Nghiên cứu tạo mô hình chuột mang thai hộ nhằm ứng dụng tạo chuột chuyển gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHAN NGỌC UN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO MƠ HÌNH CHUỘT MANG THAI HỘ
NHẰM ỨNG DỤNG TẠO CHUỘT CHUYỂN GEN

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình

Cán bộ chấm nhận xét 1 : ............................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2 : ............................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM
ngày 14 tháng 01 năm 2020
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS. TS. Nguyễn Đức Lượng
2. PGS. TS. Trần Lê Bảo Hà
3. PGS. TS. Nguyễn Thị Thủy Tiên
4. TS. Hoàng Mỹ Dung
5. TS. Nguyễn Trọng Bình

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA
KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Phan Ngọc Uyên Phương

MSHV: 1570770

Ngày, tháng, năm sinh: 26/03/1991

Nơi sinh: Quảng Trị

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60420201

I. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo mơ hình chuột mang thai hộ nhằm tạo chuột
chuyển gen
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Xác định giai đoạn động dục ở chuột cái bằng phương pháp quan sát trực
quan âm đạo thông qua phương pháp vết phết tế bào âm đạo
 Tạo chuột mẹ mang thai hộ thành công bằng phương pháp phẫu thuật
chuyển phôi vào ống dẫn trứng và theo dõi chuột mẹ mang thai sau khi chuyển
phôi.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/08/2019
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2019
IV.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 20....
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC


i

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và cảm ơn đến quý Thầy, Cô đã giảng dạy
trong chương trình Cao học Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP.
HCM đã hết lòng truyền nhiệt huyết cũng như kiến thức q giá giúp tơi hồn thành
tốt luận văn cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tơi trong suốt q trình thực hiện
luận văn thạc sĩ khoa học.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Giáo sư Fumihiro Sugiyama, Phó giáo sư
Seiya Mizuno, Tiến sĩ Đinh Thị Hương Trà, chị Tanimoto, chị Kato, Chị Daitoku,
chị Okano, nghiên cứu sinh Suziki và toàn thể anh, chị, em, bạn bè tại Khu nuôi

động vật thử nghiệm ở Trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản đã tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho tơi hồn thành luận văn.
Cám ơn tập thể lớp cao học và tất cả các anh, chị, em các khóa học, đặc biệt
là chị Nguyễn Thị Anh Thư đã động viên tinh thần giúp tôi vượt qua nhiều khó
khăn trong suốt thời gian học tại trường.
Cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học đã tài trợ nguồn kinh
phí để tơi thực hiện luận văn thạc sĩ này. Đồng thời, gửi lời cảm ơn đến các anh,
chị, em, bạn bè thuộc Phịng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Động vật – Trung tâm
Công nghệ Sinh học.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã tạo nguồn
động viên để tơi hồn thành khóa học này.
Xin chân thành cảm ơn!
Phan Ngọc Uyên Phương


ii

TĨM TẮT
Việc tạo chuột mẹ mang thai hộ đóng vai trò quan trọng trong việc tạo chuột
biến đổi gen phục vụ các nghiên cứu khoa học đặc biệt là các lĩnh vực liên quan đến
y sinh học. Mặc dù việc tạo chuột mẹ mang thai hộ đã được nghiên cứu và áp dụng
rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có một cơng trình nào được
cơng bố liên quan đến việc chuyển phôi mang gen ngoại lai vào chuột mẹ mang thai
hộ. Các nghiên cứu liên quan đến tạo phôi chuột chuyển gen đã được nghiên cứu ở
Việt Nam, tuy nhiên để có thể tạo được sinh vật chuyển gen, các phôi này phải được
chuyển vào chuột mẹ mang thai hộ để sinh chuột con mang gen. Vì vậy nghiên cứu
của chúng tơi có tiềm năng rất lớn trong việc ứng dụng tạo chuột biến đổi di truyền.
Trong nghiên cứu này, phương pháp tạo mơ hình chuột mẹ mang thai hộ được thực
hiện như sau: Đầu tiên, chuột đực hữu thụ được phẫu thuật cắt ống dẫn tinh và giao
phối với chuột cái hữu thụ nhằm kiểm tra kết quả bất thụ. Chuột cái cho phôi được

gây siêu bài noãn bằng 5 IU PMSG và 5 IU hCG, giao phối với chuột đực hữu thụ
và thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho quá trình vi tiêm
gen egfp vào tiền nhân đực. Các phôi giai đoạn 1-2 tế bào này sau đó được chuyển
vào ống dẫn trứng của chuột mẹ mang thai hộ nhằm kiểm tra hiệu quả của việc tạo
chuột mẹ mang thai hộ. Mặt khác, chuột cái hữu thụ khác sẽ được xác định giai
đoạn động dục bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo làm đối chứng với phương
pháp quan sát trực quan âm đạo. Các con chuột ở giai đoạn động dục được sàng lọc
và ghép đơi với chuột đực bất thụ, sau đó kiểm tra dấu hiệu giao phối ở nút nhầy âm
đạo. Đối với những chuột có dấu hiệu giao phối thành cơng sẽ được phẫu thuật mở
lưng kiểm tra vị trí chuyển phơi với sự hiện diện của sự trương phồng ở ống dẫn
trứng và cuối cùng là chuyển phôi vào ống dẫn trứng, theo dõi quá trình mang thai
sau 7 ngày đến 19±3 ngày. Kết quả cho thấy chuột đực bất thụ đạt tỉ lệ 80%. Đối
với chuột cái, nhóm nghiên cứu đã xác định được giai đoạn động dục với sự hiện
diện của tế bào đặc trưng là tế bào biểu mơ sừng hóa khơng nhân đồng thời đó là
trực quan âm đạo sưng, mở rộng, màu hồng, ít ẩm ướt. Các chuột ở giai đoạn động
dục được quan sát bằng mắt thường này sau đó được giao phối với chuột đực bất
thụ và cho tỉ lệ giao phối thành công của việc tạo chuột mang thai giả là 81,67%.


