lai này cịn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xịe ngón rất đẹp 4,5.
1.1.4 Giá trị kinh tế
Những năm gần đây, cùng với sự tăng lên về đời sống vật chất, nhu cầu về tinh
thần cũng được người dân quan tâm chú ý, do đó mà ngành hoa kiểng đã dần phát
2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
triển để đáp ứng lại nhu cầu của người tiêu dùng. Ngoài những giống hoa trong nước,
người trồng hoa kiểng cũng đã nhập ngoại nhiều loại hoa đẹp trong đó có các giống
hoa lại rất đa dạng về màu sắc, hình dạng phù hợp với người tiêu dùng, trong đó có
hoa Dạ Yến Thảo.
Dạ Yến Thảo là loài hoa được rất nhiều người ưa chuộng. Vì hoa tượng trưng
cho sự ấm áp, bình n, khích lệ và được mệnh danh là hoàng hậu của các loài hoa.
Hoa từ vườn anh Quốc hiện được rất nhiều người mua về trang trí ở ban cơng nhà, các
khu resort, biệt thự, nhà hàng, trưng bày tại các sự kiện, hội nghị,… Ngồi ra, cịn
cung cấp cho các đại lý hoa tươi trên địa bàn Đà Nẵng, Quảng Nam và một số tỉnh
lân cận.
Hiện nay, Dạ Yến Thảo được trồng khắp cả nước ta và giờ đây thú chơi hoa
khơng cịn là thú chơi có phần xa xỉ của những người có điều kiện nữa. Ở hầu hết các
chợ hoa ở miền Bắc cũng như miền Nam đều có bán Dạ Yến Thảo với đủ loại màu sắc
hình dạng (hoa cánh đơn, hoa cánh kép, hoa khảm,...)
Tuy được trồng khá phổ biến nhưng những nhà vườn cho biết họ trồng Dạ Yến
Thảo từ hạt giống là chính, giá bán hạt giống thì khá cao, từ 2.000 - 4.000 đ/hạt, tùy
loại hoa đơn, kép hay khảm, tỷ lệ hạt nảy mầm của hạt cũng chưa đều, chỉ khoảng
60%. Do đó mà giá bán Dạ Yến Thảo chậu chênh lệch cũng khá cao giữa chậu hoa

đơn và chậu hoa kép (hoa đơn giá trung bình 60.000 đ/chậu, hoa kép hay hoa khảm giá
trung bình 120.000 đ/chậu) 6.
1.2 Phương pháp nhân giống
1.2.1 Kỹ thuật nhân giống truyền thống
Nhân giống bằng hạt là phương pháp đơn giản, dễ làm và được áp dụng phổ biến
khi cần nhân số lượng cây con nhiều. Ưu điểm của phương pháp gieo hạt là không tốn
kém về thời gian và cơng sức, giá thành hạ, thích nghi tốt, hệ số kỹ thuật cao. Ngược
lại, phương pháp này khó đánh giá được chất lượng giống.
Nhân giống giâm cành là một phương pháp nhân giống phổ biến, được nhiều
người áp dụng trong sản xuất. Nhân giống bằng phương pháp này không những tận
dụng được chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ, dễ áp dụng trong sản xuất mà còn rút
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu
ngắn thời gian sinh trưởng của cây so với nhân giống từ hạt, nuôi cấy mơ tế bào.
Ngồi ra, người trồng có thể chủ động được nguồn giống chất lượng. Nhưng phương
giâm cành không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được truyền từ cây mẹ sang.
1.2.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là vận dụng những phương pháp, kỹ thuật để đưa
mẫu thực vật vào điều kiện vơ trùng, duy trì và phát triển chúng bằng mơi trường thích
hợp. Kỹ thuật này đem lại lợi ích rất nhiều như tạo ra số lượng nhân bản lớn, có thể
thúc đẩy q trình ra hoa và lai tạo trong ống nghiệm với thời gian nhanh hơn, kiểm
soát được hồn tồn q trình sinh trưởng phát triển của thực vật, tạo ra cây giống
đồng đều và sạch bệnh, quan trọng là nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô mà ta có thể chuyển
gene vào cây nhằm tạo ra giống vượt trội hơn. Ví dụ như có khả năng chịu hạn, chịu
rét, chịu mặn, hoặc giống cây giàu dinh dưỡng hơn, to hơn, phát triển nhanh hơn,...
Mở ra hướng phát triển mới, chuyển nên nông nghiệp truyền thống trở thành nền nơng
nhiệp cơng nghệ cao tiên tiến. Nhân giống vơ tính cây trồng in vitro hay vi nhân
giống là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong cơng nghệ nuôi cấy mô tế

