Nghiên cứu tinh sạch chondroitin sulfate bằng phương pháp hóa học và hóa lý

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ LỆ VIÊN

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CHONDROITIN SULFATE
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC VÀ HĨA LÝ

Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm
Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2018


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: GS. TS. Đống Thị Anh Đào

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Lê Ngọc Liễu

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Nguyễn Hoài Hƣơng

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. HCM
Thời gian: Ngày 17 tháng 07 năm 2018.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch Hội đồng
2. Phản biện 1
3. Phản biện 2
4. Ủy viên

5. Ủy viên

: PGS.TS Lê Nguyễn Đoan Duy
: TS. Lê Ngọc Liễu
: TS. Nguyễn Hoài Hƣơng
: TS. Trần Thị Thu Trà
: TS. Trần Thị Ngọc Yên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau
khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA
KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên

: Nguyễn Thị Lệ Viên

Ngày, tháng, năm sinh : 01/07/1994
Chuyên ngành
: Công nghệ thực phẩm

MSHV

: 1770308

Nơi sinh
Mã số

: Phú Yên
: 60540101

I. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tinh sạch Chondroitin Sulfate bằng phƣơng pháp hóa
học và hóa lý
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
˗

Tổng quan tài liệu về Chondroitin Sulfate, nguyên liệu sụn ức gà; phƣơng pháp
siêu âm, enzyme dùng trong việc thủy phân để thu nhận dung dịch Chondroitin
Sulfate thô; phƣơng pháp lọc màng và hóa học để tinh sạch.

˗

Phân tích một số thành phần hóa học cơ bản của sụn ức gà.

˗

Khảo sát các phƣơng pháp xử lý nguyên liệu sụn: hóa học (NaOH), sinh học
(enzyme Alcalase), vật lý (chần).

˗

Thiết lập quy trình cơng nghệ trích ly, khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến thu nhận
dung dịch Chondroitin Sulfate thô từ sụn ức gà bằng phƣơng pháp vật lý (sóng
siêu âm) và sinh học (chế phẩm enzyme: Alcalase).

˗

Tối ƣu hóa q trình thu nhận dung dịch Chondroitin Sulfate thơ.

˗

Thiết lập quy trình cơng nghệ, khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tinh
sạch Chondroitin Sulfate bằng phƣơng pháp lọc màng và hóa học.

˗

Tối ƣu hóa q trình tinh sạch Chondroitin Sulfate.

˗

Đánh giá chất lƣợng bột CS sau khi tinh sạch bằng các phƣơng pháp: HPLC, GPC,
SEM, FTIR.


III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

15/01/2018

IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

01/07/2018

V. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN:

GS. TS. Đống Thị Anh Đào

Tp. HCM, ngày 01 tháng 07 năm 2018
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu khoa học này, lời đầu tiên tôi xin chân
thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trƣờng Đại học
Bách khoa TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn các quý thầy cô của Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã
truyền đạt những kiến thức bổ ích và giải đáp những thắc mắc trong suốt thời gian học.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn và tri ân sâu sắc đến cô GS.TS Đống Thị Anh Đào
đã giao cho tôi đề tài này, chỉ dẫn tận tình, định hƣớng rõ ràng để tìm ra phƣơng pháp
giải quyết vấn đề một cách khoa học và hiệu quả nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn cơ Nguyễn Thị Ngun – Quản lý phịng thí nghiệm
B10 đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để tơi có thể tiến hành thí
nghiệm luận văn.

Bên cạnh đó, tơi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên cao học, các em
sinh viên K13 đã gắn bó và giúp đỡ tơi rất nhiều.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, cùng bạn bè đã hỗ trợ, khích lệ tinh
thần và bên cạnh tơi những lúc khó khăn nhất.
Kính chúc sức khỏe đến các q thầy cơ, gia đình và bạn bè.
Trân trọng cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 07 năm 2018
Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Lệ Viên


TÓM TẮT
Glycosaminoglycans (GAGs) là một hợp chất hữu cơ thuộc nhóm
mucopolysaccharide, tham gia vào hoạt động cấu tạo mơ sụn, có thể đƣợc thu nhận từ mơ
sụn động vật nhƣ sụn cá mập, sụn gà, cá nhám… Trong GAGs chứa lƣợng lớn
Chondroitin sulfate (CS) có tác dụng phịng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về khớp. Do
đó việc trích ly và thu nhận CS từ nguồn phụ phẩm của ngành công nghiệp giết mổ gia
súc, gia cầm là cần thiết nhằm thay thế hàng ngoại nhập. Sau khi xử lý sụn gà bằng dung
dịch NaOH 0,05M ở 30oC trong vòng 1 giờ, tiến hành thủy phân sụn ức gà bằng enzyme
Alcalase ở pH = 7,5; hàm lƣợng enzyme/cơ chất = 3,58 % w/wpro; nhiệt độ = 55oC; thời
gian = 198 phút thì hiệu suất thu hồi GAGs cao nhất đạt đƣợc là 22,02% so với chất khô
nguyên liệu. Sau đó tiến hành q trình tinh sạch bằng phƣơng pháp hóa học: nồng độ
CPC = 1,4% (w/wdd); nồng độ NaCl = 2,57M, nồng độ KSCN = 1,5% (w/wdd) thì hiệu
suất thu hồi CS đạt đƣợc 22,68% (so với chất khô nguyên liệu ban đầu). Mẫu sau khi sấy
phun, phân tích các thành phần theo phƣơng pháp HPLC: hàm ẩm đạt 8,47%, protein đạt
2,2%, hàm lƣợng tro đạt 22% và độ tinh sạch mẫu đạt 97,8%. Các kết quả trên cũng phù
hợp với điều kiện tiêu chuẩn của USP – 39. Bên cạnh đó, mẫu sản phẩm cũng đƣợc tiến
hành xác định KLPT bằng phƣơng pháp GPC: 157000 Da, kết quả chạy FTIR cũng chỉ ra
rằng mẫu CS thu đƣợc có độ tƣơng đồng 97,94% so với mẫu chuẩn CS4.