iii

Toàn bộ chuột mang thai giả với sự xuất hiện của đoạn bóng cho q trình chuyển
phơi giai đoạn 1-2 tế bào đạt tỉ lệ 100% chuột nhận phôi mang thai. Trong đó có
2/134 chuột phát sáng huỳnh quang chiếm tỉ lệ 1,49%. Mặc dù tỉ lệ chuột phát sáng
huỳnh quang là chưa cao, tuy nhiên các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy tiềm
năng to lớn của việc tạo mơ hình chuột mang thai hộ bằng phương pháp phẫu thuật
chuyển phôi vào ống dẫn trứng nhằm hướng đến tạo chuột chuyển gen.


iv

ABSTRACT

The creation of surrogate mothers plays an important role in creating
genetically modified mice for scientific researches, especially in biomedical fields.
Although surrogate mother mice have been studied and widely applied in the world,
but in Viet Nam has not been any published related to transfer of embryos carrying
DNA into recipient foster mice. So our research has great potential for the
application of genetically engineered mice. In this study, the method of creating a
model of surrogate mother was performed as follows: at first, the male mice were
surgically cut vasa deferens and mate with the female mice in order to check the
results. Females were superovulated, first by 5 IU PMSG injection, then 46 – 48 h
later by 5 IU hCG injection. After that, Females were placed with males for
collecting Pronuclear-stage embryos and microinjection egfp into these embryos.
These 1-2 stage embryos were then transferred to the oviducts of surrogate mothers.
On the other hand, other female mice will be identified as the estrus (estrous) stage
by vaginal cytology as a control against visual observation. Estrus females were
screened and paired with vasectomized ICR males and were checked copulation
plug and collect ICR females with vaginal plug to check position of embryo transfer
is ampulla and then reimplantation of injected embryos. Pregnancy female mice
after 7 days to 19-21 days. The results showed that male infertility was 80%. For
female mice, the team identified the estrus stage with the presence of cornified
epithelial cell and visual, pink, less wet vaginal were paired with together infertility
male mice and the success rate of mating mice was 81.67%. The whole of pseudo
pregnant mice were used for transferring of 1 – 2 stage embryo, reached the rate of
100% of mice receiving pregnant embryos. In which 2/134 fluorescing mice
accounted for 1.49%. Although the ratio of mice with fluorescent fluorescence is
not high, the results of this study show the great potential of creating surrogate mice
model by surgical transfer of embryos into the fallopian tubes to guide to create
transgenic mice.

v

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn
này là trung thực và được thực hiện bởi chính nhóm nghiên cứu của chúng tôi.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Học viên

Phan Ngọc Uyên Phương


vi

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ................................................................................... 3
2.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng chuột mẹ mang thai hộ bằng phương pháp phẫu
thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng ....................................................................... 3
2.2. Vai trò của chuột trong nghiên cứu ................................................................... 6
2.3. Tổng quan về chuột nhắt trắng .......................................................................... 6
2.3.1. Sinh lý sinh sản ......................................................................................... 6
2.3.2. Cơ quan sinh sản chuột nhắt trắng ............................................................. 6
2.3.3. Chu kì động dục ở chuột ............................................................................ 7
2.3.4. Các loại tế bào ở các giai đoạn của chu kì động dục của chuột................. 10
2.4. Công nghệ cấy truyền phôi ............................................................................. 11
2.5. GFP – EGFP và tầm quan trọng trong nghiên cứu .......................................... 13
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 14
3.1. Vật liệu ........................................................................................................... 14

3.1.1. Thiết bị, dụng cụ...................................................................................... 14
3.1.2. Hóa chất, môi trường sử dụng cho nghiên cứu ......................................... 14
3.1.3. Động vật sử dụng cho nghiên cứu ............................................................ 15
3.2. Phương pháp................................................................................................... 15
3.2.1 Tạo mơ hình chuột đực bất thụ ................................................................. 16
3.2.2 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân .................................................... 17
3.2.3. Xác định giai đoạn động dục ở chuột nhắt trắng ICR ............................... 18
3.2.3.1. Các phương pháp xác định chu kì động dục ...................................... 18
3.2.3.2. Phương pháp quan sát trực quan âm hộ ............................................ 18
3.2.3.3. Xác định chu kì động dục ở chuột cái bằng vết phết tế bào âm đạo ... 19
3.2.4. Thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân .................................................. 23
3.2.4.1. Chuẩn bị đĩa vi giọt mơi trường cho q trình thu nhận hợp tử giai
đoạn 2 tiền nhân ............................................................................................ 23


vii

3.2.4.2. Gây siêu bài noãn chuột cái và thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân
...................................................................................................................... 24
3.2.5. Kiểm tra sự hoạt động của plasmid mang gen egfp .................................. 25
3.2.6. Chuẩn bị egfp cho quá trình vi tiêm ......................................................... 25
3.2.7. Vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân ..................................... 27
3.2.8. Kiểm tra sự phát triển của hợp tử và biểu hiện huỳnh quang của phôi giai
đoạn 2 tế bào ..................................................................................................... 27
3.2.9. Nuôi phôi và chọn lọc các phôi được chuyển ........................................... 28
3.2.10. Phương pháp kiểm tra huyết thống chuột mẹ mang thai hộ và chuột con
sinh ra ............................................................................................................... 33
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................... 34
4.1. Tạo chuột đực bất thụ ..................................................................................... 34
4.2. Biểu hiện của âm hộ chuột cái ở giai đoạn động dục ....................................... 35

