Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn châu phi gây bệnh trên lợn tại việt nam

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN
VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI GÂY BỆNH
TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện

: Đặng Ngọc Trân

MSSV

: 1711545286

GVHD

: TS. Thân Văn Thái

TP. HCM, 2020


ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN
VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI GÂY BỆNH
TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện

: Đặng Ngọc Trân

Mã số sinh viên

: 1711545286

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Thân Văn Thái

TP. HCM, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Khoa Công nghệ Sinh học

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Đặng Ngọc Trân

MSSV: 1711545286

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Lớp: 17DSH1A

1. Đầu đề luận văn:
Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh
trên lợn tại Việt Nam.
2. Mục tiêu
-

Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn
tại Việt Nam.

3. Nội dung:
-

Phát hiện được ASFV bằng phản ứng PCR.

-

So sánh được mức độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp mồi với mẫu ASFV gây
bệnh trên lợn tại Việt Nam.

-

Giải trình tự và phân tích được một số gen trong phản ứng PCR.

4. Thời gian thực hiện: tháng 06/2020 đến tháng 09/2020
5. Người hướng dẫn chính: TS. Thân Văn Thái
Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn.
TP. HCM, ngày…… tháng……năm20…
Khoa/Bộ môn

Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực của bản
thân, tơi ln nhận được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, anh chị, bạn bè.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Thân Văn Thái đã hướng
dẫn nhiệt tình, giúp đỡ, khích lệ và động viên tơi trong suốt q trình tơi thực hiện
khóa luận này.
Tơi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo khoa và tồn thể q Thầy Cơ
giảng dạy tại khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã nhiệt

tình hỗ trợ cũng như cung cấp cho tơi những kiến thức sâu rộng để tơi có nền tảng
nghiên cứu đề tài.
Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè đặc biệt là khóa K17, cha mẹ cũng như
gia đình đã ln bên cạnh khích lệ tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi để tơi có thời gian
tập trung thực hiện đề tài này.
Trong quá trình thực hiện luận văn, mặc dù bản thân đã cố gắng hồn thiện,
nhưng chắc chắn khơng tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy tơi rất mong nhận được sự
chỉ dẫn, đóng góp của q Thầy Cơ và bạn đọc để khóa luận được hồn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

Đặng Ngọc Trân
Khoa Công nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
MỤC LỤC ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT .................................................................................................................. v
SUMMARY ...............................................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................... viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ x
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................1
1.1 Tổng quan về African swine fever virus .................................................................1
1.1.1 Phân loại khoa học .............................................................................................. 1
1.1.2 Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 1

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc ............................................................................................... 1
1.2 Tổng quan về dịch tả lợn Châu Phi.........................................................................3
1.2.1 Triệu chứng.........................................................................................................3
1.2.2 Cơ chế gây bệnh..................................................................................................4
1.2.3 Phương thức lây nhiễm ....................................................................................... 5
1.2.4 Dịch tễ học .......................................................................................................... 7
1.2.5 Các biện pháp phòng chống và ngăn chặn ........................................................... 9
1.3 Các phương pháp chẩn đoán ASFV .......................................................................9
1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng ............................................................................................ 9
1.3.2 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR).................................................................... 10
1.4 Kỹ thuật điện di ................................................................................................... 13
ii


1.4.1 Nguyên lý ......................................................................................................... 13
1.4.2 Các kỹ thuật điện di .......................................................................................... 10
1.5 Kỹ thuật giải trình tự gen ..................................................................................... 13
1.6 Xây dựng cây phát sinh lồi ................................................................................. 15
1.7 Tình hình nghiên cứu bệnh dịch tả lợn Châu Phi .................................................. 15
1.7.1 Các nghiên cứu trên thế giới.............................................................................. 15
1.7.2 Các nghiên cứu trong nước ............................................................................... 18
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 20
2.1 Địa điểm thực hiện ............................................................................................... 20
2.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 20
2.3 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 20
2.4 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 20
2.4.1 Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................... 20
2.4.2 Hóa chất, thuốc thử ........................................................................................... 21
2.5 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 21
2.5.1 Thu mẫu............................................................................................................ 21

2.5.2 Tách chiết DNA ................................................................................................ 21
2.5.3 PCR phát hiện ................................................................................................... 22
2.5.4 Phương pháp điện di ......................................................................................... 24
2.5.5 Giải trình tự, xây dựng cây phả hệ..................................................................... 25
2.5.6 So sánh độ nhạy của cặp mồi trong phản ứng PCR............................................ 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 27
3.1 Kết quả thu mẫu ................................................................................................... 27
3.2 Kết quả PCR phát hiện ......................................................................................... 27
3.3 Kết quả so sánh độ nhạy của các cặp mồi ............................................................. 29
iii


3.4 Kết quả giải trình tự gen....................................................................................... 34
3.5 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài ..................................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 38
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 40

iv


TÓM TẮT
Virus gây bệnh dịch tả lợn ở Châu Phi (African swine fever virus - ASFV) là tác
nhân gây bệnh nghiêm trọng ở bất kỳ lồi lợn nào và có tỷ lệ tử vong cao ở hầu hết lợn
bị nhiễm bệnh. Đề tài “Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi
gây bệnh trên lợn tại Việt Nam” được thực hiện từ tháng 06-09/2020 tại Phòng thí
nghiệm Vi sinh vật, Khoa Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.
Đề tài có ba nội dung chính như sau: (1) Phát hiện ASFV trên lợn bằng phản ứng
PCR. (2) So sánh độ đặc hiệu và độ nhạy của các cặp mồi với mẫu ASFV. (3) Giải
trình tự và phân tích một số gen trong phản ứng PCR.

