Tìm hiểu xét nghiệm hóa sinh và tính toán khoảng tham chiếu cho một số xét nghiệm phổ biến trên dòng máy b c au680

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

NGUYỄN VŨ BẢO CHÂU

TÌM HIỂU XÉT NGHIỆM HĨA SINH VÀ TÍNH TOÁN
KHOẢNG THAM CHIẾU CHO MỘT SỐ XÉT NGHIỆM
PHỔ BIẾN TRÊN DÒNG MÁY B-C AU680

Chuyên ngành :
Mã số:

Vật Lý kỹ Thuật
60520401

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2017


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Huỳnh Quang Linh

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

Cán bộ chấm nhận xét 2 :

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.
HCM ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ............................................................
2. ............................................................
3. ............................................................
4. ............................................................
5. ............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN VŨ BẢO CHÂU...................... MSHV: 7140318 .................
Ngày, tháng, năm sinh: 02-01-1991 ..................................... Nơi sinh: TP.HCM ..............
Chuyên ngành: Vật Lý Kỹ Thuật ......................................... Mã số : 60520401 ...............
I. TÊN ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU XÉT NGHIỆM HĨA SINH VÀ TÍNH TỐN
KHOẢNG THAM CHIẾU CHO MỘT SỐ XÉT NGHIỆM PHỔ BIẾN TRÊN
DÒNG MÁY B-C AU680 .............................................................................................
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Tìm hiểu về xét nghiệm hóa sinh và các thiết bị tương ứng.
- Quy trình quản lý chất lượng thiết bị xét nghiệm hóa sinh.

- Thực hiện khảo sát khoảng tham chiếu cho các xét nghiệm AST-ALT, creatinin,
glucose, ure cho dòng máy Beckman Coulter AU680
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 30/01/2016 ................................................................
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 19/12/2016 .................................................
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS. TS. Huỳnh Quang Linh ..........................................

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 20....
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA Khoa Khoa học Ứng dụng
(Họ tên và chữ ký)


Lời cám ơn
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô công tác tại khoa Khoa Học Ứng
Dụng ngành Vật lý Kỹ thuật trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã
truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện rất nhiều cho việc hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến PGS. TS. Huỳnh Quang Linh và ThS. Mai Hữu
Xuân là những người thầy mà tơi vơ cùng kính trọng. Các thầy khơng chỉ truyền đạt
kiến thức mà cịn giúp tôi tiến bộ hơn rất nhiều trong tư duy và cách suy nghĩ, liên kết
những kiến thức rời rạc lại với nhau để có thể thực hiện tốt luận văn cũng như cơng
việc hiện tại.
Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Công ty TNHH Thiết bị Minh
Tâm và Khoa Xét Nghiệm Bệnh viện Quân Y 175 đã tạo điều kiện cho tôi được làm
việc, tiếp xúc và tìm hiểu nhiều hơn về thiết bị xét nghiệm cũng như nghiên cứu trên
dữ liệu thô thu nhận được.
Trong quá tình thực hiện và báo cáo luận văn khơng tránh khỏi những sai sót,
kinh mong q Thầy, Cơ bỏ qua cho nhũng lỗi này. Đồng thời do hạn chế khả năng lý
luận về kinh nghiệm thực tiễn nên luận văn này cịn nhiều những thiếu sót, rất mong

nhân được sự đóng góp từ q Thầy, Cơ.
Em xin chân thành cảm ơn !
Nguyễn Vũ Bảo Châu


TĨM TẮT
Hiện nay, các hệ thống xét nghiệm hóa sinh tự động đang từng ngày thay thế
các hệ thống thủ công hoặc bán tự động. Điều này giúp giảm bớt thao tác thiếu
chính xác của kỹ thuật viên và nâng cao hiệu suất hoạt động. Tuy nhiên để đảm bảo
độ tin cậy ổn định cần thiết phải có những quá trình cân chỉnh và xác minh các
khoảng tham chiếu chính xác.
Luận văn này trước hết trình bày tổng quan về xét nghiệm hóa sinh nhằm cung
cấp cho người quan tâm hiểu về việc quản lý, theo dõi và điều chỉnh thiết bị cũng
như chất lượng xét nghiệm. Tiếp theo đề tài đã tiến hành thống kê lại khoảng tham
chiếu cho 5 xét nghiệm: ALT, AST, Creatinin, Glucose, Ure dựa vào những kết quả
thu nhận từ những đợt khám sức khỏe định kỳ tại TP.HCM trên máy xét nghiệm
hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680 sử dụng hóa chất Beckman Coulter.
Theo hướng dẫn của CLSI, việc tính tốn các khoảng tham chiếu đã được thực hiện
trên số lượng mẫu lớn (720 mẫu/giới tính/xét nghiệm) và tiến hành thống kê đánh
giá bằng phân bố Gauss. Kết quả đạt được thể hiện độ tin cậy ổn định của máy xét
nghiệm hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680, phù hợp với quy chuẩn
ISO15189.
ABSTRACT

Currently, manual or semi-automatic analyzers of biochemical tests are replaced
by more modern automatic systems. These equipments help to reduce the operation
errors of technical staff and improve the mass performance. However, to ensure the
reliability and stability of mentioned systems, there is necessary to provide the
essential calibration process and to verify the reference intervals.
The thesis firstly introduces an overview of biochemical tests to provide

interesting people an systematic understanding about the management, monitoring
and adjustment of test equipment as well as the quality of the test. The second topic
of the thesis presents the result of reference interval verification of 5 tests: ALT,
AST, Creatinine, Glucose, Urea based on the statistical data gained from the
population periodic health examination in Ho Chi Minh City performed on the
automatical analyzer Beckman Coulter AU680 using Beckman Coulter chemicals.
According to CLSI instructions, the reference intervals have been made on a large
number of samples (720 sample/sex/test) and statistically calculated by Gaussian
distribution. Achieved results demonstrate a good reliability and stability of the
automatical analyzer Beckman Coulter AU680 matching the ISO15189 standards.


