Trích ly hợp chất triterpenoid từ nấm linh chi đỏ việt nam bằng phương pháp trích lý có hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------o0o---------------

NGUYỄN THỊ LINH

TRÍCH LY HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ NẤM LINH CHI ĐỎ
VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY CĨ HỖ TRỢ SIÊU ÂM
VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO TRÍCH
(Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by ultrasound-assisted extraction
method and testing bioactivities of extract)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HĨA HỌC
Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2020


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Minh Nam
PGS. TS Nguyễn Hữu Hiếu
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM,
ngày 16 tháng 09 năm 2020
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. GS.TS Đống Thị Anh Đào - Chủ tịch
2. TS. Huỳnh Ngọc Oanh - Ủy viên phản biện 1
3. TS. Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long - Ủy viên phản biện 2

4. TS. Nguyễn Quốc Thắng - Ủy viên
5. TS. Nguyễn Văn Dũng - Thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Thị Linh

MSHV: 1770451

Ngày, tháng, năm sinh: 27/10/1994

Nơi sinh: Hải Dương

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số: 60520301

I. TÊN ĐỀ TÀI
Tên tiếng Việt: Trích ly hợp chất triterpenoid từ nấm linh chi đỏ Việt Nam bằng phương
pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích.
Tên tiếng Anh: Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by ultrasoundassisted extraction method and testing bioactivities of extract.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
2.1. Tổng quan: Nấm Linh chi, triterpenoid, hoạt tính của nấm Linh chi, phương pháp
trích ly hỗ trợ siêu âm, phương pháp định lượng triterpenoid, phương pháp thử nghiệm
hoạt tính kháng oxy hố, kháng ung thư, kháng khuẩn của cao trích, quy hoạch thực
nghiệm.
2.2. Thực nghiệm
 Trích ly flavonoid từ nấm Linh chi bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm.
 Khảo sát ảnh hưởng của từng điều kiện đến hàm lượng triterpenoid bao gồm: Tỷ lệ
dung môi:nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian.
 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời bốn điều kiện tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, công suất
siêu âm, nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng triterpenoid bằng quy hoạch thực nghiệm
theo phương pháp CCD.
 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố, kháng ung thư và kháng khuẩn của cao trích.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2020
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/2020
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. HOÀNG MINH NAM
PGS. TS NGUYỄN HỮU HIẾU
TP. HCM, ngày 12 tháng 10 năm 2020
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Trưởng PTN TĐ ĐHQG TP.HCM
CNHH & DK

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên tác giả xin trân trọng cảm ơn đến người thân và
gia đình đã ln quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tác giả trong
suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Tác giả xin chân thành cảm ơn thầy TS. Hoàng Minh Nam và thầy PGS. TS Nguyễn
Hữu Hiếu đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến các học viên, nghiên cứu viên và các bạn sinh viên ở
Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG TP.HCM Cơng nghệ Hóa học & Dầu khí (CEPP
Lab), Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM đã hỗ trợ tác giả trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả
Nguyễn Thị Linh

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Trong luận văn này, hợp chất triterpenoid được trích ly từ nấm Linh chi đỏ bằng
phương pháp sử dụng dung mơi etanol có hỗ trợ siêu âm. Hàm lượng triterpenoid trong
cao trích được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thu phân tử (UV–Vis).
Ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly như tỷ lệ dung mơi: nguyên liệu, công suất
siêu âm, nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng triterpenoid được khảo sát bằng phương
pháp luân phiên từng biến để chọn ra khoảng tác động. Sau đó, tiến hành khảo sát đồng

thời bốn điều kiện là tỷ lệ dung môi: nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời
gian bằng phương pháp phối hợp có tâm (CCD). Số liệu được xử lý bằng phần mềm
Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng triterpenoid cao nhất. Đồng
thời phương pháp trích ly bằng nước nóng, dung mơi etanol khơng có sự hỗ trợ của siêu
âm và Soxhlet cũng được thực hiện để đối chứng.
Cao trích tại điều kiện tối ưu được khảo sát hoạt tính sinh học thơng qua khả năng
kháng oxy hóa sử dụng phương pháp bắt gốc tự do 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl
(DPPH), 2,2'–azino–bis(3–ethylbenzthiazoline–6–sulphonic axit (ABTS) và gốc tự do
hydroxyl với chất đối chứng dương là axit ascorbic; khả năng gây độc tế bào ung thư sử
dụng phương pháp 3–[4,5–dimetylthiazol–2-yl] –2,5–diphenyltetrazol brom (MTT) đối
với dịng tế bào ung thư ung thư biểu mơ, ung thư gan, ung thư phổi và ung thư vú.

