SEMINAR các kỹ THUẬT sắc ký điều CHẾ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN cứu dược LIỆU ppt _ DƯỢC LIỆU

CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỀU CHẾ
ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
DƯỢC LIỆU

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay
nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”;
/>use_id=7046916


Nội dung
• Các kỹ thuật sắc ký điều chế:
– Sắc ký lớp mỏng điều chế
– Sắc ký cột
– MPLC
– HPLC điều chế
– Sắc ký phân bố ngược dòng


SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ


Sắc ký lớp mỏng điều chế
1.
2.
3.
4.
5.

Giới thiệu chung
Nguyên tắc
Ưu – nhược điểm phương pháp

Pha tĩnh
Yêu cầu và kỹ thuật chuẩn bị mẫu sắc ký, đưa mẫu
lên cột
6. Cách thức lựa chọn dung mơi và thay đổi dung mơi
trong q trình sắc ký
7. Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả
8. Ứng dụng


Sắc ký lớp mỏng điều chế
1. Giới thiệu chung:
Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC: preparative
thin layer chromatography) là phương pháp
phân lập và tách các chất trong một lượng mẫu
lớn hơn lượng mẫu trong SKLM thơng thường
(TLC).
Có thể sử dụng lượng mẫu từ 10mg – 1g.


Sắc ký lớp mỏng điều chế
2. Nguyên tắc:
•Tương tự với SKLM phân tích
•Trong SKLM điều chế, các chất được phân
lập trên những bản mỏng lớn hơn, dày hơn,
và thường cho vệt dài hơn là những điểm
trong vùng gắn mẫu.
•Sau khi triển khai, thu hồi bằng cách cạo
lớp chất hấp phụ từ bản mỏng trong vùng
quan tâm và rửa các chất phân lập được từ
chất hấp phụ bằng những dung môi mạnh.

•Chất thu được từ lớp mỏng có thể tinh
khiết hóa thích hợp cho việc định danh và
xác định cấu


Sắc ký lớp mỏng điều chế
3. Ưu điểm – nhược điểm:
a. Ưu điểm

•Nhanh hơn và thuận tiện hơn các phương pháp
sắc ký cột cổ điển
•Khơng tốn kém, ít phức tạp hơn sắc ký lỏng
hiệu năng cao.
•Các thao tác đơn giản dễ kiểm sốt và áp dụng.
•Giảm các tiêu chuẩn ước lượng bằng sklm
phân tích
•Khả năng thu hồi các thành phần đã phân tách
từ bản mỏng
•Khả năng chạy nhiều chất chuẩn đồng thời
trong điều kiện đồng nhất
•Lượng dung mơi ít hơn


Sắc ký lớp mỏng điều chế
b. nhược điểm

• Sự phân hủy các hợp chất không bền khi
tiếp xúc với không khí và ánh sáng ở bề
mặt lớp mỏng
• Sự hiện diện của các chất không tinh

khiết trong bản mỏng hoặc những mảnh
chất hấp phụ lẫn với mẫu thu hồi.


Sắc ký lớp mỏng điều chế
4. Pha tĩnh :
•Bề dày phổ biến của lớp mỏng là 0.5 – 2.0
mm (500 2000 m)
ãKớch thc bn mng thng khong
5ì20, 10ì20, 20ì20, 20ì40, hoc ụi khi l
20ì100 cm.
ãThnh phn: dựng cỏc tiu phân mịn tăng
tính kết dính
– Bột silicagel sử dụng nhiều nhất
– Nhôm oxid, cellulose vi tinh thể, sợi cellulose, C18
pha đảo
– có thể có P254nm hoặc P366nm để giúp phát hiện
bằng sự tắt huỳnh quang.