Những kết quả đạt được sau thời gian nghiên cứu:
1. Phát hiện được ASFV bằng phản ứng PCR.
2. So sánh độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp mồi phát hiện ASFV trong phản ứng
PCR cho thấy cặp mồi PPA-1/2 cho hiệu quả cao hơn cặp mồi OIE-F/R.
3. Giải trình tự gen B646L của chủng ASFV và phân tích cây phát sinh loài của
ASFV trên gen B646L cho thấy được chủng nghiên cứu ASFV thuộc kiểu gen
II. Chủng ASFV nghiên cứu cùng nhóm với các chủng ASFV có kiểu gen II
phân lập tại Châu Phi và Georgia đã được công bố.

v


SUMMARY
African swine fever virus (ASFV) caused serious illness in swine and high
mortality in almost all infected swine. Thesis title "Application of the PCR assay for
detection African swine fever virus causing disease in pigs in Viet Nam" carried out
from June to September, 2020 at Microbiology Laboratory, Department Biotechnology,
Nguyen Tat Thanh University.
The topic includes three contents: (1) Detection of ASFV in swine samples by
PCR. (2) Compare the specificity and the sensitivity of primers on ASFV samples. (3)
Sequencing and analysis of some genes in PCR test.
The study results as follow:
1. ASFV was detected by PCR.
2. Comparison of the specificity and sensitivity of the ASFV detected primer pairs
revealed that the PPA-1/2 more effective than the OIE-F/R.
3. The B646L gene of ASFV strain was sequenced, analyzed and phylogenetic
tree analyzed based on B646L gene indicated that the studied strain ASFV
belongs to genotype II. The ASFV strains in the same group with the ASFV
strains with genotype II isolated in Africa and Georgia.

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Ảnh vi điện tử của hạt virus ASFV ................................................................ 1
Hình 1.2 Ảnh biểu diễn giản đồ của một hạt ASFV cho thấy hàm lượng protein .......... 3
Hình 1.3 Ve mềm Ornithodoros erraticus....................................................................6
Hình 3.1 Kết quả phản ứng PCR phát hiện trong các mẫu DNA nghi nhiễm ASFV
chạy với mồi OIE-F/R........................................................................................ 27
Hình 3.2 Kết quả phản ứng PCR phát hiện trong các mẫu DNA nghi nhiễm ASFV
chạy với mồi PPA-1/2 ........................................................................................ 28
Hình 3.3 Độ nhạy của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OIE-F/R ............................... 30
Hình 3.4 Độ nhạy của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PPA-1/2................................ 31
Hình 3.5 Kết quả giải trình tự tốt ............................................................................... 33
Hình 3.6 Kết quả giải trình tự nhiễu ........................................................................... 33
Hình 3.7 Kết quả sau khi BLAST trình tự của cặp mồi OIE-F/R ................................ 34
Hình 3.8 Kết quả sau khi BLAST trình tự của cặp mồi PPA-1/2 ................................ 34
Hình 3.9 Cây phát sinh lồi mơ tả mối quan hệ gen B646L của ASFV....................... 35

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 20
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 21
Bảng 2.3 Danh mục hóa chất và thuốc thử ................................................................. 21
Bảng 2.4 Primers sử dụng của phản ứng PCR ............................................................ 23
Bảng 2.5 Các thành phần của phản ứng PCR ............................................................. 23
Bảng 2.6 Trình tự các cặp mồi và chu trình nhiệt tương ứng ...................................... 24
Bảng 3.1 Thống kê kết quả PCR phát hiện của 2 cặp mồi .......................................... 29

Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA (ng/μl) ................................................................ 30
Bảng 3.3 Giới hạn phát hiện ASFV của cặp mồi OIE-F/R và PPA-1/2....................... 31

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ASFV:

Tác nhân gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever virus)

PRRS:

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and

respiratoy syndrome)
CSF:

Bệnh sốt lợn cổ điển (Classical Swine Fever)

PCR:

Phản ứng chuỗi Polymerase

dNTP:

Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP: Dideoxynucleotide triphosphate
Nu:

Nucleotide

NCBI:

Nation center for Biotechnology information

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay nhu cầu về thịt lợn của con người ngày càng tăng cao, tạo cơ hội cải
thiện cuộc sống cho những người có thu nhập thấp thơng qua chăn nuôi, chế biến,
thương mại các sản phẩm từ chăn nuôi.
Tuy nhiên, trong những năm gần đây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) do tác
nhân African swine fever virus (ASFV) gây ra đã xuất hiện và lây lan nhanh sang
nhiều khu vực gây thiệt hại nghiêm trọng cho những nước bị nhiễm bệnh. ASFV lây
truyền trực tiếp thông qua tiếp xúc với lợn bị nhiễm bệnh, hay qua đường máu, qua các
vết thương, v.v... và khi ASF lần đầu xuất hiện tại các trang trại, khu vực thì tỷ lệ chết
có thể lên đến 100 %. Vào năm 2019, Việt Nam đã chính thức cơng bố về sự xuất hiện
ASFV lần đầu tiên tại Hưng Yên, sau đó lây qua Thái Bình, Hải Phịng, Thanh Hóa,
Hà Nội, Hà Nam. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, từ đầu năm 2020 đến
nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi đã tái phát tại 155 xã của 20 tỉnh, thành phố, và buộc
tiêu hủy gần 4.000 con lợn. Nguy cơ dịch bệnh tiếp tục tái phát, lây lan diện rộng là rất
lớn, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đến ngành chăn ni lợn ở Việt Nam.
Dù đã có nhiều nước cơng bố tình trạng về ASFV, nhưng bệnh lại mới xuất hiện
lần đầu tại Việt Nam nên những nghiên cứu ở trong nước cịn rất ít. Do khơng có
vaccine phịng và điều trị bệnh, nên việc kiểm sốt dịch chủ yếu dựa vào chẩn đốn
phịng thí nghiệm và thực hiện các biện pháp an toàn sinh học. Hơn nữa, dịch tả lợn
Châu Phi gây ra tổn thương và các triệu chứng lâm sàng tương tự với một số bệnh gây

trên lợn như dịch tả lợn cổ điển, hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (bệnh
PRRS), nên việc chẩn đốn phịng thí nghiệm để phân biệt ASF từ lợn bị nhiễm bệnh
là rất cần thiết để kịp thời hạn chế dịch lây lan. Do đó, u cầu chẩn đốn phịng thí
nhiệm phải có quy trình nhanh và chính xác cho việc phát hiện ASFV.
Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Ứng dụng phản
ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam”.
Mục tiêu của đề tài:
Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện được virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh
trên lợn tại Việt Nam.
x


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về African swine fever virus
1.1.1 Phân loại khoa học
Ngành: Nucleocytoviricota
Lớp:

Pokkesviricetes

Bộ:

Asfuvirales

Họ:

Asfarviridae

Chi:

Asfivirus

Lồi:

African swine fever virus
(ASFV)
Hình 1.1 Ảnh vi điện tử của hạt virus ASFV 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái
African swine fever virus (ASFV) là một loại virus có hình thái icosahedral (đa
diện với 20 mặt) và có đường kính trung bình là 200 nm. ASFV được nhân lên trong tế
bào chất của tế bào chủ 3.
Hạt virus có hình thái icosahedral, được sắp xếp theo cấu trúc gồm nhiều lớp. Nó
được cấu tạo bởi một hệ thống nucleoprotein, bao gồm một lõi bên trong được hình
thành bởi bộ gen trung tâm nucleoid, được bao bởi 1 lớp protein dày là vỏ lõi, một lớp
vỏ lipid bên trong bao quanh lõi và cuối cùng là lớp capsid, lớp ngoài cùng của virion
4

. Một cấu trúc khác, virus được bao phủ bởi một lớp bao bên ngoài bổ sung được thu

nhận trong quá trình nảy chồi 4.
1.1.3 Đặc điểm cấu trúc
ASFV là một loại virus DNA sợi kép lớn, từ 170 đến 190 kilobase (Kbp) mã hóa
hơn 150 khung đọc mở (ORF) tùy thuộc vào chủng virus 4. Các protein cấu trúc của
virus được mã hóa có liên quan đến sự sao chép bộ gen và nhiễm virus. ASFV có
khoảng hơn 50 protein được đóng gói thành virion và hoạt động trong q trình virus
lây nhiễm, ví dụ như p72, p54, p30, v.v…5.