Từ khóa: Glycosaminoglycans,Chondroitin sulfate, sụn ức gà, thủy phân.


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân trong suốt thời
gian tiến hành thí nghiệm. Các kết quả nghiên cứu và kết luận trong bài luận văn này là
trung thực, không sao chép từ bất cứ nguồn nào và dƣới bất kỳ hình thức nào.
Việc tham khảo các tài liệu liên quan đã đƣợc trích dẫn nguồn cụ thể và rõ ràng
theo đúng u cầu trích dẫn tài liệu tham khảo.
Tơi xin cam đoan!
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lệ Viên


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1.1

Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................. 1

1.3

Phạm vi nghiên cứu................................................................................................ 2

1.4

Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2

1.5

Ứng dụng................................................................................................................ 2

Chƣơng 2: Tổng quan .......................................................................................................... 4
2.1

Tổng quan về Chondroitin sulfate.......................................................................... 4

2.1.1

Đặc điểm và cấu trúc của CS .......................................................................... 4

2.1.2

Phân loại CS .................................................................................................... 5

2.1.3

Nguồn gốc ....................................................................................................... 6

2.1.4

Ứng dụng của CS ............................................................................................ 8

2.1.5

Thu nhận và định lƣợng Chondroitin sulfate ................................................ 12

2.1.6

Các nghiên cứu về CS ................................................................................... 14

2.2

Sụn ức gà .............................................................................................................. 15

2.3

Chăn ni ở Việt Nam ......................................................................................... 16

2.3.1

Tình hình chăn ni ...................................................................................... 16

2.3.2

Tình hình tiêu thụ thịt gà ở Việt Nam ........................................................... 17

2.3.3

Phụ phẩm từ chế biến gà thịt ......................................................................... 18

2.4

Tổng quan về phƣơng pháp thu nhận CS thô....................................................... 18

2.4.1

Ứng dụng của sóng siêu âm thu nhận CS thơ ............................................... 18

2.4.2

Ứng dụng của hệ enzyme protease để thu nhận CS thô ................................ 20

2.5

Tổng quan phƣơng pháp tinh sạch từ dung dịch CS thô ...................................... 23

2.5.1

Ứng dụng phƣơng pháp lọc màng để tinh sạch CS ....................................... 23

Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 33
3.1

Nguyên liệu .......................................................................................................... 33

3.1.1

Sụn ức gà ....................................................................................................... 33


3.1.2
3.2

Chế phẩm enzyme Alcalase .......................................................................... 33

Hóa chất và thiết bị .............................................................................................. 34

3.2.1

Hóa chất phân tích ......................................................................................... 34

3.2.2

Thiết bị .......................................................................................................... 34

3.2.3

Dụng cụ ......................................................................................................... 35

3.3

Sơ đồ nghiên cứu thu nhận CS............................................................................. 35

3.3.1

Sơ đồ nghiên cứu thu nhận CS thô ................................................................ 36

3.3.2

Sơ đồ nghiên cứu thu nhận CS tinh sạch ...................................................... 37

3.4

Quy trình thu nhận CS ......................................................................................... 38

3.4.1

Quy trình thu nhận CS thơ ............................................................................ 38

3.4.2

Quy trình thu nhận CS tinh sạch ................................................................... 42

3.4.3

Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................... 44

3.4.4

Phƣơng pháp xử lí số liệu.............................................................................. 55

3.4.5

Các phƣơng pháp phân tích và cơng thức tính tốn ...................................... 55

Chƣơng 4: Kết quả và bàn luận ......................................................................................... 59
4.1

Thành phần cơ bản của sụn ức gà ........................................................................ 59

4.2

Khảo sát các quá trình xử lý sụn ức gà ................................................................ 60

4.2.1

Xử lí sụn ức gà bằng dung dịch NaOH ......................................................... 60

4.2.2

Xử lí sụn ức gà bằng chế phẩm enzyme........................................................ 62

4.2.3

Xử lí sụn ức gà bằng q trình nhiệt ............................................................. 64

4.3

Kết quả và bàn luận phƣơng pháp thu nhận CS thơ ............................................ 65