4.3. Sự hiện diện của các loại tế bào trên vết phết tế bào âm đạo (vaginal smear)
chuột ở giai đoạn động dục .................................................................................... 37
4.4. Kiểm tra sự hoạt động của egfp ....................................................................... 39
4.5. Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân cho quá trình vi tiêm ......................... 40
4.6. Tạo chuột cái mang thai hộ ............................................................................. 41
4.7. Kiểm tra huyết thống của chuột mẹ mang thai hộ và chuột con sinh ra. .......... 45
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 48
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 48
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 48
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ........................................ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 50


viii

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Q trình tạo chuột biến đổi gen áp dụng mơ hình chuột mang thai hộ ........ 5
Hình 2.2. Quy trình tạo chuột chuyển gen . .............................................................. 5
Hình 2.3. Cơ quan sinh sản ở chuột .......................................................................... 7
Hình 2.4. Cơ quan sinh sản của chuột đực; bao gồm ống dẫn tinh, mào tinh hồn và
tinh hồn ................................................................................................................. 7
Hình 2.5. Sự thay đổi hàm lượng progesterone và estradiol trong suốt quá trình
động dục ở chuột .................................................................................................... 9
Hình 2.6. Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột ........................................... 10
Hình 2.7. Các loại tế bào đặc trưng ở giai đoạn động dục và nghỉ động dục ở chuột.
.............................................................................................................................. 10
Hình 2.8. Vị trí diễn ra sự thụ tinh tạo thành hợp tử ở chuột . ................................ 12
Hình 2.9. Chuyển phơi bằng phương pháp phẫu thuật tiếp cận ống dẫn trứng ........... 13
Hình 3.1. Đoạn ống dẫn tinh bị loại bỏ nhằm tạo chuột đực bất thụ ...................... 16
Hình 3.2. Các bước cắt ống dẫn tinh ở chuột đực .................................................. 16

Hình 3.3. Quá trình thu nhận đoạn buồng trứng - ống dẫn trứng – tử cung chuột
được mô tả sơ lược như sau . ................................................................................. 18
Hình 3.4. Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột BALB/cByJ thuộc chủng
albino . .................................................................................................................. 19
Hình 3.5. Quá trình thu nhận dịch âm đạo ở chuột ................................................ 21
Hình 3.6. Nhỏ 1 giọt dung dịch có chứa dịch âm đạo chuột lên lam kính được đánh
số thứ tự ................................................................................................................ 21
Hình 3.7. Sự hiện diện của các tế bào qua các giai đoạn của chu kì động dục được xác
định bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo và quan sát ở mẫu tươi . ................. 22
Hình 3.8. Sự hiện diện của các tế bào qua các giai đoạn của chu kì động dục được
xác định bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo và nhuộm H&E . .................... 22
Hình 3.10. Vị trí ống dẫn trứng với sự hiện diện của ampulla chứa trứng trưởng
thành hoặc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân .............................................................. 25
Hình 3.11. Bản đồ plasmid PCX-EGFP ................................................................. 26


ix

Hình 3.12. Cấu trúc đoạn egfp-Promotor sau khi cắt bởi SalI và BamHI từ plasmid
PCX-EGFP ............................................................................................................ 26
Hình 3.13. Phơi giai đoạn 2 tế bào phát triển sau quá trình vi tiêm DNA vào tiền
nhân đực ................................................................................................................ 28
Hình 3.14. Vị trí của phôi các giai đoạn trong ống dẫn trứng ở chuột ................... 30
Hình 4.1. Ống dẫn tinh được cắt thành cơng bằng kẹp nhiệt. ................................. 34
Hình 4.2. Sau 7 ngày, vết mổ hồn tồn khép kín cùng với sự hoạt động bình
thường trở lại của chuột đực sau khi cắt ống dẫn tinh ............................................ 34
Hình 4.3. Âm hộ chuột qua các giai đoạn của chu kì động dục .............................. 36
Hình 4.4. Bốn giai đoạn của chu kỳ động dục được xác định qua các loại tế bào có
trong mẫu phết âm đạo ......................................................................................... 37
Hình 4.5. tế bào HEK293T dưới kính hiển vi huỳnh quang .................................. 40

Hình 4.6. Hợp tử giai đoạn hai tiền nhân ............................................................... 41
Hình 4.7. Vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho q
trình chuyển phơi vào chuột mẹ mang thai hộ ........................................................ 41
Hình 4.8. Âm hộ chuột cái ..................................................................................... 42
Hình 4.9. Ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ .................................................... 43
Hình 4.10. Lồng chuột ni các chuột nhận phơi sau q trình chuyển phơi .......... 44
Hình 4.11. Theo dõi q trình mang thai của chuột mang thai hộ sau khi chuyển phơi .... 44
Hình 4.12. Hệ thống kính hiển vi soi nổi có gắn huỳnh quang được sử dụng cho
việc kiểm tra sự biểu hiện phát sáng huỳnh quang của chuột con ........................... 45
Hình 4.13. Chuột phát sáng huỳnh quang của protein egfp. ................................... 46