1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Phần lớn hàm lượng protein của virion ASFV được mã hóa bởi khung đọc ORF
B646L mã hóa cho VP72 và khung đọc ORF CP2475L mã hóa cho pp220 được phân
cắt thêm để tạo ra các protein virus p150, p37, p34 và p14 1. Protein pp62 được mã hóa
bởi gen CP530R được phân cắt thành các protein virus p35 và p15. p150, p37, p14,
p34, p35 và p15 đóng vai trị quan trọng trong q trình lắp ráp virus, chiếm khoảng
30 % tổng khối lượng prorein của virus, tạo thành các thành phần chính của vỏ lõi 5.
Protein p72 có trọng lượng phân tử là 73,2 kDa là protein cấu trúc chính của
ASFV và là protein kháng nguyên quan trọng được mã hóa bởi gen B646L (VP72).
p72 rất quan trọng trong việc hình thành capsid của virus và là thành phần chính của
các icosahedral virus 5.
Protein CD2v hay cịn được đặt tên là PEP402R được mã hóa bởi gen EP402R
có trọng lượng phân tử là 105 kDa. Protein được biểu hiện muộn trong quá trình lây
nhiễm và cần thiết cho hiện tượng hấp thụ máu trong các tế bào bị nhiễm ASFV.
Ngồi ra, protein CD2v cịn tham gia vào q trình kết dính tế bào, tăng cường độc lực
và điều hòa phản ứng miễn dịch 5.
Các protein sau này tạo thành lõi virus, tương ứng với 25 % khối lượng protein
của virion. Các protein gắn p12 và p24 được định vị trên màng ngồi. Protein màng
khơng thể thiếu quan trọng nhất là p54 được giới hạn trong vỏ ngoài của virus cùng
với p22, p32 và protein xuyên màng CD2v cần thiết cho quá trình hấp thụ máu của các
tế bào hồng cầu xung quanh các tế bào bị nhiễm. Các protein p10, p12, p17 cũng liên
quan đến sự hấp phụ ASFV và chuyển virion 1,5.
Các protein pp220, pp62, p54, p30, p72 và CD2v đã được xác định là các protein
cấu trúc quan trọng trong việc gắn kết, xâm nhập của virus và là thành phần chính của
virion. Bên cạnh đó, một số protein cấu trúc khác, chẳng hạn như p10, p12, p14.5 và
p17, được mã hóa bởi bộ gen ASFV. Chúng cũng có vai trị quan trọng trong việc lây
nhiễm virus. Protein p10 có trọng lượng phân tử tương đối là 8,4 kDa được mã hóa

bởi gen K78R 5.
Protein p14.5 còn được gọi là pE120R được mã hóa bởi gen E120R. Nó là một
protein liên kết DNA với trọng lượng phân tử tương đối là 13,6 kDa. Protein p14.5

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
được tổng hợp trong giai đoạn cuối của quá trình nhiễm virus, và là protein cần thiết
liên quan đến việc chuyển virion từ các nhà máy sản xuất virus đến màng sinh chất 5.

Hình 1.2 Ảnh biểu diễn giản đồ của một hạt ASFV cho thấy
hàm lượng protein 1
Ngồi ra, nó cịn được biết đến là virus arbovirus DNA duy nhất sở hữu khả
năng lây truyền bởi các vectơ động vật chân đốt, cụ thể là bọ ve mềm thuộc giống
Ornithodoros.
1.2 Tổng quan về dịch tả lợn Châu Phi
1.2.1 Triệu chứng
ASFV gây bệnh nặng ở lợn nhà, lợn rừng và có tỷ lệ tử vong cao ở hầu hết tất cả
các con lợn bị nhiễm bệnh.
Các dấu hiệu lâm sàng thường xảy ra 3 - 15 ngày sau khi lợn bị nhiễm bệnh. Các
biểu hiện ban đầu thường không cụ thể như sốt cao, chán ăn hoặc lợn có thể chết đột
ngột mà khơng có biểu hiện bệnh ra ngồi. Ở giai đoạn sau, có thể quan sát các biểu
hiện khác như da đỏ, với các mảng xuất hiện trên đầu tai, đuôi, bàn chân, ngực và dưới
bụng, nôn mửa, thở lao, mắt sưng đỏ và không sẵn sàng đứng dậy.
Nếu nghiêm trọng hơn nữa, lợn có triệu chứng da sung huyết đến tím bầm hoặc
xuất huyết nhất là ở vùng bụng, có thể co giật, chảy dịch mũi trắng, đặc có lẫn máu,
mắt có thể có ghèn, niêm mạc sung huyết nặng có thể xuất huyết, một vài lợn có hiện
tượng bón hoặc tiêu chảy có máu và sẽ chết trong vịng 7 ngày sau khi xuất hiện triệu
chứng. Trong trường hợp lợn sống sót sau nhiễm thì sẽ trở thành dạng mang mầm

