Tối ưu hóa quá trình thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzym neutrase và flavourzyme với sự hỗ trợ của sóng siêu âm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-------------------------

BK

TP.HCM

LÊ THỊ KIM HỒNG

TỐI ƢU HỐ Q TRÌNH THUỶ PHÂN COLLAGEN
TỪ DA CÁ TRA BẰNG ENZYM NEUTRASE VÀ
FLAVOURZYME VỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA SĨNG SIÊU ÂM

Chun ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã ngành: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2013


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG TP.HCM
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: ……………………………………..
TS. Phan Ngọc Hoà
Cán bộ chấm nhận xét 1: …………………………………………
TS. Nguyễn Lệ Hà
Cán bộ chấm nhận xét 2: ………………………………………....
TS. Trần Thị Ngọc Yên
Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM

ngày 30/12/2013.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS.TSKH. Lƣu Duẩn

- Chủ tịch Hội đồng

2. TS. Nguyễn Lệ Hà

- Phản biện 1

3. TS. Trần Thị Ngọc Yên

- Phản biện 2

4. TS. Võ Đình Lệ Tâm

- Thƣ ký

5. TS. Phan Ngọc Hồ

- Uỷ viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc chỉnh chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-----------------------

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-------------------Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 12 năm 2013

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Lê Thị Kim Hồng

MSHV: 11110199

Ngày, tháng, năm sinh: 07/01/1987

Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống

Mã ngành: 605402

I. TÊN ĐỀ TÀI: TỐI ƢU HỐ Q TRÌNH THUỶ PHÂN COLLAGEN TỪ DA
CÁ TRA BẰNG ENZYM NEUTRASE VÀ FLAVOURZYME VỚI SỰ HỖ TRỢ
CỦA SÓNG SIÊU ÂM
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Tách chiết và thu nhận collagen từ da cá tra
 Khảo sát thành phần nguyên liệu collagen
 Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thuỷ phân collagen với enzym
Neutrase có tiền xử lý bằng sóng siêu âm.

 Tối ƣu hố q trình thuỷ phân collagen với enzym Neutrase có tiền xử lý
bằng sóng siêu âm và xác định phân tử lƣợng, khả năng hoà tan của sản phẩm thuỷ
phân.
 Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thuỷ phân collagen với enzym
Flavourzyme có tiền xử lý bằng sóng siêu âm.
 Tối ƣu hố q trình thuỷ phân collagen với enzym Flavourzyme có tiền xử lý
bằng sóng siêu âm và xác định phân tử lƣợng, khả năng hoà tan của sản phẩm thuỷ
phân.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 24/06/2013
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22/11/2013
V. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS. Phan Ngọc Hoà
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

TRƢỞNG KHOA

(Họ tên và chữ ký)

ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CẢM ƠN


Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Bộ mơn Cơng nghệ Thực Phẩm,
Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Trƣờng Đại học Bách Khoa TP.HCM đã hỗ trợ trang
thiết bị, máy móc, dụng cụ, phịng thí nghiệm giúp em hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Phan Ngọc Hồ, cơ đã tận tình hƣớng
dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho em để hoàn thành luận văn này.
Em xin cám ơn cô Nguyễn Thị Nguyên đã hỗ trợ và tạo điều kiện làm việc
tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phịng thí nghiệm Cơng
nghệ thực phẩm.
Em cũng gửi lời cảm ơn các bạn sinh viên, học viên thực hiện luận văn tại
phịng thí nghiệm Cơng nghệ thực phẩm đã đồng hành cùng em trong thời gian thực
hiện luận văn.
Em vô cùng biết ơn ba mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên
tinh thần, chia sẻ khó khăn cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận
văn.
Cuối cùng, em xin gửi lời chúc sức khoẻ và thành công đến quý Thầy cô giáo
của Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hố học – Trƣờng Đại học Bách
Khoa TP.HCM.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 12 năm 2013
Học viên

Lê Thị Kim Hồng


ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Luận văn này nghiên cứu quá trình thuỷ phân collagen từ da cá tra bởi các
enzym protease thƣơng mại là Neutrase 0,8L và Flavourzyme 500L. Collagen
nguyên liệu đƣợc tiền xử lý bằng sóng siêu âm trƣớc khi thuỷ phân bằng enzym.
Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng nguồn nguyên liệu da cá tra rẻ tiền để sản

xuất collagen hydrolysate có phân tử lƣợng nhỏ, dƣới 10 kDa có hoạt tính sinh học
để ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm.
Collagen nguyên liệu đƣợc trích ly từ da cá tra bằng nƣớc ấm 40oC trong 114
phút, khuấy trộn 200 vòng/phút. Trƣớc khi thực hiện quá trình tách chiết, da cá tra
đƣợc tách béo, protein tạp bằng LaSNa 1% có bổ sung NaOH 0,5%; tẩy màu và mùi
tanh bằng H2O2 1% trong NaOH 0,01M; tiếp đó, da cá đƣợc ngâm trong dung dịch
acid acetic 0,5M để trƣơng nở. Kết quả phân tích điện di cho thấy collagen gồm 3
chuỗi α1, α2 và β có phân tử lƣợng lần lƣợt là 130, 140 và 250 kDa.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thuỷ phân
collagen bởi enzym Neutrase và Flavourzyme, có sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở tần
số 20 kHz, cƣờng độ 150W, thời gian 6 phút. Sau đó, chúng tơi tiến hành tối ƣu hố
hai yếu tố là tỷ lệ enzym/cơ chất và thời gian thuỷ phân đối với từng enzym bằng
phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm.
Điều kiện tối ƣu của quá trình thuỷ phân collagen với enzym Neutrase là: tỷ
lệ cơ chất/nƣớc là 1/3, tỷ lệ enzym/cơ chất là 7,62% (tƣơng đƣơng 46,42 UI/g
protein), nhiệt độ 50oC, pH 7,0, thời gian 234,44 phút. Kết quả: mức độ thuỷ phân
đạt 9,29% và collagen thuỷ phân có phân tử lƣợng từ 10,5 ÷ 28,5 kDa.
Điều kiện thuỷ phân collagen bởi enzym Flavourzyme tối ƣu là: tỷ lệ cơ
chất/nƣớc là 1/3, tỷ lệ enzym/cơ chất là 16,25% (tƣơng đƣơng 52,7 UI/g protein),
nhiệt độ 50oC, pH 6,5, thời gian 172,97 phút. Mức độ thuỷ phân đạt 13,36% và
collagen thuỷ phân có phân tử lƣợng từ 6 ÷ 24 kDa.
Thuỷ phân collagen bởi enzym Flavourzyme với sự hỗ trợ của sóng siêu âm
cho ta thu đƣợc collagen hydrolysate có phân đoạn < 10 kDa có hoạt tính sinh học.


iii

ABSTRACT
Studying to collagen hydrolysis from Pangasius hypophthalmus skin by
trade proteases, such as: Neutrase 0,8L and Flavourzyme 500L. Collagen was pretreated by ultrasound before hydrolysis with enzyme. The target is using cheap

material to product collagen hydrolysates, molecular weights are lower than 10 kDa.
They have biological active and be used in food and cosmetics.
Extraction of collagen was carried out at 40oC by water, during 114 min,
stirred 200 rpm. Before extracting, fish skin was excluded lipid, impurity protein by
1% LaSNa, added 0,5% NaOH; then fish skin was removed colour and odour by
1% H2O2, added 0,01M NaOH. We soaked fish skin into 0,5M acetic acid. The
molecular weights of α1, α2 and β chains in collagen were estimated to be 130, 140
and 250 kDa, respectively.
We investigated of effecting of factors on collagen hydrolysis by Neutrase
and Flavourzyme with supporting ultrasound at frequency of 20 kHz, capacity of
150 W, during 6 min. Then, we optimized 2 factors (enzyme/substrate ratio,
hydrolysis time) by response surface methodology.
The optimal conditions for collagen hydrolysis with Neutrase were
substrate/water ratio of 1/3, enzyme/substrate ratio of 7.62% (46.42 UI/g protein),
temprature of 50oC, pH of substrate of 7.0, and hydrolysis time of 234.44 min.
Degree of hydrolysis was 9.29% and molecular weights of collagen hydrolysates
from 10.5 to 28.5 kDa.
The optimal conditions for collagen hydrolysis with Flavourzyme were
substrate/water ratio of 1/3, enzyme/substrate ratio of 16.25% (52.7 UI/g protein),
temprature of 50oC, pH of substrate of 6.5, and hydrolysis time of 172.97 min.
Degree of hydrolysis was reached 13.36% and molecular weights of collagen
hydrolysates from 6 to 24 kDa.
We obtained collagen hydrolysates from hydrolysis of collagen with
Flavourzyme, pre-treated by ultrasound. Many collagen hydrolysates had molecular
weights lower than 10 kDa and had biological active.


iv

MỤC LỤC



Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ...........................................................................ii
ABSTRACT ............................................................................................................. iii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ x
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 2
1.1. DA CÁ TRA .................................................................................................... 2
1.2. COLLAGEN .................................................................................................... 3
1.2.1. Cấu tạo, thành phần hoá học .................................................................... 3
1.2.2. Phân loại ................................................................................................... 4
1.2.3. Tính chất hố lý ........................................................................................ 5
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng ............................................................................... 6
1.2.5. Vai trò, chức năng của collagen ............................................................... 8
1.3. COLLAGEN HYDROLYSATE ..................................................................... 9
1.3.1. Đặc điểm, thành phần hoá học của collagen hydrolysate ........................ 9
1.3.2. Hoạt tính sinh học của collagen hydrolysate .......................................... 10
1.3.3. Vai trò của collagen hydrolysate đối với sức khoẻ ................................ 14
1.3.4. Ứng dụng của collagen hydrolysate ....................................................... 15
1.4. SÓNG SIÊU ÂM ........................................................................................... 16
1.4.1. Đặc điểm, phân loại ................................................................................ 16
1.4.2. Cơ sở lý thuyết ....................................................................................... 17
1.4.3. Ứng dụng của sóng siêu âm ................................................................... 18

v
1.5. ENZYM THUỶ PHÂN PROTEIN ............................................................... 20
1.5.1. Enzym Neutrase ..................................................................................... 22
1.5.2. Enzym Flavourzyme ............................................................................... 23
1.5.3. Cơ chế thuỷ phân collagen ..................................................................... 23
1.6. CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THUỶ PHÂN COLLAGEN TỪ
THUỶ SẢN .......................................................................................................... 25
1.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................. 25
1.6.2. Các nghiên cứu trong nƣớc .................................................................... 29
1.6.3. Hƣớng nghiên cứu .................................................................................. 31
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 32
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................................... 32
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................ 32
2.1.2. Hoá chất .................................................................................................. 32
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................... 33
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 34
2.2.1. Mục đích nghiên cứu .............................................................................. 34
2.2.2. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................... 34
2.2.3. Phƣơng pháp thu nhận collagen từ da cá tra .......................................... 35
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích ........................................................................... 38
2.2.5. Thuỷ phân collagen ................................................................................ 38
2.2.5.1. Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase ........ 39
2.2.5.2. Tối ƣu quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase ........... 40
2.2.5.3. Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Flavourzyme . 42
2.2.5.4. Tối ƣu quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Flavourzyme .... 43
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...................................................................... 44
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 45
3.1. THÀNH PHẦN VÀ TÍNH CHẤT CỦA NGUYÊN LIỆU COLLAGEN .... 45
3.2. HOẠT TÍNH ENZYM NEUTRASE VÀ FLAVOURZYME ...................... 45
3.3. KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH THUỶ PHÂN COLLAGEN ................................ 46

