Nghiên cứu xác lập các điều kiện thích hợp để cố định nấm men saccharomyces cerevisiae trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng lên men rượu vang nho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TÔN NỮ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC LẬP CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ
CỐ ĐỊNH NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE
TRONG GEL ALGINATE VÀ TRÊN CELLULOSE VI KHUẨN
NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN RƯỢU VANG NHO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TÔN NỮ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC LẬP CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ
CỐ ĐỊNH NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE
TRONG GEL ALGINATE VÀ TRÊN CELLULOSE VI KHUẨN
NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN RƯỢU VANG NHO

Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm và Đồ uống
Mã số chun ngành:62540201

Phản biện độc lập 1: GS. TS. Hồng Đình Hịa
Phản biện độc lập 2: PGS. TS. Lý Nguyễn Bình

Phản biện 1: GS. TSKH. Lưu Duẩn
Phản biện 2: PGS. TS. Phạm Thu Thủy
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn

i


LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết
quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ
bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu
đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu.

Tác giả luận án
Tôn Nữ Minh Nguyệt

ii


TĨM TẮT LUẬN ÁN

Với mục đích so sánh khả năng lên men của nấm men cố định trong gel alginate và
nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men chính sản xuất rượu
vang nho, nội dung nghiên cứu của luận án gồm có bốn phần chính.
Phần 1: Xác định các thơng số thích hợp cho q trình cố định nấm men trong hạt

gel alginate và trên chất mang cellulose vi khuẩn bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao hai yếu tố, hàm mục tiêu là hiệu suất cố định tế bào. Nguyên liệu sử
dụng để làm chất mang đều có nguồn gốc nội địa.
Phần 2: So sánh khả năng lên men rượu vang của nấm men cố định trong gel
alginate, nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn và nấm men tự do thông qua khả
năng sinh trưởng, sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp sản phẩm.
Phần 3: Nghiên cứu quá trình tái sử dụng của các loại nấm men cố định để lên men
rượu vang. Việc tái sử dụng nấm men cố định được tiến hành liên tục trong 10 chu kỳ
lên men. Động học quá trình lên men ở một số chu kỳ đã được trình bày chi tiết.
Chúng tơi so sánh khả năng tái sử dụng của hai loại nấm men cố định trong gel
alginate và trên cellulose vi khuẩn dựa trên thời gian lên men, tốc độ sử dụng đường,
tốc độ sinh tổng hợp ethanol, tỷ lệ tế bào thoát khỏi chất mang, độ bền của chất mang
qua các chu kỳ tái sử dụng.
Phần 4: Thiết lập các phương trình cân bằng vật chất của q trình lên men chính
trong sản xuất rượu vang nho với nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn, nấm men
cố định trong hạt gel alginate và nấm men tự do.
Kết quả nghiên cứu đã khẳng định ưu thế của nấm men cố định so với nấm men tự
do và sự nổi trội của nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men
vang. Cả hai loại nấm men cố định đều có thể tái sử dụng ít nhất 10 chu kỳ và hoạt
tính lên men của chúng ln ln cao hơn so với hoạt tính lên men của nấm men tự do.

iii


ABSTRACT

The objective of this research was to compare the fermentation performance of the
immobilized yeast in alginate gel and the immobilized yeast on bacterial cellulose during the
primary fermentation in wine-making. The experimentation consisted of four sections.
Section 1 – Determination of technological parameters for yeast immobilization in

alginate gel and for yeast immobilization on bacterial cellulose by Face Centered Central
Composite Design with two factors. The dependent variable was yield of cell immobilization.
The supports like sodium alginate and bacterial cellulose used in this study were originated
from our country.
Section 2 – Comparison of fermentation ability in wine-making of the immobilized yeast
in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial cellulose and the free yeast: Yeast growth,
substrate uptake and metabolite production were evaluated and compared.
Section 3 – Investigation of the reuse of immobilized yeast in wine fermentation: The
fixed yeast in alginate gel and the fixed yeast on bacterial cellulose were reused for 10 cycles
in the repeated batch fermentation. The fermentation kinetics of several cycles were presented
in detail. The fermentation performance of the two immobilized yeasts was evaluated and
compared by the fermentation time, sugar uptake rate, ethanol formation rate, level of number
of cells escaped from the support, stability of the support during the reuse.
Section 4 – Establishment of stoichiometric equations of the primary fermentation in wine
– making for the immobilized yeast in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial
cellulose and the free yeast.
The experimental results showed that the fixed yeast always exhibited higher fermentation
performance than the free yeast in wine-making; the fermentation activities of the
immobilized yeast on bacterial cellulose were better than those of the immobilized yeast in
alginate gel. Both the two fixed yeasts could be reused at least for 10 cycles in the repeated
batch fermentation and the fermentation activities of them were always higher than those of
the free yeast.

iv


LỜI CÁM ƠN

Thực hiện và hoàn thành luận án trong một khoảng thời gian khá dài với những
khó khăn chung và riêng, tơi nghĩ rằng mình sẽ khơng bao giờ làm được nếu như bên

cạnh tơi khơng có những quan tâm và giúp đỡ của thầy cơ, gia đình và bạn bè. Khơng
thể nào kể ra được hết những gì mà tôi đã nhận được khi thực hiện luận án. Tơi rất
cảm kích và biết ơn vì tất cả những điều ấy…

Lời cảm ơn trân trọng nhất xin gửi đến PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn, thầy hướng dẫn
luận án và cũng là chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Thực phẩm. Từ những công sức mà
thầy đã dành cho, tôi cảm nhận sâu sắc câu “không thầy đố mầy làm nên”.
Xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương đã cho giống vi sinh vật cùng với cách
chuẩn bị chất mang cellulose vi khuẩn để cố định nấm men. Những ý kiến đóng góp
chân tình của cơ đã giúp tơi rất nhiều trong q trình nghiên cứu.
Xin cảm ơn PGS.TS. Ngơ Đăng Nghĩa đã cung cấp chất mang alginate sử dụng
trong luận án.
Xin cảm ơn các thầy cô, các bạn đồng nghiệp tại bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm đã
ln động viên, góp ý kiến, hỗ trợ và gánh bớt công việc để tơi hồn thành luận án.
Xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cơ Khoa Kỹ thuật Hóa học, phịng Đào tạo Sau
Đại học, các đơn vị hỗ trợ phân tích: Trung tâm Hóa Dầu, Trung tâm sắc ký Hải Đăng,
phịng thí nghiệm Cơng nghệ cao, Viện Cơng nghệ Hóa học.
Xin cảm ơn sự giúp đỡ của các em sinh viên, học viên trong việc thực hiện các
thực nghiệm, xử lý số liệu kết quả thí nghiệm, cơng bố các bài báo…
Cuối cùng, xin cảm ơn mẹ và gia đình đã ủng hộ tinh thần và cũng là động lực cho
tơi cố gắng. Hồn tất luận án, trở thành một TS, không chỉ là mong muốn của cá nhân
mà cũng là sự mong đợi và niềm tự hào của mẹ tơi.

