Xây dựng hệ thống PCR ứng dụng trong nghiên cứu các cảm biến y sinh micro-nano

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ









ĐOÀN NGỌC SƠN








XÂY DỰNG HỆ THỐNG PCR ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU CÁC CẢM BIẾN Y SINH MICRO-NANO

LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LIỆU VÀ LINH KIỆN NANÔ














Hà Nội – 2012


x
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐOÀN NGỌC SƠN










XÂY DỰNG HỆ THỐNG PCR ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU CÁC CẢM BIẾN Y SINH MICRO-NANO


Chuyên ngành: Vật liệu và linh kiện Nanô
Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm






LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LIỆU VÀ LINH KIỆN NANÔ




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THĂNG LONG

Hà Nội – 2012



III


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I
LỜI CẢM ƠN II
MỤC LỤC III
DANH MỤC CÁC TỪ, THUẬT NGỮ VIẾT TẮT IV
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ V
MỞ ĐẦU VII
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1
1.1. Tổng quan về công nghệ y sinh 1
1.2. Tổng quan về hệ thống PCR 5
1.3. Tổng quan về hệ thống vi lƣu 8
1.4. Tổng quan về hệ thống vi lƣu PCR 11
1.4.1. Hệ thống vi lƣu PCR 11
1.4.2. Lab-on-chip và chip sinh học 12
Chƣơng 2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 15

2.1. Kỹ thuật PCR 15
2.2. Hiệu ứng nhiệt điện 19
2.3. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của Pin Peltier 26
2.4. Các hình thức truyền nhiệt 30
2.5. Các phƣơng pháp điều khiển nhiệt độ 37
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM 40
3. 1. Thiết kế hệ thống 40
3.1.1. Sơ đồ khối của hệ thống 40
3.1.2. Khối điều khiển trung tâm 40
3.1.3. Khối đo đạc nhiệt độ 41
3.1.4. Khối điều khiển công suất 42
3.1.5. Khối truyền thông, phụ trợ khác 47
3.2. Xây dựng hệ thống 47
3.2.1. Xây dựng mạch điều khiển trung tâm 47
3.2.2. Xây dựng mạch đo đạc nhiệt độ 49
3.2.3. Xây dựng mạch điểu khiển công xuất TE 50
3.2.4. Xây dựng thử nghiệm kênh vi lƣu 51
3.3. Thử nghiệm hệ thống và kết quả 56
3.3.1. Khảo sát và hiệu chuẩn khối đo đạc nhiệt độ 56
3.3.2. Khảo sát và xây dựng thuật toán điều khiển PID 57
3.3.3. Khảo sát hệ thống với kênh vi lƣu 63
3.3.4. Khảo sát mẫu DNA trên hệ thống PCR 64
Chƣơng 4. KẾT LUẬN 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66



IV

DANH MỤC CÁC TỪ, THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

ADC Analog to Digital Converter
DNA DeoxyriboNucleic Acid
MOSFET Meta Oxide Semiconductor Field-Effect Transistor
PCR Polymerase Chain Reaction
PID Proportional Integral Derivative controller
TE ThermoElectric


V


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Welcome to Biomedical Engineering 1
Hình 1.2. Các liên kết Hidrogen của hai sợi DNA bị phá vỡ ở nhiệt độ cao 6
Hình 1.3. Thành phần cơ bản để tạo nên phân tử DNA là các mononucletide 7
Hình 1.4. Hình ảnh thiết bị của hệ thống vi lưu 8
Hình 1.5. Các thiết bị vi lưu trên chip cho hệ thống phân tích DNA 11
Hình 1.6. Mô hình một biochip 12
Hình 2.1. Máy PCR với nhiều tính năng hiện đại 15
Hình 2.2. Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. 18
Hình 2.3. Sự thay đổi nhiệt độ ở hai mặt khi cung cấp dòng điện vào thiết bị. 23
Hình 2.4. Dòng điện sinh ra khi cung cấp nguồn nhiệt vào thiết bị. 23
Hình 2.5. Hiệu ứng Peltier đối với bán dẫn loại N 26
Hình 2.6. Hiệu ứng Peltier đối với bán dẫn loại P 26
Hình 2.7. Cách mắc nối tiếp các phần tử N 27
Hình 2.8. Cách nối các phần tử N-P nối tiếp 28
Hình 2.9. Cấu tạo của thiết bị TE trên thực tế 28

Hình 2.10. Các hình thức truyền nhiệt trong nhà dân dụng và công nghiệp 30
Hình 2.11. Dẫn nhiệt xảy ra trên vật liệu khi có chênh lệch nhiệt độ 31
Hình 2.12. Dẫn nhiệt trên tinh thể do lan truyền dao động nhiệt của các phân tử 32
Hình 2.13. Đáp ứng nhiệt tĩnh 38
Hình 3.1. Sơ đồ khối của hệ thống PCR 40
Hình 3.2. Sơ đồ chân của sensor nhiệt độ LM35 42
Hình 3.3. Thiết bị gia nhiệt TEC1-12706 và các thông số kĩ thuật 43
Hình 3.4. Bộ phận gia nhiệt của hệ thống PCR 44
Hình 3.5. Cấu tạo và kí hiệu của MOSFET kênh N và P 45
Hình 3.6. Cầu H sử dụng MOSFET kênh N và P 46
Hình 3.7. Sơ đồ mạch điện của IC điều khiển TE chuyên dụng của hãng TI 46
Hình 3.8. Nguồn chuyên dụng nuôi cho tất cả hệ thống PCR 47
Hình 3.9. Sơ đồ nguyên lí của mạch điều khiển trung tâm 48
Hình 3.10. Mạch điều khiển trung tâm 49
Hình 3.11. Sensor nhiệt độ được tích hợp vào kênh vi lưu PCR 49
Hình 3.12. Sơ đồ nguyên lí mạch cầu H sử dụng MOSFET 50
Hình 3.13. Mạch cầu H hoàn thiện 51
Hình 3.14. Thiết kế kênh dẫn vi lưu PCR bằng phần mềm đồ họa 53
Hình 3.15. Biểu đồ nhiệt độ và thời gian ép nhiệt tương ứng 54
Hình 3.16. Kênh vi lưu PCR được chế tạo hoàn thiện 55
Hình 3.17. Buồng gia nhiệt của hệ thống PCR 55
Hình 3.18. Đồ thị phụ thuộc của nhiệt độ và điện áp ra của sensor 56
Hình 3.19. Mô phỏng quá trình truyền nhiệt của hệ thống PCR 57
Hình 3.20. Đồ thị PV theo thời gian, ba giá trị K
p
(K
i
và K
d
là hằng số) 59

