Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactobacillus sp có khả năng ức chế vi khuẩn helicobacter pylori

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐẶNG ĐÌNH HIỆP

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
LACTOBACILLUS SP. CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN
HELICOBACTER PYLORI

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG-TPHCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học
PGS.TS Nguyễn Thúy Hương
Cán bộ phản biện 1
PGS.TS Bùi Văn Lệ
Cán bộ phản biện 2
TS. Võ Đình Lệ Tâm
Luận văn thạc só được bảo vệ tại trường Đại Học Bách Khoa-ĐHQG
Tp.HCM, ngày 21 tháng 7 năm 2018
Thành phần hội đồng đánh giá luận văn gồm:
PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng
PGS.TS Bùi Văn Lệ

PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên
TS. Võ Đình Lệ Tâm
TS. Hoàng Anh Hoàng
Xác nhận của chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và trưởng khoa quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sữa chữa
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

GS.TS Phan Thanh Sôn Nam


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Đặng Đình Hiệp

MSHV: 7140860

Ngày, tháng, năm sinh: 1/4/1983

Nơi sinh: Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60 42 02 01

I. TÊN ĐỀ TÀI: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng ức chế vi
khuẩn Helicobacter pylori

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
x

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn lên men ở Việt nam.

x

Kiểm tra khả năng ức chế của các chủng Lactobacillus phân lập được với H.pylori,
chọn ra chủng có khả năng kháng H.pylori cao nhất

x

Khảo sát một số hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn.

x

Định danh chủng tuyển chọn bằng phương pháp 16S rDNA.

x

Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic của chủng tuyển chọn và bước đầu đánh giá độ
ổn định của chế phẩm.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ 27/2/2017

IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ 30/5/2018
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS Nguyễn Thúy Hương
Tp. HCM, ngày 31 tháng 5 năm 2018
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc đến tất cả thầy giáo, cô giáo, những người đã
cho tôi kiến thức và khuyến khích tôi trong suốt hai năm học cao học ở trường đại học
Bách Khoa Hồ Chí Minh.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương,
Người đã hỗ trợ, động viên, sửa bài và cho tôi những lời khuyên quý giá trong suốt quá
trình làm đề tài cao học.
Hơn thế nữa, tôi cũng cám ơn đến tất cả thầy cô, nhân viên ở phòng thí nghiệm, đã
giúp đỡ và cho phép tôi sử dụng những trang thiết bị ở phòng thí nghiệm để làm đề tài
nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình cũng như cơ
quan đã khuyến khích, động viên và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đề tài
nghiên cứu này.


TÓM TẮT
Viêm loét dạ dày tá tràng là một trong những vấn đề tiêu hóa thường gặp nhất, nguyên nhân

là do lớp nhày bị suy yếu, acid bắt đầu tấn công niêm mạc dạ dày và dẫn đến các viêm loét
gây đau đớn, nóng rát ở vùng thượng vị. Ngày nay khoa học đã chứng minh thủ phạm chính
gây ra tình trạng này là do vi khuẩn H.pylori. Phương pháp tiêu diệt H.pylori chủ yếu sử dụng
kháng sinh, tuy nhiên hiện nay đã trở nên thất bại vì H.pylori đã trở nên kháng kháng sinh. Vì
vậy, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic để phòng ngừa và hỗ trợ điều trị vi khuẩn
H.pylori đang được các nhà khoa học quan tâm. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân
lập vi khuẩn lactic từ các nguồn nguyên liệu lên men. Sau khi phân lập và tiến hành khảo sát
hoạt tính kháng H.pylori của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập, chọn ra chủng vi khuẩn
lactic có tỷ lệ phần trăm kháng H.pylori cao nhất, sau đó tiến hành khảo sát một số hoạt tính
probiotic cơ bản điển hình và định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn, cuối cùng là bước
đầu tiến hành thử nghiệm tạo chế phẩm.
Kết quả thí nghiệm đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn lactic từ một số thực phẩm lên men,
chọn ra được một chủng là Lactobacillus plantarum có khả năng kháng H.pylori mạnh nhất,
có tỷ lệ phần trăm ức chế là 70,48%, chịu được các điều kiện cực đoan pH thấp và muối mật
với nồng độ 0,3%. Định hướng tạo chế phẩm, đề tài đã xác định được một số thông số trong
quá trình sấy phun tạo chế phẩm được xác định: lưu lượng dịch phun là 5 ml/phút, nhiệt độ
đầu vào cho quá trình sấy phun là 1000C.
Qua những kết quả nghiên cứu trên, ta thấy rằng L.plantarum có đặc điểm sinh học phù hợp
với vai trò là một probiotic, có thể sử dụng để làm chế phẩm probiotic và kết hợpù với kháng
sinh để hỗ trợ ngăn ngừa H.pylori.