bào thực vật.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những phương pháp được sử dụng để
duy trì và ni cấy các cơ quan thực vật như: hạt, thân, lá, rễ,… trên môi trường dinh
dưỡng nhân tạo, trong điều kiện nuôi cấy vô trùng và nhiệt độ thích hợp. Sự thành
cơng của việc ni cấy mô thực vật chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tố như: môi trường
nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng cần thiết, sự vơ trùng, nhiệt độ, ánh sáng,… Ngồi ra
việc chọn mẫu ban đầu là rất quan trọng chúng quyết định sự thành cơng ban đầu cho
cả q trình ni cấy.
Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của cơng nghệ tế bào
thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm
duy trì các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống. Nhân nhanh các
cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương
thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.
Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong
nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ. Nhân nhanh ở điều kiện vô
4


Chương 1. Tổng quan tài liệu
trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. Bảo quản các tập đồn giống
nhân vơ tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn thân
non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mới hồn chỉnh.
Ưu điểm của nhân giống in vitro là hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ
động trong việc sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống.
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy
1.3.1 Yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro.
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc
nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin là rất cần thiết để
kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho

mơ cây. Đồng thời có thể chủ động điều chỉnh các yếu tố vật lý (quang kỳ, cường độ
chiếu sáng, nhiệt độ, ẩm độ, pH môi trường nuôi cấy,...), các yếu tố hoá học (các chất
khoáng, vitamin,...) và đặc biệt là việc bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng.
Điều kiện nuôi cấy: Ánh sáng bao gồm cường độ, thời gian và chất lượng ánh
sáng. Nếu nuôi cấy ở 10 - 15 w/m2 (khoảng 2000 - 3000 lux). Trong thực tế ở phần lớn
các phịng thí nghiệm thời gian chiếu sáng 16 - 18h/ngày được coi là tốt nhất cho nuôi
cấy mô. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến q trình sinh trưởng
của mơ ni cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh. Các cơng
trình nghiên cứu của Seibert (1975) chứng tỏ trên mơ sẹo cây thuốc lá thì ánh sáng
xanh lơ hoặc tím kích thích việc tạo chồi và ánh sáng đỏ cảm ứng việc phát sinh rễ.
Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá trình tạo hình thể
của thực vật được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các
chất khác 7.
Nhiệt độ: Điều kiện nhiệt độ đóng vai trị quan trọng quyết định sự phân bố hình
thái, sự sinh trưởng phát triển và ra hoa của mỗi loại thực vật. Vậy nên trên thế giới
được chia ra các khu vực khí hậu khác nhau cùng các loại thực vật đặc trưng của từng
vùng. Nhiệt độ quá thấp làm tăng độ keo trong tế bào làm cây sinh trưởng phát triển
chậm, nếu nhiệt độ quá cao thì làm cho cây bị chết đi, mặc khác có một số cây muốn
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu
nảy mầm và ra hoa được thì cần có sự chuyển đổi nhiệt độ từ âm 2 - 40C sang nhiệt độ
24 - 320C. Tuy nhiên, đối với một số trường hợp như nơi sống khắc nghiệt hay sự
chuyển đổi mơi trường sống mới thì cây sẽ có sự biến đổi để thích nghi khác nhau.
Theo nghiên cứu của Murashige vào năm 1947, nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân
chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô cấy, ảnh hưởng đến sự phát triển của
từng tế bào riêng lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp
sẽ ảnh hưởng tích cực đến q trình sinh trưởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy.
Nhiệt độ rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay ngừng sinh trưởng hẳn của mầm

