Nghiên cứu quá trình lên men sinh tổng hợp gamma aminobutyric acid (gaba) từ môi trường hạt bụp giấm sử dụng chủng lactobacillus plantarum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ BÍCH LIÊN

NGHIÊN CỨU Q TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
GAMMA AMINOBUTYRIC ACID (GABA) TỪ MÔI TRƯỜNG
HẠT BỤP GIẤM SỬ DỤNG CHỦNG LACTOBACILLUS
PLANTARUM

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2017


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Ðại học Bách Khoa – ÐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. Trần Thị Ngọc Yên
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1 : ........................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2 : ........................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Ðại học Bách Khoa, ÐHQG Tp. HCM
ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1. ............................................................
2. ............................................................
3. ............................................................
4. ............................................................
5. ............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA


ÐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ÐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ðộc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Bích Liên

MSHV: 1570427

Ngày, tháng, năm sinh: 20/09/1988

Nơi sinh: Bình Định

Chun ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm

Mã số : 60540101

I. TÊN ÐỀ TÀI:
Nghiên cứu quá trình lên men sinh tổng hợp Gamma Aminobutyric acid (GABA)
từ môi trường hạt bụp giấm sử dụng chủng Lactobacillus plantarum.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Xác định thành phần hóa học cơ bản của hạt bụp giấm
 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lí nguyên liệu đến sự tổng hợp GABA.
 Khảo sát các điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp GABA.
 Khảo sát ảnh hưởng việc xử lí enzyme protease đến q trình tổng hợp GABA.
 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung coenzyme Pyridoxal 5-Phosphate (PLP)
đến quá trình sinh tổng hợp GABA.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 16/01/2017
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 18/06/2017
IV. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. Trần Thị Ngọc Yên
Tp. HCM, ngày 18 tháng 06 năm 2017
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ÐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC


Luận văn thạc sĩ

i

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hồn thành đƣợc nghiên cứu này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
cơ Trần Thị Ngọc n đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện luận
văn này một cách thuận lợi nhất.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ
thực phẩm, các bạn làm chung phịng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ để tơi có thể
hồn thành luận văn này đúng thời hạn.
Đặc biệt, tơi xin gửi cảm ơn đến gia đình, bạn bè những ngƣời đã luôn ủng hộ,
động viên tôi để tôi có thể vƣợt qua những khó khăn trong q trình thực hiện luận văn
này.
Tp. HCM, ngày 10 tháng 06 năm 2017
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Bích Liên

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Hạt bụp giấm là một nguồn nguyên liệu dồi dào nhƣng hầu nhƣ chỉ đƣợc xem
nhƣ một phế liệu ở nƣớc ta. Nghiên cứu này tận dụng nguồn phế liệu hạt bụp giấm để
lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học Gamma aminobutyric acid (GABA), sử dụng
chủng Lactobacillus plantarum, nhằm mở đầu cho việc sản xuất GABA với chi phí
thấp và nâng cao giá trị cây bụp giấm ở nƣớc ta.
Nghiên cứu khảo sát các điều kiện xử lý nguyên liệu hạt bụp giấm để tạo dịch
lên men GABA và các điều kiện lên men tối ƣu để sản xuất hàm lƣợng GABA cao

nhất. Kết quả cho thấy quá trình xử lý hạt bụp giấm tối ƣu là: bột hạt bụp giấm đƣợc
tách béo, ngâm với tỷ lệ nguyên liệu : nƣớc = 1: 20 (w/v), tách bã khỏi dịch bụp giấm
trƣớc khi lên men. Các thơng số tối ƣu của q trình lên men là: pH ban đầu = 5, nhiệt
độ 350C, tỷ lệ giống cấy 15 % , hàm lƣợng saccharose bổ sung là 5 %, thời gian lên
men 36 giờ. Việc xử lý nguyên liệu với enzyme proteinase (Flavourzyme) ở nồng độ 4
% (w/w) sẽ cho hàm lƣợng GABA tăng 1,44 lần. Bổ sung coenzyme PLP ở hàm lƣợng
tối ƣu là 100 μg/ml sẽ làm hàm lƣợng GABA tăng lên 1,34 lần.
Quá trình lên men tổng hợp GABA từ hạt bụp giấm cho hàm lƣợng GABA là
19,86 mg/g bụp giấm ở các điều kiện tối ƣu trong nghiên cứu này. Nhƣ vậy, hạt bụp
giấm thể hiện là một nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất GABA. Đồng thời cũng cho
thấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum có khả năng sản xuất GABA tốt.