3


Chương 1. Tổng quan tài liệu
bệnh, lợn mang trùng là vấn đề lớn nhất trong việc kiểm soát bệnh
( />Tuy nhiên, tùy từng thể khác nhau mà triệu chứng của bệnh cũng sẽ khác nhau:
Thể quá cấp tính: Lợn nhiễm ASFV ở thể này thường khơng có biểu hiện triệu
chứng lâm sàng. Một số trường hợp trước khi chết lợn có thể sốt cao và nằm ủ rũ.
Thể cấp tính: Lợn nhiễm bệnh có hiện tượng sốt cao, nhiệt độ từ 40,5 oC - 42 oC.
Trong khoảng 2 đến 3 ngày đầu tiên, lợn lười vận động, nằm chồng đống, không ăn.
Các vùng da trắng như tai, ngực, bụng, đuôi, cẳng chân chuyển sang màu xanh tím
hoặc đỏ. Từ 1 đến 2 ngày trước khi chết, lợn xuất hiện các triệu chứng như đi khơng
vững, viêm mắt, thở gấp và có một số biểu hiện thần kinh. Lợn chết trong vòng từ 7 –
14 ngày, thậm chí có thể kéo dài đến 20 ngày.
Thể á cấp: Ở thể này, lợn bị nhiễm bệnh xuất hiện các triệu chứng như sốt nhẹ
hoặc khơng sốt, sụt cân, khó thở, có thể sẩy thai ở lợn đang mang thai. Tỷ lệ lợn chết
khi mắc dịch tả lợn Châu Phi ở thể này là 30 – 70 %, sau khoảng 15 – 45 ngày nhiễm
bệnh.
Thể mạn tính: Thường thấy ở lợn từ 2 đến 3 tháng tuổi, các triệu chứng lúc này
có thể kèo dài từ 1 đến 2 tháng. Lợn bị nhiễm ở thể này gặp phải tình trạng rối loạn
tiêu hóa, xuất hiện các nốt xuất huyết trên da chuyển từ đỏ sang tím. Khi mắc bệnh ở
thể này, lợn có tỷ lệ chết thấp hơn các thể khác. Tuy nhiên, khi khỏi bệnh vẫn tồn tại
virus và là nguồn lây bệnh ( />1.2.2 Cơ chế gây bệnh
Chu kỳ lây nhiễm ASFV bắt đầu với sự hấp phụ của virus và xâm nhập vào tế
bào chủ. Theo các nghiên cứu ban đầu về sự xâm nhập của ASFV cho thấy đó là một
q trình phụ thuộc vào pH và nhiệt độ thấp phù hợp với thâm nhập nội bào qua trung
gian thụ thể và đặc hiệu trong đại thực bào của lợn 4.
Virus sẽ mã hóa các enzyme cần thiết để sao chép và sao chép bộ gen của nó, bao
gồm các yếu tố của hệ thống sửa chữa cắt bỏ bazơ và protein cấu trúc. Sự nhân lên của
virus được diễn ra trong các khu vực hạt nhân, và đó là một quá trình được phối hợp

chặt chẽ với các giai đoạn tiền phiên mã, sớm, trung gian và muộn. Các gen sớm được
4


Chương 1. Tổng quan tài liệu
biểu hiện trước khi bắt đầu sao chép DNA. Sau khi sao chép DNA, sự phiên mã của
các gen trung gian và muộn bắt đầu 4.
Hầu hết sự sao chép và lắp ráp xảy ra ở các khu vực hạt nhân của tế bào được gọi
là các “nhà máy” virus và bước cuối của sự hình thành virion sẽ là việc đóng gói DNA
để tạo thành virion trưởng thành. Cuối cùng, virus mới hình thành sẽ rời khỏi “nhà
máy” và được vận chuyển đến bề mặt tế bào nơi nó được giải phóng khỏi tế bào vật
chủ bằng cách nảy chồi 4.
1.2.3 Phương thức lây nhiễm
1.2.3.1 Vectơ truyền bệnh
ASFV dễ dàng lây lan và có thể xảy ra khi tiếp xúc trực tiếp với lợn bị nhiễm
bệnh, các sản phẩm thịt lợn và fomite bị nhiễm bệnh, cũng như tiếp xúc với các vật
trung gian như lây truyền qua bọ ve mềm thuộc giống Ornithodoros. Chi
Ornithodoros của ve mềm trong họ Argasidae đóng vai trị là vectơ sinh học và là nơi
chứa tự nhiên và vật trung gian chính của ASFV 6.
Ornithodoros là một loại của bọ ve thuộc họ Argasidae. Các loài thuộc chi này
được đặt tên là Ornithodores. Bọ ve chủ yếu sống trên các loài chim, tuy nhiên, nhiều
loài sống trong hang của lồi gặm nhấm và đã thích nghi với nơi sinh sản, nhưng đơi
khi có thể đốt người, các lồi động vật khác để tạo ra một bữa ăn máu ở đó và có thể
truyền virus hoặc vi khuẩn gây bệnh sang qua các vết đốt 7.
Nhiều loài Ornithodoros được tìm thấy trong hang động vật đã bị nhiễm virus
gây bệnh dịch tả lợn châu Phi (ASF) và có khả năng truyền mầm bệnh này không chỉ
tồn tại ở Châu Phi mà còn ở các vùng của Châu Âu và Châu Mỹ.
Khi bọ ve mềm Ornithodoros bị nhiễm ASFV chúng có thể giữ lại virus trong
thời gian dài và truyền nó sang cho các vật chủ nhạy cảm. Do đó, vai trị của chúng
chủ yếu là duy trì ASFV trong khu vực. Ngoài ra, các thành viên của bọ ve

Ornithodoros spp. có thể truyền ASFV từ bọ ve này sang bọ ve khác và cho phép virus
tồn tại ngay cả khi khơng có vật chủ gây bệnh 6.