ni cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro. Trong thực tế nhiệt độ
của phịng ni cấy thường được điều chỉnh ổn định 250C ± 10C , điều này là do nhiệt
độ thật của các mơ ni cấy trong bình ni cấy có thể cao hơn 2 - 40C so với nhiệt độ
của phịng. Thơng thường người ta điều chỉnh nhiệt độ phịng ni cấy trung bình. Các
loại cây sống ở vùng ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính
vì vậy mà người ta sẽ có lợi hơn khi có những phịng ni cấy có nhiệt độ 200C ± 10C
dành cho cây nhiệt đới 8.
Đối với thực vật, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hình thái, chức năng sinh lý và khả
năng sinh sản. Về hình thái của cây: Tùy theo nơi sống có nhiệt độ cao hay thấp mà
cây hình thành nên những bộ phận bảo vệ, cây mọc ở nơi trống trãi, cường độ ánh
sáng mạnh, nhiệt độ cao thì cây có vỏ dày, màu nhạt, tầng bần phát triển nhiều lớp có
tác dụng cách nhiệt, lá nhỏ, có tầng cutin dày hạn chế sự bốc hơi nước. Trong quá
trình sống thực vật: Trong những giai đoạn phát triển cá thể khác nhau, nhu cầu nhiệt
độ cũng khác nhau. Chẳng hạn như ở giai đoạn nảy mầm, hạt cần nhiệt độ thấp hơn
thời kỳ nở hoa, vào thời kỳ quả chín địi hỏi nhiệt độ cao hơn cả. Nhiệt độ chủ yếu tác
động đến cây qua con đường quang hợp theo chiều tăng của của nhiệt độ, như nhiệt độ
của môi trường tăng 100C thì thể cường độ quang hợp tăng hai lần. Tuy nhiên, mỗi
loại cây đều có nhiệt độ tối cao hoặc tối thấp thích hợp khác nhau và khả năng chịu
đựng nhiệt độ bất lợi ở các bộ phận của thực vật cũng không giống nhau. Điều kiện
nhiệt độ thấp làm giảm sự sinh trưởng của cây, mất sự hô hấp và thúc đẩy sự phân giải
tinh bột và các chất dự trữ khác có thể cải thiện trực tiếp sự đồng hóa cung cấp cho
đỉnh chồi và thúc đẩy quá trình theo hướng sinh sản, lá là cơ quan tiếp xúc nhiều và
trực tiếp với khơng khí, do đó chịu đựng được sự thay đổi về nhiệt độ thấp.
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Đồng thời nhiệt độ có thể ảnh hưởng riêng đến sự sinh trưởng của cây thơng qua
sự xn hố, hay cảm ứng về sự nở hoa bởi nhiệt độ lạnh. Sự xuân hóa chỉ được dùng
để kích thích hoặc thúc đẩy sự ra hoa bởi việc xử lý nhiệt độ thấp. Như là một nguyên

tắc, sự khởi phát hoa xuất hiện trong thời kỳ xuân hóa nhưng hoa chỉ xuất hiện ở điều
kiện nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng. Ví dụ, cây Aconitum carmichaeli Debx (Ơ
đầu) u cầu sự xn hố cho việc nở hoa. Ở một số lồi khác, như hoa hình nón (cúc
Echinacea purpurea) thì lại khơng u cầu q trình xn hố, nhưng sau khi xử lý qua
q trình xn hố lại làm cho q trình ra hoa nhanh hơn và tăng chất lượng hoa. Rất
nhiều loài hoa lâu năm u cầu q trình xn hố cho việc sản xuất nhanh và hiệu
quả kinh tế, trong đó sử dụng phương pháp xử lý lạnh đối với hạt để tăng khả năng nảy
mầm là một ví dụ điển hình trong việc xn hố hạt giống hoa, nhất là các lồi hoa có
nguồn gốc ơn đới. Đối với một số lồi hoa, người ta làm giảm nhiệt độ xuống vài độ
so với nhiệt độ tối thích trong vịng khoảng 1 đến vài tuần trước khi thu hoạch để làm
tăng chất lượng hoa và kéo dài thời gian thu hoạch 9
pH: Tế bào và mơ thực vật địi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong
nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị mơi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần
thiết của thí nghiệm, mơi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH môi trường
là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào, pH của mơi trường ni cấy thích hợp
dao động 5,6 - 6,0 cho các loại cây trồng.
Than hoạt tính : bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường có tác dụng khử độc.
Than hoạt tính cho vào mơi trường để hấp thụ các chất màu, các chất phenol,…trong
trường hợp các yếu tố đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính
làm thay đổi mơi trường ánh sáng do môi trường trở nên tối hơn vì thấy thuận lợi cho
việc kích thích ra rễ, thêm than hoạt tính vào mơi trường ni cấy mơ sẽ cung cấp dinh
dưỡng thiết yếu và có tác dụng khử độc. Khi bổ sung than hoạt tính vào mơi trường
ni cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, carot, cà chua,
cây trường xuân nhưng lại có tác dụng ức chế đối với cây thuốc lá, đậu nành và trà mi.
Than hoạt tính nhìn chung có ảnh hưởng ở ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất
điều hòa sinh trưởng hoặc làm đệm môi trường. Người ta cho rằng, nguyên nhân gây
ức chế sự tăng trưởng của mơ cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong mơi
trường là do than hút chất điều hịa sinh trưởng trong mơi trường. NAA, IAA, kinetin,
7