Tơi sẽ cất giữ sự biết ơn này trong lịng mãi mãi !

Nghiên cứu sinh
v


Tôn Nữ Minh Nguyệt

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...................................................................................................................14
Chương 1.
1.1

TỔNG QUAN ......................................................................................4

Nấm men vang .............................................................................................. 4

1.1.1

Phân loại nấm men vang ..........................................................................4

1.1.2

Quá trình lên men rượu vang....................................................................4

1.2

Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang ............................................ 5

1.2.1

Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào ..................................................5

1.2.2

Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang.......................................7

1.2.3

Nấm men vang cố định.............................................................................8

1.3

Cố định nấm men vang trong gel aglinate...................................................... 9

1.3.1

Alginate ...................................................................................................9

1.3.2

Các phương pháp cố định vi sinh vật trong gel alginate..........................10

1.3.3

Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trong gel alginate...12

1.4

Cố định nấm men vang trên cellulose vi khuẩn............................................ 13

1.4.1

Cellulose vi khuẩn..................................................................................13

1.4.2

Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang cellulose vi khuẩn.14

1.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trên cellulose vi
khuẩn ...............................................................................................................15
1.5

Ảnh hưởng của các yếu tố cơng nghệ đến q trình lên men rượu vang....... 15

1.5.1

Ảnh hưởng của hàm lượng đường ..........................................................16

1.5.2

Ảnh hưởng của pH .................................................................................17

1.5.3

Ảnh hưởng của hàm lượng SO2 ..............................................................17

1.5.4

Ảnh hưởng của hàm lượng tannin ..........................................................18

1.6

Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men vang tĩnh nhiều chu kỳ19

1.7

Những ứng dụng khác của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang...... 21

1.8

Tổng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về hướng đề tài........... 22

Chương 2.
2.1

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................25

Nguyên liệu ................................................................................................. 25

2.1.1

Nấm men ...............................................................................................25

2.1.2

Alginate .................................................................................................25

2.1.3

Cellulose vi khuẩn..................................................................................26

2.1.4

Nho ........................................................................................................26
vi

2.1.5

Các loại hóa chất khác............................................................................26

2.2

Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 27

2.3

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm......................................................... 27

2.3.1

Phương pháp cổ điển..............................................................................27

2.3.2

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao hai yếu tố......................27

2.4

Sơ đồ thí nghiệm ......................................................................................... 28

2.5

Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 29

2.5.1

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trong gel alginate29

2.5.2

Xác định điều kiện thích hợp để cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn .
...............................................................................................................31

2.5.3 Khảo sát và so sánh hoạt động của nấm men tự do, nấm men cố định
trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men rượu vang.34
2.5.4 Khảo sát và so sánh khả năng tái sử dụng nấm men cố định trong gel
alginate và trên cellulose vi khuẩn để lên men rượu vang theo phương pháp tĩnh,
nhiều chu kỳ.......................................................................................................35
2.5.5 Thiết lập phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men vang sử
dụng nấm men cố định và nấm men tự do ..........................................................37
2.6

Phương pháp phân tích ................................................................................ 38

2.6.1

Phương pháp phân tích vi sinh ..............................................................38

2.6.2

Phương pháp phân tích hóa lý ...............................................................39

2.7

Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 40

2.8

Các công thức tính tốn ............................................................................... 40

2.8.1

Hiệu suất cố định nấm men, H ...............................................................40

2.8.2

Thời gian lên men, ...............................................................................40

2.8.3

Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại, µmax ...................................................41

2.8.4

Tốc độ sử dụng đường trung bình, Ks .....................................................41

2.8.5

Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình, Kp ..........................................41

2.8.6

Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol,  .........................................................41

2.8.7

Tỷ lệ thành phần nguyên tố của nấm men, cơ chất, sản phẩm lên men ...41

Chương 3.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................................................42

3.1

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trong gel alginate..... 42

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình cố định nấm men
trong gel alginate bằng quy hoạch cổ điển..........................................................42
3.1.2 Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trong gel alginate
bằng quy hoạch thực nghiệm..............................................................................50
3.2

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn52

3.2.1

Cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn theo phương pháp hấp phụ.....52
vii


3.2.2

Cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ–ủ....
...............................................................................................................60

3.2.3 So sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn sử
dụng hai phương pháp cố định: hấp phụ và hấp phụ – ủ .....................................61
3.3 Khảo sát và so sánh hoạt động của nấm men tự do, nấm men cố định trong
gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men rượu vang.............. 63
3.3.1

Khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men tự do và nấm men cố định.63

3.3.2
định

Khảo sát quá trình chuyển hóa cơ chất của nấm men tự do và nấm men cố
...............................................................................................................67

3.3.3 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp sản phẩm của nấm men tự do và nấm
men cố định .......................................................................................................72
3.4 Khảo sát và so sánh khả năng tái sử dụng nấm men cố định trong gel alginate
và trên cellulose vi khuẩn để lên men vang theo phương pháp tĩnh, nhiều chu kỳ .. 79
3.4.1 Khảo sát hiệu quả của giải pháp ngâm hạt gel alginate chứa nấm men cố
định trong dung dịch CaCl2 trong quá trình tái sử dụng......................................79
3.4.2 So sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong gel alginate và
trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men vang theo phương pháp tĩnh,
nhiều chu kỳ.......................................................................................................86
3.5 Thiết lập phương trình cân bằng vật chất cho quá trình lên men vang sử dụng
nấm men cố định và nấm men tự do....................................................................... 95
Chương 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................100

4.1

Kết luận..................................................................................................... 100

4.2

Kiến nghị................................................................................................... 101

DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ..........................................................102
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................103