Lời cam đoan
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của PGS. TS Huỳnh Quang Linh. Các nội dung nghiên cứu, kết quả
trong đề tài này là trung thực và chưa cơng bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá
được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham
khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu
của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về nội
dung luận văn của mình. Trường đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh khơng
liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tơi gây ra trong q trình thực
hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2016


MỤC LỤC
Mục lục ..................................................................................................................... 1

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ........................................................................ 3
Danh mục các hình vẽ, đồ thị .................................................................................... 4
Danh mục các bảng biểu ........................................................................................... 6
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 7
CHƯƠNG 1. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG........................................................... 8
1.1. Thiết bị xét nghiệm ......................................................................................... 8
1.1.1. Phân loại thiết bị xét nghiệm ................................................................ 8
1.1.2. Thiết bị xét nghiệm lâm sàng ............................................................... 9
1.2. Quang phổ ánh sáng và sự hấp thụ ánh sáng ................................................. 11
1.3. Nguyên lý đo quang ...................................................................................... 12
1.4. Nguyên lý miễn dịch đo độ đục..................................................................... 15
1.4.1. Kháng nguyên và kháng thể ............................................................... 15
1.4.2. Nguyên lý miễn dịch đo độ đục .......................................................... 17
1.5. Các phương pháp đo và đặc tính của xét nghiệm hóa sinh ............................ 21
1.5.1. Các phương pháp đo sử dụng trong máy xét nghiệm sinh hóa ........... 21
1.5.2. Các đặc tính của một xét nghiệm........................................................ 22
1.6. Nguyên lý chuẩn thiêt bị ............................................................................... 23
1.7. Các thành phần khác ..................................................................................... 24
1.7.1. Nguồn sáng và hệ thống lọc ............................................................... 24
1.7.2. Điện giải đồ ........................................................................................ 26
CHƯƠNG 2. XÉT NGHIỆM HÓA SINH ........................................................... 27
2.1. Nghiệm phẩm ................................................................................................ 27
2.1.1. Các loại nghiệm phẩm ........................................................................ 27
2.1.2. Hệ thống đơn vị sử dụng .................................................................... 28
2.1.3. Ống chứa mẫu .................................................................................... 29
2.2. Các giai đoạn thực hiện xét nghiệm .............................................................. 30
2.3. Các xét nghiệm tính tốn lại khoảng giá trị bình thường .............................. 31
2.3.1. AST và ALT ...................................................................................... 31
2.3.2. Creatinin ............................................................................................ 34
2.3.3. Glucose .............................................................................................. 35

1


2.3.4. Urea ................................................................................................... 37
CHƯƠNG 3. QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG TRONG XÉT NGHIỆM ................. 39
3.1. Độ tin cậy của xét nghiệm ............................................................................. 39
3.2. Nội kiểm soát chất lượng .............................................................................. 40
3.2.1. Khái niệm ........................................................................................... 40
3.2.2. Biểu đồ Levey-Jennings ..................................................................... 41
3.2.3. Luật Westgards................................................................................... 42
3.3. Ngoại kiểm soát chất lượng........................................................................... 43
3.3.1. Khái niệm ........................................................................................... 43
3.3.2. Đánh giá ngoại kiểm .......................................................................... 44
3.4. Quản lý chất lượng bằng ISO và An toàn sinh học ..................................... 47
CHƯƠNG 4. QUY TRÌNH THỰC HIỆN VÀ KẾT QUẢ ................................. 52
4.1. Thiết bị xét nghiệm ....................................................................................... 52
4.2. Xử lý số liệu và kết quả................................................................................. 55
4.2.1. Glucose .............................................................................................. 55
4.2.2. AST .................................................................................................... 58
4.2.3. ALT .................................................................................................... 63
4.2.4. Ure ..................................................................................................... 68
4.2.5. Creatinin ............................................................................................. 73
4.3. Nhận xét ........................................................................................................ 78
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 81

2


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Giải thích

XN

Xét nghiệm

PXN

Phịng xét nghiệm

XNHS

Xét nghiệm hóa sinh

KGTBT

Khoảng giá trị bình thường

BTTB

Giá trị trung bình

HT

Huyết thanh

NP

Nghiệm phẩm

3


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
1.1 Ví dụ mơ hình flame photometry......................................................................... 9
1.2 Phương pháp đếm tế bào Coulter Coulter .......................................................... 10
1.3 Quang phổ ánh sáng .......................................................................................... 11
1.4 Các thành phần thiết yếu của một thiết bị đo quang .......................................... 13
1.5 Định luật Lambert - Beer ................................................................................... 13
1.6 Ví dụ về đường chuẩn ....................................................................................... 14
1.7Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng trên chuột ............................................. 17
1.8 Đường cong nhưng kết ...................................................................................... 19
1.9 Vi hạt từ phủ kháng nguyên hoặc kháng thể ...................................................... 20
1.10 Phương pháp đo điểm cuối .............................................................................. 21
1.11 Phương pháp đo động học 2 điểm ................................................................... 21
1.12 Phương pháp đo động học ............................................................................... 22
1.13 Sự tuyến tính của xét nghiệm .......................................................................... 23
1.14 Mối tương quan trong hiệu chuẩn thiết bị........................................................ 23
1.15 Năng lượng quang phổ của các nguồn sáng khác nhau ................................... 25
2.1 Các thành phần của máu .................................................................................... 27
2.2 Thông số cài đặt ALT trên Beckman Coulter AU680 ....................................... 33
2.3 Thông số cài đặt AST trên Beckman Coulter AU680........................................ 33
2.4 Thông số cài đặt Creatinin trên Beckman Coulter AU680 ................................ 35
2.5 Thông số cài đặt Glucose trên Beckman Coulter AU680 .................................. 36
2.6 Thông số cài đặt Ure trên Beckman Coulter AU680 ......................................... 38
3.1 Phân bố Gauss ................................................................................................... 41
3.2 Ví dụ đồ thị Levey-Jennings theo dõi cholesterol trong 30 ngày ....................... 42

