Thu nhận ficin ứng dụng trong chế biến thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

VÕ THANH NAM

THU NHẬN FICIN
ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

VÕ THANH NAM

THU NHẬN FICIN
ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2019

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học:

TS. TRẦN BÍCH LAM ....................................

Cán bộ chấm nhận xét 1:

TS TRẦN THỊ THU TRÀ ...............................

Cán bộ chấm nhận xét 2:

TS. LÊ NGỌC LIỄU ........................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. HCM
ngày 10 tháng 7 năm 2019
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch: GS.TS. Đống Thị Anh Đào
2. Phản biện 1: TS. Trần Thị Thu Trà
3. Phản biện 2: TS. Lê Ngọc Liễu
4. UV: TS. Nguyễn Hoài Hương
5. UV, Thư ký: TS. Nguyễn Thị Hiền
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Bộ môn quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa .
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA
KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: VÕ THANH NAM

MSHV: 1670368

Ngày, tháng, năm sinh: 13/02/1993

Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh

Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm

Mã số: 60540101

I- TÊN ĐỀ TÀI:
THU NHẬN FICIN ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Tổng quan những nghiên cứu về ficin.
- Khảo sát chọn nguyên liệu Ficus.
- Nghiên cứu phương pháp thu nhận chế phẩm ficin.
- Nghiên cứu tính chất của enzyme ficin thu nhận.
- Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm.
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/01/2019
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 02/7/2019

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN BÍCH LAM
Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TS. Trần Bích Lam
TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Lời cảm ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến Cơ TS. Trần Bích Lam, đã tận tình
hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và động viên, giúp đỡ
em kịp thời trong quá trình thực hiện đề tài luận văn.
Cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Kỹ thuật hóa học - Trường
Đại học Bách Khoa – ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Xin cảm ơn, các Thầy, cô, anh, chị phụ trách các phịng thí nghiệm Cơng nghệ chế
biến thực phẩm 1-2, phịng thí nghiệm Hóa sinh, phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh
học (Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh), phịng thí nghiệm sinh học phân tử (Đại
học khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh), phịng thí nghiệm hóa lý – Vườn ươm cơng
nghệ Việt Nam – Hàn Quốc đã tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu và giúp đỡ tôi
trong lúc thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn hai em Nguyễn Ngọc Quỳnh Anh và Trần Thị Thanh đã giúp đỡ tơi rất
nhiều trong q trình thực nghiệm.
Xin cảm ơn, các bạn bè, anh chị đồng nghiệp đã có những lời động viên, giúp đỡ tơi

trong q trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ba mẹ cùng các thành viên trong gia đình và
em Thanh đã ln bên cạnh hỗ trợ, động viên, tơi trong những lúc khó khăn nhất,
ln là động lực để tơi có thể thực hiện tốt luận văn này.
Tp, Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 06 năm 2019

Võ Thanh Nam

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Ficin (EC 3.4.22.3) là thành phần protease chính có trong nhựa cây họ sung Ficus.
Ficin có nhiều ứng dụng trong chế biến thực phẩm và các lĩnh vực khác. Nghiên cứu
này nhằm mục đích thu nhận nguồn ficin từ nguyên liệu mới ít được nghiên cứu ở
Việt Nam, sau đó là nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm enzyme và thử nghiệm
sơ bộ trên một số loại thực phẩm.
Chúng tơi nghiên cứu một số tính chất ban đầu của dịch nhựa thân cây gừa (Ficus
microcarpa). Kết quả cho thấy dịch nhựa có hàm lượng chất khô 30%, cao su 5,3%,
protein tổng chiếm 60,813,6%, pH tự nhiên 6-7.
Dịch pha loãng nhựa từ nhựa cây theo tỉ lệ 1:2 (w/v) được kết tủa bằng amonium
sulfate 70% bão hịa, sau khi thẩm tích, ly tâm dịch enzyme thơ được sấy đông khô
để thu nhận chế phẩm. Ficin cũng được tinh sạch một phần bằng sắc ký lọc gel
Sephadex G75 với tỉ lệ thu hồi và độ tinh sạch lần lượt là 4,10,2 và 5,650,87 lần.
Sau khi được tinh sạch một phần bằng sắc kí lọc gel, điện di SDS PAGE cho kết quả
là chế phẩm tinh sạch một phần chứa 3 protein, phân tử lượng từ 20,1 đến 30kDa.
Enzyme sau khi tinh sạch một phần có pH tối thích là 7,6 và nhiệt độ tối thích là
65,2oC.
Chúng tơi cũng khảo sát ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme, kết quả cho thấy rằng EDTA, Cysteine, mercaptoethanol 5mM có hiệu quả