iv


ABSTRACT
In this thesis, active triterpenoid is extracted from Ganoderma lucidum by using
ultrasonic-assisted extraction. Crude extracted triterpenoid content was determined by
molecular absorption spectroscopy (UV-Vis).
The effects of each extraction conditions such as solvent: material ratio, ultrasonic
power, temperature, and time on triterpenoid content were investigated by single - factor
method to choose the impact range. Then, simultaneously surveyed these four conditions
such as solvent : material ratio, ultrasonic power, temperature and time by Central
Composite design (CCD). Data were processed by Design Expert 11.0 software to find
the extraction conditions for the highest triterpenoid content. At the same time, hot
water, ethanol and Soxhlet extractions were performed for control samples.
Crude extract at optimize conditions was investigated for biological activity through
oxidation resistance using the 1.1-diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH), 2,2' – azino –
bis free radical capture method. (3 – ethylbenzthiazoline – 6 – sulphonic acid (ABTS)
and hydroxyl free radical with ascorbic acid as positive control; carcinogenicity using

3– [4,5 – dimethylthiazol – 2-yl] ] –2,5 – diphenyltetrazole bromine (MTT) method for
carcinoma, liver, lung, and breast cancer cell lines.

v


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan luận văn này là cơng trình nghiên cứu thực sự của cá nhân
tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS. Hoàng Minh Nam và PGS.
TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG TP. HCM Cơng nghệ Hóa
học và Dầu khí (CEPP Lab), Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP. HCM.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa từng
được công bố trong bất cứ một công trình nào khác trước đây. Mọi sự giúp đỡ cho việc
hoàn thành luận văn này đều đã được cảm ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này
đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Tác giả
Nguyễn Thị Linh

vi


1. MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
Tổng quan về nấm Linh chi ................................................................................... 2
Phân loại khoa học và khu vực phân bố .......................................................... 2
Mô tả thực vật .................................................................................................... 2
Phân bố, sinh thái .............................................................................................. 3
Thành phần hoá học ......................................................................................... 3
1.1.4.1. Polysaccharide ............................................................................................ 4

1.1.4.2. Adenosine..................................................................................................... 5
1.1.4.3. Pectit, protein .............................................................................................. 6
1.1.4.4. Nhóm phenolic ............................................................................................. 6
1.1.4.5. Saponin ........................................................................................................ 6
Hoạt tính sinh học của triterpenoid ...................................................................... 8
Kháng oxy hoá ................................................................................................... 8
Kháng ung thư ................................................................................................... 9
Kháng khuẩn ................................................................................................... 11
1.2.3.1. Sơ lược về vi khuẩn.................................................................................... 11
1.2.3.2. Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid ....................................................... 13
Một số hoạt tính khác ...................................................................................... 14
Các phương pháp trích ly hoạt chất trong nấm Linh chi ................................. 14
Phương pháp trích ly truyền thống................................................................. 15
Phương pháp trích ly hiện đại ........................................................................ 15
1.3.2.1. Hỗ trợ vi sóng ............................................................................................ 15
1.3.2.2. Enzym......................................................................................................... 16
1.3.2.3. Lưu chất siêu tới hạn ................................................................................. 17
1.3.2.4. Phương pháp siêu âm ................................................................................ 18
Phân tích hàm lượng hợp chất trong cao trích bằng quang phổ hấp thu nguyên
từ ................................................................................................................................... 20
Tình hình nghiên cứu ........................................................................................... 21
Ngồi nước ....................................................................................................... 21
Trong nước....................................................................................................... 22
Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................... 22
vii


Tính cấp thiết ................................................................................................... 22
Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................ 23
Nội dung ........................................................................................................... 23

Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 23
1.6.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu ................................................ 23
1.6.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid ....... 23
1.6.4.3. Khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid ... 23
1.6.4.4. Định lượng phương pháp phân tích định lượng triterpenoid.................... 25
1.6.4.5. Phân tích thành phần cao chiết bằng phổ hồng ngoại chuyển hóa
Fourier .................................................................................................................... 26
1.6.4.6. Phân tích bề mặt vật liệu bằng kính điện tử quét ...................................... 27
1.6.4.7. Phân tích nhiệt trọng lượng....................................................................... 27
1.6.4.8. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích ............................................ 28
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................................. 34
Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm thực hiện ....................................... 34
Nguyên liệu ...................................................................................................... 34
Hoá chất ........................................................................................................... 34
Thiết bị.............................................................................................................. 35
Địa điểm thực hiện luận văn ........................................................................... 36
Thí nghiệm............................................................................................................. 36
Xác định độ ẩm nguyên liệu ............................................................................ 36
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trích ly ................................................... 36
2.2.2.1. Quy trình trích ly triterpenoid ................................................................... 36
2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid ........... 37
2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm lượng
triterpenoid ............................................................................................................. 40
2.2.2.4. Định lượng triterpenoid ............................................................................. 42
Thí nghiệm so sánh đối chứng ........................................................................ 42
Phân tích đặc tính hố lý của cao trích .......................................................... 43
Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích ................................................ 43
2.2.5.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố ........................................................ 43
2.2.5.2. Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ........................................................ 44
viii