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN ...............................................................................................................................
TÓM TẮT LUẬN VĂN ..............................................................................................................
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................3
1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori ................................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Helicobacter pylori ........................................................................4
1.1.2. Cơ chế gây bệnh của Helicobacter pylori ...................................................................4

1.1.3. Helicobacter pylori kháng kháng sinh ...........................................................................5
1.1.4. Tổng quan về tình hình đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori ..........................6
1.2.Vi khuẩn lactic và probiotic ..................................................................................................7
1.2.1. Đặc điểm chung của khuẩn lactic .................................................................................7
1.2.2. Quá trình lên men lactic ...............................................................................................8
1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic .....................................9
1.2.4. Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic.....................................................................11
1.2.5. Tổng quan về probiotic và Lactobacillus trong chế phẩm probiotic ...........................13
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước................................................................17
Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................19
2.1 Thời gian và địa điểm .........................................................................................................19
2.2. Vật liệu và thiết bị sử dụng ...............................................................................................19
2.3. Thiết kế thí nghiệm............................................................................................................20
2.4 Phương pháp........................................................................................................................21
2.4.1. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn Lactobacillus ......................................................22
2.4.2. Khảo sát các đặc điểm sinh học ...................................................................................23


2.4.3. Phương pháp nhân giống Helicobacter pylori, Lactobacillus và dựng đường cong sinh
trưởng của Helicobacter pylori..................................................................................................23
2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng kháng Helicobacter pylori ........................................23
2.4.5. Khảo sát các tỷ lệ % của chủng vi khuẩn tuyển chọn với Helicobacter pylori ...........25
2.4.6. Phương pháp khảo sát hoạt tính probiotic cơ bản và định danh chủng vi khuẩn tuyển
chọn ..........................................................................................................................................25
2.4.7. Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc .............................27
2.4.8. Thử nghiệm tạo chế phẩm Lactobacillus plantarum bằng phương pháp sấy phun ......28
2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu ...........................................................................................31
Chương3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................................32
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Lactobacillus ..........................................................................34
3.2. Xác định đường cong sinh trưởng của Helicobacter pylori và khảo sát khả năng ức chế

của vi khuẩn Lactobacillus với Helicobacter pylori ..................................................................35
3.3. Khảo sát hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn và định danh..........................38
3.4.Thử nghiệm tạo chế phẩm L.plantarum và bước đầu đánh giá độ ổn định của chế phẩm 42
3.4.1. Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun ...........................................................................42
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đầu vào ...............................................................43
3.4.3. Tạo chế phẩm sấy phun và theo dõi chế phẩm .........................................................44
3.4.4. Tái khảo sát khả năng kháng Helicobacter pylori của L.plantarum sau khi tạo chế
phẩm bằng phương pháp sấy phun ...........................................................................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................................
PHỤ LUÏC .....................................................................................................................................


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

H.pylori

Helicobacter pylori

LAB (lactic acid bacteria)

Vi khuẩn lactic

GRAS (Generally Recognized As safe)

Được công nhận chung là an toaøn

MRS

de Man, Rogosa, Sharpe

sp. (species)

Loaøi

OAC

Omeprazol, Amoxicillin, Clarithromycin

OAM

Omeprazol, Amoxicillin, Metronidazol


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Vi khuẩn H. pylori ....................................................................................................
Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế viêm loét dạ dày do H.pylori ........................................................... 5
Hình 1.3: Lactobacillus casei và Lactobacillus bulgaricus.................................................... 8
Hình 1.4: Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin .................................................................. 12
Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng của H.pylori.................................................................. 34
Hình 3.2: Tỷ lệ % ức chế của các chủng vi khuẩn lactic đối với H.pylori.......................... 35
Hình 3.3: Khả năng kháng của vi khuẩn lactic (L3) đối với H.pylori ................................. 37
Hình 3.4: Khảo sát tỷ lệ % của chủng vi khuẩn tuyển chọn với H.pylori .......................... 37
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng tuyển chọn................. 39
Hình 3.6: Kết quả định danh chủng L3 ............................................................................... 41
Hình 3.7: Kích thước hạt chế phẩm L.plantarum sau khi sấy phun..................................... 45
Hình 3.8: Hình ảnh chế phẩm L.plantarum sau khi sấy phun ............................................. 46