x

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1. Sự thay đổi của progesterol và estradiol trong quá trình động dục ở chuột
................................................................................................................................ 8
Bảng 2.2. Biểu hiện của âm hộ chuột cái được quan sát bằng mắt thường qua các
giai đoạn của chu kì động dục.................................................................................. 9
Bảng 3.1. Xác định các giai đoạn của phôi chuột tiền làm tổ ................................. 30
Bảng 4.1. Tỉ lệ chuột đực bất thụ được tạo nên bằng phương pháp cắt ống dẫn tinh . 35
Bảng 4.2. Tỉ lệ chuột cái động dục thu được bằng quan sát trực quan âm hộ.......... 36
Bảng 4.3. Sự tương quan của phương pháp quan sát trực quan âm đạo và vết phết tế
bào âm đạo. ........................................................................................................... 39
Bảng 4.4. Số hợp tử thu nhận cho quá trình vi tiêm egfp........................................ 40
Bảng 4.5. Tỉ lệ thành công của việc tạo chuột cái mang thai giả ............................ 42
Bảng 4.6. Tỉ lệ thành cơng của sự hình thành chuột mẹ mang thai hộ qua q trình
chuyển phơi ........................................................................................................... 43

1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
Ngày nay, việc sử dụng chuột như một mơ hình động vật bệnh lý được xem
như là công cụ phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu, đặc
biệt là trong lĩnh vực y sinh học. Năm 2009, chỉ riêng các bài báo nghiên cứu về
chuột thí nghiệm gấp 3 lần so với cá ngựa vằn, ruồi giấm và giun đất gộp lại. Những
nghiên cứu dựa trên loài gặm nhấm đã giải quyết mọi thứ từ thần kinh học và tâm lý
học, cho đến thử thuốc với các loại bệnh tật. Loài gặm nhấm ở phịng thí nghiệm đã
được sử dụng trên các thử nghiệm động vật trong suốt hơn 150 năm qua, và số
lượng những thí nghiệm dạng này vẫn đang đà tăng theo cấp số nhân tính đến năm
2019.
Vì vậy, có thể nói việc tạo ra mơ hình động vật bệnh lý đặc biệt là trên đối
tượng chuột là việc hết sức cần thiết, có vai trị to lớn nhằm đáp ứng nhu cầu rất lớn
trong các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến y sinh học. Bằng chứng là kỹ thuật này
đã được thực hiện từ những năm thập niên 70 và vẫn được áp dụng cho đến thời
điểm này [1].
Ngày nay, đi cùng với sự phát triển của việc chỉnh sửa gen sử dụng phương
pháp Crispr/ Cas 9 thì việc tạo ra các mơ hình động vật bệnh lý, đặc biệt là trên đối
tượng chuột thí nghiệm ngày càng được chú trọng. Việc kết hợp giữa kỹ thuật này
và phương pháp tạo ra mơ hình động vật là một sự kết hợp hồn hảo trong việc tạo
mơ hình động vật bệnh lý, đặc biệt là trên đối tượng chuột nghiên cứu. Để tạo ra
được mơ hình động vật mang gen ngoại lai, thì ngồi việc sàng lọc các phơi mang
gen để chuẩn bị cho q trình chuyển phơi thì việc chuyển phôi mang gen vào chuột
mẹ mang thai hộ là một trong các bước cực kì quan trọng. Đây có thể là bước quan
trọng nhất bởi nếu bước này khơng thành cơng thì sẽ khơng bao giờ có được sinh
vật (chuột) biến đổi gen nào được sinh ra. Năm 2018, việc tạo chuột con sinh ra từ
các tế bào không phải tế bào trứng (non-egg) được công bố, nghiên cứu này cho
thấy việc sử dụng chuột mang thai hộ đóng vai trị hết sức quan trọng.
Vì tầm quan trọng đó, tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo mơ hình chuột mẹ

mang thai hộ nhằm tạo chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang” nhằm tạo được 1


2

quy trình ổn định, có tỉ lệ thành cơng cao để có thể làm chủ được cơng nghệ tạo sinh
vật biến đổi gen đáp ứng nhu cầu cho các nghiên cứu liên quan đến mơ hình chuột.
Mục tiêu chung của đề tài: Tạo được chuột mẹ mang thai hộ nhằm ứng dụng
tạo chuột chuyển gen phục vụ các nghiên cứu liên quan đến chuột thí nghiệm và mở
ra một hướng đi mới cho việc tạo chuột biến đổi di truyền cho các nghiên cứu tiếp
theo của các nhà khoa học ở Việt Nam.
Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung cụ thể cần thực hiện như sau:
- Xác định giai đoạn động dục ở chuột cái bằng phương pháp quan sát
trực quan âm đạo thông qua phương pháp vết phết tế bào âm đạo
Chỉ tiêu đánh giá: (1) Sự hiện diện rõ rang của các tế bào đại diện cho giai
đoạn của chu kì động dục đặc biệt là giai đoạn động dục (estrous); (2). Sự tương
quan cao giữa hai phương pháp trực quan âm đạo và vết phết tế bào âm đạo nhằm
thực hiện việc quan sát trực quan âm đạo và xác định được giai đoạn động dục mà
không cần kiểm tra lại bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo.
- Sàng lọc được hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho quá trình vi tiêm
DNA chuẩn bị q trình chuyển phơi vào chuột mẹ mang thai hộ.
Tiêu chí đánh giá: (1) Thu nhận được các hợp tử giai đoạn 2 tiền nhân. (2)
Phôi sau khi vi tiêm DNA có sự sinh trưởng và phát triển thành các giai đoạn 2 tế
bào nhằm đảm bảo sự khỏe mạnh của phôi.
- Tạo chuột mẹ mang thai hộ thành công bằng phương pháp phẫu thuật
chuyển phôi vào ống dẫn trứng và theo dõi chuột mẹ mang thai sau khi chuyển
phôi.
Chỉ tiêu đánh giá: (1) Chuột đực khơng có khả năng sinh sản sau khi cắt
ống dẫn tinh; (2) Ghi nhận được dấu hiệu giao phối thành công của các chuột được
ghép đôi nhằm tiến hành kiểm tra ống dẫn trứng. (3) ống dẫn trứng chuột cái có dấu

hiệu tiếp nhận phơi (xuất hiện ampulla). (4) Chuột nhận phơi có dấu hiệu mang thai
ít nhất sau 1 tuần chuyển phôi.


3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng chuột mẹ mang thai hộ bằng phương pháp
phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng
Các nhà khoa học trên thế giới đã cơng bố nhiều cơng trình khoa học trong
việc sử dụng chuột mẹ mang thai hộ phục vụ cho các nghiên cứu của họ.
Nghiên cứu của Masaru Okabe và cộng sự năm 1997 trong việc tạo ra chuột
chuyển gen phát sáng huỳnh quang nhằm tạo ra nguồn tế bào mang gen egfp dồi
dào phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến cấy ghép tế bào đã báo cáo rằng, có
272 hợp tử đã vi tiêm DNA đã được cấy chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và kết
quả đạt được 52 chuột con sinh ra [2].
Daniel D. Carson và cộng sự năm 2000 đã báo cáo rằng, việc chuyển phôi
vào chuột mẹ mang thai hộ là một bước thiết yếu trong quá trình tạo chuột biến đổi
gen [3]. Do đó, việc tạo mơ hình chuột mang thai hộ là cần thiết.
Lars M Ittner và cộng sự năm 2007 nghiên cứu việc sản xuất chuột chuyển
gen bằng phương pháp vi tiêm DNA vào phôi đã mô tả việc chuyển phơi vào chuột
mẹ mang thai hộ, trong đó để tạo chuột mẹ mang thai hộ cần sử dụng chuột cái ở
giai đoạn động dục [4]. Trong nghiên cứu của Satoshi Kishigami và cộng sự năm
2006 về nghiên cứu sản xuất chuột nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân tế bào
sinh dưỡng cũng mô tả việc chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và chuột mang thai
hộ được tạo ra từ việc sử dụng chuột cái giai đoạn động dục.
Năm 1972 Arthur K. Champlin và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra phương
pháp xác định các giai đoạn của động dục ở chuột bằng việc quan sát trực quan âm
hộ. Giai đoạn động dục được ghi nhận âm hộ có màu hồng, ít ẩm ướt. Tuy nhiên
đây là một phương pháp đòi hỏi kĩ năng cũng như nhiều kinh nghiệm của người

thực hiện, do đó cần có các phương pháp khác đối chiếu.
Shannon L. Byers và cộng sự năm 2012 đã đưa ra phương pháp xác định các
giai đoạn của chu kì động dục ở chuột bằng quan sát trực quan âm hộ ở các chủng
chuột khác nhau, đồng thời đối chiếu là phương pháp vết phết tế bào âm đạo với sự
xuất hiện của tế bào đặc trưng như tế bào biểu mơ sừng hóa khơng nhân, tế bào biểu
mơ có nhân, tế bào bạch cầu. Các tế bào này xuất hiện với tỉ lệ khác nhau ở các giai


4

đoạn khác nhau, nhóm nghiên cứu của Shannon L. Byers cũng đã được ra cơng cụ
nhằm ước tính tỉ lệ tế bào và đưa ra giai đoạn động dục chính xác. Tuy nhiên,
phương pháp của Shannon L. Byers và cộng sự là quan sát dưới kính hiển vi với
mẫu tươi dịch âm đạo. Điều này có ưu điểm là dễ dàng thực hiện, tiết kiệm thời
gian. Tuy nhiên, các thị trường bên trong tiêu bản chứa dịch âm đạo không chỉ có tế
bào, do đó rất khó phân biệt sự khác nhau của các loại tế bào ở các giai đoạn khác
nhau.
Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 đã báo cáo về việc áp dụng mơ hình chuột
mang thai hộ trong đó sử dụng chuột ICR làm chuột mẹ mang thai hộ phục vụ
nghiên cứu về các điều kiện nuôi khác nhau ở các hệ thống khác nhau và sinh con
non bình thường [5].
Kết quả nghiên cứu của Ayako Isotani và cộng sự năm 2016 trong việc thiết
lập dòng tế bào gốc phôi của chuột đã vi tiêm gen ngoại lai vào phôi và chuyển phôi
vào chuột cái mang thai hộ nhằm sinh con non [6].
Trong nghiên cứu về hiệu quả của việc chỉnh sửa gen bằng kỹ thuật CrisprEZ được báo cáo bởi Andrew J Modzelewski và cộng sự năm 2018 trên tạp chí
Nature cũng mơ tả việc tạo chuột biến đổi gen bằng việc vi tiêm DNA vào hợp tử
giai đoạn hai tiền nhân và chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ
nhằm sinh chuột con được chỉnh sửa gen [7].
Yi Wu và cộng sự năm 2019 nghiên cứu về việc tạo ra chuột biến đổi gen
được đăng trên tạp chí Nature đã mơ tả việc vi tiêm hỗ hợp sgRNA và Cas9 mRNA

hoặc protein vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và giai đoạn 2 tế bào. Hợp tử sau vi
tiêm được nuôi đến giai đoạn hai tế bào và các phôi hai tế bào sau vi tiêm được
chuyển vào ống dẫn trứng của chuột mang thai hộ (hình 2.1) [8].


5

Hình 2.1. Quá trình tạo chuột biến đổi gen áp dụng mơ hình chuột mang thai hộ [8]
U. Lampreht Tratar và cộng sự năm 2018 trong nghiên cứu mơ hình chuột
trong các nghiên cứu liên quan đến ung thư đã chỉ ra rằng, trong tất cả ba phương
pháp tạo chuột chuyển gen mà họ đã sử dụng, điều quan trọng và chung nhất là đều
phải chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ để tạo ra mơ hình chuột nghiên cứu
theo mơ tả hình bên dưới [9] .

Hình 2.2. Quy trình tạo chuột chuyển gen [9].
Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một cơng trình nào ở Việt Nam được
công bố về nghiên cứu tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm tạo chuột phát sáng huỳnh
quang tiếp cận bằng việc phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng. Điều này có


6

thể thấy nghiên cứu của chúng tơi đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc
phục vụ cho nghiên cứu khoa học. Sự đang dạng về mặt ứng dụng của mơ hình
chuột mẹ mang thai hộ cũng cho thấy tiềm năng ứng dụng của mơ hình chuột mẹ
mang thai hộ là rất lớn, đồng thời việc làm chủ công nghệ này là một lợi thế to lớn
trong việc thực hiện các nghiên cứu khoa học tiếp theo.
2.2. Vai trò của chuột trong nghiên cứu
Thơng qua tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước được thực hiện
trên đối tượng chuột, có thể thấy chuột đóng một vai trị hết sức quan trọng trong

nghiên cứu cơ bản và cả các nghiên cứu ứng dụng, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh
học. Các nghiên cứu này càng thể hiện vai trị của nó khi ngày nay, tỉ lệ con người
mang bệnh tật ngày càng nhiều, như vậy việc tạo ra các mơ hình chuột là ngày càng
quan trọng.
Chuột được xem là một mơ hình cho các nghiên cứu và đã được chứng minh
là cực kì hữu ích bởi tính tương đồng về bộ gen của nó với con người lên đến 80%
[10]. Do đó, chuột mang thai hộ là một công cụ hỗ trợ mạnh mẽ trong các nghiên
cứu cơ bản liên quan đến y sinh học cũng như các ứng dụng điều trị trong việc phát
triển một loại thuốc mới bất kì [11].
2.3. Tổng quan về chuột nhắt trắng
2.3.1. Sinh lý sinh sản
Tùy thuộc vào từng chủng chuột mà có độ tuổi trưởng thành về mặt sinh dục
khác nhau. Trong đó, chuột được sử dụng cho nghiên cứu về sinh sản thường thấy
dao động khoảng 45 – 50 ngày đối với chuột cái và lên đến 60 ngày đối với chuột
đực [12]. Ngồi ra cịn có một số chủng chuột với các độ tuổi sinh sản khác nhau
như FVB/N (4 – 5 tuần tuổi) [13], C57BL/6 x BalBc (8 tuần tuổi) [14] bởi vì chúng
cung cấp các loại tế bào (trứng và tinh trùng) thích hợp cho việc sản xuất các dịng
chuột nhân bản [15]. Ngồi ra cũng có một số chủng chuột như B6D2F1 (C57BL/6
x DBA/2) [4], B6C3F1 (C57BL/6 x C3H/He) với độ tuổi sinh sản là 8 – 10 tuần
tuổi. Đồng thời, chủng chuột thích hợp làm chuột mang thai hộ và chuột bất thụ là
ICR (CD – 1) [8], [15], [16], [17].
2.3.2. Cơ quan sinh sản chuột nhắt trắng


7

Hình 2.3. Cơ quan sinh sản ở chuột. (bên trái: chuột cái, bên phải: chuột đực) [18]

Hình 2.4. Cơ quan sinh sản của chuột đực; bao gồm ống dẫn tinh, mào tinh hồn
và tinh hồn [19].

2.3.3. Chu kì động dục ở chuột
Chu kì động dục ở chuột hay cịn gọi là chu kì sinh sản của chuột. Chu kì
động dục được tính từ lúc bắt đầu động dục cho đến lúc bắt đầu lại 1 chu kì động
dục mới. Chu kì động dục bao gồm bốn giai đoạn chính: Tiền động dục
(proestrous), động dục (Estrous), sau động dục (metestrous), giai đoạn nghỉ động
dục (diestrous) và được xác định dựa vào việc quan sát các loại tế bào hiện diện
trong dịch âm đạo của chuột, đồng thời với sự biểu hiện của hành vi tình dục, có thể
quan sát và xác định được giai đoạn động dục của chuột. Sự thay đổi này có thể
phản ánh đối với sự thay đổi nội tiết bên trong cơ thể chuột, các thay đổi xảy ra
trong chu kì động dục của chuột là điều hiển nhiên [20]. Ta có thể xác định chu kì
động dục của chuột bằng việc quan sát vết phết tế bào âm đạo ở các giai đoạn khác


8

nhau [21], [22]. Trong suốt chu kì động dục ở chuột, các giai đoạn tiền động dục,
động dục, sau động dục thường kéo dài 12 giờ và giai đoạn dài nhất là nghỉ động
dục kéo dài khoảng 65 giờ.
Bảng 2.1. Sự thay đổi của progesterol và estradiol trong quá trình động dục ở
chuột
Giai đoạn