2.2.5.3. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ........................................................... 45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................. 46
Độ ẩm của nguyên liệu ......................................................................................... 46
Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng triterpenoid ....................... 46
Ảnh hưởng của từng điều kiện ....................................................................... 46
3.2.1.1. Tỷ lệ dung môi: nguyên liệu ...................................................................... 46
3.2.1.2. Ảnh hưởng của công suất siêu âm ............................................................. 47
3.2.1.3. Nhiệt độ...................................................................................................... 47
3.2.1.4. Thời gian .................................................................................................... 48
Ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố .............................................................. 50
Kiểm chứng mơ hình ....................................................................................... 59
Phân tích thành phần cao chiết ...................................................................... 61
Cấu trúc bề mặt của nguyên liệu trước và sau khi trích ly ........................... 63
Độ bền nhiệt của cao chiết .............................................................................. 64
Hoạt tính sinh học của cao trích .......................................................................... 65
Hoạt tính kháng oxy hố ................................................................................. 65
3.3.1.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH .................................................................. 65
3.3.1.2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS ................................................................... 66
3.3.1.3. Khả năng bắt gốc tự do hydroxyl .............................................................. 68
Hoạt tính kháng ung thư ................................................................................. 69
Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................... 70
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ........................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

ix

2. DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Nấm Linh chi ................................................................................................... 3
Hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm Linh chi [14] ........................................... 5
Hình 1.3: Adenosine ........................................................................................................ 5
Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của ATP ............................................................................. 5
Hình 1.5: Khung lanostane .............................................................................................. 7
Hình 1.6: Cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử ................................................. 9
Hình 1.7: Ảnh hưởng của triterpenoid đến quá trình tế bào chết theo chu kì ............... 11
Hình 1.8: Vi khuẩn Staphylococcus aureus .................................................................. 12
Hình 1.9: Vi khuẩn Escherichia coli ............................................................................. 12
Hình 1.10: Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid .......................................................... 14
Hình 1.11: Quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào của enzym ............................................... 17
Hình 1.12: Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2............................................................. 18
Hình 1.13: Quá trình trích ly hoạt chất có hỗ trợ của siêu âm ...................................... 19
Hình 1.14: Mơ tả hệ thống trích ly bằng sóng siêu âm dạng bể .................................... 20
Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý hấp thu tia sáng ................................................................ 21
Hình 1.16: Sơ đồ ngun lý máy UV-VIS .................................................................... 21
Hình 1.17: Các mơ hình thiết kế thí nghiệm ................................................................. 25
Hình 1.18: Cấu tạo thiết bị quang phổ FTIR ................................................................. 26
Hình 1.19: Cấu tạo máy FE-SEM.................................................................................. 27
Hình 1.20: Sơ đồ cấu tạo của thiết bị đo TGA .............................................................. 28
Hình 1.21: Phản ứng mất màu của DPPH với chất kháng oxy hố............................... 29
Hình 1.22: Phản ứng mất màu của ABTS với chất kháng oxy hoá............................... 29
Hình 1.23: Phản ứng mất màu của H2O2với chất kháng oxy hố ................................. 31
Hình 1.24: Ngun tắc thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư ........................................ 32
Hình 1.25: Cách đo đường kính vịng kháng khuẩn ...................................................... 33
Hình 2.1: Mẫu nấm Linh chi ......................................................................................... 34
Hình 2.2: Quy trình trích ly triterpenoid từ nấm Linh chi ............................................. 37
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi: ngun liệu ................................................. 46
Hình 3.2: Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm ................................................................. 47

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................ 48
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm .................................................................. 49
Hình 3.5: Hàm lượng triterpenoid từ số liệu thực nghiệm và dự đốn ......................... 53
Hình 3.6: Ảnh hưởng đồng thời của công suất và tỷ lệ dung mơi: ngun liệu............ 54
Hình 3.7: Ảnh hưởng đồng thời nhiệt độ trích ly và tỷ lệ dung mơi:ngun liệu ......... 55
Hình 3.8: Ảnh hưởng đồng thời của thời gian trích ly và tỷ lệ dung mơi: ngun liệu.
....................................................................................................................................... 56
Hình 3.9: Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ trích ly và cơng suất siêu âm ................. 57
Hình 3.10: Ảnh hưởng đồng thời của thời gian trích ly và cơng suất siêu âm .............. 58
Hình 3.11: Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly ................. 59
x


Hình 3.12: Hàm lượng triterpenoid của mẫu tối ưu và các mẫu đối chứng .................. 61
Hình 3.13: Phổ FTIR của chuẩn axit ursolic, dịch chiết và ngun liệu thơ................. 62
Hình 3.14: Ảnh SEM của mẫu nấm Linh chi trước khi trích ly (a), (b) và sau khi trích ly
bằng sóng siêu âm (c), (d) ............................................................................................. 63
Hình 3.15: Độ bền nhiệt của cao trích nấm Linh chi. ................................................... 64
Hình 3.16: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của axit ascorbic ........................................ 65
Hình 3.17: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết .............................................. 66
Hình 3.18: Khả năng bắt gốc tự do ABTS của axit ascorbic ........................................ 67
Hình 3.19: Khả năng bắt gốc tự do ABTS của cao chiết .............................................. 67
Hình 3.20: Khả năng bắt gốc tự do hydroxyl của axit ascorbic .................................... 68
Hình 3.21: Khả năng bắt gốc tự do hydroxyl của cao chiết .......................................... 68
Hình 3.22: Hoạt tính kháng ung thư của cao trích nấm Linh chi đối với bốn dòng tế bào
ung thư Lu1, Hep-G2, KB và MCF7 ............................................................................. 69
Hình 3.23: Hoạt tính kháng khuẩn E.coli của cao trích nấm Linh chi ......................... 70
Hình 3.24: Hoạt tính kháng khuẩn S. aureus của cao trích nấm Linh chi..................... 71