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

iii

ABSTRACT

Hibiscus sabdariffa L. (Roselle) seed is a plentiful material source, but almost
considered as a scrap in our country. This study use Hibiscus sabdariffa L. (Roselle)
seed as a material of gamma aminobutyric acid (GABA) biosynthesis by fermentation,
using

Lactobacillus plantarum strain. This study aim to initiate low-cost GABA

production and enhance the value of Hibiscus Sabdariffa L. seed in our country.
This study investigated the treatment method of Hibiscus sabdariffa L. seed to

prepare for GABA fermentation medium and optimum fermentation conditions to
produce the highest GABA content. The results showed that the optimal treatment of
Hibiscus sabdariffa L. seed is: defatted Hibiscus sabdariffa L. seed flour, immersed
with ratio of flour : water = 1: 20 (w/v). The optimal parameters of fermentation
conditions are: initial pH = 5, temperature of 350C, ratio of culture 15 %, saccharose
addition of 5%, fermentation time of 36 hours. The treatment of raw materials with
enzyme proteinase (Flavourzyme) at concentration 4 % (w/w) will increase GABA
content to 1,44 times. The adition of coenzyme PLP at an optimum concentration of
100 μg/ml will increase the GABA content to 1,34 times.
The GABA fermentation from Hibiscus sabdariffa L. seed gained concentration
of GABA was 19,86 mg/g material at optimal conditions in this study. Therefore,
Hibiscus sabdariffa L. seed showed that it is a good material for GABA production. It
also has been shown that Lactobacillus plantarum have good capability of GABA
producing.

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tơi thực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn của cô Trần Thị Ngọc Yên. Các kết quả trong luận văn là đúng sự thật và
chƣa đƣợc công bố ở các nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Bích Liên

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. .i
TÓM TẮT LUẬN VĂN ................................................................................................. ii
ABSTRACT ................................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... .iv
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... .ix
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... ..x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ xii
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài và nội dung nghiên cứu ............................................................. 2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................... 2
1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 2
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................ 2
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................. 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................ 3
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN ............................................................................................ 4
2.1. Tổng quan về GABA ................................................................................................ 4

2.1.1. Giới thiệu về GABA .......................................................................................... 4
2.1.2. Cơ chế tổng hợp GABA ở ngƣời ....................................................................... 5
2.1.3. Chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể ngƣời .......................................... 7
2.1.3.1. Hoạt động của GABA trong hệ thần kinh ngƣời ........................................ 7
2.1.3.2. Các chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể ngƣời ............................ 8
2.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp GABA bởi vi sinh vật ................................................... 10
2.1.4.1. Cơ chế tổng hợp........................................................................................ 10
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

vi

2.1.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp GABA bởi vi sinh vật ..... 14
2.2. Tổng quan về bụp giấm ........................................................................................... 20
2.2.1. Cây bụp giấm ................................................................................................... 20
2.2.2. Thành phần hóa học của hạt bụp giấm ............................................................ 22
2.2.2.1. Protein ....................................................................................................... 23
2.2.2.2. Chất béo .................................................................................................... 25
2.2.2.3 Carbohydrate ............................................................................................. 27
2.2.2.4. Khoáng chất và vitamin ............................................................................ 28
2.2.2.5. Một số thành phần độc tố và kháng dinh dƣỡng trong hạt bụp giấm ....... 29
2.3. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus plantarum ................................................... 30
2.3.1. Phân lớp, hình thái, đặc tính sinh hóa .............................................................. 30
2.3.2. Các con đƣờng trao đổi chất ............................................................................ 31
2.3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng .................................................................................. 33
2.4. Tình hình nghiên cứu về GABA trong và ngoài nƣớc ............................................ 34
2.4.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc về sản xuất GABA .............................................. 34
2.4.2. Các nghiên cứu trong nƣớc về sản xuất GABA .............................................. 35

CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 37
3.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 37
3.1.1. Hạt bụp giấm .................................................................................................... 37
3.1.2. Vi sinh vật ........................................................................................................ 37
3.1.3. Enzyme proteinase ........................................................................................... 37
3.1.4. Các vật liệu và hóa chất khác........................................................................... 38
3.1.5. Máy móc, thiết bị sử dụng ............................................................................... 39
3.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 39
3.2.1. Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 39
3.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 41
3.2.2.1. Quy trình lên men sinh tổng hợp GABA và phân tích mẫu ..................... 41
3.2.2.2. Khảo sát thành phần hóa học của hạt bụp giấm ....................................... 45
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

vii

3.2.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của chất béo trong nguyên liệu................................ 46
3.2.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của bã nguyên liệu ................................................... 46
3.2.2.5. Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu và nƣớc ........................................ 47
3.2.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của pH ..................................................................... 48
3.2.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................. 49
3.2.2.8. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giống cấy................................................... 50
3.2.2.9. Khảo sát hàm lƣợng đƣờng saccharose bổ sung ...................................... 51
3.2.2.10. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men ............................................ 51
3.2.2.11. Khảo sát ảnh hƣởng của enzyme proteinase (Flavourzyme).................. 52
3.2.2.12. Khảo sát hàm lƣợng coenzyme PLP bổ sung ......................................... 53
3.2.2.13. Xác định hàm lƣợng GABA tối ƣu bằng phƣơng pháp HPLC .............. 54

3.3. Các phƣơng pháp phân tích ..................................................................................... 55
3.3.1. Xác định hàm lƣợng ẩm ................................................................................... 55
3.3.2. Xác định hàm lƣợng tro tổng ........................................................................... 55
3.3.3. Xác định hàm lƣợng protein thô (nitơ tổng) .................................................... 55
3.3.4. Xác định hàm lƣợng lipid ................................................................................ 55
3.3.5. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử ...................................................................... 55
3.3.6. Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng và tinh bột ................................................... 55
3.3.7. Xác định số tế bào vi sinh vật .......................................................................... 55
3.3.8. Xác định hàm lƣợng GABA và glutamic ........................................................ 55
3.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 55
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 56
4.1. Thành phần hóa học của hạt bụp giấm .................................................................... 56
4.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu ......................................................... 57
4.2.1. Ảnh hƣởng của chất béo trong nguyên liệu ..................................................... 57
4.2.2. Ảnh hƣởng của bã nguyên liệu ........................................................................ 59
4.2.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu và nƣớc của dịch lên men ................................. 60
4.3. Kết quả khảo sát điều kiện lên men GABA ............................................................ 63
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

viii

4.3.1. Ảnh hƣởng của pH dịch lên men ..................................................................... 63
4.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men ..................................................................... 66
4.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống cấy ........................................................................ 68
4.3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccharose bổ sung .............................................. 70
4.3.5. Ảnh hƣởng của thời gian lên men .................................................................... 72
4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của enzyme proteinase .............................................. 75

4.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của coenzyme pyridoxal 5- phosphate (PLP) ........... 79
4.6. Xác định hàm lƣợng GABA tại các điều kiện tối ƣu bằng HPLC .......................... 81
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 83
5.1. Kết luận ................................................................................................................... 83
5.2. Kiến Nghị ................................................................................................................ 84
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 85
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... .92

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các chức năng sinh lý của GABA [4] .............................................................. 9
Bảng 2.2. Hệ thống GAD trong các vi sinh vật [5]........................................................ 12
Bảng 2.3. Hàm lƣợng GABA tạo ra bởi các vi sinh vật khác nhau [2] ......................... 15
Bảng 2.4. Thành phần hóa học của hạt bụp giấm [18]................................................... 22
Bảng 2.5. Thành phần các loại protein của hạt bụp giấm [20] ...................................... 23
Bảng 2.6. Thành phần amino acid trong hạt bụp giấm [17] .......................................... 24
Bảng 2.7. Thành phần acid béo trong dầu hạt bụp giấm [17] ........................................ 25
Bảng 2.8. Tính chất hóa học của dầu hạt bụp giấm [21]................................................ 26
Bảng 2.9. Hàm lƣợng các sterol trong dầu hạt bụp giấm [22] ....................................... 27
Bảng 2.10. Thành phần chất các loại chất xơ hạt bụp giấm [17] ................................... 27
Bảng 2.11. Thành phần khoáng trong hạt bụp giấm [23] .............................................. 28
Bảng 2.12. Thành phần các vitamin trong hạt bụp giấm [21], [24], [25] ...................... 28
Bảng 2.13. Một số thành phần khác trong hạt bụp giấm [26] ........................................ 29