5


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.3 Ve mềm Ornithodoros erraticus
/>Cho đến nay, tám loài Ornithodoros đã được chứng minh là vectơ thích hợp cho
ASFV. Ve mềm Ornithodoros porcinus (thường được gọi là O. moubata porcinus
hoặc O. moubata) bị nhiễm ASFV ở Châu Phi đã được tìm thấy ở Madagascar. Ngoài
ra, vectơ Ornithodoros cũng được biết là tồn tại ở các vùng của Châu Âu và Châu Mỹ.
Ve mềm Ornithodoros erraticus (còn được gọi là O. marocanus và đổi tên thành bọ ve
mềm Carios erraticus) sống ở bán đảo Iberia và các khu vực Địa Trung Hải của Châu
Phi và Châu Á, và là một vectơ quan trọng cho ASFV ở Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha
trong thế kỷ ASF - thế kỷ 20 6,7.
Ở Châu Âu và Châu Á, lây truyền giữa lợn và lợn có thể xảy ra ở chăn nuôi động
vật hoang dã. Sự lây truyền giữa lợn có khả năng duy trì và lan truyền virus trên các
khu vực địa lý rộng lớn và ve mềm đóng vai trị là vectơ trung gian chứa virus 6.
Nhiễm trùng ASFV có thể tạo ra một loạt các biểu hiện lâm sàng từ bệnh mãn
tính, hoặc bệnh ở mức độ thấp đến sốt xuất huyết và tử vong liên tục, tùy thuộc vào
chủng virus và tính nhạy cảm của vật chủ. Các nghiên cứu về phân lập kiểu gen có độc
lực cao đã tạo ra tỷ lệ tử vong 100 % ở lợn nhà và lợn rừng, với bệnh tiến triển nhanh
từ các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu như sốt, chán ăn, tiêu chảy dẫn đến tử
vong 6.
ASFV lây nhiễm khi tiếp xúc trực tiếp với lợn nhiễm bệnh, tuy nhiên mức độ
truyền bệnh khác nhau đã được quan sát đối với các chủng có độc lực cao, trung bình
và thấp, có khả năng do sự khác biệt về mức độ nhiễm virus.

6


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Máu, dịch cơ thể, phân và xác lợn nhiễm bệnh cũng đóng vai trị là con đường
lây nhiễm gián tiếp. Lợn hồi phục sau khi bị nhiễm có thể trở thành vật mang mầm
bệnh và có khả năng truyền virus sang những con lợn khác 6.
1.2.3.2 Các phương thức lây nhiễm khác
Bệnh do ASFV xảy ra ở mọi lứa tuổi của lợn và lây nhiễm qua tiếp xúc trực tiếp,
qua đường máu, các vết thương nên tốc độ lây lan khá nhanh. ASFV lây nhiễm trực
tiếp giữa lợn với lợn xảy ra qua tiếp xúc với lợn nhiễm bệnh, qua vết cắn từ ve mềm bị
nhiễm bệnh, hay qua thức ăn, nước uống nhiễm virus. Khi ASF xuất hiện lần đầu ở
trong trại hay khu vực, v.v… thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100 %.
Khi lợn ni bị nhiễm ASFV có thể bài thải một lượng lớn virus trước khi có
biểu hiện lâm sàng qua nước bọt, dịch mũi, nước tiểu, phân và cũng có rất nhiều trong
máu. Do đó, người, thiết bị, quần áo và phương tiện vận chuyển cũng là yếu tố mang
mầm ASFV lan truyền đến những nơi xa hơn, trong thời gian xảy ra dịch, virus có thể
lây truyền qua kim tiêm được dùng chung cho lợn ( />1.2.4 Dịch tễ học
Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) được mô tả đầu tiên vào năm 1921 tại Kenya
và lây lan trong khu vực Châu Phi và đến năm 1970 dịch xuất hiện và cũng được dập
tắt thành công ở khu vực Caribe và Brazil. Một lần nữa bệnh lại vượt ra khỏi biên giới
Châu Phi, vào năm 2007 dịch lại xuất hiện tại Nga. Năm 2014, bệnh đã xâm nhập vào
Đơng Âu như Cộng hịa Séc, Bungari và Ba Lan. Cho đến năm 2019, Tổ chức Thú Y
thế giới OIE đã thống kê vào giai đoạn từ ngày 01/02/2019 đến 14/02/2019 ASF đã
gây chết 5.672 con lợn tại Châu Á (trong đó có 4.776 con ở Trung Quốc và 896 con
thuộc khu vực Mông Cổ), 196 con chết hoặc bị thiêu hủy tại Châu Âu (Italia, Estonia
và Lithuania), 156 con bị chết tại Châu Phi.
Ở Việt Nam, năm 2019, Cục Thú Y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã
chính thức cơng bố dịch tả lợn Châu Phi. Tháng 02/2019, tại xã Trung Nghĩa (Hưng
Yên) đã phát hiện ổ dịch với hàng trăm con lợn bị nhiễm bệnh. Tiếp đến, tại Thái Bình

cũng đã phát hiện được bệnh ở một số hộ chăn ni tại xã Đơng Đơ. Tính đến ngày
27/02/2019, ASF đã xuất hiện tại 96 hộ, 33 thôn, 20 xã, 13 huyện của 6 tỉnh, thành phố
7