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của H.pylori ở những khu vực khác nhau trên thế giới

.............................................................................................................................................. 7
Bảng 1.2: Vi khuẩn probiotic và tính an toàn về khả năng lây nhiễm ............................... 10
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập .......................... 33
Bảng 3.2: Tóm tắt thông tin chủng giống ........................................................................... 42
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun ................................................................... 43
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đầu vào ........................................................ 44
Bảng 3.5: Theo dõi chế phẩm ............................................................................................ 47


MỞ ĐẦU
Viêm loét dạ dày tá tràng là một trong những vấn đề tiêu hóa thường gặp nhất. Thông
thường, lớp niêm mạc bên trong của dạ dày và ruột non được bao phủ bởi một lớp chất nhày,
do đó bảo vệ niêm mạc tránh được sự tác động của acid dịch vị. Khi lớp nhày bị suy yếu, acid
bắt đầu tấn công niêm mạc dạ dày và dẫn đến các viêm loét gây đau đớn, nóng rát ở vùng
thượng vị. Ngày nay khoa học đã chứng minh thủ phạm chính gây ra tình trạng này là do vi
khuẩn Helicobacter pylori. Vi khuẩn này tiết ra những độc tố làm phá hủy lớp nhày bảo vệ
niêm mạc và gây viêm loét [1, 2].
Phương pháp tiêu diệt vi khuẩn H. pylori chủ yếu là sử dụng kháng sinh, tuy nhiên hiện nay
đã gặp nhiều thất bại bởi vì H.pylori trở nên kháng với nhiều loại kháng sinh. Vì vậy, việc
nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học probiotic và bacteriocin để ức chế vi khuẩn H.pylori
đang được các nhà khoa học quan tâm [20].
Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại
những tác động có ích cho vật chủ. Bacteriocin khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong y
học do chúng là các phân tử protein nên dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu
hóa. Bacteriocin được tạo ra bởi các loài Lactobacillus có khả năng ức chế được nhiều loại vi
khuẩn gây bệnh [13]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiềú nghiên cứu sử dụng
Lactobacillus sp hay bacteriocin từ Lactobacillus sp để ức chế lại H. pylori. Đề tài “Phân lập,
tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori”
nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn dòng Lactobacillus sp. có khả năng ức chế lại vi khuẩn
H.pylori để thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học ức chế H.pylori gây ra bệnh dạ dày.

Nội dung nghiên cứu gồm:

-

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn lên men ở Việt nam.

-

Kiểm tra khả năng ức chế của các chủng Lactobacillus phân lập được với H.pylori,
chọn ra chủng có khả năng kháng H.pylori cao nhất

-

Khảo sát một số hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn.
1


-

Định danh chủng tuyển chọn bằng phương pháp 16S rDNA.

-

Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic của chủng tuyển chọn và bước đầu đánh giá độ ổn
định của chế phẩm.

2


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori
1.1.1

Đặc điểm vi khuẩn H.pylori

H.pylori là một trực khuẩn Gram âm, hình cong hoặc hình chữ S, đường kính từ 0.3- 1 µm, dài
1.5-5 µm với 4-6 lông mảnh ở mỗi đầu, chính nhờ các lông này cùng với hình thể của mình
mà H.pylori có thể chuyển động trong môi trường nhớt. Điều kiện lí tưởng cho vi khuẩn phát
triển là môi trường có 5 % O2, 10% CO2, 85% N2, nhiệt độ từ 35-370C [3, 4].