Bảng 2.14. Phân lớp của vi khuẩn Lactobacillus plantarum [32] ................................. 31
Bảng 3.1. Các vật liệu, hóa chất sử dụng ...................................................................... 37
Bảng 3.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 40
Bảng 4.1. Thành phần hóa học của hạt bụp giấm .......................................................... 56
Bảng 4.2. Kết quả sinh tổng hợp GABA của nghiên cứu ............................................. 83

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cơng thức cấu tạo của GABA [6] .................................................................... 4
Hình 2.2. Chu trình chuyển hóa GABA ở não ngƣời (GABA shunt)[8] ......................... 6
Hình 2.3. Hoạt động của GABA ở hệ thần kinh ngƣời [8] .............................................. 8
Hình 2.4. Cơ chế quá trình sản xuất GABA bởi vi sinh vật [5] ..................................... 12
Hình 2.5. Hệ thống GADe và GADi ở vi khuẩn Listeria monocytogenes [5] ............... 13
Hình 2.6. Chu trình GABA shunt ở vi sinh vật hiếu khí [5] .......................................... 13
Hình 2.7. Phản ứng tổng hợp GABA bởi GAD ............................................................. 14
Hình 2.8. Sơ đồ quá trình trao đổi chất của Lactobacillus plantarum [28] .................... 33
Hình 2.9. Đƣờng cong sinh trƣởng của Lb. plantarum 2L2 ở điều kiện kị khí [33] ...... 33
Hình 3.1. Hạt bụp giấm trƣớc và sau khi xay ................................................................ 37
Hình 3.2. Quy trình lên men GABA .............................................................................. 42
Hình 4.1. Hàm lƣợng GABA của các mẫu sau lên men ................................................ 57
Hình 4.2. Tổng số VSV của các mẫu sau lên men ......................................................... 58
Hình 4.3. Hàm lƣợng GABA của các mẫu sau lên men ................................................ 59
Hình 4.4. Tổng số VSV của các mẫu trƣớc và sau lên men .......................................... 59

Hình 4.5. Hàm lƣợng GABA của các mẫu sau lên men ................................................ 61
Hình 4.6. Tổng số VSV của các mẫu trƣớc và sau lên men .......................................... 61
Hình 4.7. Hàm lƣợng GABA của các mẫu sau lên men ................................................ 63
Hình 4.8. Sự thay đổi pH của các mẫu sau 24 giờ lên men ........................................... 64
Hình 4.9. Tổng số VSV các mẫu trƣớc và sau lên men ................................................. 64
Hình 4.10. Hàm lƣợng GABA của các mẫu lên men..................................................... 66
Hình 4.11. Tổng số VSV của các mẫu trƣớc và sau lên men ........................................ 67
Hình 4.12. Hàm lƣợng GABA của các mẫu sau lên men .............................................. 69
Hình 4.13. Tổng số VSV trƣớc và sau lên men ............................................................. 69
Hình 4.14. Hàm lƣợng GABA của các mẫu sau lên men .............................................. 70
Hình 4.15. Tổng số VSV trƣớc và sau lên men ............................................................. 71
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn thạc sĩ

xi

Hình 4.16. Hàm lƣợng GABA theo thời gian lên men .................................................. 73
Hình 4.17. Sự thay đổi pH của các mẫu theo thời gian lên men .................................... 73
Hình 4.18. Tổng VSV của các mẫu theo thời gian lên men .......................................... 74
Hình 4.19. Kết quả chạy TLC của thí nghiệm enzyme proteinase ................................ 76
Hình 4.20. Sự thay đổi hàm lƣợng glutamic của dịch lên men ...................................... 77
Hình 4.21. Hàm lƣợng glutamic vi khuẩn Lb. plantarum đã sử dụng ........................... 78
Hình 4.22. Ảnh hƣởng của enzyme proteinase đến hàm lƣợng GABA......................... 78
Hình 4.23. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng PLP bổ sung ..................................................... 80
Hình 4.24. Sắc ký đồ định lƣợng GABA bằng HPLC .................................................. .82