Hình 3.21. Đồ thị PV theo thời gian ứng với 3 giá trị K
i
(K
p
và K
d
không đổi) 60
Hình 3.22. Đồ thị PV theo thời gian, với 3 giá trị K
d
(K
p
and K
i
không đổi) 61
Hình 3.23. Hệ thống PCR hoàn chỉnh 63
Hình 3.24. Chu trình nhiệt chạy thử nghiệm hệ thống PCR 63


VI

Hình 3.25. Đồ thị thu được theo chu trình chạy thử hệ thống PCR 64
Hình 3.26. Sơ đồ chu trình nhiệt trong phản ứng PCR 64


VII


MỞ ĐẦU

Những thành tựu nổi bật của ngành nghiên cứu sinh học và y học trong những

năm gần đây đang mang lại cho cuộc sống nhiều ―phép màu‖, những người bị bệnh
nan y đã có cơ hội chữa trị, các bệnh di truyền được phát hiện sớm, các ngành khoa
học liên quan cũng nở rộ: tách gen, nhận dạng vân tay DNA, xác định huyết thống…
Một trong những lĩnh vực y sinh đang được nghiên cứu nhiều nhất trong những
năm gần đây là chế tạo các cảm biến y sinh micro-nano kết hợp với kỹ thuật PCR.
PCR là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA
trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống.
Xây dựng được một hệ thống PCR hoàn thiện sẽ đem lại nhiều thuận lợi cho việc
nghiên cứu cũng như chế tạo các cảm biến y sinh tạo tiền đề tốt cho các nghiên cứu
khác.


1



Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về công nghệ y sinh
Công nghệ Y - Sinh học (Biomedical Technology – Công nghệ y sinh) là một
lĩnh vực đa ngành, kết hợp những kiến thức khoa học về Kỹ thuật, Sinh học và Y học.
Đây là một ngành công nghệ có tiềm năng vô cùng lớn. Công nghệ y sinh ứng dụng
những kỹ thuật tiên tiến để phát triển các phương pháp nghiên cứu và chế tạo trang
thiết bị nhằm tìm hiểu các quá trình sinh học của con người và phục vụ an sinh cho
con người.
Công nghệ y sinh học cũng là một lĩnh vực liên ngành, ứng dụng các nguyên tắc
thiết kế, giải quyết vấn đề và kỹ thuật của các ngành như vật lý, toán học, tin học vào y
học và khoa học về sự sống để giúp cho vấn đề chăm sóc sức khỏe bệnh nhân được tốt
hơn cũng như tăng cường chất lượng sức khỏe con người.

Hình 1.1. Welcome to Biomedical Engineering

Công nghệ y sinh bao gồm các lĩnh vực nghiên cứu phát triển về thiết bị y tế
(medical instrumentation), thiết bị cảm quan sinh học (biosensors), tin học y tế
(medical informatics), cơ khí sinh học (biomechanics), kỹ thuật phục hồi
(rehabilitation engineering), quang học y tế (medical optics), kỹ thuật bệnh viện
(clinical engineering) và công nghệ sinh học (biotechnology).


2

Công nghệ y sinh đòi hỏi sự hiểu biết chuyên sâu trong các lĩnh vực khác nhau
của ngành khoa học ứng dụng và khoa học cơ bản. Những nghiên cứu và ứng dụng cụ
thể của ngành công nghệ này là:
- Cập nhật các kiến thức mới và tìm hiểu các hệ thống cơ thể sống thông qua các
nghiên cứu ứng dụng, thực nghiệm và các kỹ thuật phân tích, dựa trên cơ sở các lĩnh
vực Khoa học kỹ thuật.
- Sử dụng các kiến thức về Kỹ thuật, Y học và Sinh học, để nghiên cứu phát triển
những thiết bị, công cụ, thuật toán, quy trình và hệ thống mới, để cải tiến hoặc đưa ra
các giải pháp phân tích, chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn, chính xác hơn và an
toàn hơn.

Đôi nét về lịch sử công nghệ y – sinh
Nếu vào thế kỷ 20, vật lý là ngành khoa học trung tâm thì bước sang thế kỷ 21
mọi nghiên cứu sẽ theo hướng lấy sự sống làm trọng tâm. Nghĩa là ngành y sinh học là
tiêu điểm cho tất cả các ngành khoa học khác.
Sinh học là khoa học nghiên cứu về sự sống. Trong mấy chục năm cuối của thế
kỷ 20, sinh học đã phát triển mạnh cùng với tin học để trở thành những khoa học mũi
nhọn của loài người, không thể thiếu được trong mọi quốc gia muốn thành đạt.