3.3 Luật Westgard cơ bản ........................................................................................ 43
3.4 Biểu đồ Levey-Jenning trong ngoại kiểm soát chất lượng ................................. 45
3.5 Ví dụ về đồ thị TS ............................................................................................. 46
4.1 Đồ thị phân phối tần số giá trị glucose giới tính nam ........................................ 56
4.2 Đồ thị phân phối tần số giá trị glucose giới tính nữ. .......................................... 56
4.3 Đồ thị phân phối tần số giá trị glucose tổng hợp của nam và nữ ....................... 57
4.4 Biểu đồ Q-Q Plot của glucose dựa trên mẫu tổng hợp của nam và nữ............... 58
4.5 Đồ thị phân phối tần số giá trị logarit tự nhiên của AST giới tính nam ............. 60

4


4.6 Biểu đồ Q-Q Plot cho giá trị logarit tự nhiên của AST giới tính nam ................ 60
4.7 Đồ thị phân phối tần số giá trị logarit tự nhiên của AST giới tính nữ ................ 61
4.8 Biểu đồ Q-Q Plot cho giá trị logarit tự nhiên của AST giới tính nữ .................. 61
4.9 Đồ thị phân phối tần số ln giá trị của AST tổng hợp của nam và nữ ................. 62
4.10 Đồ thị phân phối tần số giá trị logarit tự nhiên của ALT giới tính nam ........... 65
4.11 Biểu đồ Q-Q Plot cho giá trị logarit tự nhiên của ALT giới tính nam ............. 65
4.12 Đồ thị phân phối tần số giá trị logarit tự nhiên của ALT giới tính nữ .............. 66
4.13 Biểu đồ Q-Q Plot cho giá trị logarit tự nhiên của ALT giới tính nữ ................ 66
4.14 Đồ thị phân phối tần số ln của AST tổng hợp của nam và nữ .......................... 67
4.15 Đồ thị phân phối tần số giá trị Ure giới tính nam ............................................ 70
4.16 Biểu đồ Q-Q giá trị Ure giới tính nam ............................................................. 70
4.17 Đồ thị phân phối tần số giá trị Ure giới tính nữ ............................................... 71
4.18 Biểu đồ Q-Q giá trị Ure giới tính nữ................................................................ 71
4.19 Đồ thị phân phối tần số giá trị Ure tổng hợp của nam và nữ ........................... 72
4.20 Đồ thị phân phối tần số giá trị Creatinin giới tính nam .................................... 75
4.21 Biểu đồ Q-Q giá trị Creatinin giới tính nam .................................................... 75
4.22 Đồ thị phân phối tần số giá trị Creatinin giới tính nữ ...................................... 76
4.23 Biểu đồ Q-Q giá trị Creatinin giới tính nữ ....................................................... 76

4.24 Đồ thị phân phối tần số giá trị Creatinin tổng hợp của nam và nữ ................... 77

5


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng

Trang

2.1 Các đơn vị thường được sử dụng ....................................................................... 28
2.2 Thông tin các loại ống đựng mẫu máu thường dùng ......................................... 29
2.3 Khoảng giá trị bình thường tham khảo của ALT và AST cho người lớn ........... 32
2.4 Khoảng giá trị bình thường của Creatinin máu .................................................. 34
2.5 Khoảng giá trị bình thường tham khảo của Glucose máu trong huyết thanh ..... 36
2.6 Khoảng giá trị bình thường tham khảo của Ure máu ......................................... 37
3.1 Cơng thức của phân bố Gauss ........................................................................... 41
3.2 Luật Westgard cơ bản ........................................................................................ 42
3.3 Mối liên quan giữa nhóm nguy cơ vi sinh vật và cấp độ ATSH ........................ 50
4.1 Bảng trình bày kết quả mẫu ............................................................................... 53
4.2 Tần xuất phân bố giá trị glucose của 720 người bình thường ............................ 55
4.3 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của glucose ................................................ 57
4.4 Tần xuất phân bố giá trị AST của người bình thường ....................................... 58
4.5 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của giá trị ln AST ...................................... 62
4.6 Tần xuất phân bố giá trị ALT của người bình thường ....................................... 63
4.7 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của giá trị ln AST ...................................... 67
4.8 Tần xuất phân bố giá trị Ure của 720 người bình thường .................................. 68
4.9 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của Ure ...................................................... 72
4.10 Tần xuất phân bố giá trị Creatinin của 720 người bình thường ....................... 73
4.11 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của Creatinin ........................................... 77