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên

Luận văn thạc sĩ

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
LAB

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

Lactic acid bacteria

Vi khuẩn lactic

Lb

Lactobacillus

Lactobacillus

Lc

Lactococus

Lactococus

GABA

Gamma Aminobutyric Acid

Axít gamma aminobutyric

GABAe

GABA extracellular

GABA ngoại bào

GABAi

GABA intracellular

GABA nội bào

GABA α-oxoglutarate

GABA α-oxoglutarate

transaminase

transaminase

GAD

Glutamic acid decarboxylase

Axít glutamic decarboxylase

Glte

Glutamate extracellular

Glutamate ngoại bào

Glti

Glutamte intracellular

Glatamate nội bào

MSG

Monosodium Glutamate

Mononatri glutamate

PLP

Pyridoxal-5’-phophate

Pyridoxal-5’-phophate

SSADH

Succinic semialdehyde

Succinic semialdehyde

dehydrogenase

dehydrogenase

Microorganism

Vi sinh vật

GABA–T

VSV

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

1

CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1. Lý do chọn đề tài
Gamma Aminobutyric Acid (GABA) là một acid amin phi protein có chức năng
quan trọng trong hoạt động của hệ thần kinh người. GABA giống như một loại thuốc
an thần tự nhiên được não bộ sản xuất ra để giúp giảm bớt các hiện tượng: căng thẳng,
lo lắng, mất ngủ…[4]. Ngày nay, GABA đã được các nhà khoa học chứng minh là có
tác dụng hỗ trợ điều trị, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về thần kinh như:
Huntington, Parkinson, Alzheimer, trầm cảm, …và làm chậm sự phát triển của các tế

bào ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư gan…[4]. Thông thường, não bộ sẽ tiết ra
lượng GABA chúng ta cần, nhưng với chế độ ăn uống kém, tiếp xúc với nhiều chất độc
hại từ môi trường, não bộ sẽ bị quá tải và không thể nào đáp ứng đủ lượng GABA cần
thiết. Do đó, việc bổ sung GABA như một dạng thực phẩm chức năng là rất cần thiết
để duy trì một cơ thể khỏe mạnh. Vì vậy việc sản xuất GABA rất được các nhà nghiên
cứu quan tâm trong những năm gần đây.
Hiện nay GABA được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau như: tách
chiết từ ngũ cốc nảy mầm, lên men bằng vi sinh vật (VSV) trên các nguyên liệu cám
gạo, dịch nho, rong biển, đậu nành… Trong đó phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn
lactic như: Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei…
đã đem lại hiệu quả cao trên một số nguyên liệu. Tuy nhiên chi phí sản xuất GABA
bằng phương pháp lên men vẫn khá cao do việc tạo một môi trường dinh dưỡng phù
hợp cho quá trình lên men khá tốn kém. Do đó việc tìm một nguồn ngun liệu để sản
xuất GABA với chi phí thấp hơn đang là vấn đề rất được quan tâm nghiên cứu.
Hạt bụp giấm ở nước ta từ trước đến nay chỉ được xem như một loại phế liệu ít có
giá trị sử dụng và thường bị thải bỏ. Nhưng hạt bụp giấm chứa hàm lượng dinh dưỡng
cao như: tổng carbohydrate là 38 %, giàu vitamin và khoáng chất, đặc biệt hàm lượng

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

2

protein lên đến 30,11 %, trong đó tỷ lệ acid glutamic chiếm 21,78 % [1]. Do đó, hạt
bụp giấm là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc sản xuất GABA với chi phí thấp.
Xuất phát từ những yêu cầu của thực tiễn, đề tài “Nghiên cứu quá trình lên men
sinh tổng hợp Gamma Aminobutyric acid (GABA) từ môi trường hạt bụp giấm sử
dụng chủng Lactobacillus plantarum” đã được lựa chọn thực hiện.

1.2. Mục tiêu của đề tài và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
Tối ưu hóa q trình lên men để sinh tổng hợp GABA đạt hiệu suất cao từ hạt bụp
giấm, sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
 Xác định thành phần hóa học cơ bản của hạt bụp giấm
 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến sự tổng hợp GABA.
 Xác định các điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp GABA.
 Khảo sát ảnh hưởng việc xử lý enzyme protease đến quá trình tổng hợp GABA.
 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung coenzyme Pyridoxal 5-Phosphate (PLP)
đến quá trình sinh tổng hợp GABA.
1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình lên men sinh tổng hợp GABA từ môi
trường hạt bụp giấm bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum.
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu hạt bụp giấm và xác định các điều kiện quá
trình lên men sinh tổng hợp GABA.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
 Khảo sát hạt bụp giấm như một nguồn nguyên liệu mới tiềm năng để sản xuất
GABA đạt hiệu quả cao.