làm tăng hoạt tính enzyme. Ảnh hưởng của các ion kim loại cũng được khảo sát, các
ion kim loại hóa trị II (Pb2+, Cd2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+) và Ag+ có ảnh hưởng mạnh
đến hoạt tính protease của chế phẩm và gần như ức chế hồn tồn, các ion cịn lại có
ảnh hưởng nhưng khơng làm mất hồn tồn hoạt tính (như Ca2+, Ba2+, Ni2+). Chế
phẩm enzyme thu được có độ bền nhiệt cao, vẫn giữ được 513,58% hoạt tính ở 70oC
trong 3 giờ.
Thử nghiệm sơ bộ enzyme trên các loại củ, quả như khoai tây, khoai lang và táo cho
thấy khả năng chống hóa nâu của enzyme có hiệu quả đáng kể thông qua các chỉ số
về màu sắc trong hệ màu CIEL*, a*, b* và độ hấp thu ở 420nm.

ii


ABSTRACT
Ficin (EC 3.4.22.3) is the protease exists in the latex of the fig tree Ficus sp. Ficin
has many applications in food processing and other fields. This study aims to receive
ficin from new material, which still few studied in Vietnam, and investigate its
properties as well as its application for anti browing reaction.
Studying latex from laurel fig (Ficus microcarpa), we found that: the latex had 30%
dry matter, insoluble matter 5,3% , pH 6-7, and ficin activity was higher ịn 5,7 fold
than that from the latex of Ficus racemosa.
The crude enzyme was received after the dilution of latex with buffer in ratio of 1: 2
(w/v), protein precipitating by 70% saturated amonium sulfate, dialyzing,
centrifuging and freeze drying. Ficin is also partially purified by Sephadex G-75 gel
chromatography with recovery yeild and purified factor are 4,10,2 and 5,650,87folds respectively. The results of SDS-PAGE showed that the eluted enzyme fraction
contained 3 proteins of MW from 20,1 to 30kDa. The enzyme after partially
purification has an optimal activity at pH 7,6 and 65,2oC. We also examined the effect
of activating agents on the activity of crude enzyme preparations, showing that
Na2EDTA, cysteine, mercaptoethanol 5mM effectively increase enzyme activity. The
influence of metal ions was also investigated, the divalent metal ions (Pb2+, Cd2+,

Fe2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+) and Ag+ strongly influenced on the protease activity of enzyme
preparation and almost inhibited completely, other ions have influence but not
completely inhibited the activity (Ca2+, Ba2+, Ni2+). Enzyme preparation obtained
high thermal stability, still remained 513,58 % activity at 70oC for 3 hours.
Preliminary testing on potatoes, sweet potatoes and apples shows that the enzyme's
anti-browning ability is significantly effective through color measurement in the CIE
L*a*b*coordinates and absorbance at 420nm.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn này là do tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của Cơ TS. Trần Bích Lam. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong
luận văn này là trung thực và không sao chép từ bất cứ một nguồn nào, dưới bất kì
hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi
rõ nguồn tài liệu theo yêu cầu. Mọi sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo,
tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Tác giả luận văn

Võ Thanh Nam

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................................ii
ABSTRACT .............................................................................................................. iii
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... iv