Hình 1.1 – Vi khuẩn H.pylori [13]
H. pylori thường cư trú ở trong lớp nhày, tập trung chủ yếu ở hang vị sau đó là thân vị, không
thấy H.pylori trên bề mặt niêm mạc ruột và vùng dị sản ruột ở dạ dày. H.pylori gắn chọn lọc
vào một vị trí đặc hiệu của chất nhày và một vị trí glycerolipidic của màng H.pylori sản sinh
ra một lượng lớn urease, lớn hơn nhiều so với bất kỳ một loại vi khuẩn nào khác, vì thế ở dạ
dày sự hiện diện của urease gần như đồng nghóa với sự có mặt của H.pylori.
Nhiễm H.pylori thường gặp nhất ở người, tần suất nhiễm H.pylori thay đổi tùy theo tuổi, tình
trạng kinh tế và chủng tộc. Có khoảng hơn nửa dân số trên thế giới bị nhiễm H.pylori, chủ
yếu ở các nước đang phát triển với tần suất rất cao từ 50-90% ở lứa tuổi lớn hơn 20 và hầu
hết trẻ em bị nhiễm từ 2-8 tuổi [5, 21]. Việt nam cũng thuộc vùng có tỷ lệ nhiễm H.pylori cao
3


vào khoảng hơn 70% ở người lớn, ở các nước phát triển tuổi bị nhiễm thường lớn hơn 50 tuổi,
chiếm 50% dân số [21].
H.pylori được lây truyền qua nhiều đường như miệng-miệng, phân-miệng. Ơ những nơi có
điều kiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây lan quan trọng ban đầu [5, 6,
21].

1.1.2

Cơ chế gây bệnh của H. pylori

Vi khuẩn H.pylori dễ dàng di chuyển qua lớp niêm dịch vào lớp dưới niêm mạc dạ dày để
tồn tại trong môi trường acid của dịch vị nhờ hoạt động của các tiêm mao và cấu trúc hình
xoắn. Sau khi vào trong lớp nhày dạ dày. H.pylori bám dính vào biểu mô tiết ra nhiều men
urease, phân hủy urea thành ammoniac trong dạ dày, gây kiềm môi trường xung quanh, giúp
H.pylori tránh được sự tấn công của acid –pepsin trong dịch vị. Mặt khác, sau khi bám vào
màng tế bào thông qua các thụ thể, H.pylori sẽ tiết ra các nội độc tố, gây tổn thương trực
tiếp các tế bào biểu mô dạ dày, gây thoái hóa, hoại tử, long tróc tế bào tạo điều kiện để
acid-pepsin thấm vào tiêu hủy rồi gây loét [5, 7].
H.pylori gây tổn thương niêm mạc dạ dày sẽ làm giảm tiết somatostatin, lượng somatostatin
giảm sẽ gây tăng gastrin máu từ tế bào G sản xuất ra, mà chủ yếu tăng gastrin-17, còn
gastrin-34 tăng không đáng kể. Hậu quả trên làm tăng tế bào thành ở thân vị, tăng tiết HCL
và kèm theo là tăng hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. Đây là hai yếu tố tấn công chính
trong cơ chế bệnh sinh của loét dạ dày tá tràng.
H.pylori sản xuất ra nhiều yếu tố có tác dụng hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu
đơn nhân, đại thực bào, giải phóng các yếu tố trung gian hóa học trong viêm, giải phóng ra
yếu tố hoạt hóa tiểu cầu một chất trung gian quan trọng trong viêm, làm cho biểu mô phù nề
hoại tử , bị acid –pepsin ăn mòn dẫn đến loét. Cơ thể bị nhiễm H.pylori, sản xuất ra kháng
thể chống lại H.pylori. Các kháng thể này lại gây phản ứng chéo với các thành phần tương
tự trên các tế bào biểu mô dạ dày của cơ thể, gây tổn thương niêm mạc dạ dày [5, 7].
H.pylori gây viêm loét dạ dày qua ba cơ chế: sự thay đổi sinh lí dạ dày, nhiễm độc trực tiếp
từ các sản phẩm của vi khuẩn, các phản ứng viêm với sự giải phóng nhiều sản phẩm phản
ứng độc tố khác nhau. Nếu nhiễm trùng không được điều trị thì sau 10 năm sẽ tiêu niêm mạc
4


dạ dày, làm tăng pH lên 6-8. Các tuyến bị mất, viêm teo niêm mạc dạ dày và di sản ruột,

điều này có thể khởi đầu cho giai đoạn ác tính [2].

Hình 1.2- Sơ đồ cơ chế viêm, loét dạ dày do H.pylori [2]
1.1.3. H. pylori kháng kháng sinh

-

Kháng kháng sinh tiên phát của H.pylori

Kháng kháng sinh tiên phát là tình trạng trẻ em chưa diệt được H.pylori trước đó, tình trạng
kháng kháng sinh là hậu quả của việc chỉ định điều trị kháng sinh chữa các bệnh lý khác cho
bệnh nhân ví dụ như dùng clarithromycin trong điều trị nhiễm khuẩn hô hấp, levofloxacin
trong điều trị nhiễm trùng đường tiểu và metronidazole trong điều trị nhiễm trùng tiết niệu
và sinh dục. Trong những trường hợp này, kháng sinh điều trị đơn liệu không thể diệt được
H.pylori và gây tình trạng đề kháng của H.pylori với kháng sinh. Một số ít trường hợp được
truyền chủng H.pylori kháng thuốc từ người khác sang, ví dụ H.pylori được truyền từ bố mẹ
sang [8].
5


-

Kháng kháng sinh thứ phát của H.pylori

Kháng kháng sinh thứ phát của H.pylori là tình trạng kháng kháng sinh của những chủng
H.pylori ở những bệnh nhân đã được điều trị diệt H.pylori trước đó [8]. Việc kháng kháng
sinh ngày càng gia tăng của H.pylori dẫn đến sự thất bại trong điều trị và điều này dẫn đến
gánh nặng về kinh tế cho gia đình bệnh nhân và xã hội.
1.1.4. Tổng quan về tình hình đề kháng kháng sinh của H. pylori
Sự đề kháng kháng sinh của H.pylori là yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của các phác đồ điều

trị hiện dùng. Tỉ lệ lưu hành của vi khuẩn kháng thuốc thay đổi tùy theo từng vùng địa lý
khác nhau và tương quan với sự sử dụng kháng sinh trong dân số chung. Ví du,ï sự tiêu thụ
clarithromycin và tỉ lệ đề kháng kháng sinh này tăng tương tự nhau (gấp 4 lần) ở Nhật Bản
trong khoảng thời gian từ 1993 đến 2000 [22]. Trái lại, sự sử dụng macrolide thận trọng ở
các nước Bắc u trong những thập niên qua kết hợp với một tỉ lệ H.pylori kháng
clarithromycin thấp hơn so với các nước Nam u, nơi mà clarithromycin được sử dụng rộng
rãi [22]. Tài liệu hướng dẫn Châu u hiện nay về điều trị H.pylori gợi ý rằng trị liệu đầu tay
phải được điều chỉnh cho thích hợp với sự đề kháng clarithromycin và metronidazole. Thật
vậy, một liệu pháp ba thuốc kéo dài 14 ngày được khuyên dùng ở những nơi mà tỉ lệ kháng
clarithromycin lớn hơn 15-20%, ưu tiên kết hợp với amocillin nếu tỉ lệ kháng metronidazole
tiên phát lớn hơn 40% [22]. Trên cơ sở này, việc theo dõi tỉ lệ đề kháng kháng sinh tỏ ra có
ý nghóa đối với việc điều trị nhiễm H.pylori trong thực hành lâm sàng. Dưới đây là một số
tổng hợp dữ liệu về tình hình đề kháng của H.pylori với nhiều kháng sinh khác nhau ở những
nước khác nhau trên thế giới.

6


Bảng 1.1.Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của H.pylori ở những khu vực khác nhau trên
thế giới
Khu vực
Châu Mỹ

Amoxycillin Clarithromycin Metronidazole Tetracyclin Levofloxacin
8/352
118/402
177/401
11/393
KSL
2,2%

29,3%
44,1%
2,7%
113/172
KSL
159/172
58/132
0/40
Châu Phi
65,6%
92,4%
43,9%
0.0%
60/517
154/8139
192/517
11/456
106/908
Châu Á
11,6%
18,9%
37,1%
2,4%
11,6%
3/599
352/3156
420/2459
14/599
148/614
Châu Âu

0,5%
11,1%
17%
2,1%
24,1%
184/1640
2014/11697
948/3549
94/1580
254/1562
Tính chung
11,2%
17,2%
26,7%
5,9%
16,2%

Đa kháng
53/352
15%
KSL
21/252
8,3%
204/2272
8,9%
278/2876
9,6%
[22]

1.2 Vi khuẩn lactic và probiotic

1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tùy ý và hầu hết không di
động. Chúng thuộc loại đa khuyết dưỡng, được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm lên men
như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua. LAB tồn tại khá hạn chế trong một số môi
trường do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó [9, 10, 24].
Về mặt hình thái, các nhóm LAB tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hình cầu, về mặt
sinh lí, chúng tương đối đồng nhất: thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrate và tiết ra
acid lactic [10]. Khác với các vi khuẩn đường ruột sinh acid lactic, LAB là nhóm kị khí không
bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzyme catalase. Tuy nhiên, chúng vẫn có thể sinh
trưởng được khi có mặt oxy do có enzyme peroxidase [9, 10, 24].
Các loại vi khuẩn lactic bao gồm 4 giống sau: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Lactobacilus.