Chương 1. Tổng quan tài liệu
trên cả nước, gồm Hưng n, Thái Bình, Hải Phịng, Thanh Hóa, Hà Nội và Hà Nam,
gây thiệt hại đáng kể về số lượng lợn trên cả nước.
Tính đến ngày 22/9/2019 dịch tả lợn Châu Phi xuất hiện tại 7.600 xã của 645
huyện tại 63/63 tỉnh, thành phố trong cả nước làm trên 5.000.000 con lợn phải tiêu huỷ
gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam cũng như ảnh
hưởng đến đàn lợn giống của quốc gia ( />Mặc dù hiện nay, chúng ta về cơ bản đã khống chế được ASFV, tuy nhiên nhiều
địa phương vẫn đang đứng trước nguy cơ tái bùng phát ASFV.
Đến ngày 27/05/2020, dịch tả lợn Châu Phi tái phát tại 20 tỉnh, thành phố và có
nguy cơ tiếp tục tái phát, lây lan trên diện rộng. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn, từ đầu năm 2020 đến nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi đã tái phát tại 155 xã
của 20 tỉnh, thành phố, và buộc tiêu hủy gần 4.000 con lợn. Nguy cơ dịch bệnh tiếp tục
tái phát, lây lan diện rộng là rất lớn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc tổ chức nuôi tái
đàn, tăng đàn lợn và bảo đảm nguồn cung thịt lợn.
Tính đến ngày 20/6/2020, đã có 103 hộ chăn ni, ở 50 xóm, thuộc 30 xã, thị
trấn tại 9/10 huyện, thành phố trong tỉnh Cao Bằng tái phát dịch tả lợn Châu Phi. Các ổ
dịch rải rác tại các địa phương và đáng lo ngại nhất là dịch bệnh có diễn biến phức tạp,
chưa được khống chế, có chiều hướng lây lan diện rộng. Tại thành phố Cao Bằng có
143 con lợn, tổng trọng lượng trên năm tấn lợn của 40 hộ chăn ni ở 13 xóm, năm xã,
phường tái phát dịch ASF. Ngày 16/7/2020, đã xuất hiện hai ổ dịch ASFV tại xã Tân
Phong, thị xã Giá Rai, Bạc Liêu, và tiêu hủy 20 con lợn bị nhiễm bệnh chết, mỗi con
có trọng lượng khoảng 20 kg.
Tuy nhiên, trong thực tiễn, ngăn chặn ASFV tái phát vẫn khó khăn do nhận thức
của một bộ phận người dân cịn hạn chế, chưa tích cực phối hợp áp dụng các biện pháp
khống chế và báo cáo dịch theo quy định. Bên cạnh đó, một số cán bộ chuyên mơn cơ

sở chưa thực sự nắm bắt tình hình dịch trên địa bàn ảnh hưởng đến cơng tác phịng
chống dịch ASF.

8


Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.2.5 Các biện pháp phòng chống và ngăn chặn
Cho đến nay vẫn chưa có vaccine hoặc thuốc để điều trị hoặc phòng ngừa ASFV,
dẫn đến việc áp dụng các biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt để kiểm soát căn bệnh này.
Biện pháp kiểm soát và diệt trừ ASFV dựa trên các phương pháp kiểm soát dịch bệnh
bao gồm giám sát, điều tra dịch tễ học, truy tìm và dập dịch các đàn bị nhiễm bệnh,
cũng như kiểm dịch nghiêm ngặt, các biện pháp an toàn sinh học.
Phòng bệnh: Vệ sinh chuồng trại thường xuyên, kiểm soát động vật lây truyền
như ve, chuột, bọ tránh để mầm bệnh phát tán ra bên ngồi. Ngồi ra cịn cần tăng
cường sức đề kháng cho lợn bằng cách bổ sung vitamin, khoáng vào khẩu phần ăn.
Ngăn chặn: Ngay khi phát hiện lợn có triệu chứng lâm sàng ngay lập tức cần
cách ly và thông báo đến các trung tâm chẩn đoán thú y, chi cục thú y vùng để xác
định rõ tác nhân gây bệnh và từ đó xử lý theo đúng quy định.
Trong trường hợp bùng phát cục bộ, có một số biện pháp kiểm sốt được khuyến
cáo áp dụng như cảnh báo sớm và báo cáo về ổ dịch, cách ly các đàn bị nhiễm bệnh và
kiểm sốt di chuyển.
Chính sách hỗ trợ người chăn ni: Việc tiêu hủy gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho
người chăn ni. Do đó việc áp dụng các biện pháp hỗ trợ sẽ khuyến khích người chăn
ni có lợn nhiễm bệnh thực hiện đúng qui định tiêu hủy, tránh lây lan bệnh trên diện
rộng.
Qui định chôn lấp: Việc xử lý hoặc đốt xác tại các bãi chôn lấp phải được thực
hiện càng gần vùng nhiễm bệnh càng tốt để tránh vùng nhiễm bệnh càng rộng. Vệ
sinh, khử trùng tiêu độc chuồng trại chăn nuôi lợn mắc bệnh bằng thuốc diệt khuẩn.
1.3 Các phương pháp chẩn đoán ASFV

1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng
Dấu hiệu lâm sàng của bệnh dịch tả lợn Châu Phi rất giống với bệnh dịch tả lợn
cổ điển, bệnh PRRS, v.v… ở lợn. Vì vậy, trong trường hợp ghi nhận có hiện tượng lợn
bệnh và chết hàng loạt ở mọi lứa tuổi với các biểu hiện lâm sàng giống với các bệnh
khác như dịch tả lợn cổ điển, bệnh PRRS thì nghi ngờ là bệnh dịch tả lợn Châu Phi.
9