4.12 So sánh kết quả đạt được với thông số của hãng và tài liệu ............................. 79

6


MỞ ĐẦU
Trong các loại máy xét nghiệm thì máy phân tích hóa học gần như được phát
minh sớm nhất, giúp cho bác sĩ lâm sàng có đầy đủ cơ sở hơn trong chẩn đoán và
điều trị. Với một quốc gia đang phát triển như Việt Nam, các hệ thống xét nghiệm
hóa sinh tự động đang từng ngày thay thế các hệ thống bán tự động đang có, điều này
khơng những giúp giảm bớt thao tác kỹ thuật viên mà còn nâng cao hiệu suất hoạt
động.
Luận văn này có 2 mục đích chính, đầu tiên là tổng hợp lại được kiến thức cần
thiết về xét nghiệm hóa sinh mà thơng qua đó, người thao tác xét nghiệm có thể dễ
dàng hơn trong việc quản lý, theo dõi và điều chỉnh thiết bị cũng như chất lượng xét
nghiệm. Điểm tiếp theo là thống kê lại khoảng tham chiếu cho 5 xét nghiệm: ALT,
AST, Creatinin, Glucose, Ure. Những kết quả này được thu nhận từ những đợt khám
sức khỏe định kỳ tại một bệnh viện lớn ở nội thành TP.HCM trên máy xét nghiệm
hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680 sử dụng hóa chất Beckman Coulter. Quy
trình thực hiện được thực hiện dựa trên hướng dẫn của tài liệu CLSI “EP28-A3C
Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory;
Approved Guideline – Third Edition”.
Hiện tại ở Việt Nam, những đơn vị tham gia ISO15189 nếu tính lại khoảng tham
chiếu thì chỉ thực hiện trên 30 mẫu với phân bố Student, nếu phân bố không đạt sẽ
tiếp tục lấy mẫu đến khi đạt. Hướng dẫn của CLSI thể hiện sự vượt trội hơn trong
việc sử dụng số lượng mẫu lớn (từ 120 mẫu trở lên) và phân bố Gauss.
Việc vận hành các thiết bị xét nghiệm tự động địi hỏi có những quy trình chuyên
biệt phù hợp quy chuẩn quốc tế và Việt nam. Luận văn này được thực hiện nhằm
cung cấp một tài liệu tổng quan về hệ thống thiết bị xét nghiệm tự động, các quy trỉnh
quản lý, vận hành, đặc biệt quản lý chất lượng và an toàn và thực hiện một quy trình

khảo sát và xác định khoảng tham chiếu theo quy chuẩn CLSI cho một số xét nghiệm
phổ biến.

7


CHƯƠNG 1. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM
1.1. Thiết bị xét nghiệm
1.1.1. Phân loại thiết bị xét nghiệm
Thiết bị phân tích hay thiết bị xét nghiệm (XN) có rất nhiều chủng loại, ứng dụng
trong nhiều ngành với đối tượng khác nhau và bằng phương pháp khác nhau. Mục
đích cuối cùng của thiết bị XN là phải xác định được ít nhất 1 trong 3 loại thơng số:
số lượng của một chất nào đó trong chất nền, định tính tự hiện diện của thành phần
nào đó trong chất nền và xác định được cấu trúc của một thành phần nào đó trong
chất nền. Dựa vào nền tảng khoa học được ứng dụng mà có:
-Thiết bị phân tích bằng quang phổ
-Thiết bị phân tích bằng sắc ký
-Thiết bị phân tích bằng năng lượng nhiệt
-Thiết bị phân tích sử dụng tia có năng lượng cao (tia X)
-Thiết bị phân tích sử dụng hiển vi
-Thiết bị phân tích sử dụng cơng nghệ điện hóa
-Thiết bị phân tích sử dụng cơng nghệ tổng hợp
Trong lĩnh vực y tế hay rõ hơn là XN lâm sàng thường dùng chỉ định lượng và
định tính các loại chất trên cơ thể sinh vật sống, chủ yếu nhất vẫn là con người.
XN sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng bao gồm 4 phân khu:
-Phân khu hóa sinh: định lượng thành phần hiện diện trong chất nền có trong các
loại nghiệm phẩm như nước tiểu, máu, các loại dịch.
-Phân khu huyết học: số lượng các loại tế bào máu, XN đông máu.
-Phân khu vi sinh: xác định sự hiện diện của vi sinh vật.
-Phân khu ngân hàng máu: Xác định loại máu.

Tuy nhiên, nói đến thiết bị XN lâm sàng nói chung có thể chia thành 7 loại máy
chính như sau:
-Đo màu
-Quang kế ngọn lửa
-Quang phổ kế

8


-Thiết bị phân tích tê bào máu
-Thiêt bị phân tích độ pH và khí máu
-Máy sắc ký
-Máy phân tích tự động
1.1.2. Thiết bị xét nghiệm lâm sàng
Flame photometry đo quang phổ của ngọn lửa cháy cung cấp bởi oxy và chất
phụ gia, thường dùng để đo nồng độ các kim loại thuần như Na+, K+, Li+, Ca++

Hình 1.1 Ví dụ mơ hình flame photometry, hỗn hợp khí gas, oxy và dung dịch chất
được đốt cháy, quang phổ thu nhận từ ngọn lửa này sẽ được thu nhận và xử lý [1].
Thiết bị phân tích tế bào máu hay máy huyết học dùng để đếm số lượng tế bào
máu tồn tại trong 1 đơn vị thể tích máu. Tế bào máu bao gồm hồng cầu bạch cầu trung
tính, bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân và tiểu cầu. Có 2 cách khác nhau để thực
hiện công việc này, cách cổ điển hơn được phát minh bởi Coulter Counter, đếm và
nhận dạng số lượng tế bào máu bằng trở kháng của từng tế bào. Cách thứ 2 xuất hiện
về sau này khi cơng nghệ laser phát triển, Dịng chảy tế bào (Flow cytometry) đếm
và phân loại tế bào dựa vào sự phản xạ, tán xạ của chùm laser.