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

3

 Thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp GABA của chủng Lactobacillus plantarum
trên môi trường dịch hạt bụp giấm.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
 Tận dụng nguồn phế liệu bụp giấm để sản xuất thực phẩm chức năng GABA
 Mở đầu cho việc sản xuất GABA chi phí thấp ở quy mô công nghiệp
 Nâng cao giá trị kinh tế của cây bụp giấm

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

4

CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về GABA
2.1.1. Giới thiệu về GABA
GABA là một amino acid phi protein có 4 carbon, nó được tìm thấy trong tế bào
vi sinh vật (VSV), thực vật và động vật. GABA được phát hiện lầu đầu tiên trong mô
củ khoai tây vào năm 1949 [2]. Chức năng của GABA ở các loài sinh vật vẫn chưa
được hiểu biết đầy đủ. Ở thực vật, GABA có vai trị trong việc chống lại các stress sinh
học từ môi trường như nồng độ muối cao, côn trùng, điều kiện ánh sáng thấp, sự xâm
nhập của vi khuẩn, virus…GABA cịn đóng vai trị trao đổi chất trong chu trình Krebs
và sự phát triển, sinh sản ở thực vật [3]. Ở động vật, GABA được tìm thấy với nồng độ
cao trong não, ngồi có vai trị trao đổi chất trong chu trình Krebs cịn đóng một vai trị
chính trong sự dẫn truyền thần kinh ức chế của hệ thần kinh trung ương và các mô
ngoại vi. Nó ngăn chặn các tín hiệu thần kinh kích thích giúp giảm căng thẳng, lo âu,
mất ngủ và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh thần kinh ở người [4]. Ở vi sinh vật, vai trò chủ
yếu của GABA là giúp vi sinh vật chống lại điều kiện pH thấp [2]. Ngồi ra, GABA
cịn liên quan đến sự nảy mầm bào tử của một số vi khuẩn [2]; tham gia vào chu trình

Krebs và chống lại điều kiện thiếu oxi ở một số vi khuẩn hiếu khí, chống lại muối mật,
áp suất thẩm thấu cao [5].

Hình 2.1. Cơng thức cấu tạo của GABA [6]
GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng α–decarboxyl không nghịch đảo
của acid L–glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic acid
decarboxylase (GAD). Enzyme này được tìm thấy ở vi sinh vật như: Lactobacillus,
Escherichia, Streptococcus, Aspergillus và Neurospora; ở thực vật như: trà, cà chua,
đậu nành, khoai tây, gạo lứt nảy mầm; và trong não của động vật có vú [4]. Ngồi ra,
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

5

GABA cịn được tìm thấy ở cơn trùng như: gián, châu chấu, sâu bướm và ong mật [4].
Tuy nhiên hiện nay người ta chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu sản xuất GABA
hơn là việc chiết tách GABA. Vi khuẩn Lactobacillus và nấm men là hai lồi quan
trọng nhất để sản xuất GABA vì chúng thường được sử dụng phổ biến trong sản xuất
thực phẩm lên men [4].
2.1.2. Cơ chế tổng hợp GABA ở ngƣời
Trong cơ thể người, GABA được phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ương
vào khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhưng đến năm 1960, GABA mới được đề
xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể. Ngoài não, GABA cũng có mặt
trong tế bào lympo B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hồn, ống tiêu hóa. GABA có chức
năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [7].
Quá trình tổng hợp và chuyển hóa GABA ở người cũng tương tự như ở thực vật,
động vật, được thực hiện theo chu trình “GABA shunt” (hình 2.2) bởi 3 enzyme chính:
enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD), GABA α-oxoglutarate transaminase

(GABA–T) và enzyme succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) [8].
“GABA shunt” là một chu trình khép kín với mục đích là để sản xuất và đảm
bảo sự cung cấp GABA. GABA có ở nồng độ cao (mM) trong nhiều vùng não. Nồng
độ này cao gấp 1.000 lần so với nồng độ các chất dẫn truyền thần kinh monoamine
thông thường trong cùng một vùng. Điều này phù hợp với tác động mạnh mẽ và
chuyên biệt của các nơron thần kinh GABAergic ở các vùng này. Glucose là tiền thân
chính cho sản xuất GABA trong cơ thể người, mặc dù pyruvate và các acid amin khác
cũng có thể đóng vai trò tiền thân. Bước đầu tiên trong “GABA shunt” là sự chuyển
hóa α-ketoglutarate (được hình thành từ chuyển hóa glucose trong chu trình Krebs) bởi
GABA α-oxoglutarate transaminase (GABA-T) tạo thành axit L-glutamic. Sau đó
enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) xúc tác cho việc khử nhóm cacboxyl của
acid glutamic (hoặc glutamate) để tạo thành GABA. GAD dường như chỉ được biểu

