ỨNG DỤNG kỹ THUẬT LAI tại CHỖ HUỲNH QUANG để PHÁT HIỆN sớm một số bất THƯỜNG NHIỄM sắc THỂ ppt _ SINH HỌC (y dược)

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM
MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ

Bài giảng pptx các mơn chun ngành Y dược
hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”;
/>use_id=7046916


• DTBS: 2,7% tổng số đẻ
TVDT &
CĐTS
• Ng/nhân: ĐB gen, ĐB NST...
• Thu thập mẫu: TB ối,
ối tua rau, máu cuống rốn,
sinh thiết thai, TB thai tự do trong máu mẹ...
• KT phát hiện:
– DT tế bào: phân tích NST  tiêu chuẩn C§RLNST
– DT phân tử
– DT tế bào – phân tử


CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN

THU THẬP MẪU:
- Chọc ối
- Sinh thiết rau
- Máu cuống rốn
- Soi phôi thai
- ADN tự do máu mẹ

DTTB
- phân tích NST băng G

Tiêu chuẩn phát
hiện ĐB NST

DTPT: PCR, Sequencing,
Southerblot, Northerblot...

phát hiện
BĐ gen

DTTB – PT: FISH

Phát hiện ĐB
NST: SL, RL nhỏ


Các loại ADN dị

ADN dß ph?n
tâm

ADN dß
tồnb? NST

ADN dß đ?u
mút

ADN dß

đ?c
hi?u
nhánh NST

ADN dß t?
ch?c h?ch
nhân

ADN dß
đ?c

ADN dß l?pđ?c
hi?utrên b
ăng R

hi?ulocus


TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KT FISH
 THẾ GIỚI

 VIỆT NAM

• 1969 bắt đầu,
1980 đầu dò huỳnh quang
Thập kỷ 90 ứng dụng rộng rãi
• Phát hiện trước sinh các RL
NST:HC Down, Edward,
Patau, Turner...
• Mất đoạn nhỏ <3Mb

• RL đầu mút & gần đầu mút

• 2003 B.V.M.Hồng-T/p
HCM: áp dụng CĐTS
• 2004 BM YSH – DT
ĐHYHN: hồn chỉnh,
CĐTS HC Down
• 2007 viện HH-TM: CĐ
leceumia
DTTB khó hoặc
khơng thể phát hiện


1

Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên
nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y

2

Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trước
sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y

3

Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối
loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST X

Mục tiêu 1

Mục tiêu 2

73
thai
ph

Đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y:
+ 3 mẫu ối: 15-18w
+ 3 mẫu ối: 28-32w

 Siêu âm (+):

Mơc tiªu 3

Cần KQ FISH 
đối chiếu:
+ 2 bệnh nhân:
RLCT NST 21, X
+ 1 mu i RLCT
NST 13

Nang BH
Đầu dß ADN
TelXp/Yp &
TelXq/Yq:
3 mẫu ối: 15-18w

Dày da gáy
Dị dạng chi,
nội quan
Triple test (+) hoc (-)

Cn KQ FISH
chẩn đoán:
+ 2 bnh nhân:
NST marker
+ 1 trẻ nam 46,XX


QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
Lấy mẫu – làm tiêu bản
nhân TB gian kỳ

Lấy mẫu - Nuôi cấy – Làm
tiêu bản NST kỳ giữa

Biến tính ADN

Lai ADN dị và ADN đích

Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang
(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)


QUY TRèNH THC HIN KT FISH (Vysis)

1. Làm tiêu bản TB èi ë
gian kú hoặc ni cấy
làm tiªu bản NST k
gia
2. Biến tính ADN dò và
ADN đích của mu XN




3. Lai ADN dò với ADN
đích của thai (20-24h)
4. Nhum mu lai bng
thuc nhum huỳnh
quang
5. Phân tích dới KHV
huỳnh quang tìm tÝn
hiÖu lai





Kết quả
sau 2-3 ngày


Các đầu dò ADN và phin lọc tơng ứng
Phin lọc
Aqua

Phin lọc
green

Đầu dò ADN
13, 18, 21, X,
Y
Phin lọc
orange
Phin lọc
orange

Đầu dò ADN
Tel Xp/Yp

(TTAGGG)n
Telomere
ADN
Đầu dò ADN TelXp

Phin lọc green

Phin lọc
green


Bảng đánh giá tín hiệu lai (Vysis)
1

Khụng ỏnh giỏ vỡ hai

tế bào chồng lên nhau

2

Đếm là 2 tín hiệu lai,
1 tín hiệu bị khuếch tán

3

Khơng đánh giá vì
các
tế bào chồng lên
nhau

4

Đếm là 2 tín hiệu
lai,
1 tín hiệu bị chia
nhỏ

5

Đếm là 3 tín hiệu
lai

6

Đếm là 4 tín hiệu
lai

7

Đếm là 3 tín hiệu
lai,


SƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTS
LµM Hå S¥
Thai phơ  35 ti
TS sinh con DT