3.

xi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi và công dụng .............................. 3
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng .................................................................................... 34
Bảng 2.2: Các dụng cụ và thiết bị sử dụng .................................................................... 35
Bảng 2.3: Các yếu tố khảo sát ....................................................................................... 38
Bảng 2.4: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: nguyên liệu .............................. 38
Bảng 2.5: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi:nguyên liệu ............................... 39
Bảng 2.6: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly................................................. 39
Bảng 2.7: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly................................................. 40
Bảng 2.8: Mức thí nghiệm của các biến độc lập của q trình trích ly triterpenoid ..... 40
Bảng 2.9: Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình CCD ........................................................ 41
Bảng 2.10: Điều kiện trích ly các mẫu so sánh đối chứng ............................................ 43
Bảng 3.1: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mơ hình CCD đối với triterpenoid ........... 50
Bảng 3.2: Kết quả phân tích ANOVA ........................................................................... 51
Bảng 3.3: Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm ....................... 52
Bảng 3.4: Điều kiện hiệu chỉnh từ mơ hình................................................................... 60
Bảng 3.5: Kết quả kiểm chứng mơ hình ........................................................................ 60

xii


4. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

TEAC

ORAC

TRAP

Trolox equivalent antioxidant
capacity

Tiếng Việt

Hoạt tính kháng oxy hóa được
so sánh với khả năng kháng
oxy hóa Trolox

Oxygen radical absorbance capacity
Total radical-trapping antioxidant

Khả năng hấp thụ gốc tự do
chứa oxy hoạt động
Khả năng bẫy các gốc tự do

potential

FRAP

ferric reducing-antioxidant power

UV-Vis

Ultraviolet–visible spectroscopy

IC50

Half Maximal Inhibitory

Lực kháng oxy hóa bằng cách
khử sắt
Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến
Nồng độ ức chế 50 %

Concentration
DMSO

Dimethylsulfoxide

OD

Optical density

GA DM

Ganoderic axit DM

TCVN

Dimetyl sulfoxit

Mật độ quang

Axit ganoderic DM

Tiêu chuẩn Việt Nam

xiii


5. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày này, với sự căng thẳng và áp lực của xã hội hiện đại đã ảnh hưởng không nhỏ
đến sức khoẻ của con người. Mặc dù những tiến bộ do công nghệ mang lại đã làm cho
cuộc sống của con người trở nên dễ dàng hơn, nhưng con người vẫn đang tìm kiếm các
giải pháp điều trị bệnh thay thế khác có nguồn gốc từ tự nhiên tốt hơn. Điều này đã dẫn
đến nhu cầu ngày càng tăng đối với các thảo dược có chứa các hoạt chất có hoạt tính
sinh học được sử dụng để nâng cao sức khỏe và hỗ trợ điều trị bệnh. Trong đó, nấm Linh
chi được biết đến là một trong những dược liệu quý, được trồng và nghiên cứu ở nhiều
quốc gia trên thế giới, đặc biệt là các nước khu vực Châu Á như: Việt Nam, Trung Quốc,
Nhật Bản và Hàn Quốc. Một số hoạt tính của nấm Linh chi như là chống oxy hóa, giảm
đau, kháng nấm, chống viêm, chống khối u, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan,...đã được
chứng minh. Các thành phần hóa học trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các
nhóm: axit béo, adenosine, triterpenoid, polysaccharides,... đã được nghiên cứu là có
nhiều tác dụng trong việc tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, kháng oxy hóa và kháng
ung thư.
Nấm Linh chi thường được trích ly bằng phương pháp truyền thống sử dụng dung
mơi hữu cơ hoặc nước nóng. Nhưng những phương pháp trên có nhiều hạn chế, hiệu
quả trích ly thấp, làm biến tính các hoạt chất, tồn tại các dung mơi hữu cơ độc trong sản
phẩm thu được. Q trình trích ly bằng sóng siêu âm với dung mơi là etanol như là một

phương án thay thế tuyệt vời cho các quá trình trích ly truyền thống.
Phương pháp trích ly bằng sóng siêu âm với dung mơi là etanol có giá thành hóa chất
và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản
phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt, hạn chế được sự hình thành các gốc tự do và
thiết bị dễ sử dụng là những ưu điểm nổi trội phương pháp này. Do đó có thể được lựa
chọn cho quá trình trích ly và phân tách các thành phần hoạt tính từ các cây thuốc q.
Vì vậy, đề tài này được thực hiện với tiêu đề “Trích ly hợp chất triterpenoid từ
nấm Linh chi đỏ Việt Nam bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm và thử
nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích”.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan về nấm Linh chi
Phân loại khoa học và khu vực phân bố
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Ganodermataceae.
Nấm Linh chi thường có tên gọi khác là Lingzi ở Trung Quốc, reishi ở Nhật Bản và
yeongji ở Hàn Quốc, còn có ở Việt Nam thường gọi là tiên thảo, nấm trường thọ, phân
bố khắp nơi trên thế giới, chủ yếu là vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như châu Á. Nấm
Linh chi có phân loại khoa học như sau [1].
Giới