4.3.1

Phƣơng pháp sử dụng sóng siêu âm .............................................................. 65

4.3.2

Ứng dụng thủy phân sụn ức gà bằng enzyme Alcalase ................................ 70

4.4

Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân bằng chế phẩm enzyme Alcalase ...................... 77

4.5

Xác định các thành phần nguyên liệu bột CS thô ................................................ 82

4.6

Kết quả và bàn luận phƣơng pháp tinh sạch CS .................................................. 83

4.6.1

Phƣơng pháp lọc màng qui mơ PTN ............................................................. 83

4.6.2

Tinh sạch bằng phƣơng pháp hóa học ........................................................... 98

4.7

Tối ƣu hóa q trình tinh sạch ........................................................................... 104


4.8

Đánh giá chế phẩm CS thu đƣợc sau tinh sạch bằng phƣơng pháp hóa học ..... 111

4.8.1

Kết quả phân tích hàm lƣợng mẫu CS thu đƣợc sau tinh sạch ................... 111

4.8.2

Cấu trúc bề mặt của Chondroitin sulfate ..................................................... 112

4.8.3

Kết quả đo KLPT bằng GPC ....................................................................... 112

4.8.4

Kết quả chạy FTIR ...................................................................................... 113

Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 114
5.1

Kết luận .............................................................................................................. 114

5.1.1

Về mặt khoa học .......................................................................................... 114

5.1.2

Về mặt ứng dụng ......................................................................................... 114

5.2

Đề nghị ............................................................................................................... 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 116
PHỤ LỤC ...............................................................................................................................

A.

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................................................................ 121

B.

CÁC GIÁ TRỊ PHÂN TÍCH THỰC NGHIỆM ................................................ 134

C.

CÁC BẢNG THỐNG KÊ ................................................................................. 162


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của CS ..................................................................................... 4
Hình 2.2: Cấu tạo hóa học của CS ....................................................................................... 5
Hình 2.3: Các đồng phân của CS......................................................................................... 6
Hình 2.4: Một số nguồn nguyên liệu thu nhận CS .............................................................. 7
Hình 2.5: Một số sản phẩm chứa bột CS ............................................................................. 8
Hình 2.6: Mơ phỏng cấu tạo khớp ....................................................................................... 8
Hình 2.7: Cấu trúc của proteoglycan ................................................................................... 9
Hình 2.8: Sụn ức gà: khi cịn mô và mỡ (a) và sau khi đƣợc làm sạch (b). ...................... 15
Hình 2.9: Biểu đồ ƣớc tính sản lƣợng chăn ni gia cầm qua các năm ............................ 16
Hình 2.10: Tình hình tiêu thụ thịt gà (năm 1997 – 2015) ................................................. 17
Hình 2.11: Bột thịt xƣơng (a) và bột lơng vũ (b) .............................................................. 18
Hình 2.12: Nguyên lý tạo và vỡ bọt khí ............................................................................ 19
Hình 2.13: Sơ đồ phân loại protease .................................................................................. 21
Hình 2.14: Cơ chế xúc tác của protease ............................................................................ 22
Hình 2.15: Sơ đồ mơ tả q trình phân riêng bằng màng .................................................. 24
Hình 2.16: Định nghĩa các đại lƣợng quan trọng trong đặc trƣng các loại màng ............. 25

Hình 2.17: Sơ đồ phân loại cấu tạo màng.......................................................................... 27
Hình 2.18: Phân loại các công nghệ màng tiến hành nhờ chênh lệch áp suất ................... 28
Hình 2.19: Vị trí lọc nano tính trên áp suất làm việc và lọc phân riêng. ........................... 30
Hình 3.1: Quy trình thu nhận bột CS thơ........................................................................... 38
Hình 3.2: Quy trình thu nhận CS tinh sạch ....................................................................... 42
Hình 4.1: Sụn gà chƣa xử lí (a) và xử lí màng thịt bên ngồi (b) ...................................... 59
Hình 4.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian xử lý NaOH đến hàm lƣợng thất thốt
GAGs ................................................................................................................................. 60
Hình 4.3: Ảnh hƣởng quá trình xử lý sụn của enzyme đến hàm lƣợng CS thất thốt ...... 62
Hình 4.4: Ảnh hƣởng của q trình chần đến hiệu suất thất thốt GAGs ......................... 64
Hình 4.5: Ảnh hƣởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung dịch (w/v) đến hiệu suất thu hồi GAGs66
Hình 4.6 : Ảnh hƣởng của pH huyền phù đến hiệu suất thu hồi GAGs ............................ 67
Hình 4.7: Ảnh hƣởng của nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs ......................... 68
Hình 4.8: Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs ........................ 69
Hình 4.9: Ảnh hƣởng của tỉ lệ sụn: đệm đến hiệu suất thu hồi GAGs .............................. 71
Hình 4.10: Ảnh hƣởng của pH dung dịch đệm đến hiệu suất thu hồi GAGs .................... 72
Hình 4.11: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi GAGs..................................... 74
Hình 4.12: Ảnh hƣởng hàm lƣợng enzyme Alcalase/cơ chất đến hiệu suất thu hồi GAGs
........................................................................................................................................... 75
Hình 4.13: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs .................. 76