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

6

hiện trong các tế bào sử dụng GABA như một chất dẫn truyền thần kinh. Khi lượng
GABA sinh ra vượt q ngưỡng thì một tín hiệu thần kinh sẽ kích hoạt q trình
chuyển hóa GABA bởi GABA-T để hình thành succinic semialdehyde. Để bảo tồn
nguồn cung GABA, sự chuyển đổi này thường xảy ra khi có sẵn một phân tử αketoglutarate để nhận nhóm amin được loại bỏ khỏi GABA, để tạo thành glutamic acid.
Do đó, một phân tử GABA chỉ có thể được chuyển hóa nếu một phân tử glutamic được
hình thành. Succinic semialdehyde có thể bị oxy hóa bởi enzyme SSADH tạo thành
succinic acid và sau đó có thể quay lại chu kỳ Krebs, hồn thành vịng lặp [8].
Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ succinic semialdehyde
nhưng vai trò cơ bản của enzyme này là chuyển hóa GABA tạo thành succinic
semialdehyde. Ngoài ra, những chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra

một lượng lớn GABA ở trong não [9]. Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có
sự tham gia của vitamin B6 hay cịn được gọi là pyridoxal-5’-phophate (PLP) được
xem như một coenzyme [2].

Hình 2.2. Chu trình chuyển hóa GABA ở não ngƣời (GABA shunt)[8]

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

7

2.1.3. Chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể ngƣời
2.1.3.1. Hoạt động của GABA trong hệ thần kinh ngƣời
GABA được tổng hợp trong não, hoạt động bằng cách ngăn chặn tín hiệu não
(các dẫn truyền thần kinh kích thích) thơng qua các thụ thể GABA. GABA được tạo ra
bởi các tế bào thần kinh GABAergic, sau đó được phóng thích ra ngồi khe Synap,
khuếch tán trong khe Synap và gắn vào các thụ thể GABA. Các thụ thể GABA, nhận
biết và gắn kết GABA, nằm tại các màng sau khe Synap. Có 3 nhóm thụ thể GABA là
GABA-A, GABA-B, GABA-C [4].
GABA-A và GABA-C là thụ thể ức chế nhanh, có vai trị ngăn chặn các truyền
dẫn co giật, lo lắng, hoảng loạn và căng thẳng. Thụ thể GABA-A liên kết với một kênh
ion. Khi GABA kết hợp với thụ thể nó làm mở kênh ion cho phép ion Cl- xuyên qua
màng và đi vào trong tế bào thần kinh, làm tăng tính phân cực của màng tế bào thần
kinh, do đó các truyền dẫn thần kinh kích thích bị ngăn chặn [4].
Các thụ thể GABA-B làm trung gian cho sự ức chế chậm các truyền dẫn thần
kinh, là loại thụ thể chuyển hóa chất, có vai trị quan trọng trong trí nhớ, tâm trạng,
phản ứng đau. Khi GABA kết hợp với thụ thể GABA-B, sẽ tạo ra sự chuyển hóa của
một chất trung gian là G-protein, làm mở kênh ion K+ gần đó, cho phép ion K+ đi ra

ngoài tế bào thần kinh, làm tăng tính phân cực của màng tế bào thần kinh, do đó các
truyền dẫn thần kinh kích thích bị ngăn chặn [4].
Sau khi làm xong nhiệm vụ, GABA được tái hấp thụ ở các tế bào thần kinh trước
Synap (nơi tạo ra GABA) và các tế bào thần kinh đệm xung quanh bởi các protein vận
chuyển GABA (GAT). Các protein này hoạt động phụ thuộc nhiệt độ hoặc gradient
nồng độ, chênh lệch nồng độ GABA bên trong và bên ngoài khoảng 200 lần. GABA
được đưa trở lại các tế bào thần kinh GABAergic để tái sử dụng, nhưng GABA được
hấp thu vào các tế bào thần kinh đệm sẽ được chuyển hóa thành succinic semialdehyde
bởi enzyme GABA-T và khơng thể tái tổng hợp trong các tế bào này vì thiếu enzyme

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên


Luận văn Thạc sĩ

8

GAD. Cuối cùng, GABA có thể được phục hồi từ nguồn này bằng đường vịng qua chu
trình Krebs [8].