Nhưng cũng do các môn khác nhau trong sinh học ngày càng đi sâu và mở rộng,
chúng tương tác và hỗ trợ nhau làm mất tính chất riêng biệt, sự hiểu biết của mỗi môn
đòi hỏi sự hiểu biết chung của cả các môn khác. Lấy ví dụ như sinh hóa học đã có một
thời là cơ sở cho mọi nghiên cứu sinh học, con người cũng như các sinh vật khác. Rồi
miễn dịch học đã thành một hướng tìm hiểu quan trọng về sự điều hòa đề kháng của cơ
thể sống đối với các tác nhân có hại cho sinh vật. Và gần đây nhất là sinh học phân tử
đi vào cấu trúc phân tử của sự sống đã trở thành một phần không thể thiếu được của
mọi ngành trong sinh học.
Như vậy, ngành y sinh học đã thành một ngành riêng có chỗ đứng rõ ràng trong
đào tạo cũng như trong lâm sàng không khác gì các ngành mà đối tượng là con người
bị bệnh như nội, ngoại, sản, nhi
Ngày xưa và cả hiện nay, ở một số nước chậm tiến, dù chưa có khái niệm đúng
đắn về ngành y sinh học, trong các bệnh viện vẫn có tổ chức một khoa xét nghiệm
gồm cả các phần về sinh hóa, huyết học, huyết thanh học, vi sinh, ký sinh trùng, nhưng
thường chúng hoạt động riêng rẽ, chủ yếu là thực hiện các kỹ thuật phát hiện theo yêu
cầu của thầy thuốc lâm sàng. Nói chung, những người làm ở bộ phận này chưa thấy
hết mối tương quan chặt chẽ giữa các môn với nhau, nhất là với lâm sàng.
Ngày nay, sự phát triển của mỗi môn không còn thể riêng biệt mà đòi hỏi một
hiểu biết chung hay một cái nền chung.


3

Hơn nữa, khoa học lâm sàng đã đạt đến một giai đoạn mà triệu chứng học đã
phát triển đến một giới hạn nếu không phải là nói quá, tột cùng rồi. Và chỉ có các môn
cơ sở mới có thể đem lại cho họ những hiểu biết, mới giúp họ thoát con đường kinh
nghiệm chủ nghĩa dẫm chân tại chỗ như y học cổ truyền đã phải trải qua. Không có
những phát minh mới của sinh học nói chung và y sinh học nói riêng thì họ không thể
nào biết được nguyên nhân gây bệnh cũng như cơ chế sinh lý bệnh sâu xa bên trong
cái biểu hiện bên ngoài mà người ta đã thấy hàng thế kỷ nay rồi.

Mặt khác, những người đem kỹ thuật sinh học ứng dụng trong y học mà không
có đôi chút hiểu biết về bệnh lý học thì cũng chỉ là những kỹ thuật viên cao cấp và làm
việc như một cái máy, không hiểu việc mình làm đúng hay sai. Như vậy làm sao để có
thể có cuộc đối thoại cần thiết và bổ ích giữa những nhà lâm sàng sát với người bệnh
với nhà y sinh học có trong tay những số liệu kết quả xét nghiệm; làm sao để có thể
khuyên nên thêm hoặc bớt một số xét nghiệm nào đó để có lợi hay tránh hại cho bệnh
nhân.
Vậy có thể định nghĩa một cách ngắn gọn, y sinh học là sinh học áp dụng vào con
người ở trạng thái bệnh để tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh cũng như cơ chế sinh bệnh.
Và tất nhiên là phải có sự phối hợp cả phần lý thuyết cũng như kỹ thuật của rất nhiều
môn có liên quan trực tiếp hay gián tiếp. Nói cụ thể hơn: "Y sinh học là sinh học áp
dụng vào việc phân tích các mẫu lấy từ máu hay từ các sản phẩm sinh học khác để
đóng góp cho quá trình chẩn đoán bệnh cũng như quá trình theo dõi việc điều trị
chúng".
Việc ứng dụng sinh học trên con người cũng vậy, đó là sự phát triển của các
ngành sinh lý, sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử nhằm tìm hiểu các hiện tượng
của sự sống ở sinh vật cao cấp nhất này. Nhưng đặc biệt khi áp dụng sâu vào các trạng
thái bệnh lý thì cần có sự bổ sung thêm những môn như huyết học, vi sinh, ký sinh
trùng để hiểu thêm những tác nhân gây bệnh.
Trước đối tượng là người bệnh, cần thiết phải tìm mọi cách áp dụng các thành
tựu kỹ thuật của sinh học vào nghiên cứu con người bị bệnh nhằm chẩn đoán và điều
trị tốt và một hệ luận tất nhiên là qua đó có thể tìm hiểu thêm về những qui luật sinh
học thấy được ở con người.
Nghiên cứu sinh vật ở trạng thái bệnh lý cũng là một biện pháp cần thiết tìm hiểu
thêm về hoạt động bình thường. Vậy y sinh học là sinh học ứng dụng trong y học hay
nói rõ hơn là trên người mang bệnh.
Từ đây sẽ hình thành nhiều giao ngành như lý sinh (BioPhysics), hoá sinh
(BioChemistry),… với mục tiêu áp dụng những khái niệm, những định luật vật lý, hóa
học để nghiên cứu sự sống, tìm ra bản chất hóa học của các quá trình sống. Từ đó giúp
chúng ta có thể hiểu rõ ràng và can thiệp được vào những quá trình này.