Hình 4.14: Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs thơ ... 81
Hình 4.15: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân đến hiệu
suất thu hồi GAGs thô ....................................................................................................... 81
Hình 4.16: Độ phân riêng carbohydrate và protein của các loại màng ............................. 84
Hình 4.17: Thơng lƣợng dịng qua các loại màng ............................................................. 85
Hình 4.18: Trở lực màng theo áp suất của các loại màng ................................................. 86
Hình 4.19: Trở lực màng (m-1) .......................................................................................... 86
Hình 4.20: Độ phân riêng của carbohydrate khi thay đổi áp suất vận hành...................... 88

Hình 4.21: Độ phân riêng cấu tử protein khi thay đổi áp suất vận hành ........................... 88
Hình 4.22: Thơng lƣợng dịng qua màng ở các điều kiện áp suất khác nhau.................... 89
Hình 4.23: Trở lực tổng qua các loại màng (m-1) .............................................................. 90
Hình 4.24: Độ phân riêng carbohydrate khi thay đổi thời gian lọc màng ......................... 92
Hình 4.25: Độ phân riêng protein khi thay đổi thời gian lọc màng................................... 92
Hình 4.26: Thơng lƣợng dịng qua màng theo thời gian ................................................... 93
Hình 4.27:Đƣờng chuẩn thơng lƣợng dịng qua các loại màng theo áp suất .................... 94
Hình 4.28: Trở lực các loại màng ...................................................................................... 95
Hình 4.29: Tỉ lệ loại bỏ protein qua màng PS10 và PS20 ................................................. 96
Hình 4.30: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của CS theo thời gian lọc ........................... 96
Hình 4.31: Thơng lƣợng dịng qua màng theo hệ số cơ đặc .............................................. 97
Hình 4.32: Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng CS thu hồi ............................................... 99
Hình 4.33: Ảnh hƣởng của nồng độ CPC đến hiệu suất thu hồi ..................................... 100
Hình 4.34: Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến hàm lƣợng CS thu hồi ............................ 102
Hình 4.35: Ảnh hƣởng của nồng độ KSCN đến hàm lƣợng CS thu hồi ......................... 103
Hình 4.36: Ảnh hƣởng của pH và nồng độ CPC đến hiệu suất thu hồi CS ..................... 109
Hình 4.37: Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl và KSCN đến hàm lƣợng CS thu hồi ........... 109
Hình 4.38: Sắc kí đồ mẫu CS tinh sạch ........................................................................... 111
Hình 4.39: Cấu trúc bề mặt CS chuẩn, bột CS thơ và CS tinh sạch ................................ 112
Hình 4.40: Sắc kí đồ KLPT của CS chuẩn và mẫu CS tinh sạch .................................... 112
Hình 4.41: Kết quả sác kí đồ FTIR của mẫu CS chuẩn và CS tinh sạch......................... 113


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Bảng phân loại CS .............................................................................................. 6
Bảng 2.2: Lƣợng thịt gà nhập khẩu vào Việt Nam năm 2012 – 2015 [1]. ........................ 17
Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng............................................................................................... 34
Bảng 3.2: Bảng quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, bốn yếu tố ảnh hƣởng ............. 49
Bảng 4.1: Các thành phần hóa học trong sụn ức gà .......................................................... 59
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian xử lý NaOH đến hàm lƣợng thất thoát

GAGs ................................................................................................................................. 60
Bảng 4.3: Giá trị ảnh hƣởng quá trình xử lý sụn của enzyme đến hàm lƣợng CS thất thoát
........................................................................................................................................... 62
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của quá trình chần đến hiệu suất thất thoát GAGs ........................ 64
Bảng 4.5: Các yếu tố cố định khi khảo sát tỉ lệ nguyên liệu sụn: dung dịch đệm ............. 70
Bảng 4.6: Các yếu tố cố định khi khảo sát pH của quá trình thủy phân enzyme .............. 72
Bảng 4.7: Các yếu tố cố định khi khảo sát nhiệt độ của quá trình thủy phân ................... 73
Bảng 4.8: Các yếu tố cố định khi khảo sát hàm lƣợng enzyme/cơ chất của quá trình thủy
phân ................................................................................................................................... 75
Bảng 4.9: Các yếu tố cố định khi khảo sát thời gian thủy phân bằng chế phẩm enzyme . 76
Bảng 4.10: Các mức yếu tố thí nghiệm tối ƣu hóa trong bài tốn tối ƣu hóa các yếu tố pH,
nhiệt độ, hàm lƣợng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs
thô (%) của lần lƣợt các enzyme. ...................................................................................... 77
Bảng 4.11: Kết quả hiệu suất thu hồi GAGs thô (%) theo các yếu tố pH, nhiệt độ, hàm
lƣợng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân khi tiến hành thí nghiệm theo quy hoạch
thực nghiệm. ...................................................................................................................... 78
Bảng 4.12: Hệ số phƣơng trình hồi quy và độ tin cậy của các hệ số tƣơng ứng với các yếu
tố của quá trình thủy phân ................................................................................................. 79
Bảng 4.13: Hệ số Lack of Fit của quá trình thủy phân ...................................................... 80
Bảng 4.14: Kết quả hiệu suất thu hồi GAGs (%) từ phƣơng trình hồi quy và thực nghiệm
........................................................................................................................................... 82
Bảng 4.15: Thành phần nguyên liệu chế phẩm thô ........................................................... 82
Bảng 4.16: Hệ số tách protein so với chondroitin Sulfate ứng với từng loại màng khác
nhau. .................................................................................................................................. 85
Bảng 4.17: Bảng giá trị trở lực màng của các loại màng ................................................. 86
Bảng 4.18: Hệ số tách protein so với carbohydrate ở các áp suất vận hành khác nhau. ... 89
Bảng 4.19: Bảng giá trị của trở lực tổng qua các loại màng ............................................. 90
Bảng 4.20: Hệ số tách protein/carbohydrate ở các chế độ thời gian lọc màng khác nhau 93
Bảng 4.21: Các giá trị của trở lực qua các loại màng ........................................................ 94

Bảng 4.22: Dự đoán cơ chế gây tắc nghẽn của màng PS20 và các giá trị i; k của phƣơng
trình Hermia ....................................................................................................................... 97
Bảng 4.23: Các mức yếu tố thí nghiệm tối ƣu hóa trong bài tốn tối ƣu hóa các yếu tố pH,
nồng độ CPC, NaCl, KSCN đến quá trình tinh sạch CS ................................................. 104
Bảng 4.24: Quy hoạch thực nghiệm. ............................................................................... 105
Bảng 4.25: Hệ số phƣơng trình hồi quy và độ tin cậy của các hệ số tƣơng ứng với các yếu
tố của quá trình tinh sạch ................................................................................................. 106
Bảng 4.26: Hệ số Lack of Fit của quá trình thủy phân .................................................... 108
Bảng 4.27: Kết quả hiệu suất thu hồi CS tinh sạch (%) từ phƣơng trình hồi quy và thực
nghiệm ............................................................................................................................. 110
Bảng 4.28: Kết quả phân tích hàm lƣợng CS sau tinh sạch bằng HPLC ........................ 111
Bảng 4.29: Kết quả Mw, Mn, PI của sản phẩm CS chuẩn và CS tinh sạch .................... 112


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CS

Chondroitin sulfate

DMMB

1,9-Dimethylmethylen Blue

DS

Dermatan sulfate

GAGs

Glycosaminoglycans

GalNAc

N-acetyl-galactosamine

GlcA

D-acid glucuronic

GPC

Gel permeation chromatography

HA

Hyaluronan hay acid hyaluronic

E/S

Enzyme/Cơ chất

HGAGs

Hiệu suất thu hồi glycosaminoglycans

HCS

Hiệu suất thu hồi CS

HPLC

High performance liquid chromatography

KS

Keratan sulfate

OD

Optical Density

TCA

Acid trichloroacetic

CPC

N - cetylpyridinium Chloride

KSCN

Potassium thiocyanate

PS20

Polysulfone 20

PS10

Polysulfone 10

NF

Nanofiltration

PI

Chỉ số phân tán

Mn

number – average molecular weight


Mw

weight – average molecular weight

KLPT

Khối lƣợng phân tử

FTIR

Fourier – transform infrared spectroscopy

SEM

Scanning Electron Microscope

1

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Tình hình chăn ni gia cầm, đặc biệt là chăn nuôi gà ở Việt Nam phát triển nhanh
chóng trong những năm qua. Năm 2005 lƣợng tiêu thụ là 322 ngàn tấn đến năm 2015 tiêu
thụ 862 ngàn tấn, sau 10 năm lƣợng tiêu thụ tăng đến 267,7%. Năm 2016, đàn gia cầm cả
nƣớc đạt 356,72 triệu con và cuối năm 2017 có 385,46 triệu con. Theo nhƣ kế hoạch phát
triển của cục chăn nuôi, đến năm 2020, số lƣợng đàn gia cầm ƣớc tính khoảng 397,9 triệu
con.
Do đó sau q trình giết mổ và sản xuất thịt gà, nguồn phụ phẩm nhƣ: xƣơng, sụn,
đặc biệt là sụn ức gà rất lớn và bán ra thị trƣờng với giá rẻ. Mặt khác thành phần sụn ức
gà lại chứa nhiều hợp chất quý nhƣ glycosaminoglycans, trong đó có hợp chất
chondroitin sulfate có chức năng tái tạo các mô sụn và xƣơng, nuôi dƣỡng tế bào giác
mạc mắt … Qua đó cho thấy: sụn ức gà là nguyên liệu đầy tiềm năng để trích ly và thu
nhận Chondroitin Sulfate.
Trên thế giới có nhiều cơng trình nghiên cứu về tách chiết, tinh sạch chondroitin
sulfate từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau trong đó có sụn gà. Sản phẩm bột CS đƣợc
ứng dụng rộng rãi trong ngành dƣợc phẩm, thực phẩm chức năng, giúp phòng ngừa và hỗ
trợ điều trị các bệnh về xƣơng khớp. Tuy nhiên, ở nƣớc ta mới chỉ có một nghiên cứu duy
nhất thu nhận CS từ sụn cá đuối, cá nhám.
Trƣớc thực trạng này, tiến hành nghiên cứu đƣa ra quy trình thu nhận và tinh sạch
CS là cần thiết. Do đó, đề tài luận văn “Trích ly – Tinh sạch Chondroitin Sulfate từ sụn
ức gà bằng phƣơng pháp hóa học và hóa sinh” đã đƣợc nghiên cứu nhằm góp phần giải
quyết vấn đề đầu ra và giúp nâng cao giá trị gia tăng cho phụ phẩm của ngành chăn nuôi
– giết mổ gia cầm nói chung và gà nói riêng. Khơng những mang lại doanh thu cho các
công ty gia cầm, đặc biệt là giúp cho ngƣời nơng dân có thêm nguồn thu nhập mà cịn tạo