Hình 2.3. Hoạt động của GABA ở hệ thần kinh ngƣời [8]
2.1.3.2. Các chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể ngƣời
Ngày nay, GABA được các nhà khoa học chứng minh là chất có hoạt tính sinh
học mạnh, có nhiều chức năng sinh lý quan trọng và tác động tích cực cho sức khỏe
của con người. Các chức năng sinh lý của GABA thử nghiệm trên động vật và người
được tổng hợp ở bảng 2.1.

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên

Luận văn Thạc sĩ

9

Bảng 2.1 Các chức năng sinh lý của GABA [4]
Chức năng sinh lý

Chức năng cụ thể

Dẫn truyền thần kinh

Ức chế dẫn truyền thần kinh

Điều chỉnh huyết áp

Giảm huyết áp

Bệnh não

Làm giảm các rối loạn thần kinh
Tăng cường trí nhớ
Làm giảm các rối loạn tâm trạng

Bệnh liên quan hệ thần kinh

Tác dụng thư giãn
Làm giảm triệu chứng mất ngủ
Giảm phiền muộn
Phòng ngừa và điều trị các chứng nghiện rượu
Bảo vệ và chống lại bệnh thận mãn tính

Các cơ quan quan trọng

Kích hoạt chức năng gan
Cải thiện chức năng thị giác
Tăng tốc độ tổng hợp protein trong não

Hệ thống miễn dịch

Tăng khả năng miễn dịch
Làm chậm và ức chế tế bào ung thư tăng sinh

Bảo vệ và phòng chống ung thư

Kích thích các tế bào ung thư tự hủy diệt
Ức chế các khối u
Chống viêm và tăng sinh tế bào nguyên bào sợi

Điều chỉnh tế bào

Tổng hợp acid hyaluronic
Nâng cao hiệu suất của các nguyên bào sợi da

Tim mạch

Hệ hơ hấp
Điều chỉnh nội tiết tố

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên

Làm suy giảm các phản ứng trao đổi chất làm thiếu
máu cục bộ
Kiểm sốt bệnh suyễn
Kiểm sốt đường hơ hấp
Tăng hormone tăng trưởng


Luận văn Thạc sĩ

10

Kiểm soát bài tiết hormone
Kiểm soát progesterone
Kiểm sốt hormone tuyến giáp
Ngăn ngừa béo phì

2.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp GABA bởi vi sinh vật
2.1.4.1. Cơ chế tổng hợp
Ở vi sinh vật, vai trò chủ yếu của việc sản xuất GABA là giúp vi sinh vật chống
lại điều kiện pH thấp như ở: E.coli, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus brevis, Listeria monocyrogenes, Mycobacterium and Clostridium
perfringens… [2]. Ngoài ra, sản xuất GABA còn liên quan đến sự nảy mầm bào tử của
một số vi sinh vật như: Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Neurospora
crassa [2]. Việc sản xuất GABA còn tạo ra chất trung gian tham gia vào chu trình
Krebs và chống lại điều kiện thiếu oxi ở một số vi khuẩn hiếu khí như: E.coli, Listeria
monocytogenes,

chống

lại

muối

mật

ở

Lactobacillus

plantarum,

Listeria

monocyrogenes, kháng lại nisin ở Listeria monocyrogenes, Lactococcus lactis, chống
lại các stress oxi hóa như H2O2 ở Saccharomyces cerevisiae , chống áp suất thẩm thấu
cao ở E.coli [5].
Trong các vi sinh vật, việc sản xuất GABA cũng được thực hiện qua hệ thống
enzyme GAD. Hệ thống này được cho rằng chủ yếu liên quan đến sức đề kháng acid
của vi sinh vật, mặc dù cũng có một số vai trò khác như đã nêu ở trên. Hệ thống GAD
đã được mô tả như là cơ chế quan trọng nhất của tính kháng acid ở dịng vi khuẩn
Escherichia coli có khả năng chịu acid cao. Sự kháng acid sẽ cho phép các vi sinh vật
gây bệnh hoặc các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm phát triển trong các thực phẩm có
tính acid cao. Hơn nữa, đây cũng là yếu tố cho phép các mầm bệnh hoặc các probiotic
vượt qua điều kiện acid cực kỳ thấp của dạ dày. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu, sự

HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên