Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu nhận các chế phẩm từ trichoderma sp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đề tài:

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
ĐỂ THU NHẬN CÁC CHẾ PHẨM TỪ
TRICHODERMA SP.

SVTH: Nguyễn Hồng Anh
MSHV: 13310293
GVHD: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TP. HỒ CHÍ MINH - 1/2015


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương
Cán bộ chấm nhận xét 1:...........................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 2: ..........................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày ….. tháng ….. năm …….
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. .................................................................
2. .................................................................
3. .................................................................
4. .................................................................
5. .................................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KTHH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Hoàng Anh

MSHV: 13310293

Ngày, tháng, năm sinh: 03/07/1989

Nơi sinh: Sóc Trăng

Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học

Mã số : 60.42.80

I. TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu nhận các chế phẩm từ
Trichoderma sp.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG
1. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu bào tử và bước đầu thử nghiệm tạo chế phẩm
bào tử nấm Trichoderma viride dưới dạng bột.
2. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu enzyme cellulase thơ từ chủng Trichoderma
harzianum.
III.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/2014

IV.

NGÀY HỒN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2014

V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

GS TS Ng yễn Thúy Hương

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 20....
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA… ………
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn công nghệ
sinh học đã tạo điều kiện cho tôi và các bạn của tơi hồn thành tốt luận văn cao học.
Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – Bộ Môn Công
Nghệ Sinh Học – Đại Học Bách Khoa TpHCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc
định hướng đề tài đến theo sát tiến trình thí nghiệm. Tơi đã học được nhiều điều hay ở
cơ về lịng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong cơng việc, và cả tình yêu thương
đối với mọi người.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đế các thầy cô và các anh chị phụ trách phịng thí
nghiệm 102, 108 và 117 của Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ và hỗ
trợ tơi trong suốt thời gian thí nghiệm tại trường.
Tơi xin gởi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến mẹ và các anh trong gia
đình tơi vì đã hỗ trợ rất nhiều về tinh thần cũng như vật chất, giúp tơi có thể an tâm
thực hiện tốt các thí nghiệm trong thời gian vừa qua.
Ngồi ra tơi cũng xin gởi lời cám ơn đến các anh chị lớp CH12 và 13 và các
bạn sinh viên khóa 2010 đã hỗ trợ nhiệt tình, cũng như phụ giúp làm thí nghiệm, trao
đổi các kinh nghiệm trong tiến trình thí nghiệm để tơi có thể hồn thành tốt bài luận
văn này


TĨM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài luận văn: “Tối ư hóa điều kiện nuôi cấy để thu nhận các chế phẩm từ

Trichoderma sp.”
-

Học viên thực hiện: Nguyễn Hoàng Anh
Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương
Thời gian thực hiện: từ 20/1/2014 - 20/7/2014

Nội d ng đề tài:
Ứng dụng 1:
1.
2.
3.
4.

Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng T. viride
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử.
Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu bào tử.
Thử nghiệm tạo chế phẩm Trichoderma dưới dạng bột.

Ứng dụng 2:
1. Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng T. harzianum.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase.
3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu enzyme cellulase.
Kết quả đề tài:
Ứng dụng 1:
1. Thời gian tối ưu để thu bào tử T. viride là 3 ngày.
2. Thí nghiệm đơn yếu tố để thu bào tử: saccharose 3%, NaNO3 0.36%, nhiệt độ
330C, tỷ lệ giống 1.0%, pH 5.0, độ ẩm 60%, bề dày 1.5 cm.
3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu là pH 5.1, độ ẩm 59.15%, tỷ lệ giống 0.98%,
saccharose 3.15%. Khi đó lượng bào tử sinh ra tối đa là 7.53.108 cfu/g.

Ứng dụng 2:
1. Thời gian tối ưu để thu enzyme cellulase từ T. harzianum là 4 ngày.
2. Thí nghiệm đơn yếu tố để thu enzyme cellulase: lactose 1.2%, D-glucose 0.4%,
peptone 1.2%, (NH4)2SO4 1.0%, nhiệt độ 290C, tỷ lệ giống 0.7%, pH 5.0, độ ẩm
60%.
3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu là pH 5.25, độ ẩm 60.68%, tỷ lệ giống 0.55%, Dglucose 0.44%, (NH4)2SO4 0.9%. Khi đó hoạt tính enzyme cực đại là 5.47 UI/g.


SUMMARY
OPTIMIZATION OF CULTURE CONDITION TO OBTAIN PREPARATIONS
FROM TRICHODERMA SP.
Content subjects
Application 1:
1.
2.
3.
4.

Survey physiology and morphology of the fungus Trichoderma viride.
Survey the ability to produce spores by the factors affecting.
Optimization of culture condition for maximal number of spores.
Production testing of Trichoderma spores in powder form.

Application 2:
1. Survey physiology and morphology of the fungus Trichoderma harzianum.
2. Survey the ability to produce cellulase enzyme by the factors affecting.
3. Optimization of culture condition to obtain cellulase enzyme.
Results
Application 1:
1. The optimal time to producing spores from T. viride is 3 days.

2. Single factor experiments to produce spores: saccharose 3%, NaNO3 0.36%,
temperature 330C, inoculum’s size 1.0%, pH 5.0, water activity 60%, culture
media thickness 1.5 cm.
3. Maximum number of spores of 7.53.108cfu/g was obtained at the optimum levels
of process variables (pH 5.1, water activity 59.15%, inoculum’s size 0.98%,
saccharose 3.15%).
Application 2:
1. The optimal time to producing cellulase enzyme from T. harzianum is 4 days.
2. Single factor experiments to produce cellulase: lactose 1.2%, D-glucose 0.4%,
peptone 1.2%, (NH4)2SO4 1.0%, temperature 290C, inoculum’s size 0.7%, pH 5.0,
water activity 60%.
3. Maximum specific enzyme activity of 5.47 UI/g was obtained at the optimum
levels of process variables (pH 5.25, water activity 60.68%, inoculum’s size
0.55%, D-glucose 0.44%, (NH4)2SO4 0.9%).


Mục lục
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... vi
DANH MỤC ĐỒ THỊ .................................................................................................. viii
DANH MỤC BẢNG....................................................................................................... ix
Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.3.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2

Chương 2 TỔNG QUAN
2.1.

Giới thiệu chung về nấm Trichoderma ............................................................... 3

2.1.1.

Phân loại .......................................................................................................... 4

2.1.2.

Đặc điểm nấm Trichoderma............................................................................ 7

2.2.

Vai trò của nấm Trichoderma trong bảo vệ thực vật ...................................... 12

2.2.1.

Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng ....................................................... 12

2.2.2.

Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật................................... 15

2.3.

Enzyme cellulase ................................................................................................ 26

2.3.1.

Phân loại ........................................................................................................ 26

2.3.2.

Cấu trúc của enzyme cellulase ...................................................................... 27

2.3.3.

Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase........................................................ 28

2.3.4.

Ứng dụng của enzyme cellulase .................................................................... 28

2.4.

Các nghiên cứu của nấm Trichoderma trong và ngoài nước ......................... 29

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ HƯƠNG HÁ
3.1.

Vật liệu ................................................................................................................ 33

3.2.

Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 35

3.2.1.

Sơ đồ tiến hành .............................................................................................. 35

3.2.2.

Giải thích quy trình ....................................................................................... 36

3.3.

Khảo sát đặc điểm sinh học ............................................................................... 36
i


3.4. Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng
đến khả năng sinh bào tử nhằm định hướng tạo chế phẩm bào từ Trichoderma. . 41
3.4.1.

Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng ........................................................ 41

3.4.2.

Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................ 42

3.4.3.

Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống ..................................................................... 42

3.4.4.

Ảnh hưởng của pH ........................................................................................ 42

3.4.5.

Ảnh hưởng của độ ẩm ................................................................................... 43

3.4.6.

Ảnh hưởng của bề dày môi trường................................................................ 43

3.4.7.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thu bào tử.......................................... 43

3.4.8.

Kiểm tra và bước đầu tạo chế phẩm bột bào tử Trichoderma....................... 47

3.5. Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng
đến hoạt tính của enzyme cellulase nhằm định hướng tạo chế phẩm enzyme thô. 48
3.5.1.

Kiểm tra sơ bộ khả năng thủy phân CMC của enzyme thô .......................... 48

3.5.2.

Ảnh hưởng thời gian ..................................................................................... 48

3.5.3.

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase .. 48

3.5.4.

Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ..................... 49

3.5.5.

Ảnh hưởng độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ................ 49

3.5.6.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ...... 49

3.5.7.

Ảnh hưởng pepton, (NH4)2SO4 đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase
....................................................................................................................... 49

3.5.8. Ảnh hưởng D-glucose và Lactose đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase ...................................................................................................................... 49
3.5.9.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thu enzyme cellulase thô .................. 49

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1. Tối ư hóa điều kiện ni cấy thu bào tử Trichoderma...................................... 55
4.1.1. Khảo sát một số đặc điểm của chủng giống Trichoderma viride nhằm thu
bào tử ....................................................................................................................... 55

4.1.2.

Kết quả lập đường cong sinh trưởng ............................................................. 56

4.1.3.

Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố dinh dưỡng ............................... 58

4.1.3.1.

Ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3............................................................ 58
ii


4.1.3.2.

Ảnh hưởng của hàm lượng Saccharose ..................................................... 59

4.1.4. Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ,
độ ẩm, pH, bề dày và tỷ lệ giống ................................................................................ 61
4.1.4.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................. 61

4.1.4.2.

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống......................................................................... 63

4.1.4.3.

Ảnh hưởng của pH ..................................................................................... 64

4.1.4.4.

Ảnh hưởng của độ ẩm ................................................................................ 65

4.1.4.5.

Ảnh hưởng của bề dày môi trường ............................................................ 66

4.1.5.

Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử .
....................................................................................................................... 68

4.1.6.

Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử .. 69

4.1.7.

Kiểm tra và bước đầu thử nghiệm tạo chế phẩm bột Trichoderma .............. 74

4.2.Tối ư hóa điều kiện nuôi cấy thu enzyme cellulase ........................................... 76
4.2.1. Khảo sát một số đặc điểm của chủng giống Trichoderma harzianum nhằm
thu enzyme cellulase ................................................................................................... 76
4.2.2.

Kết quả kiểm tra sơ bộ khả năng thủy phân CMC của enzyme thô .............. 77

4.2.3. Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố thời gian, nhiệt độ, độ ẩm, pH và
tỷ lệ giống ................................................................................................................... 77
4.2.3.1.

Ảnh hưởng thời gian .................................................................................. 77

4.2.3.2.

Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống .................................................................. 79

4.2.3.3.

Ảnh hưởng của pH ..................................................................................... 80

4.2.3.4.

Ảnh hưởng của độ ẩm ................................................................................ 82

4.2.3.5.

Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................. 83

4.2.4.

Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố dinh dưỡng ............................... 85

4.2.4.1.

Ảnh hưởng của hàm lượng Peptone và (NH4)2SO4) .................................. 85

4.2.4.2.

Ảnh hưởng của hàm lượng D-glucose và Lactose ..................................... 88

4.2.5. Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme cellulase .................................................................................................. 91
4.2.6.

Kết quả tối ưu hóa các yếu tố ảnh hướng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase
....................................................................................................................... 92
iii


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1.Kết luận .................................................................................................................. 100
5.2.Kiến nghị ................................................................................................................ 100
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 101

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

T. viride: Trichoderma viride
T. harzianum: Trichoderma harzianum
CCD – Central Composite Design – Mơ hình cấu trúc có tâm
RSM – Response Surface Methodology – Phương pháp đáp ứng bề mặt
PDA: Potato D-glucose Agar
CMC: Carboxyl Methyl Cellulose

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Nấm Trichoderma phát triển trên đĩa Petri. ..................................................... 3
Hình 2.2: Cấu tạo nấm Trichoderma ............................................................................... 4
Hình 2.3: Cơ chế chuyển protein mục tiêu đến mạng lưới nội chất ................................ 10
Hình 2.4: Sự tổng hợp một protein tiết và tạo các bóng vận chuyển. .............................. 10
Hình 2.5: Sự chế biến qua các túi màng chứa dịch của thể Golgi ....................................11
Hình 2.6: Con đường tiết protein ở Trichoderma ............................................................ 12
Hình 2.7: Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng của Trichoderma hazianum lên cây
cà chua ............................................................................................................................. 14
Hình 2.8: Chức năng của Trichoderma và Azotobacter trong đất ..................................15
Hình 2.9: Tổng quát các giai đoạn của quá trình ký sinh và tiêu diệt của nấm
Trichoderma hazianum đối với nấm bệnh Rhizoctonia .................................................. 18
Hình 2.10: Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus. ................... 20
Hình 2.11: Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào .............................. 20
Hình 2.12: Hình ảnh của Rhizotonia solani dưới kính hiển vi sau khi Trichoderma
mycoparasitic được gỡ bỏ. Enzyme do Trichoderma mycoparasitic tiết ra làm thủng tế
bào nấm bệnh ................................................................................................................... 21
Hình 2.13: Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh ............................................21
Hình 2.14: Cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp được tiết ra từ Trichoderma ......23
Hình 2.15: Ức chế sự phát triển của Pythium ultimum bởi chất kháng sinh 6PP được tiết
ra từ Trichoderma hazianum .......................................................................................... 24
Hình 2.16: Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và khơng gian sống với các nấm
bệnh khác ......................................................................................................................... 26
Hình 2.17: Cấu trúc 3D của endoglucanase từ Trichoderma harzianum ........................ 27
Hình 2.18: Cơ chế hoạt động của enzyme cellulose ....................................................... 28
Hình 3.1: Quy trình chọn lọc giống .................................................................................. 37
Hình 3.2: Quy trình quan sát đại thể và vi thể .................................................................38

Hình 3.3: Quy trình nhân giống cấp 1 .............................................................................39
Hình 3.4: Sơ đồ lên men bán rắn tạo chế phẩm bào tử Trichoderma............................... 47
vi


Hình 4.1: Bề dày mơi trường ni cấy ............................................................................67
Hình 4.2: Chế phẩm Trichoderma dạng bột ....................................................................75
Hình 4.3: Vịng thủy phân CMC bởi enzyme thô............................................................. 77

vii


DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của nấm TH1 ......................................................... 57
Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của NaNO3 đến khả năng sinh bào tử .........................................58
Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của Saccharose đến khả năng sinh bào tử ...................................60
Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bào tử ........................................61
Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh bào tử ...................................63
Đồ thị 4.6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh bào tử...................................64
Đồ thị 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh bào tử.............................. 65
Đồ thị 4.8: Ảnh hưởng của bề dày môi trường đến khả năng sinh bào tử ...................... 66
Đồ thị 4.9: Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh bào tử ....................... 69
Đồ thị 4.10: Mặt đáp ứng của số lượng bào tử theo pH và độ ẩm ..................................73
Đồ thị 4.11: Khảo sát thời gian thu enzyme .....................................................................78
Đồ thị 4.12: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống ....................................................................79
Đồ thị 4.13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase .....................................81
Đồ thị 4.14: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt tính enzyme cellulase ................................ 82
Đồ thị 4.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase ............................. 84
Đồ thị 4.16: Ảnh hưởng của hàm lượng Peptone đến hoạt tính enzyme cellulase ..........85
Đồ thị 4.17: Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến hoạt tính enzyme cellulase ......86

Đồ thị 4.18: Ảnh hưởng của hàm lượng Lactose đến hoạt tính enzyme cellulase ...........88
Đồ thị 4.19: Ảnh hưởng của hàm lượng D-glucose đến hoạt tính enzyme cellulase .......89
Đồ thị 4.20: Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzyme .....92
Đồ thị 4.21: Mặt đáp ứng của số lượng bào tử theo tỷ lệ giống và độ ẩm ....................... 97

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma ............................................5
Bảng 3.1: Mức khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, saccharose, và
NaNO3............................................................................................................................... 44
Bảng 3.2: Ma trận sàng lọc các yếu tố trên môi trường bán rắn thu bào tử .................... 45
Bảng 3.3: Các mức của ma trận thực nghiệm trên môi trường bán rắn thu bào tử .........45
Bảng 3.4: Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa lượng bào tử sinh ra ..46
Bảng 3.5: Mức khảo sát các yếu tố nhiệt độ, thời gian, pH, tỷ lệ giống, độ ẩm, hàm lượng
D-glucose, Lactose, Pepton và (NH4)2SO4. ......................................................................50
Bảng 3.6: Ma trận sàng lọc các yếu tố trên môi trường bán rắn thu enzyme .................. 51
Bảng 3.7: Các mức của ma trận thực nghiệm trên môi trường bán rắn thu enzyme ........51
Bảng 3.8: Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa thu enzyme ................ 52
Bảng 4.1: Kết quả đường cong sinh trưởng .....................................................................56
Bảng 4.2: Ảnh hưởng hàm lượng NaNO3 đến khả năng sinh bào tử ............................... 58
Bảng 4.3: Ảnh hưởng hàm lượng Saccharose đến khả năng sinh bào tử ......................... 59
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bào tử ..........................................61
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ban đầu đến khả năng sinh bào tử ........................ 63
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh bào tử ....................................64
Bảng 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh bào tử ............................... 65
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của bề dày môi trường đến khả năng sinh bào tử ........................ 66
Bảng 4.9: Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng .......................................................... 68
Bảng 4.10: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố ...........................................68

Bảng 4.11: Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố ............................................................. 70
Bảng 4.12: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố tối ưu ................................ 71
Bảng 4.13: Tọa độ điểm tối ưu ........................................................................................ 74
Bảng 4.14: Theo dõi số lượng bào tử trước và sau khi sấy .............................................75
Bảng 4.15: Khảo sát thời gian thu enzyme cellulase ....................................................... 77
ix


Bảng 4.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hoạt tính enzyme cellulase .................... 79
Bảng 4.17: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase ......................................80
Bảng 4.18: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt tính enzyme cellulase .................................82
Bảng 4.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase .............................. 83
Bảng 4.20: Ảnh hưởng của Peptone đến hoạt tính enzyme cellulase .............................. 85
Bảng 4.21: Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến hoạt tính enzyme cellulase ......................... 86
Bảng 4.22: Ảnh hưởng của Lactose đến hoạt tính enzyme cellulase ............................... 88
Bảng 4.23: Ảnh hưởng của D-glucose đến hoạt tính enzyme cellulase ........................... 88
Bảng 4.24: Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng ......................................................... 91
Bảng 4.25: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố............................................91
Bảng 4.26: Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố .............................................................. 93
Bảng 4.27: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố tối ưu .................................94
Bảng 4.28: Tọa độ điểm tối ưu ......................................................................................... 98

x


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU


Chương 1: MỞ ĐẦU

1.1.