9

Hình 1.2 Phương pháp đếm tế bào Coulter Coulter [2].
Sắc ký là loại thiết bị dùng để tách và định lượng các chất trong dung dịch, các
chất trong “pha động” lẫn dung mơi sẽ đi qua “pha tĩnh”, sự đình trệ của của một số
chất nhất định sẽ xảy ra và các chất này được giữ lại và tiếp tục di chuyển sau thời
gian lưu. Với sự kết hợp của pha tĩnh, pha động, cọt và bộ đếm mà có các loại sắc ký
sau: Sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký hấp thụ, sắc ký
loại vách ngăn, sắc ký loại trừ phân tử,…
Thiết bị XN quang sử dụng quang phổ biến đổi ánh sáng (bức xạ điện từ) thành
thành dạng năng lượng khác với 3 q trình chính: hấp thụ, huỳnh quang và phát xạ.
Hấp thụ là quá trình năng lượng của chùm photon được chuyển vào hệ nguyên tử
phân tử. Huỳnh quang là khi năng lượng từ ánh sáng bị hấp thụ bởi nguyên tử sẽ phát
xạ sau vài mili-giây. Phát xạ là khi nguyên phân tử trở nên kích thích khi nhận lượng
lớn năng lượng từ việc nung nóng, phóng điện, tia có năng lượng cao,... và phát ra
các bức xạ khi nguyên phân tử này trở về trạng thái cơ bản.Thiết bị xét nghiệm hóa
sinh lâm sàng sử dụng chủ yếu quang phổ từ ngoại gần cho đến hồng ngoại gần. Hoạt
động theo nguyên tắc là đo sự hấp thụ bước sóng hoặc phổ sóng của dung dịch như
đã trình bày ở chương sau.. Các thành phần tồn tại trong hỗn hợp mẫu và thuốc thử
sẽ được định lượng gián tiếp qua độ hấp thụ bước sóng nhất định.
Một hệ thống phân tích tự động là thiết bị phịng thí nghiệm y tế được thiết kế
để định lượng chất hóa học khác nhau và các đặc điểm khác trong một số mẫu sinh
học một cách nhanh chóng, với sự hỗ trợ của con người tối thiểu. Mẫu có thể được
xử lý đơn lẻ, theo lơ, hoặc liên tục.
Việc tự động hóa các thử nghiệm trong PXN khơng loại bỏ sự cần thiết cho
chuyên môn của con người (kết quả vẫn còn phải được đánh giá bằng kỹ thuật y học
và các chun gia phịng thí nghiệm lâm sàng có trình độ khác), nhưng sẽ làm giảm

10


lo ngại về giảm lỗi, các vấn đề nhân sự và an tồn, có thể coi là sự cải tiến và phát

triển của thiết bị XN bán tự động.
Các hệ thống tự động đã thay đổi rất nhiều tính chất của các PXN hóa học bằng
cách cho phép tăng đáng kể trong số các mẫu mà có thể được xử lý. Thậm chí ở các
hệ thống tự động lớn bao gồm nhiều thiết bị XN khác nhau kết nối nhau có thể đồng
loạt thực hiện các loại XN đa dạng mà nhanh chóng và giảm thiểu tối đa các sai sót
khi thực hiện thủ cơng bằng tay gây ra.
1.2. Quang phổ ánh sáng và sự hấp thụ ánh sáng
Ứng dụng sóng điện từ trong XN quang phổ có dãy phổ rộng rãi nằm từ vùng tử
ngoại đến hồng ngoại gần. Trong các thiết bị XNHS máu thơng thường, bước sóng
sử dụng nằm từ khoảng 340 – 900nm tùy vào công nghệ và xét nghiệm cụ thể.

Hình 1.3 Quang phổ ánh sáng khả kiến là một dải nhỏ nằm trong quang phổ điện
từ, trong đó mối liên hệ giữa năng lượng và bước sóng của ánh sáng trong dải sóng
điện từ được mô tả qua công thức sau: ε = hν; trong đó h=6,.625.10-34 J.s là hằng số
Planck, c=299.792.458 m/s là vận tốc của ánh sáng trong chân không [3] [4].
[Trong hệ thống máy XNHS, khi cho bức xạ ánh sáng đi qua dung dịch, hiện
tượng vật chất hấp thụ hoặc phát xạ năng lượng xảy ra. Sự hấp thụ và phát xạ này xảy
ra có nặng lượng ΔE = hν, ứng với độ biến thiên cửa mức năng lượng ban đầu và lúc
cuối. ΔE>0 ứng với sự hấp thụ bức xạ điện từ và ngược lại ΔE<0 là sự phát xạ.
Bất kỳ một hệ nào cũng cần có sự vận động để tồn tại, một phân tử cũng thế, cơ
bản là có các chuyển động sau (xét phân tử này trong một hệ cô lập):

11


- Chuyển động của các điện tử quanh các hạt nhân: các điện tử hóa trị và các điện
tử khơng tham gia tạo liên kết hóa học - gọi chung là chuyển động điện tử.
- Chuyển động thay đổi tuần hồn các vị trí của các hạt nhân so với nhau - gọi là
chuyển động dao động của phân tử.
- Chuyển động thay đổi phương hướng của toàn phân tử trong không gian - gọi