Progesterol

Estradiol

Tiền động dục

Tăng cao

Tăng cao

Động dục

Giảm dần

Giảm dần

Sau động dục

Duy trì ở mức thấp

Duy trì ở mức thấp

Tăng cao

Tăng nhẹ sau đó giảm và duy trì ở

Nghỉ động dục

mức thấp

Trong quá trình động dục, hàm lượng progesterone và estradiol có sự thay đổi rõ
rệt. Đối với giai đoạn tiền động dục, hàm lượng progesterone và estradiol tăng cao
nhưng sẽ giảm dần cho đến khi vào giai đoạn động dục và duy trì ổn định cho đến
cuối giai đoạn sau động dục, Đến giai đoạn nghỉ động dục, hàm lượng progesterone
sẽ tăng đột ngột và duy trì ở ngưỡng cao này cho đến cuối giai đoạn nghỉ động dục,
hàm lượng progesterone sẽ giảm dần khi bắt đầu lại chu kì động dục mới. Ngược lại
với progesterone thì estradiol có sự biến thiên trong giai đoạn này. Cụ thể, estradiol
sẽ tăng lên đáng kể, tuy nhiên thấp hơn nhiều so với progesterone và điều đáng nói

là estradiol khơng duy trì ở mức cao mà sẽ giảm dần ngay sau đó và duy trì ở mức
thấp như ở giai đoạn động dục và sau động dục [23]. Đối với người, chu kì sinh sản
hay cịn gọi là chu kì kinh nguyệt và thường kéo dài từ 28 – 32 ngày. Chu kì động
dục khác nhau ở các lồi; đối với chuột, chu kì động dục thường kéo dài 4 - 5 ngày
[12], [20], [23]; tuy nhiên sự động dục ở các thời điểm rất đa dạng và tùy thuộc vào
từng loài. Giai đoạn động dục của chuột được xác định trong khoảng thời gian từ
lúc chuột cái có dấu hiệu chấp nhận giao phối bằng biểu hiện hành vi và quan sát
âm hộ [12].
Xác định chu kì động dục của chuột là cơng cụ rất hữu ích cho việc lựa chọn
chuột để chuẩn bị ghép đôi [20]. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, xác định giai


9

đoạn động dục của chu kì động dục được thực hiện nhằm nâng cao tỉ lệ ghép đôi
của chuột, do đó chúng tơi chọn giai đoạn động dục là giai đoạn thích hợp nhất [24].

Hình 2.5. Sự thay đổi hàm lượng progesterone và estradiol trong suốt quá trình
động dục ở chuột [23]
 Sự thay đổi về âm hộ ở các giai đoạn khác nhau của chu kì động dục của chuột:
Theo Byers và cộng sự năm 2012, có sự khác biệt rõ ràng của âm hộ chuột
cái được quan sắt bằng mắt thường được thể hiện qua bảng 1.2 và hình 2.6 như sau:
Bảng 2.2. Biểu hiện của âm hộ chuột cái được quan sát bằng mắt thường qua
các giai đoạn của chu kì động dục.
Giai đoạn của chu kỳ

Biểu hiện âm hộ

động dục
Tiền động dục

Động dục

Sau động dục

Kích thước âm đạo mở nhưng nhỏ, màu sắc âm hộ đỏ hồng,
khơ, sưng nhiều và có nếp nhăn (hình A).
Âm đạo lúc này mở rộng, màu sắc âm hộ hồng nhạt, khơ, sưng,
bóng, có nếp nhăn (hình B).
Kích thước âm đạo thu nhỏ lại, ít sưng hơn và có màu tái nhạt,
khơ và khơng sưng (hình C).
Kích thước âm đạo rất nhỏ, điều này cho thấy chuột ngưng tiếp

Nghỉ động dục

nhận các hoạt động tình dục. Âm hộ khơng sưng, khơ và màu
sắc tái nhạt hơn nhiều so với các giai đoạn khác (hình D).

Nguồn: Byers và cộng sự, 2012 [20], [24].


10

Sự thay đổi về âm hộ ở các giai đoạn khác nhau của chu kì động dục của
chuột được biểu thị như hình sau:

Hình 2.6. Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột [20], [24]
CbyB6F1/J (bên trái); C57BL/6J (bên phải) [20]. A: Proestrous – tiền động dục. B:
Estrous – động dục. C: Metestrous – sau động dục. D: Diestrous – nghỉ động dục


Sự thay đổi về tử cung của chuột trong chu kì động dục.

Tử cung chuột có sự thay đổi lớn ở giai đoạn tiền động dục và giai đoạn
động dục. Ở hai giai đoạn này, tử cung trương phồng, có sự tập trung của mạch máu
một cách rõ rệt do sự tuần hoàn của estrogen tăng cao. Đồng thời, tử cung ướt và
khơ có trọng lượng nặng nhất. Ở hai giai đoạn còn lại là sau động dục và nghỉ động
dục hình dạng tử cung trở lại bình thường, trọng lượng ướt và khơ của tử cung
chuột thấp nhất ở giai đoạn nghỉ động dục - diestrous [12].
2.3.4. Các loại tế bào ở các giai đoạn của chu kì động dục của chuột

Hình 2.7. Các loại tế bào đặc trưng ở giai đoạn động dục và nghỉ động dục ở
chuột [25].