Đặt vấn đề

Nấm Trichoderma hiện diện khắp nơi trên toàn thế giới. Tiềm năng của chúng được
biết đến như là một tác nhân điều khiển sinh học trên đối tượng bệnh hại cây trồng, đã
được nghiên cứu từ những năm 1930. Nấm Trichoderma là đối tượng được quan tâm vì
khả năng đối kháng mạnh, phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh trên cây
trồng và khả năng kích thích sự phát triển bộ rễ. Một trong những vũ khí mạnh của chúng
phải kể đến khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào rất hiệu quả, tham gia trực tiếp vào quá
trình phá hủy vách tế bào nấm bệnh. Hệ enzyme mà chúng có khả năng sản sinh ra là
chitinase, β-glucanase, cellulase có tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của nấm
bệnh [25].
Những nhóm enzyme này được ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp để phịng trừ
nấm bệnh và kích thích sự phát triển bộ rễ thông qua việc phân giải các hợp chất khó tan
cho cây dễ hấp thu. Hiện nay chúng đã và đang được nghiên cứu để tạo chế phẩm sinh
học phòng trừ các loại nấm bệnh như: Rhzoctonia, Fusarium, Pythium và Phytophthora…
Việc sử dụng chế phẩm này đạt hiệu quả cao hơn thuốc diệt nấm và duy trì lâu hơn.
Ngồi ra còn làm giảm rủi ro về sức khỏe, chi phí và thiệt hại từ mơi trường do tập qn
sử dụng thuốc hóa học gây ra. Hiện nay, đã có những nỗ lực để mở rộng sản phẩm
thương mại Trichoderma và đã được phát triển bởi các trường đại học, các viện nghiên
cứu và các cơng ty phân bón.v.v…
Trên thế giới và Việt Nam đã có rất nhiều những nghiên cứu về thu sinh khối và
enzyme cellulase có nguồn gốc từ Trichoderma. Tuy nhiên, việc tìm ra điều kiện ni
cấy tối ưu và phương pháp thực hiện để thu nhận các chế phẩm từ Trichoderma thì vẫn
đang trong quá trình nghiên cứu và cần được hệ thống hóa nhằm tìm ra một quy trình
chuẩn để đi vào hoạt động sản xuất trong tương lai.
Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn Tối ư hóa
điều kiện ni cấy để thu nhận các chế phẩm từ Trichoderma sp.

1


Chương 1: MỞ ĐẦU
1.2.

Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện nhằm 2 mục tiêu chính:
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu bào tử và bước đầu thử nghiệm tạo chế phẩm

-

bào tử nấm Trichoderma viride dưới dạng bột.
Tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu enzyme cellulase thô từ chủng Trichoderma

-

harzianum.
1.3.

Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu của đề tài đặt ra nội dung nghiên cứu như sau:
 Hướng ứng dụng 1:
1. Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng nấm Trichoderma viride
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử
3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm thu bào tử
4. Thử nghiệm tạo chế phẩm bào tử nấm Trichoderma dưới dạng bột.
 Hướng ứng dụng 2:

1. Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng nấm Trichoderma harzianum
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase
3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy nhằm thu enzyme cellulase.

2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN


Chương 2: TỔNG QUAN
2.1.

Giới thiệu chung về nấm Trichoderma
Trichoderma là loại nấm có mặt nhiều trong đất, các rễ cây, chúng có khả năng

phân hủy gỗ, các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật [29]. Các chủng Trichoderma là
thành phần chính trong hệ vi sinh vật của đất, đó có thể là do khả năng trao đổi chất
phong phú và cạnh tranh tích cực của chúng. Trichoderma được cho là ít liên quan đến
dịch bệnh ở thực vật sống, mặc dù một nhóm của Trichoderma harzianum gây bệnh trên
nấm thương mại. Năm 1996 thì Samuels đã đưa ra đánh giá tồn diện về đặc tính sinh
học của Trichoderma, kỹ thuật thu nhận được enzyme tiết ra từ Trichoderma và khả
năng kiểm soát sinh học của chúng [2].
Nấm Trichoderma sp. thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (imperfect fungi)
Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, học Moniliaceae, chi Trichoderma [17]. Nấm
Trichoderma phát triển nhanh và sinh nhiều bào tử màu xanh lá cây.

Hình 2.1: Nấm Trichoderma phát triển trên đĩa Petri [2].
Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra Trichoderma có thể ký sinh trên các loại nấm

bệnh và khả năng tiết kháng sinh. Năm 1932 Weinding và các cộng sự đã mơ tả chi tiết
q trình ký sinh lên nấm bệnh Rhizoctonia solani của Trichoderma, từ việc cuộn xung
quanh các sợi nấm bệnh, thâm nhập và sau đó phá hủy tế bào của nấm chủ. Ơng cũng đã
mơ tả khả năng tiết kháng sinh để tiêu diệt hai chủng Rhizotonia và Sclerotinia và đặt
tên nó là gliotoxin. Trong những năm nghiên cứu này, nhiều kết quả tương tự khác cũng
đã được báo cáo bởi các nhà bệnh lý học thực vật. Ví dụ: chất kháng sinh được tiết ra từ

3


Chương 2: TỔNG QUAN
Trichoderma virens thể hiện sự ức chế mạnh đối với Pythium ultinum và Phytothora
[30].
Sử dụng chế phẩm Trichoderma để kiểm soát hiệu quả các bệnh gây ra trên cây
trồng đã và đang được quan tâm rất lớn, một số sản phẩm thương mại của nấm
Trichoderma được sản xuất ở các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng
trên một loạt các loại cây trồng. Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm
và bào tử vách dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc
chất lỏng lên men [2, 27].
2.1.1. Phân loại
Loài Trichoderma được phân loại như sau [50]:
Ngành: Ascomycota.
Lớp: Euascomycetes.
Bộ: Hypocreales.
Loại: Hypocrea.
Loài: Trichoderma.
Năm 1998, Kubicek và Harman đã mô tả chi tiết 33 lồi Trichoderma, ơng cho
rằng tùy từng lồi nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [25].

Hình 2.2: Cấu tạo nấm Trichoderma [48].

4


Bảng 2.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma
Đặc điểm

Tên loài

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8-9cm sau 14 ngày
nuôi cấy ở 20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2Trichoderma
atroviride

14µm. Bào tử màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục đường
kính từ 4-12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt
hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa [6].
Đại thể: Mơi trường có nhiệt độ từ 15-350C, pH: 4.7-5.7 rất
thích hợp cho sự phát triển của nấm. Khuẩn lạc phát triển nhanh,
đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày ni cấy ở nhiệt độ 200C.

Trichoderma
harzianum

Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục,
vách trơn láng, kích thước (2.7-3.2)x(2.5-2.8)µm
Sinh hóa: Là lồi nấm rất phổ biến trong đất, nảy mầm tốt
nhất trong môi trường mùn cưa có độ ẩm khoảng 30% [3].
Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính 3-5cm sau 5 ngày ni
cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích
thước (3.0-4.8)x(1.9-2.8)µm.

Trichoderma
koningii

Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất mặt, nhưng ở độ sâu
120cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt
ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH: 3.76.0 [6].

Hình ảnh


Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt 7cm khi ni cấy 5 ngày
ở 200C. Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng elip, có kích thước khác
nhau tùy theo chủng.
Trichoderma
hamatum

Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3.7-4.7 là những điều kiện
rất thuận lợi cho sự phát triển của Trichoderma hamatum và
chúng phát triển chậm lại ở 00C [3].

Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu,
kích thước (4-5)x(2.5-3)µm.
Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản
Trichoderma
viride

và phức tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng trên nguồn
cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì
ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate [15].

Chương 2: TỔNG QUAN
2.1.2. Đặc điểm nấm Trichoderma
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma
Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất
nhằm phân tích, xác định mật độ và khu vực phân bố của chúng [3].
Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất,
trên vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của
cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi
mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các lồi Trichoderma. Sự phân bố và
điều kiện mơi trường sống của các lồi Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn
chung các lồi Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung tính hoặc kiềm [6]. Đặc điểm
hình thái của nấm này là cành bào tử khơng màu, sợi nấm khơng màu, có vách ngăn, có
khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh,
đơn bào hình trứng, trịn, elip hoặc hình oval tùy từng lồi. Bào tử đính ở đỉnh của cành
[3].
Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm
sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C. Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ,
mùn cưa, cám trấu hoặc trên các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở
mức cao (10%).
Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm dựa vào độ pH của đất và khả năng này mất
dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của
Trichoderma làm thay đổi pH của đất, ảnh hướng đến khả năng kháng nấm sẵn có của
đất. Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến
hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất do đặc tính làm thay đổi pH. Độ
nhạy của đất kháng nấm được cơng bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acid. Các
bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mơ bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử
phân sinh.
Thiết lập quần thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: vi sinh vật trong đất hoạt động

phụ thuộc vào nhiều loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau.
Khi sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi
7