3.3.1. Kết quả khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bởi enzym Neutrase ..... 46


vi
3.3.1.1. Tỷ lệ cơ chất/nƣớc........................................................................... 46
3.3.1.2. Tỷ lệ enzym/cơ chất ........................................................................ 48
3.3.1.3. Thời gian thuỷ phân ........................................................................ 50
3.3.2. Kết quả tối ƣu hố q trình thuỷ phân collagen bởi enzym Neutrase .. 51
3.3.3. Kết quả khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bởi enzym Flavourzyme ..
.......................................................................................................................... 57
3.3.3.1. Tỷ lệ enzym/cơ chất ........................................................................ 57
3.3.3.2. Thời gian thuỷ phân ........................................................................ 58
3.3.4. Kết quả tối ƣu hố q trình thuỷ phân collagen bởi enzym .................
Flavourzyme ..................................................................................................... 60
3.4. SO SÁNH HIỆU QUẢ CỦA CÁC QUY TRÌNH THUỶ PHÂN
COLLAGEN ......................................................................................................... 65
3.4.1. Mức độ thuỷ phân................................................................................... 65
3.4.2. Phân tử lƣợng ......................................................................................... 67
3.4.3. Khả năng hoà tan của collagen hydrolysate ........................................... 68
3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TẠO SẢN PHẨM .................... 69
3.5.1. Quy trình cơng nghệ ............................................................................... 69
3.5.2. Thuyết minh quy trình ............................................................................ 70
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 72
4.1. KẾT LUẬN.................................................................................................... 72
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 75
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 83
PHỤ LỤC A: Các phƣơng pháp phân tích ........................................................... 83
PHỤ LỤC B: Số liệu thuỷ phân collagen bởi enzym Neutrase ............................ 92
PHỤ LỤC C: Số liệu thuỷ phân collagen bởi enzym Flavourzyme ..................... 96

PHỤ LỤC D: Phân tích Anova DH của các mẫu collagen thuỷ phân bởi enzym
Neutrase ..................................................................................................................... 98
PHỤ LỤC E: Phân tích Anova DH của các mẫu collagen thuỷ phân bởi enzym
Flavourzyme ............................................................................................................ 105


vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen .............................................. 4
Hình 1.2. Quá trình hình thành và phá vỡ bọt khí..................................................... 18
Hình 1.3. Phân loại peptidase theo vị trí xúc tác....................................................... 22
Hình 1.4. Vị trí xúc tác của Collagenase................................................................... 24
Hình 1.5. Cơ chế xúc tác thuỷ phân collagen của Collagenase ................................ 25
Hình 1.6. Tốc độ chelate với sắt của các hydrolysates ở những thời gian thuỷ phân
khác nhau................................................................................................................... 29
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu....................................................................................... 35
Hình 2.2. Quy trình thu nhận collagen từ da cá tra ................................................... 36
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ cơ chất/nƣớc đến DH ..................... 47
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ enzym/cơ chất đến DH .................. 48
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian thuỷ phân đến DH .................. 50
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tỷ lệ enzym/cơ chất và thời gian thuỷ
phân đến DH ............................................................................................................. 54
Hình 3.5. Đồ thị vịng dự đốn kết quả quy hoạch thực nghiệm .............................. 55
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ enzym/cơ chất lên DH ................... 57
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian thuỷ phân đến DH .................. 59
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian thuỷ phân lên DH bởi Protamex,
Alcalase và Flavourzyme .......................................................................................... 60
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tỷ lệ enzym/cơ chất và thời gian thuỷ

phân đến DH ............................................................................................................. 63
Hình 3.10. Đồ thị vịng dự đốn kết quả quy hoạch thực nghiệm ............................ 63
Hình 3.11. Kết quả phân tích điện di của collagen thơ (2) và collagen thơ đƣợc xử lý
sóng siêu âm (3) ........................................................................................................ 67
Hình 3.12. Kết quả phân tích điện di của collagen thuỷ phân bởi enzym Neutrase và
Flavourzyme có tiền xử lý bằng sóng siêu âm .......................................................... 67
Hình 3.13. Quy trình thu nhận collagen hydrolysate từ da cá tra ............................. 70


viii
Hình 4.1. Quy trình tối ƣu thu nhận collagen hydrolysate từ da cá tra bằng enzym
Flavourzyme .............................................................................................................. 72


ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của da cá tra nguyên liệu ............................................. 2
Bảng 1.2. Sự phân bố các acid amin trong chuỗi polypeptide ............................................ 3

Bảng 1.3. Các peptide có hoạt tính kháng khuẩn ........................................................ 11
Bảng 2.1. Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu............................................... 33
Bảng 2.2. Các loại máy, thiết bị và dụng cụ dùng trong thí nghiệm........................... 34
Bảng 2.3. Các mức thí nghiệm thuỷ phân collagen bằng Neutrase ............................ 40
Bảng 2.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm thuỷ phân collagen bằng Neutrase ......... 41
Bảng 2.5. Các mức thí nghiệm thuỷ phân collagen bằng Flavourzyme ..................... 43
Bảng 2.6. Ma trận quy hoạch thực nghiệm thuỷ phân collagen bằng Flavourzyme .. 43
Bảng 3.1. Thành phần và tính chất nguyên liệu collagen ........................................... 45
Bảng 3.2. Kết quả xác định hoạt tính các enzym ........................................................ 46

Bảng 3.3. Kết quả xác định DH theo tỷ lệ cơ chất/nƣớc............................................. 46
Bảng 3.4. Kết quả xác định DH theo tỷ lệ enzym/cơ chất .......................................... 48
Bảng 3.5. Kết quả xác định DH theo thời gian thuỷ phân .......................................... 50
Bảng 3.6. Kết quả tối ƣu quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase ........... 52
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của các biến độc lập đến DH ................................................... 52
Bảng 3.8. Bảng phân tích phƣơng sai cho mơ hình RSM của DH ............................. 53
Bảng 3.9. Kết quả xác định DH theo tỷ lệ enzym/cơ chất .......................................... 57
Bảng 3.10. Kết quả xác định DH theo thời gian thuỷ phân ........................................ 58
Bảng 3.11. Kết quả tối ƣu quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Flavourzyme .. 61
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của các biến độc lập đến DH ................................................. 61
Bảng 3.13. Bảng phân tích phƣơng sai cho mơ hình RSM của DH ........................... 62
Bảng 3.14. Kết quả xác định DH theo các phƣơng pháp thuỷ phân collagen khác
nhau ............................................................................................................................. 65
Bảng 3.15. Độ hoà tan của CH theo các phƣơng pháp thuỷ phân khác nhau ............. 68


x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACE

Angiotensin converting enzyme

CH

Collagen hydrolysate

DH

Degree of hydrolysis

E/S

Enzym/cơ chất

SSA

Sóng siêu âm


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Collagen là thành phần cấu tạo của mô liên kết nhƣ da, xƣơng, dây chằng, …
Do vậy, việc bổ sung collagen từ nguồn thực phẩm là rất quan trọng. Nguồn nguyên
liệu để sản xuất collagen hiện nay chủ yếu từ da động vật và các phụ phẩm cá nhƣ
vây, da, xƣơng,… Tuy nhiên, do collagen có phân tử lƣợng cao nên khó hấp thu.
Trong khi đó, collagen hydrolysate có phân tử lƣợng thấp, dễ hấp thu, và có hoạt
tính sinh học. Vì vậy, thuỷ phân collagen là việc cần thiết. Nhiều năm gần đây đã có
những thử nghiệm thuỷ phân collagen bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ: hoá học (dùng
acid hay kiềm), sinh học (enzym protease). Để tăng hiệu suất thuỷ phân collagen,
ngƣời ta đã kết hợp nhiều phƣơng pháp nhƣ kết hợp nhiều enzym protease, kết hợp
phƣơng pháp vật lý với enzym protease. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tơi
đã có hai cơng trình đƣợc cơng bố là ―Nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá tra
bằng enzym Neutrase có sự hỗ trợ của sóng siêu âm‖ của Lê Thị Diễm Ngọc và
―Nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme Neutrase kết hợp với
enzyme Flavourzyme‖ của Lê Thị Thanh Vân. Kết quả nghiên cứu cho thấy sóng
siêu âm có tác dụng tháo xoắn một phần đối với collagen và việc sử dụng enzyme
Neutrase để thuỷ phân collagen có tiền xử lý bằng sóng siêu âm cho sản phẩm có

phân tử lƣợng từ 8,5 ÷ 18 kDa. Sử dụng enzym Flavourzyme để tiếp tục phân giải
sản phẩm thủy phân bằng enzyme Neutrase cho sản phẩm có các phân đoạn có phân
tử lƣợng từ 6 ÷ 8,5 kDa. Điểm hạn chế của hai nghiên cứu này là sử dụng acid
acetic để trích ly collagen từ da cá tra ở 5oC trong 24 giờ. Về mặt kinh tế thì vừa tốn
hố chất và năng lƣợng, vừa tốn nhiều thời gian. Mặt khác acid acetic gây ảnh
hƣởng xấu đến mùi vị của sản phẩm thuỷ phân
Để tiếp nối những thành công và khắc phục những mặt hạn chế của hai cơng
trình nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tối ƣu hoá các điều kiện thuỷ
phân collagen – đƣợc trích ly từ da cá tra bằng nƣớc ở 40oC, với enzyme Neutrase
và Flavourzyme có sự hỗ trợ của sóng siêu âm. Từ đó, chúng tơi đề xuất quy trình
thuỷ phân tối ƣu thu nhận collagen hydrolysate có phân tử lƣợng dƣới 10 kDa, có
thể k vọng có hoạt tính sinh học để ứng dụng trong y học và thực phẩm chức năng.
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


2

CHƢƠNG 1:

TỔNG QUAN
1.1. DA CÁ TRA
Cá tra thuộc bộ cá nheo Siluriformes, họ cá tra Pangasiidae, giống cá tra
dầu Pangasianodon, loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus.
Cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lƣng xám đen, bụng hơi bạc,
miệng rộng, có hai đơi râu dài. Cá tra sống chủ yếu trong nƣớc ngọt, có thể sống
đƣợc ở vùng nƣớc hơi lợ (nồng độ muối 7 ÷ 10% ), có thể chịu đựng đƣợc nƣớc
phèn với pH >5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dƣới 15oc, nhƣng chịu nóng tới 39oc. [70]

Cá tra là mặt hàng xuất khẩu tiềm năng của Việt Nam, kim ngạch xuất khẩu
năm 2012 đạt 1,744 tỷ USD với thị trƣờng 142 quốc gia. [71]
Lƣợng phụ phẩm trong quá trình chế biến cá tra là rất lớn. Cứ tính ra khoảng
2,6 kg cá ngun liệu thì chỉ thu đƣợc khoảng 1 kg thành phẩm. Còn lại 1,6 kg là
phụ phẩm (đầu, xƣơng, da, …). Nhƣ vậy, cứ khoảng 1 tấn cá tra phile sẽ có khoảng
140 ÷ 160 kg da cá đƣợc thải ra.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của da cá tra nguyên liệu [1]
Thành phần

Hàm lƣợng (%)

% Chất khô

Ẩm

65,49±1,75

Protein tổng:

24,03±0,35

69,63±1,43

- Collagen

17,30±0,42

50,13±1,22

- Protein tạp

6,73±0,15

19,50±0,43

Lipid

8,69±0,58

25,18±1,68

Tro

0,11±0,01

0,32±0,03

Thành phần khác

1,68±0,02

4,87±0,06

Da cá tra có hàm lƣợng collagen khá cao 17,30% (50,13% chất khơ), vì vậy
có thể xem đó là một nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận collagen.
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ

3
1.2. COLLAGEN
1.2.1. Cấu tạo, thành phần hoá học [41]
Collagen là 1 protein cấu trúc ở động vật. Ở ngƣời, collagen chiếm 1/3 tổng
số protein, 3/4 khối lƣợng chất khô của da, là thành phần chính của mơ liên kết đảm
nhận sự kết dính giữa các mơ, sự đàn hồi của da, sụn và xƣơng. 28 loại collagen
khác nhau đƣợc tìm thấy ít nhất ở 46 chuỗi polypeptide ở động vật có xƣơng sống
và cũng có những phân tử protein khác chứa những phân đoạn collagen. [14]
Nét đặc trƣng của collagen là một mạng lƣới cấu trúc mà trong đó ba sợi
polypeptide song song xoắn trái, kết dính với nhau bởi liên kết hydro.
Năm 1940, Astbury và Bell [11] đã chỉ ra đƣợc phân tử collagen là 1 chuỗi
polypeptide kéo dài với những liên kết amin dạng cis. Đến năm 1951 thì Pauling và
Corey [51] khám phá ra cấu trúc thực sự của collagen là chuỗi xoắn α và phiến gấp
β. Trong dạng cấu trúc này, ba sợi polypeptide đan vào nhau theo hình xoắn ốc dính
nhau bởi liên kết hydro. Bên trong mỗi bộ ba acid amin, những liên kết hydro này
đính 4 trong số 6 nguyên tử khác chuỗi và 2 trong 3 liên kết peptide chuyển thành
dạng cis. Năm 1954, Ramachandran và Kartha [53] lại tìm ra cấu trúc của collagen
là xoắn ba. Đặc điểm của cấu trúc này là 3 chuỗi song song xoắn ốc phải, collagen
loại II xoắn trái với các liên kết peptide dạng trans và 2 liên kết hydro bên trong mỗi
bộ ba.
Mỗi sợi collagen gồm có hàng nghìn acid amin, chủ yếu gồm có glycine,
proline và hydroxyproline. Các acid amin sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy
với sự phân bố nhƣ sau:
Bảng 1.2. Sự phân bố các acid amin trong chuỗi polypeptide
Triplet

Tỷ lệ

Gly – X – X

Gly – X – Y
Gly – Y – X
Gly – Y – Y

0,44
0,20
0,27
0,09

Trong đó, Y là proline (28%) hay hydroxyproline (38%), X là các acid amin
khác. Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các acid amin và nó đƣợc phân bố một
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


4
cách đều đặn trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự
lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành
nên một đƣờng xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi.

n 1 1. Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen [13]
Khoảng 20 hoặc 21 acid amin khác nhau đƣợc biết là có mặt trong những
loại collagen khác nhau. Collagen có chứa glycine, proline, chứa một lƣợng lớn
hydroxyproline, trong khi thiếu tryptophan. Cysteine chỉ có trong collagen loại III,
IV và methionine là acid amin có lƣu hu nh chỉ có trong collagen loại I và II.
Khoảng 33% tổng lƣợng acid amin là glycine, khoảng 12% là proline, 11% là
alanine và hydroxyproline. 14 acid amin khác chiếm tỷ lệ nhỏ trong phần còn lại.
Hàm lƣợng của hydroxylysine, histidine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine, và

acid amin có chứa lƣu hu nh là khoảng 1% hoặc ít hơn ứng với mỗi acid amin. [12]
1.2.2. Phân loại [43, 58]
Hiện nay, 28 loại collagen đƣợc tìm thấy có thể phân thành 2 nhóm chính là
nhóm collagen có cấu trúc sợi và collagen khơng có cấu trúc sợi.
Collagen dạng sợi cơ: Collagen loại I, II và III là những collagen dạng sợi
điển hình. Collagen loại V và XI cũng là những collagen dạng sợi điển hình có cấu
trúc tƣơng đồng với collagen loại I - III. Nhìn chung các collagen dạng sợi có cấu
trúc phân tử tƣơng tự nhau. Chúng bao gồm một vùng cấu trúc xoắn ba với khoảng
1000 acid amin, một đầu C tận cùng và đầu N tận cùng không phải collagen. Với

HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


5
cấu trúc có trật tự so le 1/4, những collagen này tạo nên độ bền cơ học chủ yếu cho
cơ thể ở gân, da, thành mạch máu, dây thần kinh, ruột và thành tế bào.
Collagen không ở dạng sợi: Collagen loại IV, VI-X và XII-XIX không ở
dạng sợi cơ, chúng biểu hiện sự không đồng nhất về cấu trúc, phân bố ở các mô
bào, các tổ chức đại phân tử và các protein chức năng.
Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV. Collagen
loại I xuất hiện rộng rãi, chủ yếu trong những mô liên kết nhƣ da, xƣơng và gân.
Collagen loại II có trong các mô sụn. Collagen loại III phụ thuộc vào tuổi tác: da rất
trẻ có thể chứa đến 50%, nhƣng theo thời gian giảm xuống còn 5 đến 10%. Những
loại collagen khác đƣợc tìm thấy với lƣợng rất ít và phần lớn là trong các cơ quan
cụ thể.
1.2.3. Tính chất hoá lý [24, 45]
Collagen là một loại protein cấu trúc nên nó cũng có đầy đủ các tính chất hố

lý của một protein nhƣ sự biến tính, tính kỵ nƣớc, khả năng kết tủa thuận nghịch,
khơng thuận nghịch, tính hydrat hóa, tính chất của dung dịch keo... Ngồi ra, nó cịn
có một số tính chất khác đặc trƣng cho collagen nhƣ:


Khả năng trƣơng nở

Collagen khơng hịa tan trong nƣớc mà nó hút nƣớc để trƣơng nở, cứ 100 g
collagen khơ có thể hút đƣợc khoảng 200 g nƣớc, trong đó khoảng 70 g là nƣớc liên
kết và 20 g là liên kết vững chắc. Collagen kết hợp với nƣớc nở ra, độ dày tăng lên
chừng 25% nhƣng độ dài tăng lên khơng đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen
tăng lên 2 ÷ 3 lần.
Do nƣớc phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của
collagen làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 ÷ 4 lần. Khi nhiệt độ tăng
cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt
đầu đứt thành những mạch polypeptide tƣơng đối nhỏ. Khi nhiệt độ tăng lên trong
khoảng 60 ÷ 65oC, collagen hút nƣớc bị phân giải.
Sự gia tăng độ trƣơng nở dƣới tác động của acid là kết quả của sự giảm nồng
độ ion H+ tác động đến các anion acid, và tác động của bazơ gây ra bởi nồng độ
nhóm OH- giảm ảnh hƣởng đến các cation bazơ.
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


6
Muối trung tính ở nồng độ vừa phải (1M) ngăn cản sự trƣơng nở, nồng độ
cao nó sẽ hiệu quả hơn. Các anion nhìn chung làm gia tăng độ trƣơng nở hiệu quả
hơn các cation.



Khả năng tạo nhũ tƣơng

Là một protein khơng tan, collagen có thể có ít dấu hiệu cho thấy là một chất
nhũ hóa. Tuy nhiên, collagen có nguồn gốc từ da sống đƣợc xử lý và biến tính ở
mức độ khác nhau có thể là một chất nhũ hóa tốt hơn sữa gầy.


Khả năng hịa tan

Collagen tan trong glycerin, acid acetic, urê nhƣng không tan trong nƣớc
lạnh. Collagen cũng đã đƣợc phân chia thành bốn lớp trên cơ sở tính hịa tan trong
các dung dịch đệm khác nhau: tan trong muối trung tính, tan trong acid, tan trong
kiềm, và không tan trong kiềm.
Các thành phần tan trong acid thƣờng bao gồm hai nhóm là β2 hoặc β11 gồm
hai chuỗi α1, và hai là nhóm β1 hoặc β12 gồm một chuỗi α1 và một chuỗi α2 liên kết
bởi liên kết cộng hóa trị kiểu este. Collagen hịa tan trong muối gồm 90% các chuỗi
α và 10% các chuỗi dạng β, trong khi collagen hòa tan trong acid là khoảng 10%
chuỗi α và 90% ở dạng β. Chỉ có 50% nhóm ion hồ tan trong acid của collagen hịa
tan trong muối. Các nhóm cịn lại có thể tham gia vào mối liên kết chéo. Các thành
phần tan trong kiềm và khơng hịa tan trong kiềm đại diện cho collagen trƣởng
thành.
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng [21, 35, 45, 66]


Ảnh hƣởng của acid và kiềm


Ảnh hƣởng của acid

Acid acetic có thể làm collagen trƣơng nở 50% và tăng khả năng peptid hóa
collagen hơn acid HCl ở pH 2,0.
Sự ảnh hƣởng của HCl tới collagen: một số cation H+ kết hợp với anion –
COO-. Quá trình này tiếp tục cho đến khi tất cả nhóm –COO- đã đƣợc phóng điện
và tất cả nhóm cation đều ở dạng tự do. Vì vậy, pha nƣớc bên trong cấu trúc
collagen sẽ chứa nhiều Cl- hơn H+. Sự phân phối ion khác nhau giữa hai pha tạo ra

HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


7
sự khác nhau về áp suất thẩm thấu và khả năng tích điện. Để tạo trạng thái cân bằng
nồng độ ion giữa hai pha, nƣớc đi vào các phân tử collagen và gây ra sự trƣơng nở.


Ảnh hƣởng của kiềm

Trong trƣờng hợp bazơ mạnh (nhƣ NaOH) khả năng trƣơng nở của collagen
gia tăng, đặc biệt là các hydroxide của ion kim loại hóa trị II ở pH > 10, ở pH này
có sự chuyển hóa khơng thuận nghịch thành các ion. Sự phân hủy nhóm hydroxy
của các acid amin (serin và threonine) và sự thủy phân của liên kết keto - imide giữa
proline và hydroxyproline xảy ra trong suốt quá trình xử lý collagen bằng kiềm ở
pH 12 ÷ 14.
Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, collagen phân giải biến thành
gelatine, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành nhƣ sau:



Ảnh hƣởng của nhiệt độ

Nhiệt độ cao là nguyên nhân làm cho một số protein trong collagen bị biến
tính. Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh,
làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tƣơng đối nhỏ.
Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 ÷ 65C, collagen hút nƣớc bị phân giải và nếu
tiếp tục đun collagen sẽ tiếp tục thủy phân thành gelatin. Sự ổn định nhiệt đƣợc xem
là tỷ lệ thuận với tổng lƣợng proline và hydroxyproline, lƣợng proline và
hydroxyproline càng nhiều thì collagen càng bền nhiệt.
Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chƣa xử lý tƣơng đối cao.
Khi ngun liệu đã khử hết chất khống, thì nhiệt độ phân giải sẽ giảm xuống.


Ảnh hƣởng của các chất khác

Collagen trong dung dịch muối trung tính cùng với gốc –COOH và –NH2 tạo
thành các hợp chất muối. Tác dụng phân giải collagen của NaCl so với Na2SO4
mạnh hơn (độ điện ly của NaCl lớn hơn).

HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


8
Collagen bị thuỷ phân chậm bởi trypsin và pepsin, trong khi đó gelatin dễ bị
phân huỷ hơn. Một số thực nghiệm cho thấy trypsin có thể phân giải đƣợc collagen

đã xử lý (với nhiệt, ngâm acid, kiềm, ...) ở nhiệt độ 37oC, pH = 8,1 ÷ 8,2.
1.2.5. Vai trị, chức năng của collagen [72, 73]
Collagen loại I ÷ V chiếm tới 99% collagen đƣợc tìm thấy trong cơ thể:
-

Loại I: tìm thấy ở xƣơng, gân, dây chằng và da

-

Loại II: có ở sụn và mắt

-

Loại III: có ở gan, phổi, động mạch

-

Loại IV: ở thận và một số cơ quan nội bào

-

Loại V: có ở vỏ tế bào, tóc và nhau thai.

Collagen có 2 chức năng cơ bản. Một mặt, collagen kết hợp với eslatin và
glycoprotein, thực hiện vai trò cố kết tế bào và các cơ quan. Mặt khác, collagen
hydrat hoá tế bào và các cơ quan, tăng độ bền chắc, độ đàn hồi và tính linh hoạt.
Một số chức năng của collagen trong cơ thể:
- Da: một trong những chức năng đáng nói của collagen là sự chống đỡ cho
da. Collagen chiếm tới gần 80% khối lƣợng chất khô của da, đƣợc phân bổ chủ yếu
ở lớp hạ bì của da. Collagen tạo cấu trúc da, liên kết với protein khác, eslatin, tạo

cho da sự linh hoạt nhƣ căng ra và đàn hồi. Collagen có tác dụng kết nối các tế bào,
kích thích q trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi của da. Sự suy giảm về chất lƣợng
và số lƣợng collagen sẽ dẫn đến hậu quả ―lão hoá‖ của cơ thể, mà sự thay đổi trên
làn da, trên khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt
đầu từ các đƣờng nhăn mảnh trên khoé mắt, khoé miệng, lâu dần thành nếp nhăn
sâu, các đƣờng nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ.
- Xƣơng: xƣơng đƣợc tạo nên từ sự kết hợp của collagen và một khoáng chất
là hydroxyapatite (Ca5(PO4)3(OH)), tạo nên sự linh hoạt và độ mạnh cho xƣơng.
Theo nghiên cứu của Trung tâm thí nghiệm Radiocarbon, trƣờng đại học Qaikato ở
New Zealand, khoảng 30% xƣơng đƣợc tạo ra bởi các chất hữu cơ, trong đó 95% là
collagen.

HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


9
- Mạch máu: collagen cũng giúp tạo nên các thành tĩnh mạch, động mạch và
mao mạch ở ngƣời. Điều này tạo nên độ mạnh, cấu trúc và sự linh hoạt, tất cả
những tính chất này cần cho sự vận chuyển máu đến các cơ quan một cách hiệu quả.
- Collagen giúp vết thƣơng nhanh lành sẹo: sẹo đƣợc hình thành do liên kết
collagen và elastin của da bị gãy và tổn thƣơng. Collagen có tác động tích cực để
sản sinh ra các tế bào da mới, giúp làn da hồi sinh nhanh chóng nên các vết thâm
cũng sẽ bị làm mờ dần.
- Tác dụng của collagen với sụn: collagen chiếm 50% trong cơ cấu thành
phần sụn. Thiếu collagen làm cho ma sát giữa các khớp xƣơng lớn hơn, gây ra các
biến dạng ở xƣơng và sụn. Việc bổ sung collagen giúp ngăn ngừa và giảm thiểu các
bệnh liên quan đến khớp xƣơng. Ngồi ra, collagen cịn giúp phịng chống các bệnh

nhƣ đau thắt lƣng, thoát vị đĩa đệm và một số bệnh về xƣơng, sụn khác.
- Tác dụng collagen với mắt: collagen tồn tại nhiều trong giác mạc và thuỷ
tinh thể của mắt dƣới dạng kết tinh. Thiếu collagen làm cho giác mạc hoạt động
kém, gây ảnh hƣởng đến thị lực của mắt và làm cho thủy tinh thể mờ đi do amino bị
lão hóa, đây chính là ngun nhân gây ra bệnh đục thủy tinh thể mắt.
- Tác dụng của collagen với nội tạng: collagen cũng tồn tại trong nội tạng cơ
thể ngƣời và có tác dụng giữ cho các bộ phận nội tạng luôn khỏe mạnh.
- Tác dụng của collagen với răng: collagen có nhiều trong lợi răng và đƣợc
coi là tố chất đề kháng các bệnh về răng miệng nhƣ viêm nha chu.
- Tác dụng của collagen với tóc, móng chân – tay: collagen có trong chất
sừng ở tóc, móng chân, móng tay và có tác dụng cung cấp chất dinh dƣỡng hỗ trợ
hoạt động của chất sừng này.
1.3. COLLAGEN HYDROLYSATE
1.3.1. Đặc điểm, thành phần hoá học của collagen hydrolysate
Collagen hydrolysate (CH) là một hỗn hợp các peptide có phân tử lƣợng thấp
và các acid amin tự do thu đƣợc từ quá trình thuỷ phân collagen bằng tác nhân hoá
học hay sinh học.
CH là collagen bị thủy phân từ xƣơng, gân hoặc da của các loại động vật trên
cạn cũng nhƣ các loại cá. Khi thủy phân thì các collagen mạch dài cấu trúc bậc 3 sẽ
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


10
bị phân giải thành các peptide nhỏ có cấu trúc đơn giản hơn. Các peptide khơng có
độ dài thích hợp để có các cầu nối hydro nhằm ổn định cấu trúc xoắn nên tính chất
vật lý cũng nhƣ hóa học có khác biệt so với collagen ban đầu. Ví dụ nhƣ tính tan
trong nƣớc của CH tăng lên rõ rệt so với collagen ban đầu.

CH là kết quả của quá trình thủy phân nhờ các enzyme thủy phân protein nhƣ
Neutrase, Flavourzyme, Alcalase, Corolase,.... chúng thủy phân collagen có khối
lƣợng khoảng 300 kDa xuống cịn khoảng 2 ÷ 5 kDa. Có tài liệu nói rằng phân tử
lƣợng của CH từ 0,3 ÷ 15 kDa có thể đƣợc dùng đƣợc trong thực phẩm, dƣợc
phẩm.
CH có thành phần acid amin tƣơng tự nhƣ collagen, có khoảng 20 acid amin,
trong đó glycine, proline và hydroxyproline chiếm khoảng 50% tổng số.
CH chứa proline và glycine nhiều hơn gấp 3 lần so với các loại protein khác.
Những loại acid amin này cần thiết cho sự tổng hợp collagen và ảnh hƣởng đến sự
ổn định của cấu trúc collagen trong sụn.
Fish protein hydrolysate: Protein thuỷ phân từ cá (FPH) có độ hồ tan tốt
trong các dung dịch ion và có pH thay đổi trong khoảng rộng và nhiệt độ cao mà
không tạo kết tủa (Skanderby, 1994). FPH có các tính chất chức năng tốt nhƣ: khả
năng giữ nƣớc, tạo gel, whipping, nhũ hoá khi cho vào thực phẩm (Kristinsson,
2007). FPH có khả năng tạo bọt và nhũ hoá tốt nên đƣợc sử dụng làm chất tạo nhũ
và chất ổn định hệ nhũ tƣơng. Vì kích cỡ của các peptide rất quan trọng đối với hoạt
tính bề mặt của FPH, nên mức độ thuỷ phân là quan trọng. [49]
1.3.2. Hoạt tính sinh học của collagen hydrolysate


Tính kháng khuẩn [22]

Gómez-Guillén và cộng sự (2010) cho biết hoạt tính kháng khuẩn của các
phân đoạn peptide từ da cá ngừ và mực ống có phân tử lƣợng từ 1 ÷ 10 kDa và dƣới
1 kDa. Các sản phẩm thuỷ phân đƣợc thử nghiệm bằng khuếch tán agar chống lại 18
chủng vi khuẩn (cả Gram dƣơng lẫn Gram âm), Lactobacillus acidophilus và
Bifidobacterium animalis subp. Lactis, Shewanella putrefaciens và Photobacterium
phosphoreum là những loài dễ bị tổn hại nhất. Việc giảm phân tử lƣợng của các
phân đoạn peptide làm cho các acid amin tiếp xúc và tích điện tốt hơn với màng tế
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG

MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


11
bào vi khuẩn. Các dipeptide đƣợc tổng hợp từ Nα-lauroyl và các acid amin khác từ
CH, có tính kháng khuẩn cao hơn hẳn đối với cả vi khuẩn G(+) và G(-), là những
cation.
Mối quan hệ giữa tính chất của peptide và hoạt tính chống oxi hố chƣa đƣợc
làm rõ. Một vài yếu tố nhƣ thành phần acid amin, trình tự sắp xếp acid amin, khối
lƣợng phân tử và loài vi khuẩn cần đƣợc đƣa vào nghiên cứu (Di Bernardini và
cộng sự, 2011). Theo Wieprecht và cộng sự (1997), tính kỵ nƣớc của acid amin
giúp các peptide dễ tấn công màng tế bào vi khuẩn, khi các peptide tích điện dƣơng
bắt đầu tƣơng tác với bề mặt vi khuẩn tích điện âm. Mặt khác, sự khác nhau trong
thành phần màng tế bào cũng liên quan đến kiểu hoạt động và nét đặc trƣng của các
hợp chất kháng khuẩn (Floris và cộng sự, 2003). Patrzykat và Douglas (2005)
chứng minh mức độ liên kết lipopolysaccharide (LPS) vừa không trực tiếp, vừa
không tỷ lệ nghịch với hoạt tính peptide, vì sau khi phá vỡ màng ngồi, hoạt tính
peptide sẽ phụ thuộc vào khả năng tƣơng tác với màng tế bào chất vi khuẩn. Do đó,
cả trình tự chuỗi peptide, nồng độ peptide và thành phần màng tế bào vi khuẩn sẽ
ảnh hƣởng đến kiểu tƣơng tác.
Bảng 1.3. Các peptide có hoạt tính kháng khuẩn [37]
Loài cá

Bộ phận

Tên peptide

Cá croaker cỡ lớn

Đầu và quả cật

Hepadin

Cá vền đỏ

Mang cá

Chrysophsin-1,2,3

Cá chạch

Toàn bộ

Misgurin

Cá trê

Thớ thịt

Parasin 1

Cá tráo

Chất nhầy da cá

Pleurocidin

Cá trầm sọc vằn

Da và mang

Moronecidin



Hoạt tính chống oxi hố [22, 34]

Marcuse (1960) lần đầu tiên cơng bố về tác dụng chống oxi hố của peptide;
có nhiều nghiên cứu khảo sát tính chống oxi hố của các sản phẩm thuỷ phân và
peptide từ nguồn thực vật và động vật nhƣ cám gạo, protein hoa hƣớng dƣơng,
protein lá cây đinh lăng, đạm sữa casein, protein lòng đỏ trứng, protein thịt cá thu,
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ


12
gelatin da mực ống, gelatin da cá, gelatin da bò, xƣơng cá ngừ,… Một lƣợng lớn
phụ phẩm từ ngành chế biến cá đƣợc sử dụng trong sản xuất các hydrolysate và
peptide chống oxi hoá là từ da cá, nhƣ cá tuyết Alaska, cá tuyết hoki, cá bơn, bạch
tuột, mực ống Jumbo.
Cơ chế chống oxi hoá của peptide chƣa đƣợc hiểu rõ ràng, nhƣng cũng có vài
nghiên cứu cho rằng chúng là những chất ức chế các peroxide béo, khử các gốc tự
do và loại trừ các ion kim loại chuyển tiếp. Những peptide chống oxi hoá thu đƣợc
từ sự thuỷ phân collagen và gelatin có thể bảo vệ tế bào sống chống lại sự oxi hoá
các gốc tự do. Kim và cộng sự (2001) báo cáo rằng các peptide đƣợc phân tách từ
da cá tuyết có thể bảo vệ các tế bào gan ở chuột khỏi sự tổn thƣơng do bị oxi hoá

bởi hợp chất hydroperoxide hữu cơ t-BHP. Theo nghiên cứu khác, hai peptide tinh
chế từ da mực có tác dụng làm tăng sức sống cho tế bào tu theo liều lƣợng sử dụng
vì khả năng chống lại độc tính của t-BHP đƣợc thử nghiệm trên nguyên bào ở phổi
ngƣời (Mendis và cộng sự, 2005). Hơn nữa, kết quả từ một nghiên cứu khác cho
thấy peptide đƣợc phân tách từ da cá hoki có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác
của các enzym chống oxi hố nhƣ glutathione peroxidase, catalase và superoxide
dismutase trong các tế bào ung thƣ gan ở ngƣời.
Hoạt tính chống oxi hố của peptide có liên quan đến thành phần, cấu trúc và
tính kỵ nƣớc của acid amin. Thành phần của các collagen thuỷ phân tƣơng tự nhƣ
protein gốc, giàu các acid amin nhƣ Gly, Ala, Pro, Hyp, Glx và Asx, nhƣng nghèo
Met, Cys, His và Tyr. Theo nghiên cứu riêng từng acid amin của tác giả Dávalos và
cộng sự (2004) thì Trp, Tyr và Met có hoạt tính chống oxi hố cao nhất, sau đó là
đến Cys, His và Phe. Những acid amin khác khơng có hoạt tính chống oxi hố. Tuy
nhiên, nhiều peptide đƣợc mơ tả là có hoạt tính chống oxi hố cao mặc dù khơng
chứa bất k acid amin nào đóng góp vào chức năng này. Kim và cộng sự (2001) đã
phân tách hai peptide chứa 13 và 16 acid amin từ da cá tuyết Alaska, cả hai peptide
này đều chứa Gly ở đầu C và chuỗi Gly-Pro-Hyp lặp đi lặp lại. Li và cộng sự (2007)
xác định peptide Gln-Gly-Ala-Arg từ CH heo có hoạt tính chống oxi hố. Peptide
Asn-Gly-Pro-Leu-Gln-Ala-Gly-Gln-Pro-Gly-Glu-Arg đƣợc chiết xuất từ gelatin da
mực ống có khả năng bẩy gốc tự do (Mendis và cộng sự, 2005). Hơn nữa, hoạt tính
HVTH: LÊ THỊ KIM HỒNG
MSHV: 11110199

CBHD: TS. PHAN NGỌC HOÀ