là chuyển động quay của phân tử, chuyển động này chỉ có ở các phân tử các chất ở
trạng thái khí và hơi.
Mỗi phân tử của một chất thì có cấu trúc khác nhau nên có các bước chuyển năng
lượng khác nhau, sẽ có phổ hấp thụ phân tử đặc trưng và khác nhau. Mặt khác với
các kỹ thuật phù hợp, người ta tạo phổ điện tử, phổ dao động, phổ quay của phân tử
của chất nghiên cứu, đó chính là cơ sở của các phương pháp phân tích định tính. Cịn
để phân tích định lượng, người ta dựa vào định luật về sự hấp thụ bức xạ điện từ
Lambert-Beer [6].
Thông thường sự phát xạ chỉ xảy ra ở một số đơn chất và chất vô cơ, gần như là
tất cả các trường hợp thực tế trong máy XNHS là sự hấp thụ năng lượng của phân tử
và hợp chất hữu cơ. Khi bước sóng được chọn đi qua môi trường chất, các phân tử
hấp thụ năng lượng và làm giảm cường độ của bước sóng đó.
Trong hệ thống máy AU của hãng Beckman, ánh sáng từ bóng halogen đi qua
cuvette chứa dung dịch trước khi được phân tích bởi hệ thống cách tử. Như vậy để
xác định được nồng độ chất trong dung dịch, cần phải sử dụng bước sóng mà dung
dịch hấp thụ mạnh nhất. Ví dụ: dung dịch chất màu đỏ hấp thụ ánh sáng màu xanh
dương là mạnh nhất, vì thế dùng bước sóng màu xanh dương để xác định nồng độ
chất.
1.3. Nguyên lý đo quang
Bản chất của thiết bị đo quang (hay cịn gọi là đo màu) là tính tốn được nồng độ
chất gián tiếp thông qua việc thu nhận và đo đạc đại lượng vật lý quang học là ánh
sáng. Mối quan hệ giữa nồng độ chất (gọi tắt là nồng độ) và tín hiệu quang (độ hấp
thụ quang) của dung dịch là điều cốt lõi nhất mà thiết bị XNHS cần giải quyết. Định
luật về sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch hay còn gọi là định luật Bouguer – Lambert
– Beer là mơ hình tốn học cho hiện tượng vật lý quan trọng này.

12


Hình 1.4 Mơ hình đơn giản các thành phần thiết yếu của một thiết bị đo quang

thông thường.
Khi chiếu chùm sáng đơn sắc, sự hấp thụ ánh sáng trong dung dịch mô tả ánh
sáng bị hấp thụ (Ia) thông qua cường độ chùm sáng đầu ra (I) và cường độ chùm sáng
đầu vào (I0), Ánh sáng bị phản xạ bởi bề mặt cuvette (Ia) được bỏ qua vì khơng đổi
và rất nhỏ.

Hình 1.5 Mật độ cường độ quang dI = - λ.I.dx với λ là độ giảm cường độ, đây
được xem là tiền đề cho định luật Lambert – Beer.
Định luật Bouguer – Lambert dạng logarit thập phân được mô tả như sau:
I = I0 . 10 -λ .L
Trong đó :
I là cường độ dòng sáng sau khi đi qua dung dịch.
I 0 là cường độ dòng sáng rọi vào dung dịch.
L là đường đi của tia sáng - quang lộ
λ là hệ số giảm sáng hay hệ số tắt sáng
Khi nghiên cứu sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch thì Beer đã thiết lập rằng: Hệ
số tắt λ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ ánh sáng :
λ = .C
Với :
C: nồng độ chất tan (mol/L)
: hệ số hấp thụ mol (molar absorptivity) hay còn gọi là hệ số suy
giảm mol (molar attenuation coefficient) hoặc hệ số dập tắt mol
(molar extinction coefficient )(m2mol-1)

13


Kết hợp hai định luật trên ta được phương trình của định luật cơ bản về phương
pháp đo màu gọi là định luật Bouguer – Lambert – Beer [7]: I = I0.10-.C .L
Tỷ số giữa dòng sáng sau khi đi qua dung dịch (I t) với dỏng sáng rọi vào dung

dịch (I 0) gọi là độ truyền qua, ký hiệu là T: T = I / I 0 = 10-.C .L. Đại lượng T ứng
với chiều dày lớp dung dịch bằng 1 cm được gọi là hệ số truyền qua.
Logarit của đại lượng nghịch đảo với độ truyền qua là độ hấp thụ, ký hiệu là A
hay trong thiết bị XN hóa sinh gọi là nồng độ quang, ký hiệu là D hoặc OD : OD = D
= A = Log 1/T = Log I0 / It = CL.
Đối với các chất có dạng đồ thị là tuyến tính, khi áp dụng phương pháp đo màu,
ta đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch và xác định được nồng độ của chất đó bằng
cách nhân độ hấp thụ E với một hệ số, hệ số này phụ thuộc vào bản chất của chất
nghiên cứu. Hệ số này được xác định bằng cách lập tỷ số của độ hấp thụ trên nồng độ
của dưng dịch chuẩn.
X = tanα = Độ hấp thụ (A) / Nồng độ chuẩn (C).
α là góc tạo bởi trục hoàng và đường calib
Đối với chất cần định lượng thì C‘ = X.A‘

Hình 1.6 Ví dụ cho đường chuẩn được tạo ra bởi chất chuẩn có nồng độ xác định,
thiết bị đo qua sẽ đo đạc, thu nhận và tính tốn ra giá trị OD, từ đó tạo với gốc một
đường thẳng y = ax + b. Trong đó a = tanα = L gọi là hệ số góc và B là offset.
Để tiếp nối thành cơng của định luật Bouguer – Lambert – Beer, năm 2013, J.
Mark Parnis làm việc tại khoa hóa học của đại học Trent, Canada đã chứng minh
được rằng độ hấp thụ của ánh sáng trong mơi trường chất sẽ có sự thay đổi tuyến tính
phụ thuộc vào thời gian. Mơ phỏng và tính tốn ở góc độ lượng tử, Parnis đã triển
khai hàm vi phân của công thức OD thành bộ đôi công thức vi phân từng phần thể
hiện sự tương quan về không gian và thời gian, (x là hướng dọc đường đi tia sáng)
[8]:

14


Sự ảnh hưởng do thời gian hồn tồn được xóa bỏ khi thời gian đo mẫu chuẩn và
và thời gian đo nghiệm phẩm bằng nhau. Hiệu chuẩn thiết bị thực chất là đưa một

chất có nồng độ xác định để máy đo ra OD tương tứng, từ đó mà tính ra X.
1.4. Nguyên lý miễn dịch đo độ đục [9]
Các XN miễn dịch phức tạp hơn từ khâu chế biến, cơ chế, sự thay đổi của kết
quả, yêu cầu về cơng nghệ và kỹ thuật,... đơn giản là vì với vi lượng rất nhỏ, rất khó
để có sự chính xác trong định tính và định lượng. Các phương pháp XN miễn dịch
cần phải có chất đánh dấu phát quang để đong đếm được nồng độ hoạt chất. Tuy
nhiên, nguyên lý miễn dịch đo độ đục không cần đến các chất đánh dấu, cơ chế rửa
nhiều lần,... mà chỉ đơn giản là cho hỗn hợp kháng nguyên kháng thế kết dính với
nhau và tạo thành khối protein hấp thu đơn bước sóng nhất định, thường là khoảng
500 – 800 nm.
Đường chuẩn xây dựng cũng có phương trình và hình dáng khác so với đo quang
thông thường. Nếu đo quang so màu tạo ra đường chuẩn là đường thẳng thì thơng
thường đường chuẩn trong miễn dịch lại không phải là đường thẳng, xem thêm 1.4.2.
để rõ hơn về cách xây dựng đường cong chuẩn này.
Một số đặc tính của xét nghiệm miễn dịch đo độ đục như: độ nhạy, khoảng tuyến
tính, độ chính xác, độ lặp lại, sự tương quan với các phương pháp khác,... gần như
được hiểu khơng khác gì so với phương pháp so màu dung dịch.
1.4.1. Kháng nguyên và kháng thể [10]
Trong lịch sử phát triển của y học, miễn dịch có nhiều định nghĩa khác nhau.
Nhắc đến nhiều nhất về miễn dịch là sự gắn liền với việc bị nhiễm trùng. Miễn dịch
ngày nay được định nghĩa chung là: “Miễn dịch là khả năng phịng vệ của tồn bộ cơ
thể đối với các yếu tố mang thông tin di truyền ngoại lai (thông tin lạ).”
Hệ thống miễn dịch của sinh vật có thể phân thành 2 loại chính: Miễn dịch tự
nhiên (không đặc hiệu) và miễn dịch thu được (đặc hiệu). Miễn dịch tự nhiên là các
hàng rào vật lý bên nghoài như da, màng tế bào; các tế bào như bạch cầu, đại thực
bào,…; hàng rào hóa học bao gồm các hóa chất ức chế hoạt động của vật lạ; hàng rào
sinh vật và hàng rào thể chất. Miễn dịch thu được xuất hiện khi có sự kết hợp giữa
kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu tương ứng. Ứng dụng cơ chế liên kết đặc hiệu
này mà người ta thế kế ra các loại thuốc thử bắt được các thành phần có nồng độ thấp
trong nghiệm phẩm, cụ thể là: ASO, RF, HbA1c, một số thành phần thuốc trong dịch

cơ thể …
15


Kháng nguyên là những chất, kể cả những chất của cơ thể mà trong thời kỳ phát
triển phôi thai chúng chưa được tiếp xúc (hay làm quen) với cơ quan miễn dịch của
cơ thể. Kháng ngun có tính kháng ngun và tính đặc hiệu, định lượng hóa sinh
bằng miễn dịch đo độ đục là ứng dụng sự đặc hiệu này mà tạo ra sự liên kết. Tính đặc
hiệu của kháng thể được thể hiện qua 1 phần của kháng thể, đó là các yếu tố kháng
nguyên (epitope), các epitop này có bản chất là protein.
Kháng thể là các phân tử globulin miễn dịch nên được gọi là immunoglobulin (có
bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ
lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vơ hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn
các vi khuẩn hoặc virus. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện đặc hiệu một kháng
nguyên duy nhất. Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi
nặng (H, heavy) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light) cũng giống hệt nhau. Có
hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử
immunoglobulin chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ. Các chuỗi của immunoglobulin
liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfidevà có độ đàn hồi nhất định. Một phần cấu
trúc của các chuỗi thì cố định nhưng phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến
thiên giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản
ứng đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzym
tiếp xúc với cơ chất của nó. Có thể tạm so sánh sự đặc hiệu của phản ứng kháng thểkháng nguyên như với ổ khóa và chìa khóa.
Là kháng ngun khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể
dịch thể đặc hiệu (chủ yếu là IgG) để kết hợp với kháng nguyên đó. Đáp ứng miễn
dịch dịch thể do các lympho bào B phụ trách. Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế
giới (WHO, 1964) “kháng thể dịch thể làcác protein có trong huyết thanh và sữa có
tính kháng ngun vàcấu trúc giống globulin”, ký hiệu là Ig (Immunoglobulin). Ở
người có 5 lớp Ig là Ig G, Ig A, Ig D, Ig E, Ig M.
Để điều chế thuốc thử là các kháng thể bắt các kháng nguyên, kháng thể đó được