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Ứng dụng của nấm men cố định trong sản phẩm thức uống chứa ethanol......5
Bảng 1.2 Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang ....6
Bảng 1.3. Các ứng dụng của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang .................21
Bảng 2.1. Thành phần của các dịch nho sau khi ép ....................................................26
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả cố định
nấm men trong gel Ca alginate...................................................................................29
Bảng 2.3. Các chất bổ sung vào dịch nho Red Cardinal để thực hiện quá trình lên men
sử dụng của nấm men cố định trong gel Ca alginate...................................................30
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả cố định
nấm men trên cellulose vi khuẩn................................................................................32
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm so sánh khả năng lên men của nấm men tự do và cố định
trong quá trình lên men rượu vang .............................................................................35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới độ cứng của hạt gel alginate chứa nấm
men cố định ...............................................................................................................43
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới tốc độ sinh tổng hợp ethanol (g/L.h) của
nấm men cố định trong 5 chu kỳ lên men...................................................................43

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới tỷ lệ thoát bào (% so với số tế bào ban
đầu trong hạt gel) trong 5 chu kỳ lên men ..................................................................43
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới tỷ lệ hạt gel alginate bị vỡ (% so với số
hạt ban đầu) trong 5 chu kỳ lên men ..........................................................................44
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới độ cứng của hạt gel
alginate chứa nấm men cố định..................................................................................46
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới tốc độ sinh tổng
hợp ethanol (g/L.h) của nấm men cố định trong 5 chu kỳ lên men .............................46
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới tỷ lệ thoát bào (%
so với số tế bào ban đầu trong hạt gel) trong 5 chu kỳ lên men ..................................46
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới tỷ lệ hạt gel
alginate bị vỡ (% so với số hạt ban đầu) trong 5 chu kỳ lên men ................................47
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới độ cứng của hạt gel alginate
chứa nấm men cố định ...............................................................................................48
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới tốc độ sinh tổng hợp ethanol
(g/L.h) của nấm men cố định trong 5 chu kỳ lên men.................................................49
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới tỷ lệ thoát bào (% so với số tế
bào ban đầu trong hạt gel) trong 5 chu kỳ lên men .....................................................49
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới tỷ lệ hạt gel alginate bị vỡ (%
so với số hạt ban đầu) trong 5 chu kỳ lên men............................................................49
Bảng 3.13. Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm .........50
Bảng 3.14. Các hệ số của phương trình hồi quy Y1 ....................................................51
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu trong huyền phù giống đến mật độ tế
bào và hiệu suất cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn........................................53

ix


Bảng 3.16. Ảnh hưởng của kích thước chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố
định trên chất mang cellulose vi khuẩn ......................................................................53

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của khối lượng chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố
định trên chất mang cellulose vi khuẩn ......................................................................55
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của pH huyền phù giống đến mật độ tế bào và hiệu suất cố định
trên chất mang cellulose vi khuẩn ..............................................................................55
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đảo đến mật độ tế bào và hiệu suất cố định trên
chất mang cellulose vi khuẩn .....................................................................................56
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ nấm men đến mật độ tế bào và hiệu suất
cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn..................................................................57
Bảng 3.21. Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm .........58
Bảng 3.22. Các hệ số của phương trình hồi quy Y .....................................................59
Bảng 3.23. Biến đổi của mật độ tế bào nấm men cố định theo thời gian ủ ..................60
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của mật độ tế bào cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn
đến quá trình lên men vang ........................................................................................62
Bảng 3.25. Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định và tự do
trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi.65
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên men vang sử
dụng nấm men cố định và nấm men...........................................................................68
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung
bình của nấm men cố định và tự do trong quá trình lên men vang ..............................69
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng ethanol trong
vang non sử dụng nấm men cố định và tự do .............................................................73
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp
ethanol trung bình trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do..74
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp
ethanol trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do...................75
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến sự tạo thành các hợp chất
hương chính của rượu vang non sau q trình lên men vang sử dụng nấm men cố định
và tự do......................................................................................................................78
Bảng 3.32 Thời gian lên men (h) của nấm men cố định trong gel alginate trong quá
trình tái sử dụng.........................................................................................................79

Bảng 3.33. Hàm lượng ethanol trong vang non (%v/v) sau mỗi chu kì lên men của nấm
men cố định trong gel alginate ...................................................................................84
Bảng 3.34. Hàm lượng các hợp chất hương trong vang non ở các chu kỳ 1,3,5,7,10 ..95
Bảng 3.35. Tỷ lệ cơ chất đã được nấm men sử dụng và hàm lượng sản phẩm do nấm
men sinh ra trong vang non khi lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men
tự do ..........................................................................................................................96
Bảng 3.36. Công thức phân tử của các thành phần trong dịch lên men và vang non khi
lên men vang sử dụng nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn, trong gel alginate và
nấm men tự do ...........................................................................................................96
Bảng 3.37. Số mol cơ chất hoặc sản phẩm tính theo 1mol đường lên men trong q
trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do ...............................97
Bảng 3.38. Hiệu suất tổng hợp sinh khối và sản phẩm (% tính theo đường lên men)
trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do................98

x


MỤC LỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của alginate .................................................................................10
Hình 1.2. Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ ................................................10
Hình 1.3. Cơ chế tạo gel của alginate từ bên ngoài (trái) từ bên trong (phải) .............11
Hình 1.4. Cấu trúc cellulose vi khuẩn (trái) và cellulose thực vật (phải) ....................13
Hình 1.5. Cấu trúc cellulose vi khuẩn I (trái) và cấu trúc cellulose vi khuẩn II (phải) 13
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung dịch alginate tới hiệu suất cố
định nấm men trong gel alginate ................................................................................42
Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men trong huyền phù
giống tới hiệu suất cố định nấm men trong gel alginate..............................................45
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới hiệu suất cố
định nấm men trong gel alginate ................................................................................49

Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống và nồng độ dung dịch
alginate đến hiệu suất cố định nấm men trong gel alginate.........................................51
Hình 3.5. Hình chụp SEM hạt gel alginate sau khi cố định tế bào nấm men ...............52
Hình 3.6. Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống và thời gian hấp phụ
đến hiệu suất cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn ..............................................59
Hình 3.7. Hình chụp SEM chất mang cellulose vi khuẩn sau khi cố định bằng phương
pháp hấp phụ .............................................................................................................61
Hình 3.8. Hình chụp SEM chất mang cellulose vi khuẩn sau khi cố định bằng phương
pháp hấp phụ-ủ, thời gian ủ 2 ngày ............................................................................61
Hình 3.9. Hình chụp SEM chất mang cellulose vi khuẩn cố định bằng phương pháp
hấp phụ-ủ sau quá trình lên men vang (thời gian ủ là 2 ngày).....................................63
Hình 3.10. Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men cố định và tự do trong quá trình lên
men vang khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi ..............................64
Hình 3.11. Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men cố định và tự do trong
quá trình lên men vang khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi..........65
Hình 3.12. Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men vang sử dụng nấm
men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi.............67
Hình 3.13. Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men vang sử
dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi
..................................................................................................................................70
Hình 3.14. Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men vang sử
dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi
..................................................................................................................................72
Hình 3.15. Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang sử dụng nấm
men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi.............73
Hình 3.16. Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men vang sử dụng nấm
men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi.............76
Hình 3.17. Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men vang sử
dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi
..................................................................................................................................77

xi


Hình 3.18. Tỷ lệ nấm men thốt ra khỏi hạt gel alginate so với tổng số nấm men trong
dịch lên men qua các chu kỳ tái sử dụng ....................................................................82
Hình 3.19. Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trước khi lên men
chu kỳ 1 .....................................................................................................................82
Hình 3.20. Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong trường hợp
không ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 ...........................83
Hình 3.21. Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong trường hợp
có ngâm trong dung dịch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7.......................................83
Hình 3.22. Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong gel
alginate qua các chu kỳ tái sử dụng............................................................................84
Hình 3.23. Sự biến đổi pH của vang non khi tái sử dụng nấm men cố định trong gel
alginate ......................................................................................................................85
Hình 3.24. Sự thay đổi mật độ tế bào trong canh trường sử dụng nấm men cố định ở
các chu kỳ tái sử dụng thứ 1, 3, 5, 7, 10 .....................................................................86
Hình 3.25. Tỷ lệ tế bào nấm men thoát khỏi chất mang so với tổng số nấm men trong
dịch lên men qua các chu kỳ tái sử dụng ....................................................................87
Hình 3.26. Tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men cố định ở các chu kỳ tái sử
dụng thứ 1, 3, 5, 7, 10 ................................................................................................88
Hình 3.27. Hình chụp SEM bề mặt hạt gel alginate (trái) và miếng cellulose vi khuẩn
(phải) trước khi lên men chu kỳ 1 ..............................................................................89
Hình 3.28. Hình chụp SEM bề mặt hạt gel alginate (trái) và miếng cellulose vi khuẩn
(phải) trước khi lên men chu kỳ 7 ..............................................................................89
Hình 3.29. Hình chụp SEM mặt cắt hạt gel alginate (trái) và mặt cắt miếng cellulose vi
khuẩn (phải) trước khi lên men chu kỳ 7 ....................................................................89
Hình 3.30. Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men vang của nấm men
cố định ở các chu kỳ tái sử dụng thứ 1,3,5,7,10..........................................................90
Hình 3.31. Thời gian lên men của nấm men cố định ở các chu kỳ tái sử dụng............91

Hình 3.32. Tốc độ sử dụng đường trung bình của nấm men cố định qua các chu kỳ tái
sử dụng......................................................................................................................92
Hình 3.33. Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang của nấm men
cố định trong quá trình lên men vang ở các chu kỳ tái sử dụng thứ 1,3,5,7,10...........93
Hình 3.34. Hàm lượng ethanol trong vang non sau q trình lên men chính sử dụng
nấm men cố định qua các chu kỳ tái sử dụng .............................................................93
Hình 3.35. Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong quá
trình lên men vang qua các chu kỳ tái sử dụng ...........................................................94
Hình 3.36. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong quá
trình lên men vang qua các chu kỳ tái sử dụng ...........................................................94

xii


DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADH
DCM

: Alcohol dehydrogenase
: Deligninfied cellulose material, cellulose đã tách lignin

DEAE-cellulose : Diethylaminoethyl-cellulose
GAE

: Gallic acid equivalents, hàm lượng được tính theo acid gallic

MLF

: Malolactic fermentation, quá trình lên men malolactic

Nmcđ/A
Nmcđ/Akn

: Nấm men cố định trong gel alginate
: Nấm men cố định trong gel alginate không được ngâm trong dung
dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sử dụng

Nmcđ/An

: Nấm men cố định trong gel alginate được ngâm trong dung dịch
CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sử dụng
: Nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn
: Nấm men tự do
: Scaned electronic microscope, kính hiển vi điện tử quét

Nmcđ/B
Nmtd
SEM

-xiii-


MỞ ĐẦU
Rượu vang là một thức uống lên men từ dịch nho sử dụng nấm men
Saccharomyces cerevisiae [ HYPERLINK \l "Rib06" 1 ],2].Rượu vang được nhiều
người ưa thích do hương vị hết sức đặc trưng và những tác dụng có lợi cho sức khỏe [
HYPERLINK \l "Lum98" 3 ],4].
Yếu tố quyết định chất lượng của một sản phẩm rượu vang, bên cạnh nguyên liệu
nho, là giống nấm men. Giống nấm men được xem là mấu chốt công nghệ để tạo ra