MỤC LỤC ................................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... xi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................xii
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................. 1
1.1. Enzyme ficin ........................................................................................................ 1
1.1.1. Danh pháp và các tên gọi trong lịch sử .............................................................1
1.1.2. Tính chất của enzyme ficin ...............................................................................2
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính ficin .........................................................9
1.2. Nguồn thu nhận enzyme ficin ............................................................................ 13
1.2.1 Cây sung ...........................................................................................................15
1.2.2 Cây si/gừa .........................................................................................................16
1.2.3 Cây sanh ...........................................................................................................17
1.3. Thu nhận enzyme ficin ....................................................................................... 18
1.3.1. Các nghiên cứu quốc tế ...................................................................................18
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước .............................................................................22
1.4. Khả năng ứng dụng của enzyme ficin ................................................................ 23
1.4.1. Ứng dụng ficin trong công nghiệp thực phẩm ................................................23
1.4.2. Ứng dụng ficin trong y học .............................................................................24
1.4.3. Ứng dụng ficin trong các lĩnh vực khác ..........................................................25

v


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .......................................................................................................... 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 26
2.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 30

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nguyên liệu ...............................................................30
2.3.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu phương pháp thu nhận và tinh sạch một phần enzyme
...................................................................................................................................34
2.3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tính chất chế phẩm enzyme .................................38
2.3.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm ứng dụng ficin trên một số loại thực phẩm .........42
2.4. Phương pháp phân tích ....................................................................................... 43
2.4.1. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford ................43
2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .44
2.4.3. Phân tích hỗn hợp protein bằng phương pháp điện di mini-gel SDSpolyacrvlamide ..........................................................................................................44
2.4.4. Phương pháp đo màu (CIE L*,a*, b*) ............................................................45
2.4.5. Phương pháp đo độ hóa nâu (browning index) ...............................................46
2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................. 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................... 47
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nguyên liệu .................................................................. 47
3.1.1. Khảo sát hoạt tính protease một số giống Ficus..............................................47
3.1.2. Khảo sát thời điểm thu dịch nhựa thân cây gừa ..............................................48
3.1.3. Khảo sát khảo sát tính chất của dịch nhựa nguyên liệu ..................................49
3.1.4. Khảo sát tỉ lệ đệm pha loãng dịch nhựa thân gừa ...........................................49
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease dịch nhựa thân ...............50
3.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease dịch nhựa thân .......52
3.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu phương pháp thu nhận và tinh sạch một phần enzyme
................................................................................................................................... 53

vi


3.2.1. Khảo sát phương pháp kết tủa bằng amonium sulfate ....................................53
3.2.2. Tinh sạch một phần enzyme bằng phương pháp lọc gel .................................55
3.2.3. Đánh giá mức độ tinh sạch enzyme qua các giai đoạn xử lý ..........................57
3.2.4. Phân tích enzyme bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .............................58

3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm enzyme .................. 60
3.3.1. Tối ưu hóa ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme ..................60
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt tính enzyme ..................63
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme ....................64
3.3.4. Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme ..................................................................66
3.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm ứng dụng ficin trong một số loại thực phẩm.......... 67
3.4.1. Thử nghiệm khả năng chống hóa nâu trên một số thực phẩm sơ chế .............67
3.4.2. Khảo sát khả năng chống hóa nâu của chế phẩm ficin đối với nước quả ......76
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 78
4.1. Kết luận .............................................................................................................. 78
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 80
PHỤ LỤC A. HƯỚNG DẪN PHA HÓA CHẤT ....................................................... 1
PHỤ LỤC B. CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI ......................... 7
PHỤ LỤC C. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................................................. 8
PHỤ LỤC D. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ................................................................. 15
PHỤ LỤC E. HÌNH ẢNH ......................................................................................... 29
PHỤ LỤC F. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM .................................................................. 30

vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Trình tự các acid amin nằm ở vùng lân cận nhóm –SH hoạt động ở
enzyme ficin so sánh với papain và bromelain ...........................................................4
Hình 1.2 Cơ chế xúc xác của thiol protease ................................................................8
Hình 1.3 Một số lồi trong chi Ficus ........................................................................14
Hình 2.1 Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme thơ .................................................27
Hình 2.2 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu ........................................................................29
Hình 2.3 Bài khí gel ..................................................................................................36

Hình 2.4 Cơ chế phản ứng tạo màu trong phương pháp Bradford............................44
Hình 3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ pha lỗng đến hoạt tính riêng...........................................50
Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme dịch nhựa thân .........................51
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme..........................................52
Hình 3.4 Hoạt tính và nồng độ protein phần dịch theo nồng độ bão hịa AS ...........54
Hình 3.5 Hoạt tính riêng của phần kết tủa theo nồng độ bão hịa AS .......................54
Hình 3.6 Sắc kí đồ lọc gel Sephadex G75 .................................................................56
Hình 3.7 Kết quả điện di gel SDS-PAGE .................................................................59
Hình 3.8 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính riêng
của enzyme ................................................................................................................62
Hình 3.9 Tương quan giữa giá trị thực nghiệm và dự đốn từ mơ hình ...................62
Hình 3.10 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên hoạt tính của ficin ...............................63
Hình 3.11 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của chế phẩm ficin ...............64
Hình 3.12 Cơ chế tác động của thủy ngân clorua đến phân tử ficin .........................65
Hình 3.13 Độ bền nhiệt của chế phẩm ficin thơ........................................................66
Hình 3.14 Sự biến đổi L*, L* của khoai lang khi xử lý bằng ficin và đối chứng ..68
Hình 3.15 Sự biến đổi a*, a* của khoai lang khi xử lý bằng ficin và đối chứng ...69
Hình 3.16 Sự biến đổi b*, b* của khoai lang khi xử lý bằng ficin và đối chứng ...69
Hình 3.17 Sự biến đổi E của khoai lang khi xử lý bằng ficin và đối chứng...........69

viii


Hình 3.18 Sự biến đổi L*, L* của khoai tây khi xử lý bằng ficin và đối chứng ....71
Hình 3.19 Sự biến đổi a*, a* của khoai tây khi xử lý bằng ficin và đối chứng .....71
Hình 3.20 Sự biến đổi b*, b* của khoai tây khi xử lý bằng ficin và đối chứng .....71
Hình 3.21 Sự biến đổi E* của khoai tây khi xử lý bằng ficin và đối chứng...........72
Hình 3.22 Sự biến đổi L*, L* của táo khi xử lý bằng ficin và đối chứng ..............74
Hình 3.23 Sự biến đổi a*, a* của táo khi xử lý bằng ficin và đối chứng ...............74
Hình 3.24 Sự biến đổi b*, b* của táo khi xử lý bằng ficin và đối chứng ...............74

Hình 3.25 Sự biến đổi E* của táo khi xử lý bằng ficin và đối chứng ....................75
Hình 3.26 Nước ép táo được xử lý với ficin .............................................................77

ix


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin ......................................3
Bảng 1.2 Trình tự acid amin của phân tử Ficin...........................................................5
Bảng 1.3 Tính chất của các dạng Ficin từ Ficus carcia var Horaishi .........................6
Bảng 1.4 Những tính chất vật lý của ficin ..................................................................7
Bảng 1.5 Các tính chất hóa học và hóa sinh của Ficin................................................8
Bảng 1.6 Số lượng ficin của các giống cây sung ngọt F. carcia ..............................15
Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .............................................................30
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ và pH của enzyme ..........................39
Bảng 3.1 Hoạt tính protease của một số loài thuộc chi Ficus với cây gừa ...............47
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời điểm thu dịch nhựa tới hoạt tính enzyme .................48
Bảng 3.4 Bảng tổng kết q trình tinh sạch ficin ......................................................57
Bảng 3.5 Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình ...............................................61
Bảng 3.6 Bảng phân tích phương sai của mơ hình hồi quy ......................................61
Bảng 3.7 So sánh ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên ficin thu nhận từ các nguồn khác
nhau ...........................................................................................................................64
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính ficin trong các nghiên cứu khác
nhau ...........................................................................................................................65
Bảng 3.9 Sự biến đổi màu sắc khoai lang khi xử lý bằng ficin và đối chứng...........70
Bảng 3.10 Sự biến đổi màu sắc khoai tây khi xử lý bằng ficin và đối chứng...........73
Bảng 3.11 Sự biến đổi màu sắc của táo khi xử lý bằng ficin và đối chứng ..............76
Bảng 3.12 Độ hấp thu của nước ép táo khi được xử lý với ficin ở các nồng độ khác
nhau ...........................................................................................................................77

x


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

HLP:
HPLC:
HT:
HTR:
HTTĐ:
KT:
MALDI-TOF:
pHopt:
pI:
PPO:
QCVN:
SD:
SDS-PAGE:
STT:
TCA:
TCN:
TCVN:
TN:
Topt:
TQ:

Độ hấp thu
Phân tích phương sai
Amonium sulfate
Bovine serum albumin

Commassive Brilliant Blue
Dung dịch
Tiểu ban Enzyme (Enzyme Commission)
2,2',2'',2'''-(Ethane-1,2-diyldinitrilo)tetraacetic acid
Tổ chức nông lương của Liên hợp quốc (Food and Agriculture
Organization)
Cực tím xa (Far Ultraviolet)
Hàm lượng protein
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hoạt tính
Hoạt tính riêng
Hoạt tính tương đối
Kết tủa
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight
pH tối thích
Điểm đẳng điện
Polyphenol oxidase
Quy chuẩn Việt Nam
Độ lệch chuẩn
Điện di gel polyacrylamide với SDS
Số thứ tự
Tricloacetic acid
Trước cơng ngun
Tiêu chuẩn Việt Nam
Thí nghiệm
Nhiệt độ tối thích
Trung Quốc

Tris:

Tris(hydroxymethyl)aminomethane

UV-VIS:
v/v:
VSV:
w/v:
w/w:
WHO:

Tử ngoại - nhìn thấy (Ultraviolet-Visible)
Tỉ lệ thể tích/thể tích
Vi sinh vật
Tỉ lệ khối lượng/thể tích
Tỉ lệ khối lượng/khối lượng
Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

Abs:
ANOVA:
AS:
BSA:
CCB
dd:
E.C
EDTA:
FAO:

Far-UV:

xi

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Enzyme ficin hay cịn gọi là ficain là một thiol-protease có trong dịch nhựa của các
loài sung, vả thuộc chi Ficus, họ Moraceae. Tương tự các protease thực vật khác
(papain, bromelain) ficin cũng có chứa nhóm sulfhydryl (-SH) ở trung tâm hoạt động,
quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme. Enzyme ficin được ứng dụng trong chế biến
thực phẩm như những loại protease khác: dùng trong đông tụ sữa làm phô mai (thay
thế cho renin), làm mềm thịt, giảm thời gian chế biến nhiệt,...và đặc biệt là hạn chế
sự hóa nâu do enzyme polyphenol oxidase.
Hiện nay nguồn thu nhận enzyme ficin chủ yếu là từ nhựa của cây vả tây (sung ngọt)
(Ficus carica) và Ficus glabrata. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về ficin và
nguồn thu nhận ficin từ các loài thuộc chi Ficus. Ở Việt Nam đề tài này còn khá mới,
có một số nghiên cứu thu nhận enzyme ficin từ cây sung (Ficus racemosa), vả (Ficus
auriculata Lour.)… Ngoài cây sung, vả ở Việt Nam cịn nhiều lồi thuộc chi Ficus
nhưng vẫn chưa được nghiên cứu như: gừa (F. microcarpa), sanh (F. benjamina),
sung trổ (F. variegata); sung ba thùy (F. hirta),… Các loài này sinh trưởng khá nhiều
ở Việt Nam, đặc biệt là gừa và sanh là những loài thường gặp và dễ thu nhận.
Nhằm góp phần tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào này, thu nhận nguồn enzyme
ficin có hoạt tính cao, ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Thu nhận ficin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm”
2. Mục tiêu đề tài:
Nhằm khai thác nguồn nguyên liệu mới để thu nhận và sử dụng enzyme ficin.
3. Yêu cầu của đề tài:
Chọn được nguồn ngun liệu giàu ficin sẵn có ở Việt Nam. Tìm phương pháp thu
chế phẩm enzyme ficin. Xác định tính chất của enzyme và khả năng ứng dụng.
4. Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài
Ý nghĩa thực tiễn: khai thác nguồn nguyên liệu enzyme mới có khả năng ứng dụng
trong chế biến, bảo quản thực phẩm

xii


Ý nghĩa khoa học: các kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về một
nguồn thu nhận enzyme ficin có hoạt tính cao, cịn ít biết đến ở Việt Nam.