ra một sản phẩm có lợi cho sức khỏe của ngƣời tiêu dùng với giá thành hợp lý, hỗ trợ
thêm cho ngành y tế trong việc điều trị các bệnh về xƣơng khớp. Bên cạnh đó cũng giải
quyết đƣợc vấn đề ô nhiễm môi trƣờng từ nguồn phụ phẩm.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
-

Tìm đƣợc điều kiện xử lý màng thịt bám bên ngoài sụn tốt nhất bằng các
phƣơng pháp: hóa học, hóa sinh và vật lý.

-

Khảo sát các q trình thu nhận CS thơ bằng phƣơng pháp vật lý và hóa sinh.
Sau đó tiến hành tối ƣu hóa điều kện thu nhận CS thơ tốt nhất.
1


-

Khảo sát quá trình tinh sạch và thu nhận CS bằng phƣơng pháp lọc màng và
hóa học. Tối ƣu hóa các yếu tố của quá trình thu nhận CS tinh sạch.

-

Đánh giá chất lƣợng của sản phẩm CS.

1.3 Phạm vi nghiên cứu
-

Nghiên cứu này đƣợc thực hiện ở quy mô phịng thí nghiệm B10: thiết bị lọc
màng, siêu âm,bể điều nhiệt …

-

Đối tƣợng nghiên cứu là sụn ức gà mua tại Công ty TNHH Phạm Tôn.

-

Enzyme Alcalase sử dụng cho nghiên cứu là sản phẩm của Công ty Brenntag.

1.4 Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào các nội dung sau:
-

Tổng quan tài liệu về CS, chức năng sinh học và các phƣơng pháp thu nhận.

-

Tổng quan về nguyên liệu sụn ức gà và enzyme dùng trong thủy phân.

-

Tổng quan về siêu âm, lọc màng, tinh sạch bằng phƣơng pháp hóa học.

-

Phân tích một số thành phần hóa học cơ bản của sụn ức gà.

-

Xác định hoạt độ enzyme Alcalase.

-

Khảo sát phƣơng pháp xử lý nguyên liệu sụn: NaOH; enzyme Alcalase và Chần.

-

Thiết lập quy trình cơng nghệ trích ly và thu nhận CS thô từ sụn ức gà bằng
phƣơng pháp siêu âm và thủy phân. Tối ƣu hóa các yếu tố trong phƣơng pháp thu
nhận CS thô tốt nhất.

-

Thiết lập quy trình tinh sạch CS bằng phƣơng pháp lọc màng và phƣơng pháp hóa
học. Tối ƣu hóa phƣơng pháp thu nhận CS tinh tốt nhất.

-

Phân tích và đánh giá CS thu đƣợc.

1.5 Ứng dụng
-

Từ kết quả nghiên cứu thu đƣợc, đƣa ra quy trình trích ly và thu nhận Chondroitin
Sulfate từ sụn ức gà.

-

Xây dựng đƣợc mơ hình tối ƣu hóa, các thơng số kỹ thuật của quy trình sản xuất.

2


-

Bƣớc tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo để đƣa vào sản xuất các sản phẩm
thực phẩm chức năng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về xƣơng khớp
tại Việt Nam mà không cần phải nhập nguyên liệu từ nƣớc ngoài.

3


2 Chương 2: Tổng quan
2.1 Tổng quan về Chondroitin sulfate
2.1.1 Đặc điểm và cấu trúc của CS
Chondroitin sulfate (CS) là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide,
gồm các monome là các đơn vị disaccharide chứa nhóm: glucuronic acid (GlcA) và Nacetyl-galactosamine (GalNAc) liên kết với nhau bởi liên kết glucoside (GlcA β (1→3)
GalNAc) (hình 2.1) tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycans (CS-GAGs) khơng
phân nhánh. Một chuỗi CS-GAGs có thể chứa từ 20 – 40 đơn vị disaccharide và các
disaccharide liên kết với nhau bởi liên kết 1 →4 glycoside[1], [2]
Mỗi nhóm OH của CS-GAGs đƣợc thay thế bởi nhóm sulphate (SO42-) tại vị trí
carbon C4 hoặc C6 của GalNAc và vị trí carbon C2 hoặc C3 của GlcA sẽ tạo ra các đồng
phân của CS (hình 2.1) [4],
[5].