những loại rượu vang có chất lượng khác nhau. Những chủng nấm men vang thuộc
loài Saccharomyces cerevisiae đã được phân lập từ nho trong quá trình lên men rượu
vang tự nhiên và được cấy chuyền lưu giữ để phục vụ cho ngành công nghiệp rượu
vang. Hiện nay, hầu hết các nhà máy sản xuất rượu vang, bao gồm những nhà máy ở
Việt Nam, vẫn sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae dạng tự do để lên men
rượu vang. Mặc dù chất lượng sản phẩm đã ổn định hơn so với rượu vang lên men tự
nhiên, nhưng việc sử dụng nấm men tự do để lên men rượu vang vẫn còn khá nhiều
nhược điểm. Đặc biệt khi tiến hành lên men trong những điều kiện khơng thuận lợi thì
sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất của nấm men
tự do bị ức chế rõ rệt [ HYPERLINK \l "Ots80" 5 ], 6],[ HYPERLINK \l "Bou98" 7 ].
Một trong những giải pháp để khắc phục các nhược điểm trên là sử dụng nấm men
cố định. Các nghiên cứu về sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang đều
cho thấy nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do 8], [
HYPERLINK \l "MGu06" 9 ]. Ngoài ra, khả năng tái sử dụng của nấm men cố định
còn đem lại nhiều lợi ích về mặt kinh tế vì chi phí sản xuất giảm.
Để cố định nấm men lên men rượu vang, phương pháp keo tụ tế bào tỏ ra khơng
thích hợp vì những tế bào nằm tại vùng tâm của khối keo tụ khó tiếp xúc với cơ chất
10], [ HYPERLINK \l "Kur11" 11 ]; phương pháp nhốt tế bào bằng màng membrane
hay vi bao cũng ít được sử dụng vì membrane dễ bị tắt nghẹt bởi các chất keo có trong
dịch nho 12]. Đối với phương pháp nhốt tế bào trong cấu trúc gel, nhiều loại chất
mang đã được sử dụng như alginate [ HYPERLINK \l "Mag89" 13 ], 14], agar [
HYPERLINK \l "Nig98" 15 ], gelatin 16], -carrageenan [ HYPERLINK \l "Tan89"
-xiv-


17 ], polyacrylamide 18], polystyrene[ HYPERLINK \l "Cla12" 19 ]. Alginate là vật
liệu được sử dụng phổ biến nhất; hơn 80% các nghiên cứu về cố định tế bào trên thế
giới đã sử dụng alginate. Chế phẩm nấm men cố định trong gel alginate đã được
thương mại hóa và được ứng dụng trong quy trình sản xuất rượu vang ở quy mô lớn.
Nấm men cố định bằng phương pháp hấp phụ trên bề mặt chất mang xốp như

kissiris 20], [ HYPERLINK \l "Bak97" 21 ], vải cotton 22], mẫu thủy tinh xốp [
HYPERLINK \l "Nav77" 23 ], ceramic 24], [ HYPERLINK \l "Rap11" 25 ], hay trên
chất mang giàu cellulose như bã mía26], miếng trái cây[ HYPERLINK \l "YKo01" 27
]… cũng được ứng dụng để lên men rượu vang. Trong vài năm gần đây, có hai cơng
bố khoa học về việc sửdụng cellulose vi khuẩn làm chất mang cố định nấm men để
ứng dụng trong quá trình lên men sản xuất rượu vang và ethanol28], [ HYPERLINK \l
"Yao11" 29 ]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu chuyên sâu về nấm men
vang cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn. Chất mang cellulose vi khuẩn và chế
phẩm tế bào cố định trên cellulose vi khuẩn vẫn chưa được thương mại hóa ở thị
trường trong và ngồi nước.
Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác lập các điều kiện thích hợp để cố
định nấm men Saccharomyces cerevisiae trong gel alginate và trên cellulose vi
khuẩn nhằm ứng dụng lên men rượu vang nho”, với:
Mục tiêu chung:cải thiện hiệu quả kinh tế của quá trình lên men rượu vang bằng
giải pháp sử dụng nấm men cố định trên chất mang mới (rút ngắn thời gian lên men,
tái sử dụng nấm men và ổn định chất lượng sản phẩm).
Mục đích của nghiên cứu: so sánh hiệu quả sử dụng hai chế phẩm nấm men vang
cố định, trong đó có một chất mang đã được sử dụng phổ biến (alginate) và một chất
mang mới (cellulose vi khuẩn) trong quá trình lên men chính rượu vang nho.
Nội dung nghiên cứu: chúng tơi sẽ tìm điều kiện thích hợp để cố định nấm men
trên hai loại chất mang alginate và cellulose vi khuẩn, so sánh khả năng lên men rượu
vang của nấm men cố định trên hai loại chất mang cùng với nấm men tự do, so sánh
khả năng tái sử dụng của nấm men cố định và thiết lập phương trình cân bằng vật chất
cho q trình lên men chính rượu vang nho cho cả hai loại nấm men cố định và nấm
men tự do.

-2-


Kế thừa kết quả đã công bố của một số nhà khoa học trong nước, trong nghiên cứu

này, chúng tôi sử dụng chất mang alginate và cellulose vi khuẩn có nguồn gốc tại Việt
Nam.

-3-


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1 Nấm men
1.1.1 Nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang
Nấm men có thể được chia thành hai nhóm là Saccharomyces và nấm men bản địa.
Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men chủ lực thực hiện quá trình lên men
ethanol trong sản xuấtrượu vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được
gọi là “nấm men vang” 1],[ HYPERLINK \l "Rib061" 2 ],30].
Nấm men bản địabao gồm một số giống nấm men khác trong dịch nho lên men
như Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces,
Candida, Pichia, Cryptococcus. Hầu hết các loài thuộc nấm men bản địa khơng có khả
năng tồn tại khi nồng độ ethanol cao hơn 6%v/v, ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis
có thể phát triển trong mơi trường có nồng độ ethanol lên đến 12%. Trước đây, nấm
men bản địa được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng rượu vang. Tuy nhiên, những
nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số lồi nấm men bản địa có lợi cho chất lượng
sản phẩm, làm đa dạng hóa hương vị của rượu vang[ HYPERLINK \l "Ots80" 5 ],31].
1.1.2 Quá trình lên men rượu vang
Lên men rượu vang tự nhiên là quá trình lên men vang xảy ra tự nhiên mà khơng
cần cấy giống. Thường thì các giống nấm men bản địa như Kloeckera, Hanseniaspora
và Candida chiếm tỷ lệ cao trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Ở giai đoạn tiếp
theo, Pichia và Metschnikowia chiếm ưu thế. Ở giai đoạn lên men cuối cùng, chỉ còn
lại Saccharomyces cerevisiaetồn tại nhờ khả năng chịu được nồng độ ethanol cao. Các
giống nấm men khác như Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,
Zygosaccharomyces, Brettanomyces cũng có thể sống sót trong q trình lên men và là
ngun nhân gây nên những “khuyết tật” liên quan đến giá trị cảm quan của sản phẩm[

HYPERLINK \l "Lum98" 3 ], 7],[ HYPERLINK \l "Lin04" 32 ].
Lên men rượu vang có bổ sung nấm men giống bao gồm quá trình xử lý dịch nho
bằng SO2 nhằm hạn chế sự phát triển không mong muốn của một số loài nấm men bản
địa, và chủ động cấy giống Saccharomyces cerevisiaeđể khởi đầu quá trình lên men.
-4-