4

Do đó mà xã hội cần ngành kỹ thuật y sinh bên cạnh các ngành khoa học thuần
tuý khác, như y học, vật lý , sinh học, …
Vậy kỹ thuật y sinh là một ngành khoa học lấy kỹ thuật làm phương tiện, sinh
học là cơ chế, còn y học là mục đích. Nghĩa là dùng các thiết bị kỹ thuật làm phương
tiện sinh ra các tác nhân tác dụng với tổ chức sống trong cơ thể. Từ đó hình thành các
hiệu ứng sinh học mà ta có thể định tính cũng như định lượng. Qua sự nghiên cứu này
giúp con người chúng ta có thể đánh giá cũng như thay đổi các trạng thái, chức năng,
cấu trúc trong cơ thể, nghĩa là chẩn đoán và điều trị bệnh.
Cho nên ―kỹ thuật y sinh được xem là bệ phóng cho các ngành kỹ thuật khác
xâm nhập sâu hơn vào các ứng dụng y sinh‖. Trước nhu cầu tất yếu của xã hội, một
ngành kỹ thuật mới, hiện đại đã ra đời. Đó là ngành kỹ thuật y sinh – Bio Medical
Engineering.

Đôi nét về những thành tựu nổi bật của công nghệ y sinh
Công nghệ Y - Sinh học là một lĩnh vực tương đối mới mẻ, đa phần các thành tựu
đạt được chỉ mới dừng ở mức độ nghiên cứu, bao phủ nhiều lĩnh vực khác nhau: tin
sinh học, chẩn đoán hình ảnh, xử lý hình ảnh, xử lý tính hiệu sinh lý học, cơ sinh học,
vật liệu sinh học với kỹ thuật sinh học, phân tích hệ thống, mô hình hóa 3 chiều
Ví dụ cụ thể về ứng dụng của kỹ thuật y sinh là việc phát triển và sản xuất các bộ
phận giả tương thích sinh học, thiết bị y học, thiết bị chẩn đoán và các thiết bị hình ảnh
như MRI và EEG, cũng như các loại thuốc.
Ngày nay, khi mà khoa học kỹ thuật phát triển vượt bậc thì nó đã gắn liền với đời
sống con người, hiện diện trong mọi lĩnh vực, với mục đích làm cho chất lượng cuộc
sống của con người ngày một nâng cao. Và y học không phải là một ngoại lệ.
Nếu một ngày bước chân vào một bệnh viện thì bạn sẽ thấy được sự phát triển
không ngờ của khoa học. Với những thiết bị kỹ thuật mà bạn có thể đọc thấy trong

những trang sách tiểu thuyết khoa học viễn tưởng. Tiêu biểu là các thiết bị chẩn đoán
như CT, MRI, PET,SPECT…, hay thiết bị điều trị như ―dao mổ‖ điện, châm cứu bằng
laser (quang châm)… . Chắc chắn là trong số đó có nhiều thiết bị bạn mới nghe tên lần
đầu. Vì đây là những thành tựu đạt được trong thời gian gần đây dựa theo định hướng
phát triển của y học hiện đại : ứng dụng khoa học kỹ thuật tiến tiến, nhằm giúp con
người ngày càng hoàn thiện hơn các thiết bị chẩn đoán, cũng như chữa trị những căn
bệnh mà con người mắc phải.
Trên thế giới, đây là một lĩnh vực đã và đang phát triển rất mạnh mẽ. Tại Việt
Nam, trong những năm qua, sự quan tâm đến công nghệ Y - Sinh đã gia tăng đáng kể.
Đã có một số trung tâm, phòng thí nghiêm, cơ sở nghiên cứu phát triển (RD) hình


5

thành ở các thành phố như Hà Nội, Hồ Chí Minh và thu được những kết quả nghiên
cứu và ứng dụng có ý nghĩa thực tế trong đời sống.
Trong chẩn đoán, thành tựu nổi bật là các thiết bị chẩn đoán công nghệ cao
không ngừng ra đời, đổi mới, hoàn thiện hơn. Nhờ đó mà chất lượng chẩn đoán bệnh
ngày càng được nâng cao, các bệnh hiểm nghèo ngày càng được phát hiện sớm để kịp
thời chữa trị. Có thể kể đây như là X-quang, CT - chụp cắt lớp điện toán, DSA - chụp
X-quang kỹ thuật số mạch máu theo phương pháp loại trừ, MRI - chụp cộng hưởng từ,
ứng dụng hạt nhân (PET,SPECT), …
Một trong những thành tựu quan trọng trong điều trị là ứng dụng laser , với rất
nhiều phương thức điều trị nội khoa, ngoại khoa đạt được hiệu quả cao hơn cách điều
trị kinh điển. Ví dụ như châm cứu, trị liệu bằng laser, laser nội tĩnh mạch, điều trị thoát
vị đĩa đệm bằng laser chọc qua da, điều trị các tật khúc xạ mắt bằng laser Excimer
(―dao cắt lạnh‖-phi nhiệt), dao mổ laser CO2, laser bán dẫn trong phẫu thuật …
Và rất may mắn cho chúng ta là ở Việt Nam đã ứng dụng thành công các kỹ thuật
công nghệ tiên tiến kể trên tại nhiều bệnh viện, trung tâm trên toàn quốc, góp phần
nâng cao chất lượng cuộc sống con người.

1.2. Tổng quan về hệ thống PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài
sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen".
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra
nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli
hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán
những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh ra, ông đã đoạt giải
Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông
đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên
nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng
nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ
sung.
Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực
hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở
96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung
enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ.


6


Hình 1.2. Các liên kết Hidrogen của hai sợi DNA bị phá vỡ ở nhiệt độ cao

Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian,
cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy

từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110 °C.
DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi
dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA.
Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép
DNA có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ
Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực
nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá
trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai
exonuclease 3’-5’.
Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai
(cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong
chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả
độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.