Chương 1. Tổng quan tài liệu
BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính. Trong khi đó, khả năng kích thích sự tăng trưởng
của than hoạt tính đối với mơ cấy là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc trong
thời gian ni cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ
0,5 - 3% (w/v).
Nguyên tố đa lượng: thường chiếm 0,1% khối lượng khô của thực vật, cịn có
Nitơ, Phốt pho, kali, magie, lưu huỳnh,… là các muối vơ cơ. Chúng có mặt trong các
hợp chất quan trọng như diệp lục, protein, acid amin,… tham gia q trình như điều
hồ áp xuất thẩm thấu thấu của tế bào, quang hợp, vận chuyển năng lượng trong
hô hấp,…
Hàm lượng nitơ (N): Là một yếu tố quan trọng đối với thực vật vì nó cần thiết
cho q trình hình thành chất diệp lục và cho phép cây trồng sử dụng ánh sáng để biến
nước và CO2 thành đường để cung cấp cho cây. N kích thích sự phát triển của thân cành - lá cây. Là thành phần chính của hầu hết các mơi trường là nitơ vô cơ dưới dạng
nitrat (NO3-) hoặc amonium (NH4+). Mô tế bào thực vật trong ni cấy có thể sử dụng
nitrogen như khoáng aminonium và nitrate, đồng thời sử dụng các dạng nitrogen hữu
cơ như amino acid. Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Tỉ lệ
amonium và nitrate thay đổi tùy theo loài và trạng thái phát triển của mơ. Vì thế, N
đóng vai trị quan trọng quyết định sự sinh trưởng cũng như năng suất của thực vật.
Bên cạnh sự khử độc tính của amonium cà amoniac, các hợp chất chứa N phân lượng
thấp cịn có một số chức năng khác như: Cung cấp N trong các liên kết hữu cơ và NH2 được thực vật hấp thụ như nguồn N hữu cơ cho quá trình sinh tổng hợp các amino
axit và protein là quan trọng nhất. Các hợp chất phân tử lượng nhỏ này còn được sử
dụng làm chất mang cation như Mn, Cu để vận chuyển các cation qua hệ thông mạch
dẫn trong cây.
Lưu huỳnh (S): Hàm lượng S trong phân bón có tác dụng gián tiếp đến ngành
chăn ni do đồng cỏ được bón bổ sung lưu huỳnh làm tăng năng suất chất xanh cao
hơn, hàm lượng protein tăng rõ rệt, đồng thời làm giảm lượng nitrat có hại. Lưu huỳnh
rất cần thiết trong dinh dưỡng thực vật để thực hiện các chức năng tổng hợp axit
amin(xystin, xistin, metionin), tổng hợp protein, tạo clorophil, ferrodoxin, glucoxit,
hoạt hoá một số men (papainaza, sufun-laza ATP), tổng hợp một số vitamin (biotin,

8


Chương 1. Tổng quan tài liệu
timin, vitamin Bi) và chen-zim A. Đối với nguồn S như SO được hấp thụ ở rễ cây với
tốc độ chậm. Giống như nitrat, lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh
tổng hợp các hợp chất có chứa S như amino axít, protein và enzym. S ở dạng chưa khử
được kết hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid. Cystein là sản phẩm bền đầu
tiên trong q trình đồng hóa và là tiền chất của tất cả các hợp chất hữu cơ có chứa S
trong thực vật, ví dụ như: Protein, co - enzym, các hợp chất trao đổi chất thứ cấp...
Quá trình đồng hóa S chủ yếu diễn ra ở lục lạp. Khi thiếu S, sinh tổng hợp protein bị
kìm hãm, lượng diệp lục tố trong cây bị giảm sút. S chưa bị khử là thành phần cấu tạo
sulpholipid, là phân tử tạo thành cấu trúc của màng sinh học (thylakoid) và tham gia
vào quá trình vận chuyển các ion qua màng. Đồng thời nhờ sự hiện diện của
sulpholipid trên màng tế bào cũng gây ảnh hưởng đến khả năng chịu muối của thực vật.
Magiê (Mg) là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng
thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số emzim vận chuyển photphat Trong
phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dịng điện tử, từ đó tạo ra ATP
và NADPH đóng vai trị quan trọng đối với cố định ở lục lạp. Nồng độ cao các ion
Mg và K là cần thiết để duy trì pH khoảng 6,5 - 7,5 trong lục lạp và tế bào chất, trái
với ở không bào pH chỉ vào khoảng 5 - 6. Ngồi ra, pH cịn xác định cấu trúc của
protein và emzym nên nó ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp cấu trúc protein.
Photpho (P) là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật, chúng tham gia vào
việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, axit nucleotic và tham gia cấu trúc
của màng. Trong môi trường nuôi cấy photpho được cung cấp dưới dạng mono hay
dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Đây cũng là ion dễ được thực vật hấp
thụ nhất.
Kali (K) K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cây cần bằng được các amino
vô cơ và hữu cơ. Ion được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trị chính là điều
hồ pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi trường