Sắc ký lớp mỏng điều chế
5. Yêu cầu và kỹ thuật chuẩn bị mẫu, đưa mẫu lên cột:
•Trước khi tiến hành SKLM điều chế nên sử dụng SKLM
phân tích.
•Với những bản mỏng dày hơn, đĩa SKLM điều chế sẽ hút
dung mơi nhanh vào các khoang trống hơn đĩa phân tích.
Có thể thêm dung môi khi khai triển nhưng tránh khuấy
động chất lỏng trong bình.
•Theo Kirchner, Stahl, Halpaap, hỗn hợp dung môi sẽ tăng
khả năng khai triển các chất phân cực yếu hơn và cho giá trị

Rf ban đầu thấp nhưng thành phần dung môi sẽ bay hơi sau
khi khai triển với tốc độ khác nhau.
•Nếu Rf <0,1 thì cần cải tiến.
•Sau khi phân lập và tách rửa, các chất chưa được phân
tách hồn tồn có thể tiến hành lại trên bản mỏng phân tích.


Sắc ký lớp mỏng điều chế
6. Cách chọn dung môi và thay đổi dung mơi
trong q trình sắc ký:
A. Chọn dung mơi:
•Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại
•Dung mơi khơng q dễ bay hơi
B. Thay đổi dung mơi:
•Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC
tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các hợp chất
nàygiữa chất hấp phụ và dung mơi ly giải.
•Thường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng
tránh sử dụng hỗn hợp dung mơi có nhiều hơn
2cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc
thay đổi pha khi thay đổi nhiệt độ) .


Sắc ký lớp mỏng điều chế
7. Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả:
A. Phát hiện:
•Các chất hữu cơ có màu thì có thể dễ dàng nhìn
thấy bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày.
•Các chất phát quang thì có thể soi dưới uv.
•Chất phát hiện hóa học tốt nhất trong sklm điều chế

là hơi iod trong buồng kín. Nó sẽ làm rõ các vùng
màu nâu sáng hoặc tối trên nền màu vàng sáng.
•Test huỳnh quang- brom cũng phát hiện được các
liên kết chưa no và những thành phần khác.
•Phun thuốc thử.
•Những chất phóng xạ được phát hiện bằng những
dụng cụ chụp bằng tia phóng xạ.
•Tránh làm nóng các bản mỏng trong q trình sắc ký
vì có thể làm cho các chất không thể thu hồi được.


Sắc ký lớp mỏng điều chế
Thu nhận kết quả:
Với các chất nằm trong vùng được đánh dấu có thể thu được bằng cách hịa tan
trong dung mơi thích hợp, sau đó cơ đặc mẫu thường là bằng cách bốc hơi..
•Dung mơi thu hồi:
•Dung mơi dùng để phân lập chất lỏng nên có độ phân cực vừa đủ và có thể trộn
lẫn với các thành phần.
•Khơng nên sử dụng methanol vì có thể hịa tan silicagel và một số tạp chất khác.
•Acetone, ethanol, chloroform… là những sự lựa chọn tốt cho việc thu hồi các
chất.
•Tránh dùng nước vì sẽ gây khó khăn cho việc bốc hơi khi cơ đặc.
Với vùng ngồi chứa các chất quan trọng
•Cạo ra cho vào giấy lọc
•Thêm một ít nước để lấy các chất trên lớp chất mang. Để giảm sự mất silicagel
trong q trình cạo có thể phun một ít cồn để làm ẩm lớp mỏng.
•Các chất cạo ra được cho vào ống, thêm dung môi, sau đó đem cho vào máy trộn
Vortex hoặc lắc bằng tay trong vịng 5 phút.
• Các chất trong ống sẽ được để lắng hoặc đem li tâm. Gạn, lọc, hoặc dùng pipet
để thu những chất nổi trên bề mặt. Để đảm bảo rằng silicagel được loại hoàn toàn

khỏi dịch nên sử dụng loại lọc cỡ trung bình.
b.