7


a

b

Hình 1.3.Lactobacillus casei (a) và Lactobacillus bulgaricus (b) [10]
1.2.2. Quá trình lên men lactic
Quá trình lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy acid lactic trong
môi trường. có thể tóm tắt theo phương trình sau:

Các loài LAB khác nhau về cơ chế lên men glucose, căn cứ vào sản phẩm lên men LAB được
chia thành hai nhóm

 Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình: sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic
 Nhóm vi khuẩn lên men dị hình: sản phẩm tạo ra ngoài acid lactic còn có

ethanol, CO2.....
Lên men lactic đồng hình
Các LAB lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP và cho sản phẩm chủ yếu
là acid lactic (90-98%). Chỉ một phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển thành
acid acetic, ethanol, aceton và CO2. Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc vào sự có mặt
của oxy.
8


Một số LAB lên men đồng hình thường gặp là L. acidophilus, L. casei
Lên men lactic dị hình
Vi khuẩn lactic lên men dị hình do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase
và triozophosphat- merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo
con đường pentose-phosphat. Quá trình chuyển hóa trizophosphat thành acid lactic giống như
lên men đồng hình.
Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic còn có các sản phẩm khác như
acid succinic, ethanol, acid acetic và các chất khí còn lại [10, 24].

Một số LAB lên men dị hình thường gặp là L. brevis, L.fementum… [9, 10].
1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic
Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là LAB, do
chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế phẩm probiotic. Tuy
nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm probiotic. Những chủng LAB
được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau: tiêu chuẩn về an toàn, tiêu chuẩn về đặc điểm
và chức năng [11, 12].
Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau:

 Có định danh chính xác.
 Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người.
 Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh.

 Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh.
9


 Không liên quan tới bệnh tật.
 Không gây khử liên hợp muối mật.
 Đặc điểm di truyền ổn định.
 Đề kháng được kháng sinh.
Lẽ tất nhiên, tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu. Có một số
phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như nghiên cứu trên các đặc
tính của chúng probiotic, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotic, nghiên cứu các
tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ. Các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS
(Generally Regarded As Safe).
Bảng 1.2.Vi khuẩn probiotic và tính an toàn về khả năng lây nhiễm
Giống vi sinh vật

Khả năng lây nhiễm

Lactobacillus

Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ờ các bệnh
nhân suy giảm miễn dịch (AIDS).

Lactococcus

Không gây bệnh.

Streptococus

Gây bệnh cơ hội, có S.thermophilus được sử dụng trong các

sản phẩm sữa.

Bacillus

Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotic.

Bifidobacterium

Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người
[12]

Đối với những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic (bảng 1.2) cho người đều bắt buộc phải
đạt những yêu cầu trên, song đối với vật nuôi chúng ta có thể giảm bớt đi một số yêu cầu,
chủ yếu là tùy thuộc vào từng loài vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng nó [11, 12]ù.
Để một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng phải có những
đặc điểm sau:

10


 Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể
đưa vào sản xuất, dễ nuôi cấy.

 Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm ,
không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm.

 Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng, để tồn tại được
chúng phải có hai đặc tính là có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp
ở dạ dày) và dịch vị của người, đồng thời chúng phải có khả năng dung nạp
với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotic có thể sống sót được

khi đi qua ruột non). Bên cạnh đó, vi khuẩn phải có khả năng bám dính vào
niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ, khả năng bám vào bề mặt và sau đó là
phát triển trong đường tiêu hóa người được xem là điều kiện tiên quyết
quyết định chức năng của probiotic. Những vi khuẩn có khả năng bám dính
vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu hiện
những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng
bám dính.

 Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có
thể sử dụng, có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây
viêm.

 Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng
với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh đường ruột.

 Sản xuất các chất kháng vi sinh vật như bacteriocins, acid hữu cơ..
 Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.
1.2.4. Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách
tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Đó là các acid hữu
cơ như acid lactic, acid acetic và đặc biệt là bacteriocin nhóm peptide hay protein được tổng
hợp nhờ ribosome có hoạt tính kháng vi sinh vật
11


Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh
hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện
bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ
yếu là acetate, propionate và butyrate, nhất là acid lactic.

Hình 1.4 Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin [26]
Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu
tiên ở nisin, bacteriocin Gram dương [26]. Dựa trên bản chất cation và tính kị nước, hầu hết
các peptide hoạt đông như màng tế bào thấm. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn
khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin
còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu
thành tế bào [26]. Trong giả thiết rộng của kiểu hoạt động của bacteriocin, có giả thiết rằng
sự tương tác của bacteriocin với tế bào nhạy cảm bao gồm 2 giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất
tương ứng với sự hút bám vật lý của phân tử bacteriocin để tiếp cận thụ quan bên ngoài tế
bào và nó có thể là một pha thuận nghịch. Sự tổn thương sinh lý học không thường xuyên
12


được tạo ra và loại bỏ của bacteriocin trong giai đoạn này. Trong một thời gian vừa phải sau
đó, giai đoạn 2 phát triển mà thay đổi bệnh lý không thuận nghịch bị ảnh hưởng qua tổn
thương sinh hóa đặc trưng. Những nghiên cứu về colicins thấy rằng colicinsù hút thụ quan đặc
trưng trên vỏ bên ngoài của sinh vật.
Giai đoạn 1: sự hút bám vật lý để tiếp cận với thụ quan của tế bào. Quá trình thuận nghịch
không thường xuyên gây nguy hiểm sinh lý tế bào.
Giai đoạn 2: xuất hiện những thay đổi không thuận nghịch dẫn đến chết tế bào.
Lactobacillus là một ví dụ điển hình, được ứng dụng làm chế phẩm probiotic để ức chế sinh
trưởng của vi khuẩn H.pylori và làm giảm hoạt tính của urease cần thiết cho H.pylori để sống
trong môi trường acid của dạ dày [26].
1.2.5. Tổng quan về probiotic và đặc điểm vi sinh Lactobacillus trong chế phẩm probiotic
1.2.5.1. Tổng quan về probiotic
Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những nông dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh học
người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo
nghóa đen là “ vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt
đến sức khỏe của người và động vật [28].
Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có chứa

“Lactobacillus acidophilus” [27, 28].
Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi Fuller (1989), Probiotic là “một chất bổ trợ thức
ăn chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện sự cân bằng hệ
vi sinh vật đường ruột của nó”.
Một định nghóa khác về probiotic là “các vi sinh vật sống có ích cho sức khỏe của vật chủ khi
được bổ sung một lượng vừa đủ” [13]. Đây là những nhóm vi khuẩn sống trong đường tiêu
hóa của người, chúng tạo thành một khu hệ vi sinh vật, cản trợ sự phát triển của một số vi
sinh vật gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến
13


hệ miễn dịch. Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loài thực phẩm, thuốc
phòng và chữa bệnh [13].

-

Các vi sinh vật probiotic thường gặp

Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn,
nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp
với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các
chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB.
Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác động thông
qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước
hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa, điển hình
là các điều kiện như:

 Chịu pH thấp
 Chịu acid mật
 Chịu kháng sinh

 Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột
-

Cơ chế hoạt động của probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường tiêu hóa
của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh, sản
sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ [13].
Ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra acid lactic, acid béo,
peroxide và các kháng sinh.
Tăng cường tiêu hóa thức ăn: vi khuẩn lactic sản xuất vitamin nhóm B và các enzyme phân
giải protein, lipid và chuyển hóa đường lactose trong sữa thành acid lactic, ngăn ngừa chứng
tiêu chảy do không dung nạp đường lactose trong sữa.

14


Giảm cholesterol: nhiều kết quả cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm cholesterol
trong máu. Gilliland và cộng sự (2007) thấy rằng vi khuẩn lactic phân lập từ lợn có khả năng
phân hủy cholesterol trong môi trường nuôi cấy. Các báo cáo cho thấy nồng độ cholesterol
trong máu thấp ở những con lợn được nuôi bằng cholesterol có bổ sung các chủng vi khuẩn
lactic được phân lập trên.