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Các trang trại trong vùng xảy ra dịch có nguy cơ bị lây nhiễm cao phải hết sức
chú ý để kịp chẩn đoán sớm, cách ly và tiêu hủy nhanh lợn nghi nhiễm bệnh nhằm hạn
chế nguy cơ lây lan sang những khu vực khác ( />1.3.2 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
1.3.2.1 Lịch sử hình thành
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis – nhà khoa
học người Mỹ phát minh năm 1985. Ý tưởng của Mullis là phát triển một quy trình mà
DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi
enzyme DNA polymerase 8.
DNA polymerase có mặt tự nhiên trong sinh vật sống, thực hiện chức năng nhân
DNA khi tế bào phân chia. Enzyme DNA polymerase làm việc bằng cách nối với sợi
DNA mạch đơn và tạo sợi DNA bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme
phản ứng nhân DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro), sợi DNA đôi bị tách
thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 oC và việc tổng hợp mạch đơi DNA sẽ nhờ hoạt
tính của enzyme DNA polymerase. Tuy nhiên quy trình PCR gốc của Mullis khơng đạt
hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase 8.
Sau này, quy trình trên được phát triển hơn bằng cách sử dụng DNA polymerase
lấy từ vi khuẩn ưa nhiệt (Thermophilic bacteria). DNA polymerase từ sinh vật này ổn
định được ở nhiệt độ cao và khi sử dụng trong quy trình PCR thì khơng bị phá vỡ khi
hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Một trong những DNA polymerase chịu
nhiệt đầu tiên được phân lập từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq
polymerase là enzyme được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR 8.

1.3.2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự
đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu
bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn
DNA này 9.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn
DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có
10


Chương 1. Tổng quan tài liệu
thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA
bằng các thao tác trên gel 9.
1.3.2.3 Thành phần phản ứng
Trình tự DNA cần nhân bản là đoạn acid nucleic đặc trưng của vi khuẩn gây
bệnh, của gen bệnh lý, của dấu ấn di truyền… mà phản ứng PCR sẽ nhân bản lên (gia
tăng số lượng) để chúng có thể được phát hiện dễ dàng 10.
Đoạn mồi (Primer) là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ
vài chục base (18 - 30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) vào đoạn
khởi đầu và kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi
đơn 10.
dNTP (deoxy nucleoside triphosphate) là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản
sao của DNA đích. Năng lượng để phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate
giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP 10.
Enzyme DNA polymerase: Taq-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt được
sử dụng đầu tiên cho phản ứng PCR. Hiện nay, một số DNA polymerase chịu nhiệt
khác cũng được sử dụng trong phản ứng PCR như Vent/deep vent DNA polymerase
(Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA
polymerase (Thermus thermophilus), UITma DNA polymerase (Thermotoga
maritime) 10.

Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: Thường chứa muối đệm Tris-HCl, KCl,
MgCl2. Trong đó, MgCl2 ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng PCR. MgCl2 cần cho hoạt
động của Taq-polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp
làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng
phản ứng qua thử nghiệm 10.
1.3.2.4 Chu trình nhiệt
Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng nhiều chu kỳ nối tiếp nhau và mỗi chu kỳ
gồm 3 giai đoạn chính:
Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành 2 mạch
đơn. Giai đoạn này nhiệt độ tăng lên từ 94 - 96 °C để tách hai sợi DNA ra. Chính 2
11


Chương 1. Tổng quan tài liệu
mạch đơn này đóng vai trị là mạch khn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới. Bước
này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA
thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được
phân tách hồn tồn và chỉ cịn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1 - 2
phút 11.
Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống cho phép mồi bắt cặp vào sợi
DNA khuôn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi
và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45 - 60 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong
giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi khơng gắn hồn tồn vào DNA mẫu, hay gắn một
cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp: 1 - 2 phút 11.
Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.
Cuối cùng, DNA-polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động
dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNApolymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài
của trình tự DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc 1000 bp/ 1 phút. Và các đoạn
DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khn để tổng hợp cho các chu kỳ

tiếp theo 11.
1.3.2.5 Phát hiện ASFV bằng phản ứng PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng để phát hiện bộ gen ASFV
trong máu, nội tạng, v.v… từ các mẫu lợn. Các đoạn DNA nhỏ sẽ được khuếch đại
bằng phản ứng PCR cho đến khi số lượng có thể phát hiện được. Tất cả các xét
nghiệm PCR cho phép phát hiện DNA virus ngay trước khi xuất hiện các biểu hiện
lâm sàng, và chẩn đốn ASF được thực hiện chỉ trong vịng vài giờ sau khi đến phịng
thí nghiệm 12.
Các phản ứng PCR thơng thường và RT-PCRs được OIE khuyến nghị trong
Hướng dẫn xét nghiệm chẩn đoán và vaccine cho động vật trên cạn là cơng cụ hữu ích
để chẩn đốn bệnh. Các quy trình RT-PCR khác đã được chứng minh là cung cấp độ
nhạy cao hơn so với các phương pháp RT-PCR do OIE quy định để phát hiện bộ gen
ASFV 12.
12