xiii


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Enzyme ficin
1.1.1. Danh pháp và các tên gọi trong lịch sử
Ficin (hay cịn gọi là ficain) là enzyme thủy phân protein chính có trong nhựa cây
sung, vả (Ficus).
Việc sử dụng nhựa sung vào nhiều mục đích khác nhau được nhắc đến từ lâu trong
các tác phẩm lịch sử, văn học. Trong tác phẩm Iliad (khoảng 850 TCN), Homer nhắc
đến việc sử dụng nhựa cây vả tây (F. carcia) mọc hoang để làm đông tụ sữa. Pedanius
Dioscorides vào thế kỷ đầu tiên của kỷ ngun Kitơ giáo trích dẫn việc sử dụng nhựa
vả tây của người Hy Lạp cổ làm thuốc nhuận tràng, chữa bệnh gout, phong cùi, động
vật độc cắn, bệnh da, và làm đông tụ sữa. Trải qua nhiều thế kỷ, ở nhiều nơi trên thế
giới, nhiều loại bệnh tật được cho rằng đã giảm bớt hoặc chữa khỏi bởi quả vả/sung
hoặc nhựa của chúng như sốt, phong, các vết thương, tiểu đường, chân bị nứt và viêm,
và đau răng,...[1].
Ở nhiều nơi trên thế giới nhựa của các loài thuộc chi Ficus còn được dùng để lấy cao
su, bẫy chim, nhuộm baktik, làm nến, chất keo, sơn dầu, trị giun…[1].
Ở Colombia, Venezuela và Trung Mĩ, Paraguay và Peru, nhựa họ sung/vả được gọi
theo tên địa phương là “leche de higueron”, “Leche de higueron branco” hoặc “leche
de oje” và chúng thu được từ Ficus laurifolia Hort. ex Lam., Ficus glabrata HBK,
Ficus anthelmintica Mart. - hiện nay là Ficus insipida Wild.

Peckolt (1861) nghiên cứu nhựa của một số cây trong chi Ficus, đặc biệt là Ficus
doliaria Mart, ông cho rằng đã tách được một “alkaloid” mà ông đặt tên là "doliarina"
và pepsin thực vật mà ông đặt tên là "urostigma papayotin"[2]. Các nghiên cứu của
Peckolt được tiếp tục bởi một số nhà nghiên cứu Brazil. Moncorvo (1881), một bác
sĩ ở Rio, đã mô tả Ficus doliara (Ficus gameleira Standley) và hoạt động tiêu hóa
của nhựa cây, mà ơng gọi là “leite de gamelleira”. Nó có hoạt tính giống như là một

1


loại thuốc giun với sự hiện diện của “doliarina”, tương tự như papain của Carica
papaya L.).
Mussi (1890) đã kiểm tra các đặc tính tiêu hóa của nhựa Ficus carica L., xác định các
đặc tính của enzyme mà ơng gọi là “cradina” và phân biệt nó với pepsin và papain.
Chadot và Rouge (1906) đã đặt tên “labferment” trong nhựa “sycochymase” và nhấn
mạnh rằng nó là enzyme đơng tụ lâu đời nhất được biết đến, đã được sử dụng ở Hy
Lạp cổ đại để sản xuất phô mai[1].
Tên gọi “ficin” được đặt ra bởi Robbins vào năm 1930 cho một loại bột protein ông
đã thu nhận từ cây vả tây (sung ngọt) thuộc chi Ficus. B.H. Robbins nhận thấy trong
nhựa của cây thuộc chi Ficus có một loại enzyme có khả năng tiêu diệt được giun
trịn Ascaris [3].
Năm 1961, ficin được chính thức đưa vào Hệ thống phân loại enzyme quốc tế với mã
số là EC 3.4.4.12 (Enzyme thủy phân – Thủy phân liên kết peptide (Peptidase) –
Peptidyl peptide hydrolase). Đến năm 1972 ficin được mã hóa lại, thành EC 3.4.22.3
(Enzyme thủy phân – Thủy phân liên kết peptide (Peptidase) – Cysteine
endopeptidase).
Nhiều nghiên cứu về nhóm enzyme thủy phân protein trong họ Ficus đã chứng minh
rằng trong Ficus khơng chỉ có cysteine protease mà cịn có cả aspartic protease và
serine protease [4, 5].
1.1.2. Tính chất của enzyme ficin