11



Sự thay đổi về biểu hiện hành vi tình dục của chuột ở giai đoạn động

dục của chu kì động dục ở chuột
Trong giai đoạn động dục, chuột cái có thể ngửi thấy mùi Pheromones của
chuột đực, do đó dễ dàng bị hấp dẫn bởi chuột đực và tiếp nhận giao phối. Ngược
lại ở giai đoạn diestrus, chuột cái không thể ngửi thấy mùi của chuột đực, do đó
khơng những khơng tiếp nhận giao phối mà thậm chí có thể trở nên hung dữ và tấn
công ngược lại với chuột đực được ghép cặp.
2.4. Công nghệ cấy truyền phôi
Chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ có thể được thực hiện bằng nhiều
phương pháp khác nhau như chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ bằng cách tiếp cận

âm đạo mà khơng xâm lấn [17]. Ngồi ra có thể chuyển phơi vào ống dẫn trứng,
sừng tử cung hoặc tử cung bằng việc phẫu thuật. Nghiên cứu của các nhà khoa học
trên thế giới về việc ứng dụng hệ thống CRISPR – Cas9 trong việc chỉnh sửa gen,
hỗn hợp này được vi tiêm vào phôi giai đoạn 2 tế bào và chuyển phôi vào ống dẫn
trứng [4], [5], [7], [8], [26], [27], [28].
Ngun tắc:
Tùy theo phơi được chuyển mà chúng ta có vị trí chuyển phơi khác nhau. Thơng
thường, khi tinh dịch được phóng thích vào âm đạo chuột, tinh trùng sẽ tách khỏi
tinh tương và di chuyển qua cổ tử cung để vào tử cung. Tinh trùng khỏe mạnh tiếp
tục di chuyển đến 1/3 ngoài của ống dẫn trứng và thụ tinh tại đây. Quá trình thụ tinh
diễn ra sẽ tạo ra hợp tử và phát triển thành phôi hai tế bào. Phôi hai tế bào tiếp tục
phát triển đến các giai đoạn 4-8 tế bào trong đoạn ống dẫn trứng. Đến giai đoạn
phơi dâu và phơi nang thì sẽ ở vị trí gần sừng tử cung, sau khi phơi thốt nang sẽ
vào tử cung để làm tổ. Nghiên cứu của R. Carballada và cộng sự năm 2000 [29] cho
thấy trong tổng số 111 hợp tử, có 93 hợp tử phát triển đến giai đoạn 2 tế bào chiếm
tỉ lệ 83,8%, số hợp tử phát triển đến giai đoạn blastocyst là 27 chiếm tỉ lệ 24% giảm
59,8%. Nghiên cứu của Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 cho thấy việc nuôi phôi
đến giai đoạn 2 tế bào đạt 100%, trong khi đó ni phơi đến giai đoạn blastocyst đạt
93%, giảm 7% so với ban đầu. Đồng thời, nghiên cứu của Lifang Cui và cộng sự
năm 2014 [5] cho thấy việc phẫu thuật chuyển phôi giai đoạn blastocyst được nuôi


12

từ 1 tế bào đạt 63,3% và phôi blastocyst tự nhiên đạt 75,3%. Một nghiên cứu gần
đây nhất của Nguyen Van Thuan và cộng sự năm 2019 [30] trong việc thiết lập
dịng phơi chuột phát sáng huỳnh quang bằng phương pháp tiêm tinh trùng trữ lạnh
-80oC vào bào tương trứng, trong đó kết quả của việc tạo phơi giai đoạn hai tế bào
đạt 100% và nuôi đến được nuôi đến giai đoạn phơi nang (blastocyst) thì giảm cịn
83,11% ở nhóm đối chứng, nhóm sử dụng tinh trùng tươi đạt 100% ở giai đoạn hai

tế bào và nuôi đến giai đoạn phơi nang thì tỉ lệ này cịn 57,5%, đối với nhóm sử
dụng tinh trùng gfp đạt 85,7% ở giai đoạn hai tế bào và ni đến giai đoạn phơi
nang cịn 21,2%. Điều này cho thấy việc nuôi phôi trong điều kiện invitro có bất lợi
cho việc phát triển của phơi. Do đó, việc chuyển phơi vào cơ thể chuột mẹ nhận
phơi là càng sớm càng tốt cho sự bám dính và làm tổ của phơi. Vì vậy, tùy vào mục
đích thí nghiệm để cân nhắc việc ni phơi đến giai đoạn hai tế bào hay đến giai
đoạn phôi nang. Ngày nay, việc chuyển phôi sử dụng phương pháp tiếp cận tử cung
bằng phương pháp phẫu thuật được sử dụng ngày càng nhiều trên thế giới [28].
Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành chuyển phôi giai đoạn phơi
2 tế bào, do đó chúng tơi tiếp cận chuyển phơi từ vị trí ống dẫn trứng. Phơi được
chuyển là phơi giai đoạn 1- 2 tế bào, do đó vị trí chuyển sẽ ở gần ampulla hoặc
thơng qua vịi ống dẫn trứng (infundibulum).
Bên cạnh đó, phương pháp chuyển phơi vào ống dẫn trứng là phương pháp
mang lại hiệu quả cao và được các nhà nghiên cứu sử dụng rộng rãi. do đó, để
nghiên cứu của chúng tơi mang tính ứng dụng cao là có thể phù hợp với các nghiên
cứu mới nhất, chúng tôi tiến hành tiếp cận phương pháp chuyển phơi vào ống dẫn
trứng.

Hình 2.8. Vị trí diễn ra sự thụ tinh tạo thành hợp tử ở chuột [31].