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của CS

Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) gốc đƣờng với các nhóm carboxyl (COO-)
của gốc đƣờng acid làm cho phân tử chondroitin có điện tích âm rất cao, dễ dàng liên kết
cộng hóa trị với các protein trong proteoglycan (PG). Trong các nghiên cứu của Kato

(1994) và Bernfield (1999) đã cho thấy CS thƣờng gắn với các protein bằng liên kết oglycosid tạo thành một PG, là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide. [24]
Chuỗi CS đƣợc gắn với nhóm – OH của gốc serine ở một số protein. Sự gắn kết
chuỗi GAGs bắt đầu với bốn gốc đƣờng đơn theo phƣơng thức cố định bởi liên kết tetra –
saccharide: xylose – galactose – galactose – glucuronic acid (Xyl – Gal – Gal – GlcA)
(hình 2.2) trong đó xylose đƣợc gắn với protein trong mạng lƣới nội bào, còn các phân tử
đƣờng khác đƣợc gắn trong hệ Golgi.[6],[22]

4


Hình 2.2: Cấu tạo hóa học của CS

CS ƣa nƣớc vì thế hàm lƣợng nƣớc trong mơ sụn cao. Các điều kiện thủy phân
cũng có thể làm giảm trọng lƣợng phân tử trung bình của sản phẩm thu đƣợc. Mỗi phân
tử đƣờng có thể bị sulfate hóa 1, 2 lần hoặc khơng bị sulfate hóa. Đa phần nhóm OH ở vị
trí cacbon 4 và 6 của GalNac đƣợc sulfate hóa. Quá trình này nhờ các enzyme
sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulfate hóa ở các vị trí carbon khác nhau tạo nên hoạt tính
sinh học đặc thù của CS. [3]
2.1.2 Phân loại CS
Chondroitin có 3 loại chính A, B và C, chúng đƣợc đặc trƣng bởi số lƣợng và vị trí
gắn sulfate trong nhóm dissacharide của chuỗi polysaccharide [5],[9], [32].
-

Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4)
có nhiều ở mơ sụn, có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit.

-

Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic, thƣờng có nhiều
ở da, gan, vân tim, thành mạch... Vị trí bị sulfate hóa ở C-4 của GlcNac và C-5

của glucuronic acid bị epime hóa thành iduronic acid.

-

Chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate,
CS6).

5


Hình 2.3: Các đồng phân của CS

Ngồi ra cịn có Chondroitin sulfate D và E. Phân loại CS đƣợc tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1: Bảng phân loại CS

Tên

Chondroitin sulfate B
(Dermetan sulphate)

Vị trí bị sulphate hóa
Cacbon 4 của đƣờng Nacetyl-D-galactosamine
(GalNAc)
Cacbon 4 của GalNAc-Liduronic acid

Chondroitin sulfate C

Cacbon 6 của GalNAc

Chondroitin sulfate A

Chondroitin sulfate D
Chondroitin sulfate E

Cacbon 2 của glucuronic
acid and 6 của GalNAc
Cacbon 4 và 6 của
GalNAc

Tên phân loại
Chondroitin-4-sulphate
(CS4)
Chondroitin-4-sulphate
(CS4)
Chondroitin-6-sulphate
(CS6)
Chondroitin-2,6-sulfate
(C2,S6)
Chondroitin-4,6-sulfate
(C4,S6)

Số lƣợng đồng phân của CS đƣợc tìm thấy rất nhiều. Điều này cho thấy rằng, cấu
trúc chuỗi CS khơng mang tính ngẫu nhiên và những chuỗi CS có thể chứa những thơng
tin sinh học, cấu trúc phân tử đặc biệt ảnh hƣởng đến chu trình sinh học của cơ thể theo
Robert M. Lauder và các cộng sự (2009). [1]
2.1.3 Nguồn gốc
CS phân bố khắp cơ thể ngƣời, động vật có vú, động vật khơng xƣơng sống và
trong một số lồi vi khuẩn. Tại các mô khớp, CS chiếm khoảng 20%, một số lƣợng tuy
khơng lớn nhƣng đóng vai trị vơ cùng quan trọng trong sự bền chắc và đàn hồi của mô
sụn. Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tại giác mạc CS chiếm khoảng