Nhờ vậy, quá trình lên men vang diễn ra nhanh hơn, an tồn hơn và có thể tạo ra rượu
vang với hương vị đặc trưng ổn định. Tuy nhiên, một số ít phân xưởng sản xuất vang ở
quy mơ nhỏ vẫn sử dụng phương pháp lên men tự nhiên vì quy trình đơn giản mặc dù
chất lượng sản phẩm kém ổn định6],[ HYPERLINK \l "Fug07" 30 ].
1.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men
Kỹ thuật cố định tế bào nấm men được ứng dụng trong ngành công nghiệp thức
uống lên men như rượu vang nho, vang táo, biavà nước trái cây lên men có nồng độ
ethanol thấp.Mục đích chính của việc sử dụng nấm men cố định là để rút ngắn thời
gian lên men, tái sử dụng nấm men và ổn định chất lượng sản phẩm.Bảng 1.1 tóm tắt
một số ứng dụng của nấm men cố định trong sản xuất thức uống chứa ethanol.
Bảng 1.1Ứng dụng của nấm men cố định trong sản phẩm thức uống chứa ethanol
Sản phẩm
Vang nho

Vang táo
Vang dứa
Bia nghèo ethanol
Bia

Bia nồng độ cao

Vi sinh vật
S. cerevisiea

S. cerevisiea
S. bayanus
C. stellata + S. cerevisiae
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea+L. oenos
S. bayanus+L. oenos
S. cerevisiea
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae

Chất mang
DEAE-cellulose
Khoáng kissiris
Ca-alginate
Ca-alginate
Mảnh -alumina
Miếng táo
Cellulose vi khuẩn
Hạt lúa mì
Vỏ nho, lõi bắp
Ca-alginate
Ca-alginate

Ca-alginate
Miếng dứa
DEAE-cellulose
-caraageenan
Ca-alginate
DEAE-cellulose
Ca-alginate

Nguồn
Lommi H. et al., 1990[33]
Bakoyianis V. et al., 1992 [20]
Busova K.et al., 1994[34]
Ferraro L. et al., 2000[35]
Loukatos P.et al., 2000 [36]
Kourkoutas Y. et al., 2001[27]
Nguyen T.H. et al., 2008[28]
Kandylis P., 2010[37]
Genisheva Z., 2011[38]
Kassim H.C, 2012[39]
Cabranes C. et al., 1998[40]
Nedovic V.A. et al., 2000 [41]
Diep T.X. et al.,2009[42]
Van Iersel M., 1995[43]
Smogrovicova D., 1999[44]
Patkova J., 2000[45]
Kourkoutas Y. et al., 2004 [46]
Tran Q. H., et al., 2008[47]

1.2.1 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào
Chất mang vô cơ: chúng cóđộ bền cơ học và hóa học cao. Tuy nhiên sản phẩm lên

men thu được thường bị lẫn các tạp chất có xuất xứ từ chất mang. Chất mang vô cơ
thường gặp là hạt thủy tinh, ceramic dạng khối trụ hay dạng hạt, các kissiris khoáng,
gamma-alumina…
Chất mang hữu cơ: chúng không làm cho sản phẩm lên men bị lẫn tạp chất, bền
nhiệt và tương đối ổn định về mặt hóa học trong điều kiện lên men. Chất mang hữu cơ
cố định nấm men bao gồm các polymer tổng hợp như gel polyvinylalcohol,
-5-


polyvinylchloride, màng polyethylene, các chất mang tự nhiên bản chất polysaccharide
như agar, alginate, chitosan, pectin, carrageenan, dẫn xuất diethylaminoethylen của
cellulose (DEAE-cellulose), cellulose đã tách lignin (Delignified cellulose), cellulose
vi khuẩn (Bacterial cellulose), hạt lúa mì, lúa mạch,các miếng trái cây như miếng táo,
lê, mộc qua, quince, sung, nho… một số loại phế liệu như bã malt, bã mía, lõi bắp, vỏ
nho, bã nho ép, vỏ dưa hấu… và các chất mang tự nhiên bản chất protein như gelatin,
viên gluten (Bảng 1.2)
Bảng 1.2 Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang
Chất mang
Chất mang
vô cơ

Loại chất mang
Montmorilonite,polygorskite
Thủy tinh
Kissiris
-alumina

Chất mang
hữu cơ

Hydroxyapatite ceramics
-carrageenan
Acid pectic, agar
Alginate

Cellulose vi khuẩn
Cellulose đã tách lignin
Gelatin
Gluten
Polyvinyl alcohol
Polystyren
Miếng lê
Miếng mộc qua
Miếng táo
Nho khô
Quả sung
Miếng ổi
Hạt lúa mì, hạt lúa mạch
Củ cải đường
Vỏ nho
Vỏ dưa hấu
Bã mía
Vỏ kén tằm
Thân, gốc cây bắp

Chất mang
kết hợp

Nội nhũ hạt
Đĩa thủy tinh phủ alginate

Nguồn
AgeevaN.M. et al., 1985[48]
Hamdy M.K., 1990[49]
Bakoyianis V. et al., 1992,1997[20], [21];Argiriou T. et
al.,1996 [50];Loukatos P. et al.,2003[51]
Bakoyianis V. et al.,1997[21]; Loukatos P. et al.,2000
[36];Galanakis M.C. et al.,2012[52]
Rapoport A., et al.,2011[25]
Nakanishi K. et al.,1987 [53];GoødiaF. et al.,1991[54]
Nakanishi K.et al.,1987[53]
Mori S., 1987 [55];Fumi M.D. et al.,1987,1988,1989 [56],
[57], [58];Rosini G. et al.,1993 [59],Yokotsuka K. et
al.,1993,1997,2003 [60], [61], [62];Busova K. et al.,1994
[34]; Suzzi G. et al.,1996 [63];Bakoyianis V. et al.,1997[21];
Ferraro L. et al.,2000 [35]; Silva S. et al.,2002,2003 [64],
[65];Kassim H.C., 2012[39]
Nguyen T.H.et al.,2008[28]; Yao W. et al.,2011[29]
Bardi E.P. et al.,1996 [66]; Balli D. et al.,2003 [67]; Loukatos
P. et al.,2003 [51]; Mallouchos A. et al.,2003[68]
Parascandola P. et al.,1992[16]
Bardi E.P. et al.,1996,1997 [66], [69]; Iconomopoulou M. et
al.,2002 [70]; Plessas S. et al., 2005[71]
Martynenko N.N. et al.,2004[72]
TranT.H.C. et al.,2012[19]
Mallios P., et al.,2004 [73]
Kourkoutas Y. et al.,2002,2003,2005[74],[75], [76]
Kourkoutas Y. et al.,2001,2002,2006[27],[77], [78]
Tsakiris A.et al.,2004[79]
Bekatorou A. et al., 2002[80]