XN triple test
AFP, HCG, uE3

XĐ thai phụ nguy cơ cao
sinh con bất thờng NST
TV di truyền Sản khoa
Chọc ối CĐ trớc sinh
XN: DTTB – ph©n tÝch NST
KT FISH
T vÊn DT – Theo dõi
QT mang thai, sau sinh

Siêu âm


1.Hoµn chØnh kü tht FISH
2.øng dơng kü tht fish trong chẩn đoán
trớc sinh một số bất thờng nst

3.ứng dụng kỹ thuật fish trong chẩn đoán
một số rối loạn nst


1. Hoµn chØnh kü tht FISH
Bảng 1. Kết quả hồn chỉnh kỹ thuật FISH với
đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên nhân gian kỳ
Mẫ
u

TuÇn
thai

1

KẾT QUẢ FISH (sè tÝn hiƯu lai)

KÕt qu¶
DTTB

NST
13

NST
18

NST
21

15

2

2

2

2

0

46, XX

2

18

2

2

2

1

1

46,XY

3

18

2

2

2

1

1

46,XY

4

28

2

3

2

2

0

47, XX +18

5

30

2

2

3

1

1

47,XY,+21

6

32

2

2

2

1

1

46, XY

NST X NST Y


HỒN CHỈNH CÁC NỘI DUNG
• Thể tích dịch ối:
– Thai 15-18w: 5ml
– Thai 28-32w: 10ml

• Xử lý nhân TB
– Loại trừ máu mẹ (nếu lẫn)
– Trypsin 0,25% trong 15 – 25’ tuỳ thuộc tuần thai

• Biến tính ADN: 730C x 3’
• Lai ADN dị và ADN đích:
– thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm
– Thời gian lai 20-22h

• Phân tích tín hiệu lai
– Tín hiệu lai thật: phát sóng ở bước sóng đặc hiệu & kích thước ổn
định
– Tín hiệu lai giả: phát sáng dưới nhiều phin lọc, kích thước khơng ổn
định


Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nam bình thường
NST 13

NST 21

NST 21
NST 13

Đầu dị ADN 13, 21

NST 18
NST Y
NST X

NST 18

Đầu dò ADN 18, X, Y


Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nữ bình thường

NST 13

NST 21

NST 13
NST 21

Đầu dị ADN 13, 21

Tríc sinh

NST 18
NST X

NST 18

NST X

Đầu dị ADN 18, X, Y


Bảng 2. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH
với các đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và
Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữa
KÕt quả FISH (sè tÝn hiệu lai)
ầu dò 13, 18, 21, X, Y

Ký
hiệ
u
mẫ
u

Tuầ
n
thai

1

ầu dò
Tel Xp/Yp

ầu dò
Tel Xq/Yq

NS
TX

NS
TY

Xp

Yp

Xq

Yq

Kết
qu di
truyền
tế bào

2

2

0

2

0

2

0

46, XX

2

2

1

1

1

1

1

1

46, XY

2

2

1

1

1

1

1

1

46, XY

NS
T
13

NS
T
18

15

2

2

2

15

2

3

18

2

NS
T
21


HỒN CHỈNH CÁC NỘI DUNG
• Thu hoạch TB kỳ giữa: colcemid, KCl/huyÕt
thanh, carnoy...
• Phun tiêu bản: lam lạnh kèm kéo dài khử nước bằng
cồn 70%/2’, 80%/2’, 100%/2’.
• Biến tính ADN: 730C x 5’
• Lai ADN dị và ADN đích:
– thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm
– Thời gian lai 420C: 20-22h (13, 18, 21, X, Y)
22-24h (TelXp/Yp; TelXq/Yq)

• Phân tích tín hiệu lai: tín hiệu lai nằm trên NST 
đánh giá dễ hơn nhân gian kỳ

TelXp

TelYq

TelYp

TelXq

Đầu dị TelXp/Yp trên
NST kỳ giữa của thai
nam bình thường

Đầu dị Telq/Yq trên NST
kỳ giữa của thai nam
bình thường


2. ứng dụng kỹ thuật fish trong chẩn đoán trớc
sinh mét sè bÊt thêng nst
Kết quả chẩn đoán trước sinh một số bất thường NST


Kết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng Turner
Đối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong hội chng Turner

Số l
ợng

FISH

(số tín hiệu lai trên NST)
Kết qu siêu âm

Di
truyền
tế bào

13

18

21

X

Y

NBH đơn thuần

2

2

2

1

0

45, X

19

NBH, phù toàn thân,
dấu hiệu bất thờng
khác

2

2

2

1

0

45, X

1

Không có NBH, chân
tay ngắn, TDMP

2

2

2

1

0

45, X

mẫu

4


Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ
và karyotyp của thai hội chứng Turner

NST
X
NST 18
NST
18


Sơ đồ đối chiếu kết quả siêu âm
nang bạch huyết với các bất thường NST