Sắc ký lớp mỏng điều chế
8. Ứng dụng
•Chất béo: tách diglyceride, sterol tự do,
triglyceride.
•Thuốc và các dược chất:
– Tách hydrocortisone khỏi prednisolone.
– Tách papaverine, noscapine, thebaine, codeine,
morphine
– Tách các chất narcotic và barbiturate từ mơ người

•Phẩm nhuộm:
– Tách vàng OB, sudan I, sudan III, sudan II, methyl đỏ,
tím tinh thể.
– Tách chlorophyll trong lá thực vật


SẮC KÝ CỘT


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
-

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác

nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh
chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động
chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân
chủ yếu của việc tách sắc ký.


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
1. Nguyên tắc
- Mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp
phụ (thường là silica gel, nhôm Oxyt).
- Cột chứa chất hấp phụ sẽ đóng vai trị là pha tĩnh.
- Một dung mơi khai triển (pha động) di chuyển dọc
theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử mẫu thử, do
các cấu tử này có độ phân cực khác nhau, ái lực của
chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau.
- vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp phụ và bị đẩy đi
với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị
trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác
nhau.


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
2. Pha tĩnh
Silica gel (hay kieselgel của acid silicic) pha thuận:
- Là 1 chất phân cực
- Si-40, Si-60, Si80, Si-100 được dùng trong sắc ký điều
chế, Si-60 thường được sử dụng nhất
- Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề
mặt quyết định- trung tâm hấp phụ.
- Cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại được

loại bỏ bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước
rửa sạch ion clorid và lắng gạn để loại các hạt nhỏ lơ
lửng, sau đó sấy 1050Cx2 giờ. Không sấy quá lâu,
nhiệt độ vượt quá ngưỡng tránh làm mất nhóm
silanol→khả năng hấp phụ bị bất hoạt.


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
2. Pha động

Silicagel pha đảo:
- Có nhiều loại mẫu kỵ nước như các peptid,
thì sắc ký pha đảo thường là phương pháp
được lựa chọn sử dụng cột silicagel C-18.
Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon
dài thường là 18C(C-18) hay 8C(C-8) :Si-OSi- nối Carbon
- Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh khơng
phân cực , pha động phân cực.
- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ
tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→
alcol/phenol →amin→ eter/aldehyd→
cetone→hợp chất halogen→alkan


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
2. Pha tĩnh

Nhơm oxyt
- Ít được sử dụng hơn silicagel, thường được
dùng trong sắc ký hấp phụ

- Là chất hấp phụ phân cực.
- Trong sắc ký có 3 dạng nhơm oxyd: nhơm trung
tính, acid, base.Tùy vào chất cần tách mà lựa
- Hoạt tính của nhơm oxyd tùy thuộc lượng nước
nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng nước
gia tăng. Trước khi dùng cần hoạt hóa bằng
cách sấy
- Oxyd nhôm phân tách tốt các chất phân cực
yếu đến trung bình, thường dùng để phân tách
các hợp chất thơm


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
2. Pha tĩnh
Kieselguhr
- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại
là các oxyt kim loại.
- Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất
phân cực như đường, các triglycerid, các acid béo
bậc cao, cetoacid, lacton. Nhưng thường được dùng
chủ yếu làm giá mang cho pha tĩnh trong sắc ký
phân bố.


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
2. Pha tĩnh
Cellulose
- Là chất cao phân tử thiên nhiên có cơng thức
[C6H7O2(OH)3]n, dạng bột mịn, dùng khơng cần chất
kết dính.

Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử
- Rây phân tử thường dùng các chất như: dextran,
agarose hay poly-acrylamide( Sephadex, Sepharose,
Fraktogel, Bio-gel P2…)
- Tách các hợp chất thân nước.


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
3. Pha động
- Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý
đến khả năng trộn thành hỗn hợp của các dung môi.


SẮC KÝ CỘT ĐiỀU CHẾ
3. Pha động
Độ mạnh của dung môi
Snyder dựa trên giá trị thực nghiệm đưa ra bảng giá
trị độ phân cực của dung môi