Reddy V.L. et al., 2006[81]
Kandylis P. et al., 2010, 2012[37], [82]
Vucurovic M.V. et al.,2012[83]
Mallouchos A. et al., 2002,2003[84], [85]
Reddy V.L. et al., 2008[86]
Yu J. et al., 2010[26]
Rattanapan A. et al., 2011[87]
Vucurovic M.V. et al., 2008 [88]; Razmovski R. et al.,
2012[89]
Kopsahelis N. et al., 2007[90]
Ogbonna J.C. et al.,1989[91]

-6-


1.2.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men
Cố định tế bào bằng cách gắn trên bề mặt chất mang rắn:Tế bào nấm men có thể kết
dính trên bề mặt chất mang rắn nhờ những tương tác vật lý như lực mao quản, liên kết
tĩnh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước, hoặc liên kết cộng hóa trị. Phương pháp này
yêu cầu bề mặt chất mangphải có cấu trúc xốp hoặc có chứa nhiều nhóm chức hóa học
khác nhau như hạt thủy tinh xốp, thanh ceramic, DEAE-cellulose, bã mía, hạt gluten,
miếng trái cây[23], [25],[26], [33], [70], [81].
Cố định tế bào bằng cách nhốt trong khung mạng xốp:Các tế bào được đưa vào bên
trong một khung mạng xốp để ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi trường xung quanh
nhưng vẫn cho phép tế bào hấp thu các chất dinh dưỡng và trao đổi chất. Chất
mangthường là các loại polysaccharide (alginate, -carrageenan, agar, chitosan,
pectin),

protein

(gelatin,

collagen),

polymer

tổng

hợp

(polyacrylamide,

polyvinylalcohol, polyurethane, polyvinylchloride, polystyrene). Chất mang thường có
cấu trúc khung mạng gel (ion gel, covalent gel, non-covalent gel, cryogel)[39], [46],
[72], [92], [93], [94].
Cố định tế bào bằng cách keo tụ: Các tế bào nấm men S. cerevisiae có khả năng tự
bám chặt với nhau và hình thành nên khối bao gồm hàng ngàn tế bào nhờ các tương
tác vật lý hay hóa học. Có 2 kiểu keo tụ tế bào: keo tụ tự nhiên (không sử dụng hóa
chất)và keo tụ nhân tạo (sử dụng hóa chất để tạo liên kết giữa các tế bào). Phương
pháp cố định này ít sử dụng cho nấm men vì các tế bào ở bên trong khối nấm men khó
tiếp xúc với các chất dinh dưỡng có trong canh trường [46].
Cố định tế bào bằng cách nhốt bên trong một màng chắn:Sự khuếch tán của tế bào ra
mơi trường bên ngồi được ngăn chặn bằng cách bao bọc chúng vào trong các
membrane nhưng vẫn đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa chúng với môi trường.
Chất mang là sợi thủy tinh, nylon và một số màng bán thấm khác như polyvinyl
chloride, cellulose acetate, polyamide. Phương pháp này ít được sử dụng cho nấm men
dùng để lên men vang vì màng membrane dễ bị nghẹt bởi các hợp chất keo trong dịch
nho khi thực hiện quá trình lên men vang[29], [46],[95], [96], [97], [98], [99].

-7-

1.2.3 Nấm men ở trạng thái cố định
1.2.3.1 Những thay đổi về đặc điểm sinh học của nấm men cố định
Việc cố định tế bào sẽ làm thay đổi hình thái, sinh lý và các hoạt động trao đổi chất
của nấm men [46], [100].
Khả năng sinh trưởng: Nấm men cố định thườngcó khả năng sinh trưởng kém hơn
so với nấm men tự do vì khả năng hấp thu oxygiảm. Tế bào nấm men cố định có hình
dạng và kích thước không đồng đều. Nhiều nghiên cứu cho thấynấm men cố định sinh
trưởng đến một giới hạn nhất định và giữ nguyên lượng sinh khối cho đến khi kết thúc
quá trình lên men[101], [102], [103].
Hoạt động trao đổi chất: Nấm men cố định có tốc độ sử dụng glucose, tốc độ sinh
tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự do vì nấm men khi
được cố định trên chất mang sẽcó những thay đổi về đặc tính sinh lý, hoạt tính enzyme
và có pH nội bàothấp hơn so với nấm men tự do[21], [100], [104], [105].
Khả năng lên men trước những biến đổi bất lợi trong quá trình lên men: Nấm
men cố định có khả năng chịu được sự ức chế của cơ chất và sản phẩm trao đổi chất
cao hơn nấm men tự do[106], [107], [108], [109]. Ở những điều kiện lên men cực đoan
thì nấm men cố định cũng thể hiện ưu thế do chất mang đã bảo vệ tế bào trước các tác
động bất lợi của dịch lên men[110], [111], [112], [113], [114], [115], [116], [117],
[118], [119], [120], [121], [122].
Sự tạo thành hợp chất hương: So với nấm men tự do, nhìn chung nấm men cố
định tạo thành nhiều ester hơn, tạo thành ít diacetyl, acetaldehyde, methanol, acid dễ
bay hơi và rượu bậc cao hơn. Loại chất mang, phương pháp cố định cũng có ảnh
hưởng đến khả năng tạo thành hợp chất hương và các sản phẩm phụ khác [46],
[85],[123], [124],[125], [126], [127].
1.2.3.2 Ưu thế của nấm men cố định trong quá trình lên men vang
Việc sử dụng tế bào nấm men cố định để lên men vang có nhiều thuận lợi. Chất
mang đóng vai trò tác nhân bảo vệ tế bàotrước những tác động bất lợi từ môi trường
lên men như sự thay đổi vềnhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất ban đầu và sản phẩm cuối, từ