1.1.2.1. Thành phần acid amin
Những kết quả nghiên cứu về thành phần acid amin của enzyme ficin của những tác
giả khác nhau là khác nhau [6].
Bảng 1.1 cho biết thành phần acid amin của ficin theo kết quả nghiên cứu của MariniBetolo (1963), Metrione (1963), Gould (1964) trên chế phẩm enzyme ficin, được tinh
sạch chỉ bằng phương pháp kết tủa phân đoạn bởi muối trung tính; và của Englund
(1968) đã xác định thành phần acid amin trên chế phẩm ficin, thu nhận từ quá trình
kết tủa bằng muối và sắc ký trên CM-cellulose [7].

2


Bảng 1.1 Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin
Tên tác giả nghiên cứu
STT

Lynn

Marini –

Metrione

(1968)

Betolo

(1967)

[5]

(1965) [8]

[9]

Amino acid

Gould

Englund

(1965) (1968) [7]
[10]

1

Lysin

12

7

9

9

5

2

Histidine

7

2

2

2

1

(3)

(Amonia)

-

-

52

25

4

Arginine

19

8

7

10

10

5

Aspartic acid

74

20

21

21

17

6

Threonine

38

10

8

10

8

7

Serine

37

13

10

16

14

8

Glutamic acid

44

22

23

25

25

9

Proline

25

11

12

13

11

10

Glycine

44

28

30

32

28

11

Alanine

32

19

21

21

20

12

Half-cystine

-

7

4

9

8

13

Valine

35

15

15

19

18

14

Methionine

2

3

3

4

5

15

Isoleucine

22

7

10

10

7

16

Leucine

39

14

17

17

15

17

Tyrosine

14

11

14

15

15

18

Phenylalanine

23

6

5

6

5

19

Tryptophan

-

3

-

9

6

206

211

300

243

Tổng số gốc amino acid*

*số lượng các gốc amino acid/ 1 mol protein

3


Cấu trúc bậc I của ficin có chứa nhóm sulfhydryl (-SH). Trình tự các amino acid ở
gần trung tâm phản ứng khá giống với trình tự đã được tìm thấy của những thiolprotease thực vật khác như papain và bromelain (Hình 1.1).
Tuỳ theo nguồn thu nhận enzyme ficin từ các lồi khác nhau mà thành phần hóa học
sẽ khác nhau [11].

Hình 1.1 Trình tự các acid amin nằm ở vùng lân cận nhóm –SH hoạt động ở
enzyme ficin so sánh với papain và bromelain
Nguồn: Whitaker và cộng sự [12]
a: Theo R.C. Wong và I.E. Liener (1964) xác định trên chế phẩm ficin tinh sạch bởi muối

trung tính [13].
b: Theo A. Light, R. Frater, J.R. Kimmel và E.L. Smith (1964) [14].
c: Theo L.P. Chao và I.E. Liener (1967), Husain và G. Lowe (1968)[15].

Tính tương đồng về trình tự của các acid amin nằm quanh vùng hoạt động của các
protease thực vật trên phản ánh một cơ chế xúc tác chung.
Từ các dữ liệu nghiên cứu được trình bày ở Bảng 1.2 cho thấy các loại ficin tuy khác
nhau nhưng có trình tự acid amin gần giống nhau.

4


Bảng 1.2 Trình tự acid amin của phân tử Ficin
S
T
Tên enzyme
T
1 Microcarpain
2 Ficin A

Nguồn thu nhận

Trình tự Acid amin

Ficus microcarpa
Ficus carica

VPETVDWRSKGAV
LPETVDWRSKGAV

[16]
[17]

3
4
5

Ficus carica
Ficus carica
Ficus carica

LPETVDWRSKGAV
LPETVDWRSKGAV
LPESVDWRSKGAV

[18]
[19]
[20]

Ficin 3
Ficin D
Ficin 4

Tham khảo

1.1.2.2. Tính chất vật lý
Tương tự như thành phần hóa học, tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin mà tính chất
vật lý của chúng cũng không giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này khơng lớn.
Tóm tắt về những tính chất vật lý nghiên cứu được được trình bày ở Bảng 1.3 và Bảng
1.4.