nuôi cấy thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước. K+ được cung cấp dưới dạng muối
KNO3, KCl. 6H2O, KH2PO4. Muối kali có vai trị quan trọng trong việc điều chỉnh tính
thẩm thấu của tế bào, có vai trị quan trọng trong việc duy trì cân bằng ion.

9


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Canxi (Ca) cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các amino trong cây nhưng
cách thức không giống K+ và Mg2+ và Ca2+ không phải là ion tăng động. Có vai trị
quan trọng trong việc phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều
hoà sinh trưởng đặc biệt auxin và cytokinin. Ngồi ra, cịn là thành phần quan trọng
của thành tế bào và màng tế bào, giúp cũng cố độ vững chắc cho thành tế bào và điều
hoà cấu trúc màng tế bào.
Các yếu tố khác: Agar đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có
thể bị chìm và chết vì thiếu oxi. Để tránh tình trạng này, mơi trường ni cấy được làm
đặc bằng cách bổ sung agar ở nồng độ thích hợp, một loại tinh bột được chế từ rong
biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng
độ 0,6 - 1%.
Nước dừa: Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mơ thuộc về
Van Overbeek và cộng sự. Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong mi trường
ni cấy mô, tế bào thực vật được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa được xác định là
giàu các chất hữu cơ, chất khống và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được
sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây trong nhiều loại
môi trường khác nhau. Nước dừa được sử dụng ở hai dạng: một là được lấy từ quả của
các giống cây và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản, hai là nước dừa
được một số công ty bán hóa chất bán dưới dạng đống chai sau chế biến và bảo quản.
Vitamin: Tất cả các tế bào được ni cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các
loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức u cầu. Để mơ có sức
sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các

vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa. Các vitamin sau đây được sử dụng
phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic axit, trong đó
vitamin B1 là khơng thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết
cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong mơi
trường MS. Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong mơi
trường ni cấy mơ. Inositol thường được nói đến như một vitamin kích thích một
cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó khơng phải
10


Chương 1. Tổng quan tài liệu
cần thiết trong mọi trường hợp. Các vitamin khác, đặc biệt là ticotinic axit (vitamin
B3), canxi phantothenate (vitamin B5) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức
sinh trưởng của mô nuôi cấy. Ảnh hưởng của vitamin lên sự phát triển của tế bào ni
cấy in vitro ở các lồi khác nhau là khác nhau hoặc thậm chí cịn gây hại (độc).
Hàm lượng đường: Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và
được sử dụng thường xuyên trong hầu hết trong các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi
mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp. Mơ thực vật có khả năng hấp
thụ một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí là tinh bột,
nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng hơn glucose trong môi trường
nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu
theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị
dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc
đưa vào mơi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn cacbon
thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2 - 3%,
song cũng cịn phụ thuộc vào mục đích ni cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2%
(chọn dịng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước) 9.
1.3.2 Chất điều hòa sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng: có vai trị quan trọng trong q trình phát sinh

hình thái của mơ ni cấy. Hiệu quả tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng phụ
thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của nó và mẫu ban đầu. Tỷ lệ cytokinin
và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập tạo trồi và rễ. Một tỉ lệ
cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo rễ, cịn ở mức độ trung gian thích hợp
cho tạo mơ sẹo.
Các chất điều hồ sinh trưởng thực vật: là thành phần quan trọng bậc nhất của
môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều
chỉnh q trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Trong ni cấy mơ tế bào hai
nhóm chất điều hồ sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin.
Cytokinin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên quan chặt chẽ
đến q trình phân bào, kích thích phân hố chồi từ mô cấy. Cytokinin là một trong
các chất điều hịa sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất, nó có vai trị kích thích sự
11