con người sản xuất từ động vật, gọi là kháng thể đơn dòng. Kháng thể đơn dịng là
kháng thể chỉ có 1 loại Ig được sản xuất chỉ để liên kết với 1 loại epitope riêng biệt.
Các kháng thể đơn dịng giống nhau hồn toàn về cấu trúc, paratop, mức độ đặc hiệu.
Kháng thể đơn dịng khơng có trong điều kiện tự nhiên. Con người đã phải nghiên
cứu và sản xuất ra trong phòng thí nghiệm, đây là đóng góp lớn cho miễn dịch học về
nghiên cứu, ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị.Năm 1975, phương pháp sản xuất
kháng thể đơn dòng này được Milstein và Kohler tạo ra bằng kỹ thuật liên hợp tế bào
Myeloma (tế bào u tủy) với lympho bàoB hoạt hố của chuột.
Để sản xuất kháng thể đơn dịng, người ta dùng kỹ thuật lai tế bào để kết hợp hai
loại tế bào: Tế bào u tuỷ (tế bào Myeloma) với lympho bào B đã hoạt hoá của chuột
để tạo tế bào lai, tế bào lai nuôi trong môi trường nhân tạo có khả năng phân chia phát
triển lâu dài và sản xuất kháng thể đặc hiệu. Khoa học phát triển, nhiều loại tế bào và
nhiều giống loại được kết hợp và cho ra những sản phẩm mong muốn [11].

16


Hình 1.7 Sơ đồ mơ tả chung quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng trên chuột
[11] .

17


1.4.2. Nguyên lý miễn dịch đo độ đục
Phương pháp định lượng hóa sinh phân loại theo đặc điểm thuốc thử có 2 loại
chính, một là định lượng bằng dung dịch thuốc thử và mẫu hấp thụ bước sóng nhất
định, hai là sử dụng cơ chế liên kết kháng nguyên kháng thể để đo độ đục.
Phương pháp miễn dịch đo độ đục được gọi đầy đủ là phương pháp miễn dịch đo
độ đục vi hạt (microparticle immunoturbidimetric) chủ yếu dùng để định lượng sự
hiện diện các thành phần thuốc hoặc chỉ dấu sinh học trong nghiệm phẩm là dịch cơ

thể như huyết thanh, huyết tương hoặc nước tiểu,… Phương pháp này được thực hiện
dựa trên nguyên tắc là sự kết dính của kháng nguyên – kháng thể. Đường cong phản
ứng được hình thành phụ thuộc vào nồng độ, tốc độ ngưng kết tối đa với nồng độ
thuốc thấp nhất và ngược lại, tốc độ ngưng kết tối thiểu với nồng độ thuốc cao nhất.
Cũng như những phương pháp ứng dụng miễn dịch khác, phương pháp này dựa
trên đặc tính và độ nhạy phản ứng cao giữa kháng nguyên và kháng thế. Tất cả các
kháng thể đều là các phân tử globulin miễn dịch (immunoglobin) thuộc họ
glycoprotein và được chia thành 5 loại là IgG, IgA, IgD, IgM và IgE. Cấu trúc thơng
thường của kháng thể là phân tử có hình chữ Y chứa các chuỗi polypeptide có trọng
lượng phân tử khác nhau. Khu vực kháng nguyên và kháng thể liên kết với nhau gọi
là epitop, đây cũng chính là các yếu tố quyết định đặc tính của miễn dịch, yếu tố này
sẽ tạo ra sự liên kết bằng các liên kết ở mức độ phân tử trong khơng gian ví dụ như
liên kết cộng hóa trị. Các rành buộc này được thiết kế bằng 6 – 10 amino acid, với
bất kỳ sự sai lệch hoặc thay đổi nhỏ nào cũng có thể dẫn tới sự khác biệt về lực liên
kết giữa kháng nguyên – kháng thể. Sự bền vững này có nhiều các chỉ tiêu khác nhau
để đánh giá và tất nhiên không thể loại trừ những trường hợp nhiều loại kháng nguyên
khác nhau có epitop giống nhau [12].
Độ hấp thụ quang được xử lý gián tiếp thơng qua sự dính kết của hợp chất. Đường
cong ngưng kết định lượng (quantitative precipitin curve). Đường cong này mô tả
mối liên hệ về sự kết của giữa nồng độ kháng nguyên và nồng độ kháng thể.

18


Hình 1.8 Đường cong ngưng kết định lượng của tất cả các phương pháp miễn
dịch đề có thể chia thành 3 phân vùng chính. Nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể
quá nhiều đều ảnh hưởng đến độ kết tủa của hợp chất, pha đầu tiên tượng trưng cho
trường hợp có ít kháng nguyên trong mẫu, pha tiếp theo nồng độ kháng nguyên và
kháng thể tương đối xấp xỉ nhau và pha cuối cùng, lượng kết quả giảm do nồng độ
kháng nguyên quá cao [13].

Trong thực nghiệm, kháng nguyên tồn tại trong nghiệm phẩm có thể là các thành
phần vi lượng, virus, … có epitop đặc trưng, kháng thể trong thuốc thử sẽ được phủ
lên hạt latex (vi hạt ở mức độ nano). Các nghiên cứu về hạt latex và phản ứng ngưng
kết được mô tả lần đầu bởi Singer và Plotz năm 1956 trong ứng dụng định lượng các
yếu tố thấp RF trong cơ thể. Khoa học và y học phát triển, con người đi sâu hơn vào
công nghệ này. Đến năm 1992 khoảng 200 thuốc thử ứng dụng công nghệ này đã
được thương mại hóa [12].
Phản ứng ngưng kết sẽ diễn ra tạo thành khối đơng, âm tính hay dương tính đều
là kết quả trung gian của việc so sánh định lượng với một giá trị ngưỡng. Ví dụ: Thuốc
thử Beckman Coulter OSR6199 dùng để định lượng CRPhs huyết thanh có thể trả kết
19