Một số tính chất vật lý chung của enzyme ficin như sau:
Một số tính chất vật lý [11, 21]:
- Trọng lượng phân tử: Trọng lượng phân tử: 20000 Da [16], 23800-26000 (Ficus
spp., Phân tích axit amin, siêu ly tâm, lọc gel, chuẩn độ với 5,5'-dithiobis (2nitrobenzoic acid), điện di SDS); 50000 (Ficus elastica, HPLC)[21].
- Đơn vị con: Monomer, Dimer (2 x 29000, Ficus elastica, SDS-electrophoresis)
- Nhiệt độ có hoạt tính: 30-800C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác: 50-70oC
- Hệ số lắng: 2,5 - 2,7 S
- Điểm đẳng điện: 9-10
- Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước hoặc
glycerine

5


Bảng 1.3 Tính chất của các dạng Ficin từ Ficus carcia var Horaishi
Ficin
S

Ficin
A

Ficin
B

Hoạt tính riêng (U/mg)
Casein
Tos-Arg-Ome (x10-2)

1,8
2,4

2,0
2,4

2,8
12,3

3,7
2,5

5,7
2,6

pHotp

8,0

7,5

7,0

7,0

7,5

Totp

60

65

60

78

55

Đồ bền với pH

2

Độ bền nhiệt

67

67

63

80

56

Tỉ lệ thủy phân casein (%)

13

13

18

17

16

Chất hoạt hóa [10-2 M] (%)
Cysteine (0,0025M)
Cysteine
Mercaptoethanol

100
99
80

100
103
74

100
96
75

100
98
90

100
98
82

Chất ức chế [10-6M] (hoạt tính cịn lại %)
HgCl2
3,5
p-chloromercurybenzoate
76

2,0
74

3,7
30

3,5
9,6

3,0
8,4

pI

9,1

8,3

10,2

>10,2

>10,2

MW (x10000)

2,6

2,4

2,4

2,6

2,6

Hàm lượng đường (%)

4,8

0

0

0

0

Tính chất

Nguồn: Sugiura và cộng sự [22]

6

Ficin
C

Ficin
D

8


Bảng 1.4 Những tính chất vật lý của ficin
Nguồn thu

Phương pháp tinh

nhận

sạch

F. glabrata

Hệ số

Trọng

lắng

lượng

(S0)

phân tử

Tủa muối → sắc ký

25.500

trên

 750

CMcellulose,

pI

Hệ số
tắt
21,0

Bước
sóng
(nm)
267

Tham
khảo
[7]

pH7

F. glabrata

Chỉ tủa muối

2,56 S 26.000

F. carica var Mỗi hợp chất có
Kadota

[23]
> 9,6 20,2

[24]

hoạt tính được tách
trực tiếp từ nhựa
bằng sắc ký trên
CMcellulose, pH7

F.

Chỉ tủa muối

26.500

anthelmitica

1.1.2.3. Tính chất xúc tác của ficin
Ficin là một thiol protease, với cơ chế xúc tác như trên Hình 1.2.
Trung tâm hoạt động gồm 2 acid amin là cystein và histidine.
Cơ chế thủy phân gồm 2 giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

7

[6]


Hình 1.2 Cơ chế xúc xác của thiol protease
Bảng 1.5 Các tính chất hóa học và hóa sinh của Ficin
Tính chất
Phản ứng xúc tác
Loại phản ứng
Cơ chất

Nội dung

Tham
khảo

Protein+ H2O  sản phẩm thủy phân protein
[11, 21]
- Thủy phân liên kết Carboxylic acid amide (peptide,
[11, 21]
endopeptidase)
- Các cơ chất tự nhiên: Protein (như gelatin, collagen,
protein sữa, hemoglobin, elastin, protein đậu nành, [11, 21]
fibrin, fibrinogen)
- Proteins + H2O (thủy phân các liên kết peptide-,
ester-, và amide ưu tiên ở Gly, Ser, Thr, Met, Lys,
Arg, citrulline, Leu, isoAsp, Tyr)

8