7

Đôi nét về lịch sử hình thành kĩ thuật PCR
Những phát minh cơ bản mà nếu không có chúng thì sẽ không có phát minh ra
PCR:
1) Năm 1953, Watson, Crick & Wilkens công bố công trình mô tả cấu trúc
xoắn kép và đưa ra ý tưởng sao chép của phân tử DNA (giải thưởng Nobel 1962)
- DNA gồm 4 bases, liên kết với nhau bởi các phân tử đường deoxyribose và các
gốc phosphate.


Hình 1.3. Thành phần cơ bản để tạo nên phân tử DNA là các mononucletide

- Hai sợi của phân tử DNA chạy ngược chiều nhau

- Mặt phẳng của các bases nằm vuông góc với trục xoắn ốc, mặt phẳng của các
phân tử đường gần như thẳng đứng.
- Hai sợi của phân tử DNA được liên kết với nhau bởi các cầu nối hydrogen giữa
các bases: adenine-thymine; cytosine-guanine
2) Năm 1950's, Arthur Kornberg phân lập nghiên cứu enzyme DNA
polymerase từ E. coli (Pol I) và cơ chế sinh tổng hợp DNA (giải thưởng Nobel 1959).
- Tổng hợp DNA cần dNTPs.
- Muốn phát hiện được dNTPs đính vào phân tử DNA cần đánh dấu đồng vị
phóng xạ phân tử phosphate của dNTPs và kết tử DNA bằng tricloroacetic acid - TCA.
- Chọn E. coli làm đối tượng nghiên cứu vì vậy thu được một lượng lớn tế bào và
từ đó thu được một lượng lớn enzyme và nghiên cứu 1 enzyme quan trọng từ E. coli -
enzyme xúc tác sinh tổng hợp DNA - Ông đặt tên là DNA polymerase. Hiện nay là
DNA polymerase - chìa khóa mở đầu cho rất nhiều nghiên cứu sau này.
3) Năm 1969, Brock & Freeze: mô tả vi khuẩn thermus aquaticus chịu nhiệt.
4) Năm 1970, Klenow & Henningsen tạo ra mảnh Klenow bằng enzyme thủy
phân hoạt tính exonuclease đầu 5' của E. coli pol 1.


8

5) Ý tưởng của Cary Mullis và thí nghiệm của ông về phát minh PCR. (giải
thưởng Nobel năm 1993)
- Năm 1983, ông đã cân nhắc làm thế nào để sử dụng polymerase DNA với mồi
oligonucleotide để xác định một nucleotide được ở một vị trí nhất định trong một phân
tử DNA phức tạp, chẳng hạn như hệ gene của người. Trong ổ đĩa này ông đã phát
minh hay phát hiện ra phương pháp tạo bản sao DNA không giới hạn từ một bản sao
của DNA, và được gọi là phương pháp "phản ứng chuỗi polymerase (PCR)".
Sau công bố của Cary Mullis phải có những phát minh say đây thì chúng ta mới
có được PCR hoàn hảo như ngày nay:
- Năm 1984, ông đã tiến hành thí nghiệm đầu tiên thành công cùng với Klenow

Fragment.
- Năm 1988, Saiki sử dụng DNA - polymerase chịu nhiệt trong phản ứng PCR.
- Cùng năm 1988, Perkin Elmer- hãng đầu tiên sản xuất máy chu kỳ nhiệt tự
động (Thermocycle).
- Năm 1989, Lawyer và cs Taq tái tổ hợp trong E. coli.
- Năm 1990's, thập kỷ đưa PCR vào nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi (chẩn đoán,
lập bản đồ di truyền, xác định trình tự DNA, tạo đột biến DNA in vitro ).

1.3. Tổng quan về hệ thống vi lƣu
Hệ thống vi lưu là một lĩnh vực mới thú vị của khoa học và kỹ thuật cho phép
phân tích kiểm soát trên quy mô rất nhỏ và thiết bị nhỏ gọn, tiết kiệm chi phí, hiệu quả
và mạnh hơn hệ thống thông thường khác.
Vi lưu đã xuất hiện vào đầu những năm 1980 và được sử dụng trong việc phát
triển DNA chip, phòng thí nghiệm trên một công nghệ vi mạch (lab-on-chip), công
nghệ vi nhiệt.v.v…


Hình 1.4. Hình ảnh thiết bị của hệ thống vi lưu


9

Vi lưu khống chế và điều khiển dòng chất lỏng trong một không gian, một thế
tích siêu nhỏ cỡ dưới milimet (micromet, nanomet…).
Một thiết bị vi lưu có thể có một hoặc nhiều kênh với ít nhất một kích thước nhỏ
hơn 1 mm. Chất lỏng thường được sử dụng trong các thiết bị vi lưu bao gồm toàn bộ
mẫu máu, tế bào vi khuẩn, protein, DNA, hóa chất dùng cho các phản ứng sinh hóa
Việc điều khiển dòng chảy của chất lỏng ở những kích thước siêu nhỏ phụ thuộc
nhiều yếu tố khác nhau như: Sức căng bề mặt của chất lỏng, sự mất mát năng lượng,
sức cản chất lỏng…