Chương 1. Tổng quan tài liệu
phân chia tế bào và hình thành cơ quan, tạo chồi và tăng trưởng nụ nách. Các
cytokinin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA.
BA (6 - benzylaminopurine) là dạng bột kết tinh màu trắng, khó tan trong nước,
hoạt lực của BA cao hơn nhiều so với Kinetin và bản thân BA bền vững hơn zeatin
dưới tác động của nhiệt độ cao. BA có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ
cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và q
trình trao đổi chất.
Kinetin (6 - furfurylaminopurine) được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc
nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống
khơng có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá
nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích
thích q trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mơ khơng phân hóa.
Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn dài của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều
ngang của tế bào làm tế bào to theo chiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây

to về chiều ngang. Ngồi ra, auxin cịn kích thích sự tổng hợp các hợp cấu trúc nên
thành tế bào như các chất cenlulose, pectin, hemicenlulose... Auxin còn ảnh hưởng đến
sự phân chia tế bào, tuy nhiên ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào
trong mỗi tác động tương hỗ với các phytohormone khác.
Auxin gây kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sự hình thành
tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng. Vì
vậy, khi phun auxin ngoại sinh có thể gây giảm sự rụng lá, làm tăng khả năng đậu quả
và hạn chế sự rụng nụ hay quả non, dẫn đến tăng năng suất cho cây. Trong điều kiện
tự nhiên, khi cây tổng hợp đủ lượng auxin sẽ ức chế sự rụng hoa, quả, lá 10.
Auxin là nhóm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là
IAA (1H- indole-3-acetic acid, NAA (1-naphthaleneacetic acid), IBA (1H-indole-3butyric acid) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi
đỉnh, đóng vai trị kích thích sự phân hố của các mô dẫn (xylem and phloem). Auxin
kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự
tăng trưởng của mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái và có khả
12


Chương 1. Tổng quan tài liệu
năng khởi đầu sự phân chia tế bào.. Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân
chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài
thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch
dẫn. Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô,
auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ.
1.4 Các cơng trình nghiên cứu trong nước và ngồi nước
1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu ni cấy in vitro cây Dạ
Yến Thảo nhằm tạo ra số lượng lớn phục vụ cho sản xuất.
Năm 2004, Kortessa Dimasi-Theriou và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh cây Dã
Yên Thảo (Petunia hybrida L.) in vitro bằng ethylene. Nghiên cứu cho thấy giảm

ethylene sản xuất nội sinh bằng ethysorb (KMnO4), một chất hấp thụ ethylene, làm
giảm số lượng chồi. Mặt khác, việc bổ sung ethylene (0,01 - 10 ppm) vào môi trường
nuôi cấy làm tăng đáng kể số lượng chồi mà không ảnh hưởng đến chiều dài và trọng
lượng tươi. Phương pháp xử lý ethylene (1 ppm) được cho là có hiệu quả nhất khi
chúng được áp dụng vào tuần thứ hai của q trình ni cấy mẫu petunia. Việc bổ
sung Co2+ vào môi trường dẫn đến giảm ethylene nội sinh và đồng thời làm giảm sự
hình thành chồi. Tương tự, bổ sung Ag+, một chất ức chế hoạt động của ethylene, dẫn
đến sự hình thành chồi kém. Ethylene dường như cũng đóng một vai trị nào đó đối với
sự ra rễ của các micro Petunia in vitro trong mơi trường khơng có auxin. Ethylene ở
nồng độ 10 ppm gây ra sự hình thành rễ nhanh chóng đáng kể, trong khi ở nồng độ
thấp (0,0 - 1 ppm) nó khơng ảnh hưởng đến sự ra rễ 11.
Năm 2007, Moshe Reuveni, Dalia Evenor đã nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh
sáng đến tái sinh chồi ở cây Dã Yên Thảo (Petunia hybrida). Nghiên cứu tiến hành
trên lá cây Dã Yên Thảo đã khử trùng được đặt trên môi trường MS bổ sung 5,7 μM
IAA và 2,25 μM zeatin. Mô lá tiếp xúc với các khoảng thời gian ánh sáng hoặc bóng
tối khác nhau và sự tái sinh đã được ghi lại. Giống Petunia hybrida R khơng tái sinh
trong bóng tối trong khi P. axillaris tái sinh trong bóng tối. P. hybrida và P. axillaris
tái sinh trong ánh sáng. P. hybrida lá trên môi trường tái sinh MS được chiếu sáng, cần
chiếu xạ tối thiểu 6 ngày để tái sinh chồi. Các chồi phát triển tối được hình thành, điều
13