Fungi

Ngành

Basidiomycota

Lớp

Agaricomycetes

Bộ

Polyporales

Họ

Ganodermataceae

Chi

Ganoderma

Lồi

Ganoderma lucidum

Mơ tả thực vật
Nấm Linh chi thường kí sinh hoặc hoại sinh trên nhiều loại cây hoặc phát triển trên
các giá thể là gỗ mục. Nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm. Cuống nấm
dài hoặc ngắn, hình trụ, đường kính 0,5 – 3 cm. Cuống nấm thường không phân nhánh,
đôi khi uốn khúc cong. Lớp vỏ cuống màu đỏ – nâu đỏ – nâu đen, bóng, khơng có lơng,
phủ suốt trên mặt tán nấm. Mũ nấm dạng thận – gần trịn, đơi khi xịe hình quạt. Trên
mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh – vàng nghệ – vàng nâu – vàng
cam – đỏ nâu – nâu tím, nhẵn bóng, láng như vecni. Khi già, sẫm màu lớp vỏ láng, lớp
phấn đỏ nâu trên bề mặt ngày càng nhiều và dày hơn. Kích thước mũ nấm thường 5 –12
cm, dày 0,8 – 3,3 cm. Phần đỉnh cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm [2]. Hình ảnh thực
tế của nấm Linh chi được thể hiện như 1.1.

2


Hình 1.1: Nấm Linh chi
Phân bố, sinh thái
Nấm Linh chi là loài phân bố khắp nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, nấm Linh chi có
thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai đến Lâm Đồng. Nấm Linh chủ yếu
sinh sản bằng bào tử ở mặt dưới của quả thể. Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ
sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất [3].
Thành phần hố học
Nấm Linh chi có chứa khoảng 400 hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau có trong
loại nấm này. Polysaccharide, triterpenoid, germanium hữu cơ, ergosterol, nucleotit,
sterol, axit amin, axit béo, protein và các nguyên tố vi lượng là những hợp chất hoạt
động chính có các hoạt tính sinh học [4, 5]. Bảng 1.1 thể hiện một số hoạt chất sinh học
trong nấm Linh chi.
Bảng 1.1: Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi và cơng dụng
Hoạt chất

Nhóm chất

Hoạt tính dược lý

Adenosine và dẫn xuất

Nucleotit

Ganodosteron

Steroid

Giảm độc gan

Axit lanosporeric A

Steroid

Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Lonosterol

Steroid

Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Ganoderan A, B, C

Polysaccharide

Hạ đường huyết

Ức chế kết dính tiểu cầu,

3

thư giãn cơ, giảm đau


Beta–D–glucan

Polysaccharide Chống ung thư, tăng tính miễn dịch

BN–3B:1, 2, 3, 4

Polysaccharide

Tăng tính miễn dịch

D–6

Polysaccharide

Tăng sinh tổng hợp protein

Axit ganoderic R, S

Triterpenoid

Ức chế giải phóng histamine

Axit ganoderic B, D, F, H, K, Y Triterpenoid

Giảm huyết áp

Ganodermadiol

Triterpenoid

Giảm huyết áp

Axit ganodermic

Triterpenoid

Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Axit ganodermic T.O

Triterpenoid

Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Lucidone A

Triterpenoid

Tăng cường chức năng gan

Lucidenol

Triterpenoid

Tăng cường chức năng gan

Ganosporelacton A

Triterpenoid

Chống khối u

Ganosporelacton B

Triterpenoid

Chống khối u

1.1.4.1. Polysaccharide
Các polysaccharide của nấm Linh chi có tác dụng sinh học như kháng viêm, hạ đường
huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng miễn dịch,
kháng oxy hóa [6, 7]. Có trên 200 loại polysaccharide được phân lập từ nấm Linh chi,
trong đó chủ yếu gồm 2 loại chính là galactan và glucan. Đặc biệt, glucan có liên kết β
(β–glucan) là hoạt chất sinh học có nhiều cơng dụng quý, có lợi cho con người [8, 9].
β–glucan là một chuỗi các phân tử D–glucose liên kết bởi liên kết (1,3) –β hay (1,6) –β.
Các sản phẩm tự nhiên có chứa β–glucan đã được sử dụng rất lâu, nhưng β–glucan chỉ
mới được nghiên cứu trong những năm gần đây. Các nghiên cứu cho thấy các tác động
kích thích miễn dịch và được sử dụng để điều trị một số bệnh bao gồm ung thư, bệnh
truyền nhiễm, bệnh tiểu đường và các bệnh tim mạch [10, 11]. Cấu trúc hóa học của
hoạt chất β-glucan được trình bày như ở hình 1.2.
Một số sáng chế ở Nhật Bản như sản xuất chế phẩm trích ly từ Linh chi có tác dụng
kháng carcinogen của công ty Kureha Chemical Industry (1976), sản xuất sản phẩm
trích ly từ Linh chi có gốc glucoprotein làm ức chế neoplasm của công ty Teikoko
Chemical Industry (1982) và bằng sáng chế Mỹ sản xuất từ Linh chi chất

4


mucopolysaccharide dùng để kháng ung thư của công ty Kureha Chemical Industry
(1976) [12, 13].

Hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm Linh chi [14]

1.1.4.2. Adenosine
Adenosine là một purine nucleoside được cấu tạo bởi một phân tử adenine gắn với
một phân tử đường ribose thông qua liên kết glycoside như thể hiện ở hình 1.3 [15].

Hình 1.3: Adenosine
Các dẫn xuất của adenosine được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên, tế bào của cơ thể
con người và đóng vai trị quan trọng trong các q trình sinh hóa trong cơ thể, như là
nguồn gốc hình thành nên adenosine triphosphate (ATP) – “đồng tiền năng lượng” của
tế bào cũng như dẫn truyền tín hiệu cho sự làm việc của nhiều hệ cơ quan. Hình 1.4 thể
hiện cơng thức hố học của ATP.

Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của ATP
5


Adenosine đã được chứng minh là có khả năng ổn định huyết áp, điều trị và phòng
ngừa các bệnh về tim mạch, tăng cường q trình tuần hồn oxy trong máu, cải thiện
khả năng sinh lý, ổn định thần kinh và hỗ trợ hoạt động của hệ thần kinh.
1.1.4.3. Pectit, protein
Năm 1989, các tác giả người Nhật đã phân lập từ sợi nấm Linh chi một polypeptit
dựa trên sắc ký lọc gel (cột Saphadex G-10) và sắc kí trao đổi ion (cột DEAE Sephadex25).
Protein trong nấm Linh chi có chứa tất cả các axit amin thiết yếu, rất giàu lysin và
leucin. Tổng hàm lượng chất béo thấp và tỷ lệ cao các đa axit béo khơng bão hồ tương
đối so với tổng số axit béo của nấm được coi là đóng góp đáng kể cho giá trị của nấm
Linh chi [16].
1.1.4.4. Nhóm phenolic
Các hợp chất phenolic là một trong những hợp chất hoạt tính sinh học quan trọng và
được chiết xuất phổ biến nhất từ nấm Linh chi. Các hợp chất này có thể được phân thành
phenol đơn giản và axit phenolic như axit gallic, axit benzoic, axit syringic, axit
chlorogenic và polyphenol [17]. Flavonoid là một nhóm các hợp chất polyphenol với

các đặc tính có lợi cho sức khỏe đã biết bao gồm loại bỏ gốc tự do, ức chế các enzym
thủy phân và oxy hóa và hoạt động chống viêm. Các hợp chất phenolic có các đặc tính
sinh học và dược lý mạnh. Cao chiết phenolic của quả thể và sợi nấm có khả năng chống
oxy hóa cao hơn so với polysaccharide được trích ly từ nấm Linh chi.
1.1.4.5. Saponin
Ssaponin hay saponosid thường được định nghĩa trên cở sở cấu trúc hố học đó là các
triterpen glycosid hay các 27-C steroid glycosid. Cấu trúc của saponin gồm hai phần là
phần đường và phần aglycon (hay genin). Phần aglycon thường được gọi là sapogenin.
Sapogenin có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30 cacbon hoặc steroid với 27 cacbon.
Dựa trên cấu trúc hố học của phần aglycon có thể chia saponin thành hai nhóm lớn
là saponin triterpenoid và saponin steroid.
Cấu trúc phần genin của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi các đơn vị
terpen. Các saponin này được chia làm hai loại là saponin triterpenoid 5 vòng và saponin
triterpenoid 4 vịng. Saponin triterpenoid 5 vịng có phần sapogenin với khung 30 cacbon
với 5 vịng và 8 nhóm methyl. Nhóm này được chia thành 5 nhóm nhỏ là oleanan, ursan,

6


teraxasteran và hopan. Saponin triterpenoid 4 vịng có 4 nhóm dammaran, lanostan,
tirucallan và cucurbitan.
Triterpenoid
Khoảng 140 loại triterpenoid đã được xác định trong nấm Linh chi, hầu hết
triterpenoid loại lanostane. Chính các triterpenoid này làm cho nấm Linh chi có vị đắng.
Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ sáu đơn vị isopren. Các triterpenoid
có bộ khung chính từ 30 nguyên tử carbon (C30H48) thường gặp trong thực vật. Các
triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (khơng có phần đường), có cấu trúc vịng, mang một
số nhóm chức như: -OH, -O-, C=O, v.v. Đặc tính chung là tan tốt trong etanol, metanol,
ít tan trong nước ngoại trừ khi kết hợp với đường để tạo thành glycosid. Các triterpenoid
có độ nhớt vừa phải và tạo vị đắng trong nấm Linh chi [18, 19].