Công nghệ vi lưu đòi hỏi sự kết hợp của các ngành Kỹ thuật, Vật lý, Hóa học,
Công nghệ vi chế tạo và Công nghệ sinh học. Công nghệ này đang từng bước trở thành
một công nghệ mũi nhọn cho phép chế tạo những vi hệ thống sử dụng vi thể tích chất
lỏng.
Những nghiên cứu trong công nghệ sinh học thường đòi hỏi một số lượng khá
lớn những trang thiết bị và phòng thí nghiệm, cụ thể là những phân tích DNA, những
nghiên cứu về các loại thuốc, những trang thiết bị thu thập thông tin về người bệnh
như film chụp X-quang, cắt lớp…
Hầu hết những quá trình nêu trên đều đòi hỏi phải khống chế và điều khiển được
dòng chảy của chất lỏng. Nhu cầu sử dụng thường xuyên và liên tục đòi hỏi những
thiết bị này phải nhỏ gọn, tiện dụng và có thế mang ra khỏi các phòng thí nghiệm.
Chính vì lẽ đó mà xu hướng ―càng nhỏ càng tốt‖ đang dần biến đổi ―thế giới lỏng‖
theo một cuộc cách mạng tương tự như cuộc cách mạng về công nghiệp điện tử khi
transistor ra đời.
Trên thực tế có rất nhiều những nghiên cứu, những ứng dụng trong công nghệ
sinh học cần phải thao tác với dòng chảy của chất lỏng trong những kênh dẫn rất nhỏ,
lĩnh vực này được gọi tên là vi lưu. Lĩnh vực này đòi hỏi sự nghiên cứu tổng hợp ba
vấn đề: nghiên cứu phương pháp mới nhằm chế tạo ra những hệ thống điều khiển chất
lỏng, nghiên cứu những phương pháp tích hợp những chức năng phức tạp của chất
lỏng vào trong một thiết bị, và nghiên cứu về cách thức, đặc điểm của chất lỏng khi nó
chảy trong những kênh dẫn siêu nhỏ.
Sự phát triển của công nghệ vi lưu đang góp phần tạo ra những phương pháp thí
nghiệm mới trong ngành sinh học cơ bản, ngành khoa học vật liệu và hóa lý.
Các hệ thống vi lưu gồm rất nhiều loại khác nhau tương ứng với nhiều ứng
dụng khác nhau như: những ứng dụng trong ngành công nghiệp in phun, trong pin
nhiên liệu lỏng, nghiên cứu hóa sinh, tổng hợp hóa chất, tách chiết DNA ra khỏi tế
bào, phân tích di truyền, phân tích PCR, bào chế thuốc.v.v…
Mọi hệ thống vi lưu đều được cấu thành từ những thành phần cơ bản như: máy
bơm, van, bộ trộn, bộ lọc, bộ chia… Trong ngành vi điện tử, kích thước của linh kiện

10

không làm ảnh hưởng đến tính năng của linh kiện, nhưng trong công nghệ vi lưu dòng
chảy trong thể tích nhỏ khác khá nhiều so với dòng chảy trong thể tích lớn hơn, điều
này có thể quan sát thấy trong thực tế đời sống. Cụ thể hơn nữa khi các thiết bị vi lỏng
điều khiển các dòng chảy trong những thể tích chỉ cỡ microlit hoặc nhỏ hơn đến cỡ
picolit thì sự khác biệt trên lại trở nên cực kỳ rõ ràng.
Những thiết bị phần cứng của các thiết bị vi lưu đòi hỏi phương pháp thiết kế và
chế tạo rất khác so với những thiết bị siêu nhỏ khác. Khi kích thước của một thiết bị
hay một hệ thống vi lưu được làm nhỏ hơn thì cách thức hoạt động của chất lỏng đột
ngột thay đổi. Những hiệu ứng không đáng kể trong quy mô lớn cũng trở nên vượt trội
hơn, rõ rệt hơn trong quy mô rất nhỏ. Đó chính là hiện tượng mao dẫn sẽ xuất hiện khi
chất lỏng chảy trong những ống có tiết diệt nhỏ hơn 1mm, nhưng hiện tượng này lại
không xuất hiện khi chất lỏng chảy trong những ống có thiết diện rất lớn.
Trong thời kỳ khủng hoảng về nhiên liệu của thế giới thì việc nghiên cứu và
phát triển ngành công nghệ vi lưu đang trở nên có ý nghĩa hơn. Các hệ thống vi lưu
thường có kích thước rất nhỏ, việc chế tạo ra chúng sử dụng ít nhiên liệu hơn, rẻ hơn
và rất dễ dàng chế tạo hàng loạt. Thêm nữa là các kênh dẫn trong thiết bị vi lưu chỉ có
thể tích vài nanolit, các mẫu thử cũng trở nên rất nhỏ, lượng thuốc thử sử dụng cũng
rất ít, do đó mà việc phân tích các kết quả thí nghiệm cũng trở nên dễ dàng hơn, tiết
kiệm nguyên liệu hơn.
Đến đây chúng ta có thể thấy được sự tương đồng giữa ngành công nghệ vi điện
tử và công nghệ vi lưu, đó là cố gắng tích hợp nhiều thiết bị, nhiều chức năng chỉ trên
một con chip. Trong tương lai chúng ta hoàn toàn có thể tin tưởng khả năng các thiết
bị nghiên cứu phân tích có thể được tích hợp trên một thiết bị cầm tay. Cũng không có
gì phải ngạc nhiên khi trong tương lai ngành công nghệ vi lưu sẽ tạo ra những bước
tiến nhảy vọt cho các ngành khoa học khác, đặc biệt là lĩnh vực y sinh.