đó làm ổn định và kéo dài hoạt tính lên men. Q trình trao đổi chất của tế bào cố định
biến đổi theo chiều hướng tăng hiệu quả sử dụng cơ chất, sản phẩm được tạo ra nhiều
-8-


hơn. Mật độ tế bào nấm men cố định trên một đơn vị thể tích canh trường cao nên làm
giảm thời gian lên men[46], [109], [112],[122].
Khi sử dụng nấm men cố định để lên men vang, quá trình lọc, tách nấm men ra
khỏi dịch lên men được thực hiện nhanh và dễ dàng, từ đó làm giảm chi phí cho việc
thu hồi và hoàn thiện sản phẩm[81], [84].
Nấm men cố định có thể tái sử dụng được nhiều chu kỳ và có nhiều khả năng ứng
dụng trong quy trình lên men liên tục ở quy mơ cơng nghiệp, từ đó mang lại hiệu quả
kinh tế cao hơn cho nhà sản xuất[21], [102].
Tuy vậy, sử dụng nấm men cố định cũng cịn một số hạn chế khihiện tượng tế
bàothốt ra khỏi chất mang quá nhiều, cấu trúc chất mang bị phá hủy trong quá trình
sử dụng, sự khuếch tán cơ chất đến tế bào ở trung tâm của khối chất mang bị hạn
chế[46], [128].
1.3 Cố định nấm men trong gel aglinate
1.3.1 Alginate
Alginate hay algin là tên gọi thường được sử dụng cho muối alginic acid. Alginate
hiện diện trong thành tế bào của các loài rong nâu (Phaeophyceae), chiếm đến 40%
khối lượng chất khô và thường ở dạng muối alginate của calcium, magnesium và
sodium. Mặc dù có một vài nguồn gốc khác nhau, tuy nhiên tất cả các alginate thương
mại hiện nay đều có nguồn gốc từ rong biển và dạng Ca alginate là thích hợp nhất để
tạo khung mạng gel cố định nấm men để lên men rượu vang[129].
1.3.1.1 Đặc điểm cấu tạo của alginate
Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer -Dmannuronic acid (M) và -L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết
1,4-glycoside. Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block.
Tỷ lệ của mannuronic acid và guluronic acid (M/G) của alginate từ rong biển dao
động trong một khoảng rộng tùy theo loài rong và mùa thu hoạch. Tỷ lệ này ảnh

hưởng đến độ bền gel Ca alginate[129],[130], [131].

-9-


Hình 1.1. Cấu trúc của alginate[129]
(a-các monomer của alginate; b-chuỗi alginate; c-sự phân bố các block)

1.3.1.2 Cơ chế tạo gel của alginate
Alginate có khả năng kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao để tạo gel. Ái lực
của alginate đối với các ion hóa trị 2 giảm theo trình tự: Pb 2+ - Cu2+ - Cd2+ - Ba2+ Sr2+ - Ca2+ - Co2+ - Ni2+ - Zn 2+ - Mn2+. Tùy thuộc vào loại ion liên kết và nguồn gốc
alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau. Thông thường, người ta thường sử
dụng Ca2+ để làm ion tạo gel[131], [132].

Hình 1.2. Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+[129]
1.3.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trong gel alginate
1.3.2.1 Các phương pháp tạo gel alginate
Có hai phương pháp tạo gel alginate: tạo gel từ ngoài và tạo gel từ trong.
Phương pháp tạo gel từ ngồi phổ biến hơn vì tạo gel nhanh và thao tác đơn giản.
Khi nhỏ giọt dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation, thường là Ca2+, bề mặt
ngồi của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa. Sau đó, các cation tiếp tục khuếch tán vào
bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa [129],[133].
-10-


Phương pháp tạo gel từ trong mang lại tính đồng nhất và đa dạng về hình thức cho
cấu trúc gel. Cho muối chứa Ca2+ dạng không tan như CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, Ca
citrate… vào dung dịch alginate, sau đó thay đổi độ hòa tan của muối bằng cách chỉnh
pH dung dịch. Ca2+ giải phóng dần và tạo gel với alginate [134], [135], [136].
Đa số các nghiên cứu về cố định tế bào nấm men trong gel alginate đều sử dụng

phương pháp tạo gel từ ngoài. Sinh khối nấm men sẽ được thêm vào dung dịch
alginate rồi nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2. Các hạt gel chứa tế bào nấm men vừa tạo
thành sẽ được tiếp tục ngâm trong dung dịch CaCl2 một thời gian để ổn định cấu trúc
trước khi được sử dụng trong q trình lên men [13],[14],[137].
L ư ïc ñ a åy

N a - A lg in a te

H+

Na-Alginate

Ca

CaCO3
Ca
C aC l2

Ca

Ca

NaA l g in a t e

Ca

Ca

Ca

Ca

HCO3

GDL

CO2

H+
H2O

Ca
H a ït g e l C a c iu m A lg in a te

Hình 1.3. Cơ chế tạo gel của alginate từ bên ngoài (trái) từ bên trong (phải) [129]
1.3.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men
Khối lượng phân tử alginate:khối lượng phân tử alginate ảnh hưởng nhiều đến độ
bền gel. Mạch alginate càng dài thì cấu trúc gel càng bền, nhưng ít ảnh hưởng đến khả
năng khuếch tán của glucose, tốc độ lên men và sự tạo thành ethanol của nấm men cố
định trong gel alginate[133],[138].
Tỷ lệ M/G: là phần mol của D-mannuronic acid (M) so với L-guluronic acid (G).
Alginate có hàm lượng G nhỏ hơn 20-25% sẽ khơng tạo gel được. Alginate có hàm
lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc, không biến dạng và giữ được độ cứng trong
một thời gian dài. Alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm, ít xốp và dễ bị rã
hơn. Gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở
đến khả năng khuếch tán của glucose và hạn chế sự sinh trưởng của tế bào nấm men
sau khi cố định[130], [132],[138],[139].
Nồng độ alginate: nồng độ alginate không ảnh hưởng đến kích thước, hình dạng
hạt gel nhưng ảnh hưởng đến độ bền của hạt gel. Khi tăng nồng độ dung dịch alginate
sẽ tăng độ bền hạt gel, khả năng giữ nước của gel cũng tốt hơn nhưng tốc độ lên men

-11-