Các triterpenoid đầu tiên được phân lập từ nấm Linh chi là axit ganoderic A và B.
Đến nay, các nghiên cứu cho thấy đã có hơn 100 triterpenoid. Trong số đó, hơn 50
triterpenoid mới được tìm thấy trong Linh chi, chủ yếu là axit ganoderic, lucidenic và
những triterpenoid khác như ganoderals và ganoderiols [20, 21].
Phần lớn cấu trúc hóa học của triterpenoid trong nấm Linh chi dựa trên cấu trúc của
lanostane là một chất chuyển hóa của lanosterol, tổng hợp dựa trên sự tạo vòng của các
squalene [22, 23]. Hình 1.5 mơ tả cấu trúc của một dạng khung lanostane điển hình.

Hình 1.5: Khung lanostane
Theo thống kê có hơn một trăm triterpenoid đã được phân lập từ nấm Linh chi. Các
hợp chất này được chứng minh là có tác dụng tốt đối với sức khỏe. Đây là một trong
những hợp chất quan trọng đã được nghiên cứu về dược tính trong thành phần của nấm
Linh chi. Các tác dụng của triterpenoid có thể kể đến như: khả năng kháng oxy hóa,
giảm huyết áp, tăng cường chức năng gan, hạn chế khối u và giảm các triệu chứng của
ung thư, ức chế giải phóng histamin, ức chế tổng hợp cholesterol, hỗ trợ điều trị bệnh
Herpes và hạn chế sự hoạt động của HIV-1 protease [24].
7


Hoạt tính sinh học của triterpenoid
Kháng oxy hố
Gốc tự do là các ngun tử hoặc phân tử có lớp ngồi cùng chứa một điện tử đơn lẻ.
Do đó, khơng cân bằng về điện tử, dễ tạo ra phản ứng chiếm đoạt điện tử bị thiếu từ các
nguyên tử hay phân tử khác để trở về trạng thái ổn định. Đồng thời, các phân tử bị tấn
công và mất electron sẽ trở thành gốc tự do mới, bắt đầu một phản ứng dây chuyền và
gây rối loạn hoạt động bình thường của tế bào [25].
Bản chất gốc tự do là nhóm nguyên tử mang electron độc thân như superoxide,
hydroxyl, peroxyl, alkoxyl. Các gốc tự do này kém bền, hoạt động hóa học cực mạnh
theo phản ứng dây chuyền, khi phân tử nào bị chiếm electron phân tử đó sẽ trở thành
gốc tự do mới [26].

Các gốc tự do có xu hướng bao phủ lên bề mặt của màng tế bào và oxy hóa màng tế
bào. Điều này ngăn cản tế bào hấp thu oxy, nên gây ra tình trạng thiếu oxy cho tế bào,
đồng thời cũng gây cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào như: cản trở sự tổng hợp
các phân tử chất đạm, đường, bột, mỡ, phá hủy các enzym và hormone của cơ thể, v.v.
Bên cạnh đó, gốc tự do cũng phá vỡ màng tế bào, tấn công các ty thể, phá vỡ nguồn
cung cấp năng lượng làm thất thoát các chất dinh dưỡng và làm suy yếu chức năng của
tế bào, dẫn đến chết tế bào hoặc các tế bào có ADN bị lỗi, đột biến gen. Đây là nguyên
nhân dẫn đến các tổn thương như: biến đổi cấu trúc protein, thay đổi nội tiết tố, kích
thích các mầm bệnh và dẫn đến các chứng bệnh: xơ vữa động mạch, tiểu đường, tai biến
và ung thư. Chất kháng oxy hóa hay cịn gọi là chất bắt gốc tự do giúp ngăn chặn q
trình oxy hóa diễn ra bằng cách trung hòa các gốc tự do. Chất kháng oxy hóa được chia
thành hai loại: chất kháng oxy hóa nội sinh (có bản chất enzym) và chất kháng oxy hóa
ngoại sinh (khơng có bản chất enzym). Trong cơ thể sống ln có một hệ thống các
enzym nội bào có thể phân cắt các gốc tự do trở thành các phân tử ít nguy hại: superoxide
dismuatase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) với sự kết hợp các
nguyên tố kim loại vi lượng như Se, Mn, Cu, Fe và Zn. Khi cơ thể mất cân bằng, q
trình oxy hóa diễn ra mạnh hơn q trình kháng oxy hóa. Việc vơ hiệu hóa gốc tự do và
phục hồi tế bào bị tổn thương bằng các chất kháng oxy hóa sẽ tăng cường hệ thống miễn
dịch, ngăn ngừa bệnh tật và làm chậm q trình lão hóa. Các chất kháng oxy hóa có khả
năng giải phóng ra những điện tử hoặc proton H+ cho các gốc tự do, vơ hiệu hóa khả

8


năng oxy hóa và ngăn chặn sự tấn cơng các tế bào khỏe mạnh [27]. Hình 1.6 thể hiện cơ
chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử.