11

1.4. Tổng quan về hệ thống vi lƣu PCR
1.4.1. Hệ thống vi lƣu PCR
Việc thu nhỏ kích thước của sinh học và hóa học trong phân tích của các thiết bị
công nghệ vi-điện-cơ-hệ thống (MEMS) đã đặt ra một ảnh hưởng quan trọng trên các
lĩnh vực như chẩn đoán y tế, phát hiện vi sinh vật và sinh học phân tích khác.
Trong số rất nhiều các thiết bị thu nhỏ phân tích, các chuỗi phản ứng polymerase
vi mạch (PCR) / microdevices được nghiên cứu rộng rãi, và do đó sự tiến bộ lớn đã
được thực hiện trên các khía cạnh của vi gia trên chip (chế tạo, liên kết và đóng dấu),
lựa chọn vật liệu bề mặt, hóa học bề mặt và kiến trúc của buồng phản ứng, xử lý mẫu
chất lỏng cần thiết, kiểm soát của ba hoặc thermocycling nhiệt độ hai bước, phát hiện
các sản phẩm khuếch đại acid nucleic, tích hợp với các đơn vị phân tích chức năng
chẳng hạn như chuẩn bị mẫu, điện mao dẫn (CE), lai tạo DNA microarray, vv…


Hình 1.5. Các thiết bị vi lưu trên chip cho hệ thống phân tích DNA

Trong đó bao gồm: (A) – phân loại, sàng lọc, phân tích các tế bài hoạt động
chống lại chất kích thích; (B) – ly giải tế bào; (C) – PCR và thu hồi DNA của kháng
thể đặc hiệu từ một ngăn riêng biệt.
Công nghệ vi lưu sẽ đại diện cho một công nghệ trung tâm trong nhiều hệ thống
thu nhỏ được sử dụng cho hóa học, sinh học và y tế ứng dụng, có tiến bộ hứa hẹn cách
mạng hóa nhiều quá trình phát hiện các mầm bệnh hoặc chất gây ô nhiễm môi trường.
Trong số các microfluidics, các dụng cụ PCR thu nhỏ (hay gọi là PCR
microfluidics) đã trở thành một công cụ rất quan trọng. Quá trình PCR được sử dụng


12

rộng rãi như một công cụ sinh học phân tử để tái tạo ADN, và có thể tạo ra các bản sao
của đoạn cụ thể của DNA qua các chu trình nhiệt.
Mỗi một chu kỳ nhiệt độ có thể tăng gấp đôi DNA, và như vậy 20-35 chu kỳ có
thể tạo ra hàng triệu bản DNA. Tuy nhiên, dụng cụ PCR thông thường, để phân tích
PCR hoàn chỉnh cần khoảng 1-2 h. Tất cả các loại công nghệ PCR vi lỏng đã tạo điều
kiện khuếch đại DNA với tỷ lệ nhanh hơn nhiều đó là kết quả tốc độ truyền nhiệt lớn
hơn.
Việc ứng dụng các thiết bị thu nhỏ của PCR đạt được nhiều cải tiến, chủ yếu bao
gồm giảm chi phí chế tạo và sử dụng; tiết kiệm được thời gian khuếch đại DNA; lượng
mẫu tiêu thụ ít; giảm việc sinh ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu khác; tăng tính di
động và hội nhập của các thiết bị PCR. Ngoài ra, thực hiện được một số lượng lớn các
phân tích khuếch đại song song trên cùng một chip vi lưu PCR.
1.4.2. Lab-on-chip và chip sinh học
Lab-on-chip
Đây là thuật ngữ chỉ nhiều phép phân tích xử lý mẫu DNA, tiến hành song song
và được thực hiện trên cùng một chip.
Về cơ bản: chip DNA là các sensor DNA thu nhỏ, có thể phân tích đồng thời
nhiều thông số (massive parallel analysis) tức thời và song song.

Hình 1.6. Mô hình một biochip


13

Chip sinh học
Một thiết bị siêu nhỏ, chứa các đoạn DNA hoặc các vật liệu sinh học khác
(protein, tế bào) cho phép thực hiện song song hàng chục nghìn phản ứng phân tử trên
cùng một miếng vật liệu có diện tích khoảng 1cm.
Cấu trúc
Thiết bị thu nhỏ gồm một bề mặt chất rắn (đế) có cấu trúc & thành phần hóa học

xác định, trên đó được gắn các mẫu dò DNA (probe) là các sợi đơn (single strand)
bằng các liên kết hoá học (cộng hóa trị) hoặc vật lý (hấp phụ, đơn phân tự lắp ráp -
Self Asembly Monolayer - SAM). Đây là phần thụ thể sinh học của chip DNA (còn
được gọi là DNA probe arrays).
Các mẫu dò DNA
Gene hoặc một trình tự xác định ngắn và với số lượng từ hàng trăm đến hàng
nghìn tùy thuộc vào mục đích sử dụng của chip và là thông số quyết định độ phức tạp
(complexity) của chip.
Nguyên lý hoạt động
Dựa trên khả năng nhận dạng (sensing) chọn lọc và tức thời các DNA đích
(target) khi các DNA mẫu dò và đích kết hợp với nhau tạo thành sợi kép nhờ sự ghép
cặp bổ sung giữa các base A, T, G, C trong quá trình lai phân tử:
– A-T và G-C.
– Nếu phân tử DNA đích liên kết với mẫu dò có trình tự là ATCGGC thì có thể
suy ra trình tự bổ sung của phân tử DNA đích này.
– RNA cũng tuân theo nguyên tắc ghép cặp base nghiêm ngặt khi kết hợp với
DNA.
– Do vậy rất dễ dàng suy luận trình tự của bất kỳ sợi RNA nào bắt cặp với DNA
trên microarray.
Ư
Ư
u
u


đ
đ
i
i
ể

ể
m
m
:
:


 Thể tích nhỏ (vài µl) để phân tích
 Phân tích đồng thời (arrays) => hiệu suất cao
 Giảm thời gian cho 1 mẫu phân tích
 Tăng độ chính xác
 Dễ dàng lặp lại
Tại sao chip có thể thực hiện đồng thời hàng loạt phản ứng trong một thí nghiệm
dưới những điều kiện gần như nhau?