20%...[10]
6


Nguồn gốc của CS trên thị trƣờng hiện tại đƣợc chiết xuất từ nhiều nguồn nguyên
liệu nhƣ: phụ phẩm của heo (lỗ tai và mõm heo), sụn cá mập (xƣơng sọ, xƣơng sống và
vây), ống khí quản bị, sụn bị .... và có thể dùng CS từ sụn khí quản động vật (khí quản
gà, vịt...) để thay thế cho sụn cá mập, giảm giá thành nhƣng vẫn đảm bảo chất lƣợng của
sản phẩm.
Trong các nghiên cứu khoa học đã đƣa ra hàm lƣợng CS của một số nguyên liệu.
Sụn từ xƣơng hàm cá sấu và sụn ức gà là những nguyên liệu chứa nhiều CS, lần lƣợt là
14,84% và 14,08% tính theo trọng lƣợng sụn khơ [10]. Theo một nghiên cứu khác của
Luo và cộng sự (2002) thì hàm lƣợng CS từ sụn ức gà chiếm 16,8% [23]. Hàm lƣợng
CS từ các sụn khác nhƣ: sụn xƣơng ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn
vây cá mập 9,6%, sụn sƣờn cá sấu 5,56%, và sụn cá đuối 5,27% (tính theo chất khơ) [10].
Hàm lƣợng CS trong khí quản vịt đƣợc nghiên cứu là khoảng từ 9,7% đến 10,6% theo
hàm lƣợng chất khơ [46]

Hình 2.4: Một số nguồn nguyên liệu thu nhận CS

CS trong mô động vật liên kết chặt chẽ với protein trong dạng phức proteoglycan
cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu các liên kết giữa
CS – Protein và phân hủy protein để giải phóng CS. [24]

7


Tùy vào nguồn gốc xuất xứ mà CS có cấu trúc hóa học khác nhau, mỗi cấu trúc
hóa học của mạch polyme khác nhau có chức năng sinh học khác nhau. Một trong những
yếu tố quyết định đến giá trị của CS đó là chất lƣợng và sự cơng nhận của các cơ quan có

thẩm quyền. Một số sản phẩm có thể chứa hàm lƣợng CS ít hơn so với quy định đã đăng
ký nhƣng không nhỏ hơn 10%, do đó cần phải tiến hành kiểm tra chất lƣợng và nguồn
gốc của CS trong các sản phẩm thƣơng mại. [4],[7].
2.1.4 Ứng dụng của CS
CS đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong các thực phẩm chức năng và thị trƣờng các chế
phẩm bổ sung dinh dƣỡng CS và glucosamine rất lớn. Chỉ trong vòng một năm (1998 –
1999), doanh thu bán lẻ tại Mỹ đạt đƣợc 500 triệu USD. CS có nhiều tác dụng trong điều
trị bệnh lý cũng nhƣ trong các lĩnh vực khác.

Hình 2.5: Một số sản phẩm chứa bột CS

2.1.4.1 Bệnh khớp
Khớp là bộ phận liên kết bao bọc làm cầu nối giữa 2 đầu xƣơng, bao gồm bởi
nhiều loại mô khác nhau nhƣ sụn khớp, bao khớp, dịch khớp, dây chằng (hình 2.6).

Hình 2.6: Mơ phỏng cấu tạo khớp

8


Sụn khớp là lớp mô bao lấy đầu xƣơng để ngăn các xƣơng tiếp xúc trực tiếp với
nhau, giúp khớp vận động dễ dàng đóng vai trị nhƣ miếng đệm giữa các khớp xƣơng và
tái tạo đầu xƣơng kéo dài ở lứa tuổi đang phát triển [13],[33], [35].
Dich khớp: là dịch trong, có độ nhớt cao, có tác dụng bơi trơn, cung cấp các dƣỡng
chất cho cấu trúc bên trong khớp.
Khi cử động, sụn khớp giúp cho xƣơng hoạt động đƣợc nhịp nhàng và dịch khớp
đƣợc tiết ra giúp bôi trơn các sụn khớp, tăng cƣờng hiệu quả của các quá trình vận động.
Proteoglycan là một trong các thành phần chính cấu tạo nên sụn khớp, tạo cơ chất xung
quanh nền ngoại bào của mô liên kết của sụn khớp [2], [13].

Hình 2.7: Cấu trúc của proteoglycan

Proteoglycan là những polyanionic có chứa các chuỗi heteropolysaccharide liên
kết với chuỗi polypeptide qua cầu nối Xyl-Gal-Gal-GlcA. Các polysaccharide này gồm
CS và hyaluronic acid chiếm 90% cấu trúc của proteoglycan. [2]
Trong cơ thể, quá trình tổng hợp của proteoglycan tại các sụn khớp cần phải có
mặt của CS, amino acid và hyaluronic acid dƣới sự xúc tác của các enzyme và đặc hiệu
trong cơ thể từng lồi.
Proteoglycan có khả hấp thụ nƣớc vào các mô tạo ra áp suất thẩm thấu dẫn đến sự
giãn nở của các mô sụn. Khả năng chịu lực của sụn khớp và xƣơng là do độ đàn hồi của
các mô sụn kết hợp với các mô bao khớp và dây chằng có thành phần chính là collagen
tạo nên một hệ thống xƣơng khớp bền vững. Vì vậy, CS và hyaluronic acid đóng vai trị
quan trọng trong cấu trúc và chức năng của mô sụn.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy CS đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong điều
trị các bệnh lý về xƣơng khớp, đặc biệt là bệnh viêm khớp theo các cơ chế:
9