Cho điện tử

Chất chống oxy hố

Electron tự do

Gốc tự do

Hình 1.6: Cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử
Chất kháng oxy hóa đa số có tính khử, đóng vai trị như những tác nhân thu bắt gốc
tự do từ đó làm chậm tiến trình oxy hóa gây hại. Những hoạt chất như tocopherol
(vitamin E), axit ascorbic (vitamin C), epigallocatechin-3-gallate (EGCG), axit gallic,
tannin, catechin, caroten và glutathione từ lâu đã được chứng minh có khả năng bắt gốc
tự do mạnh nên những chất này thường được sử dụng làm đối chứng khi khảo sát tính
kháng oxy hóa của dược liệu, cũng như cần bổ sung các chất này khi cơ thể con người
bị stress [28, 29] .
Nhờ cơ chế khử các gốc tự do sinh ra trong q trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm
xạ mà các cơ quan bị tổn thương được phục hồi và ngăn chặn sự tấn cơng các tế bào gây
ra sự lão hóa cơ thể. Ngoài ra, triterpenoid là tiền thân của steroid, một loại hợp chất tham
gia cấu tạo nên các màng tế bào, do đó triterpenoid cịn giúp trẻ hóa các tế bào trong cơ
thể [30].
Ngồi những lợi ích trên, triterpenoid trong nấm Linh chi cịn tham gia vào q trình
truyền xung thần kinh lên não, từ đó giúp hỗ trợ tăng cường sức mạnh hệ thần kinh,
kiểm sốt và duy trì sự hoạt động ổn định của cả hệ thống cơ thể [31].
Kháng ung thư
Nguyên nhân chính cho sự phát triển của khối u là rối loạn hoặc hệ thống miễn dịch
hoạt động kém. Các nghiên cứu về khả năng kháng ung thư của triterpenoid cho thấy,
các triterpenoid tự do liên kết với nhau một cách chặt chẽ hình thành nên axit ganoderic
9


chống viêm và kháng nguyên lại các khối u. Ngoài ra, triterpenoid cịn có thể điều chỉnh
và kích hoạt hệ thống miễn dịch giúp tăng cường chức năng miễn dịch cơ thể và tăng

khả năng tự vệ chống lại ung thư [32, 33].
Các triterpenoid tác động đến các tế bào ung thư thơng qua 3 tác động chính là kìm
hãm tế bào, ngăn tế bào chết và chống di căn. Các hợp chất này kích thích tế bào ung
thư chết theo chu trình Apoptosis. Apoptosis hay cịn gọi là tế bào chết theo chu trình là
một hiện tượng đóng vai trị quan trọng trong nhiều q trình sinh lý xảy ra trong cơ thể
con người. Cơ thể con người có khoảng 60 nghìn tỷ tế bào và mỗi tế bào đều được quy
định tuổi thọ tối đa. Chúng được lập trình để tự tái tạo sau khoảng thời gian hoạt động
nhất định. Tuy nhiên, tế bào ung thư lại có khả năng sống “bất tử” trong cơ thể, hơn nữa
còn liên tiếp nhân đơi mất kiểm sốt. Các saponin triterpenoid giúp thúc đẩy quá trình
tự chết của tế bào ung thư, buộc các tế bào ung thư phải tuân theo q trình tự chết như
bình thường, từ đó ức chế sự tăng trưởng và phát triển của ung thư. Triterpenoid Rh2
gây giảm điện thế màng ty thể và giải phóng cytochrome c từ ty thể, dẫn đến kích hoạt
caspase 3 và 9. Cytochrome c được phóng thích khỏi ti thể, các cytochrome c được
phóng bám vào các nhân tố kích hoạt protease chết rụng -1 (apoptotic protease activating
factor - 1, Apaf-1) và ATP khiến chúng trải qua quá trình oligomer hóa và trở thành một
phức hợp mang tên thể chết rụng (apoptosome) như thể hiện ở hình 1.7 [34].

10


Triterpenoid
Triterpenoid

Thụ thể
Bên trong tế bào

chết
Triterpenoid

Tế bào chết theo

chu kì
Hình 1.7: Ảnh hưởng của triterpenoid đến quá trình tế bào chết theo chu kì
Kháng khuẩn
1.2.3.1. Sơ lược về vi khuẩn
Vi khuẩn có thể được phân biệt Gram âm và Gram dương do sự khác nhau cấu tạo và
tính chất của màng tế bào. Vi khuẩn Gram dương và Gram âm có sự khác biệt về cấu
tạo hình thái. Vi khuẩn Gram dương có màng peptidoglycan dày, khơng có màng ngồi
tế bào, giữ lại màu tím thuốc nhuộm [35]. Trong khi đó, vi khuẩn Gram âm có màng
peptidoglycan mỏng kẹp giữa lớp màng tế bào bên trong và bên ngoài của vi khuẩn,
không thể giữ lại màu thuốc nhuộm sau bước khử màu. Do đó, trong đề tài này, tiến
hành nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao chiết triterpenoid trong nấm Linh chi.
a. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (S. aureus) còn gọi là tụ cầu vàng, là những cầu khuẩn Gram
dương có đường kính từ 0,8 – 1,0 µm, khơng có lơng và nha bào, thường khơng có vỏ
như thể hiện ở hình 1.8.

11