14

Câu trả lời là mỗi loại mẫu dò được định vị ở một vị trí cố định trên đế của chip
& các phân tử DNA hay RNA đưa lên bề mặt array đã đánh dấu (ví dụ, bằng huỳnh
quang) có thể được phát hiện trên máy quét. Khi chip được quét thì máy tính sẽ
chuyển số liệu thô sang kết quả có thể đọc được.
Chip Protein
Lai các protein trên bề mặt chip
• Sử dụng kỹ thuật di truyền để xử lý các protein nhằm đính lên bề mặt. Đối với
các protein tái tổ hợp, cách thích hợp nhất là gắn các đuôi vào đầu N hoặc C. His-tag
có thể được sử dụng để lai các protein có đính Ni
2+
trên bề mặt chip
• Phương pháp khác liên quan đến đầu N là gắn serine hay threonine vào trình tự

protein tạo cơ sở để gắn đặc hiệu vị trí với poly ethylene glycol. Các đuôi khác như
protein đặc hiệu biotin cũng đã đợc sử dụng để lai và cho kết quả tốt.
• Đối với các protein không tái tổ hợp, các phương pháp khác để lai có định
hướng dựa trên các nhóm chức năng sẵn có trong protein. Đại đa số phương pháp
được xây dựng cho các kháng thể đơn dòng và được thiết kế nhằm đảm bảo các vị trí
đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể hướng ra khỏi bề mặt chip.
Ứng dụng của Biochip
Các lĩnh vực chính sử dụng công nghệ chip DNA là nghiên cứu kiểu gen, phát
hiện đa hình nucleotide đơn, phân tích sự biểu hiện gen, đột biến… Chip DNA được
ứng dụng trực tiếp trong các ngành y - dược để tìm kiếm dược phẩm, xác định độ an
toàn của thực phẩm & môi trường, trong quân sự để phát hiện vũ khí sinh học…
Hướng ứng dụng về kiểu gen: Kỹ thuật MicroArray có thể cho biết, nguyên nhân
lây nhiễm chính xác của bệnh nhân có triệu chứng giống cúm (như đau đầu, sốt cao và
khó thở). Bề mặt của MicroArray có thể được gắn các DNA đại diện cho các gen chỉ
xuất hiện trong những tác nhân gây bệnh chọn lọc và phòng thí nghiệm y học có thể
tách chiết và đánh dấu DNA từ mẫu mô lây nhiễm (ví dụ, từ dịch mũi của bệnh nhân).
Sự kết hợp giữa DNA của bệnh nhân với một số trình tự gen trên chip có thể cho biết
đâu là tác nhân gây bệnh. Tương tự, hiện nay nhiều chip đang được thiết kế nhằm xác
định các loại vi khuẩn than đặc biệt dùng trong khủng bố sinh học hay các mầm bệnh
khác xâm nhập vào cộng đồng.
Nghiên cứu sự biểu hiện gene: trên cơ sở xác định lượng mRNA có trong mẫu
mô. Các chip xác định trực tiếp lượng protein mặc dù rất phức tạp cũng đang được
nghiên cứu thiết kế. Các nhà sinh học tế bào thường sử dụng loại array này để thu thập
các thông tin về những protein chiếm ưu thế sau khi mô chịu tác động bởi những điều
kiện khác nhau.


15

Chƣơng 2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.1. Kỹ thuật PCR
Thực nghiệm PCR
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần.
Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen.
Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể
lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi
đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base.
Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thước lên đến 40kb ít hơn
nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa
hơn 3 tỉ cặp base.
Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đó
là:
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.
- Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.
- Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng
DNA mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA.
- Polymerase.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm
nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng.

Hình 2.1. Máy PCR với nhiều tính năng hiện đại


16

Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR
cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một
lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng
2500 USD.
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn
ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường
là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của
sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm
bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những
điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp
của sợi DNA mới.
Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA
trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR—được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi
bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu.
Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều
vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị
giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80 °C sẽ
gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt
nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75 °C.
Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn mồi
này là hỗn hợp tương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể thuận tiện nếu có
cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có thể là
tương tự nhưng không giống nhau.
Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên
chuỗi protein. Như nhiều codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường rất khó để
suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit
amin isoleucine có thể là ―ATH‖, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với
adenine, thymine, hay cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về codons) Sử dụng
đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn
đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR.

Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào sản xuất
sản lượng:
- Hàm lượng GC nên trong khoảng 40-60%.
- Tính toán nhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác
quá 50 °C và nhiệt biến tính của sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10 °C.
- Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóng chảy 50 °C. Tuy nhiên, nên
chọn lựa theo kinh nghiệm cho từng trường hợp cụ thể.


17

Tóm tắt quy trình PCR
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
(1) Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra:
Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu
kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và
mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.
Thời gian: 1-2 phút
(2) Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn
vào sợi DNA đơn:
Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và
thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45-60 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai
đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một
cách tùy tiện.
Thời gian: 1-2 phút.
(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và
hoạt động dọc theo sợi DNA:
Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase.
Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh
DNA cần khuếch đại theo quy tắc 1000bp/ 1 phút.

18


Hình 2.2. Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ.

(1) Nóng chảy ở 96°C.
(2) Gắn mồi ở 68°C.
(3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase).
(4) Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu
trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ).
Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có
phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực riêng biệt. Ở giai
đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử
dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng
trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này.