-

Ứng dụng probiotic cho viêm loét dạ dày

Phương pháp tiêu diệt vi khuẩn H.pylori chủ yếu là sử dụng thuốc kháng sinh, tuy nhiên hiện
nay đã gặp nhiều thất bại. Sau nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, các nhà nghiên cứu thấy
rằng uống probiotic có thể giúp ngăn chặn các vi khuẩn có hại gây loét. Một nghiên cứu thử

nghiệm về hoạt động của lợi khuẩn Bifidobacterium bifidum chống lại H.pylori thực hiện trên
chuột đã được công bố trong ứng dụng và vi sinh môi trường. Kết quả thử nghiệm cho thấy,
sau vài ngày, những con chuột được sử dụng lợi khuẩn có loét ít hơn so với nhóm đối chứng.
Người ta giải thích kết quả này là do khi đưa probiotic vào trong hệ thống tiêu hóa, sẽ cạnh
tranh với H.pylori về oxy và thức ăn để tiêu diệt chúng. Các xét nghiệm bổ sung cũng cho
thấy phương pháp điều trị này đã giảm thiểu một phần thương tổn mô dạ dày do nhiễm
H.pylori và vi khuẩn Bifidobacterium bifidum không gây bệnh hoặc tử vong cho cả những con
chuột khỏe mạnh cũng như những con bị suy giảm miễn dịch.
Sử dụng kháng sinh để tiêu diệt H.pylori sẽ không thể loại bỏ được hoàn toàn vi khuẩn này, tỉ
lệ tiêu diệt cao nhất chỉ đạt 75 đến 90%. Hiệu quả điều trị cao hơn nếu phối hợp kháng sinh
với probiotic. Probiotic sẽ làm giảm các tác dụng phụ khi sử dụng kháng sinh, tăng hiệu quả
của phác đồ sử dụng kháng sinh, hạn chế khả năng bám dính của H.pylori vào tế bào biểu mô
[15, 23].
1.2.5.2.Đặc điểm vi sinh Lactobacillus trong chế phẩm probiotic

-

Tính kháng mật của Lactobacillus

Dịch mật là một thách thức lớn với rất nhiều vi sinh vật được đưa vào đường tiêu hóa. Mật
phá hủy màng tế bào vi sinh vật và tiêu diệt vi khuẩn. Các chủng vi sinh Lactobacillus có lợi

15


trong nghiên cứu có khả năng thích ứng được trong môi trường mật nồng độ lên tới 2%. Chế
phẩm probiotic dùng một số chủng Lactobacillus có khả năng thích nghi với dịch mật tốt nhất.

-

Khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus

Khả năng chống lại các vi khuẩn có hại với hệ tiêu hóa là điểm quan trọng nhất trong các
nghiên cứu. Chế phẩm sinh học Lactobacillus có lợi cho đường ruột bởi vì hoạt tính kháng
khuẩn của Lactobacillus tốt, chống lại những vi khuẩn gây hại nghiêm trọng. Lactobacillus có
hoạt tính kháng khuẩn cao, tuy nhiên lại không biểu hiện tính kháng lại những vi khuẩn có lợi
hay vi khuẩn cùng chủng.

-

Tạo ra bacteriocin và nhiều chất kháng khuẩn khác

Lactobacillus tạo ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic làm giảm môi trường pH trong
đường ruột, kích thích hoạt hóa kháng khuẩn. Bên cạnh đó, Lactobacillus cũng tạo ra
bacteriocin và nhiều chất kháng khuẩn khác như H2O2, CO2..

-

Khả năng kháng kháng sinh

Lactobacillus qua nghiên cứu có khả năng kháng kháng sinh tốt, kháng sinh không làm ảnh
hưởng tới hệ vi sinh Lactobacillus. Vi khuẩn Lactobacillus giúp chức năng tiêu hóa được duy
trì, loại bỏ nguy cơ rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy do kháng sinh ở người. Khả năng kháng các
loại kháng sinh vô hình chung tạo nên một hệ miễn dịch tự nhiên cho đường tiêu hóa, bảo vệ
đường ruột khỏi các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy sinh trưởng, nhân rộng do mất cân bằng vi
sinh.
Giảm cholesterol: nhiều kết quả cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm cholesterol
trong máu. Gilliland và cộng sự (2007) thấy rằng vi khuẩn lactic phân lập từ lợn có khả năng
phân hủy cholesterol trong môi trường nuôi cấy. Các báo cáo cho thấy nồng độ cholesterol
trong máu thấp ở những con lợn được nuôi bằng cholesterol có bổ sung các chủng vi khuẩn

lactic được phân lập trên [16].

16