Thực hành công nghệ vi sinh
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (803.52 KB, 69 trang )
<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1></div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>
<b>THS. NGUYỄN THỊ THU HẰNG </b>
<b>THỰC HÀNH </b>
<b>CÔNG NGHỆ VI SINH </b>
</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3></div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>
<b>MỤC LỤC </b>
MỤC LỤC ... i
MỞ ĐẦU ... 1
GIỚI THIỆU MÔN HỌC ... 2
<i><b>Bài 1. NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ...5 </b></i>
1.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 5
1.2. Kiến thức lý thuyết ... 5
1.3. Nội dung thực hành ... 6
<i>1.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 6 </i>
<i>1.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 6 </i>
1.4. Kiểm tra, đánh giá ... 10
<b>Bài 2. ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƢƠNG NỞ BỘT MÌ ... 13 </b>
2.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 13
2.2. Kiến thức lý thuyết ... 13
2.3. Nội dung thực hành ... 14
<i>2.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 14 </i>
<i>2.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 14 </i>
2.4. Kiểm tra, đánh giá ... 16
<b>Bài 3. QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL ... 17 </b>
3.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 17
3.2. Kiến thức lý thuyết ... 17
3.3. Nội dung thực hành ... 18
<i>3.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 18 </i>
<i>3.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 19 </i>
3.4. Kiểm tra, đánh giá ... 25
<b>Bài 4. QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC ... 28 </b>
4.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 28
</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>
4.3. Nội dung thực hành ... 29
<i>4.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 29 </i>
<i>4.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 30 </i>
4.4. Kiểm tra, đánh giá ... 35
<b>Bài 5. QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETIC ... 38 </b>
5.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 38
5.2. Kiến thức lý thuyết ... 38
5.3. Nội dung thực hành ... 39
<i>5.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 39 </i>
<i>5.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 39 </i>
5.4. Kiểm tra, đánh giá ... 40
<b>Bài 6. QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI CELLULOSE NHỜ VI SINH VẬT ... 42 </b>
6.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 42
6.2. Kiến thức lý thuyết ... 42
6.3. Nội dung thực hành ... 42
<i>6.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 42 </i>
<i>6.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 43 </i>
6.4. Kiểm tra, đánh giá ... 43
<b>Bài 7. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT ... 45 </b>
7.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 45
7.2. Kiến thức lý thuyết ... 45
7.3. Nội dung thực hành ... 45
<i>7.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 45 </i>
<i>7.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 46 </i>
7.4. Kiểm tra, đánh giá ... 47
</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>
<i>8.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 48 </i>
<i>8.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 50 </i>
8.4. Kiểm tra, đánh giá ... 51
<b>Bài 9. ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ VI SINH TRONG Q TRÌNH</b> <b>PHÂN HỦY </b>
<b>RÁC HỮU CƠ ... 53 </b>
9.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 53
9.2. Kiến thức lý thuyết ... 53
9.3. Nội dung thực hành ... 54
<i>9.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 54 </i>
<i>9.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 54 </i>
9.4. Kiểm tra, đánh giá ... 54
<i><b>Bài 10 THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC TỪ VI KHUẨN BACILLUS </b></i>
<i><b>THURINGIENSIS ... 56 </b></i>
10.1. Mục tiêu và yêu cầu ... 56
10.2. Kiến thức lý thuyết ... 56
10.3. Nội dung thực hành ... 57
<i>10.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ... 57 </i>
<i>10.3.2. Thực hiện thí nghiệm ... 58 </i>
10.4. Kiểm tra, đánh giá ... 60
</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7></div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>
<b>MỞ ĐẦU </b>
Bài giảng “Thực hành Công nghệ Vi sinh” là tài liệu học tập chính cho sinh
viên năm thứ ba ngành Công nghệ sinh học, là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành
Thú y và các ngành học liên quan của Trường Đại học Lâm nghiệp.
Bài giảng gồm 10 bài thực hành, được viết theo trình tự với các mục: Mục tiêu
và yêu cầu, kiến thức lý thuyết, nội dung thực hành (trình bày chi tiết các bước trong
thí nghiệm thực hành), kiểm tra và đánh giá. Các bài thực hành nhằm minh họa,
chứng minh lý thuyết của các quá trình: Lên men thu nhận sinh khối vi sinh vật, lên
men nhờ vi sinh vật tạo sản phẩm trong công nghệ thực phẩm, ứng dụng công nghệ
vi sinh trong giải quyết ô nhiễm môi trường... Do vậy, thông qua thực hiện các bài
thực hành, người học nắm vững, củng cố nhận thức, hiểu sâu sắc vai trò và tầm quan
trọng của vi sinh vật trong các quá trình chuyển hóa vật chất, từ đó biết cách định
hướng và ứng dụng vi sinh vật trong quá trình tác nghiệp sau khi ra trường.
Trong quá trình biên soạn, mặc dù có nhiều cố gắng, tuy nhiên chắc chắn khơng
tránh khỏi có những thiếu sót. Tác giả mong nhận được ý kiến đóng góp của người đọc.
</div>
<span class='text_page_counter'>(9)</span><div class='page_container' data-page=9></div>
<span class='text_page_counter'>(10)</span><div class='page_container' data-page=10>
<b>GIỚI THIỆU MÔN HỌC </b>
<b>1. Mục tiêu mơn học </b>
Sau khi hồn tất mơn học Thực hành Công nghệ vi sinh, sinh viên:
<b>- Biết vận dụng kiến thức, kỹ thuật về vi sinh vật vào các lĩnh vực: công nghiệp </b>
thực phẩm (cải thiện chất lượng, chế biến, bảo quản thực phẩm), nông nghiệp, chăn
nuôi, bảo vệ môi trường, bảo vệ thực vật…;
<b>- Biết kết hợp giữa lý thuyết, thực hành, viết báo cáo, nhận xét, cách tra cứu tài </b>
liệu và làm ra được một số sản phẩm lên men từ chủng vi sinh vật thuần khiết hoặc vi
sinh vật phân bố trong tự nhiên.
<b>2. Yêu cầu của môn học </b>
<i> Kiến thức căn bản cần biết trước </i>
- Lý thuyết về Vi sinh vật học.
<b>- Lý thuyết về Vi sinh vật ứng dụng. </b>
<b>- Lý thuyết về Q trình và thiết bị cơng nghệ </b>
<i> Sau khi kết thúc thực hành, sinh viên nắm vững kiến thức lý thuyết và thực </i>
<i>hiện thành thạo, đúng kỹ thuật </i>
<b>- Cách làm môi trường, cấy và giữ giống vi sinh vật. </b>
<b>- Phân lập và tinh sạch vi sinh vật. </b>
<b>- Sàng lọc chủng vi sinh vật có ích (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc), có hoạt tính </b>
sinh học để ứng dụng trong cơng nghiệp.
<b>- Phân tích và đánh giá kết quả của các quá trình lên men do vi sinh vật. </b>
<b>3. Các bài thực hành </b>
<i>Bài 1. Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae. </i>
Bài 2. Ứng dụng nấm men để làm trương nở bột mì.
Bài 3. Quá trình lên men ethanol.
Bài 4. Quá trình lên men lactic.
Bài 5. Quá trình lên men acetic.
</div>
<span class='text_page_counter'>(11)</span><div class='page_container' data-page=11>
Bài 7. Xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật.
Bài 8. Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật.
Bài 9. Ứng dụng công nghệ vi sinh trong quá trình phân hủy rác hữu cơ.
<i>Bài 10. Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis. </i>
<b>4. Cách thức tổ chức thực hiện </b>
<b>- Trước khi đi thực hành, sinh viên phải đọc, nắm vững kiến thức lý thuyết và </b>
nội dung của bài thực hành.
<b>- Sinh viên thực hiện thao tác thực hành dưới sự hướng dẫn trực tiếp của giảng </b>
viên/trợ giảng.
<b>- Sinh viên ghi các kết quả thực hành, xử lý số liệu và viết báo cáo kết quả theo </b>
hướng dẫn của giảng viên/trợ giảng.
<b>5. Cách thức kiểm tra, đánh giá </b>
<b>- Điểm chuyên cần: 20%. </b>
<b>- Kết quả thực hiện và báo cáo kết quả thí nghiệm của từng bài thực hành: </b>
40%.
</div>
<span class='text_page_counter'>(12)</span><div class='page_container' data-page=12>
<b>Bài 1 </b>
<i><b>NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN SACCHAROMYCES </b><b>CEREVISIAE </b></i>
<b>1.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Sinh viên hiểu rõ nguyên lý của quá trình lên men sản xuất chủng, giống vi sinh
vật đảm bảo chất lượng và có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm; làm nguồn
dinh dưỡng bổ sung cho con người, vật nuôi, cây trồng…
Yêu cầu
<b>- Củng cố và khắc sâu các kiến thức: </b>
+ Sinh khối vi sinh vật chứa hàm lượng rất cao protein;
+ Công việc sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể thực hiện tốt trong diện tích
nhỏ, sản phẩm dễ thu hoạch với hiệu suất thu hồi cao, việc sản xuất không phụ thuộc
thời tiết, khí hậu và sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm...
<b>- Thực hành và rèn luyện các kỹ năng: </b>
+ Chuẩn bị môi trường lên men sản xuất sinh khối nấm men;
+ Chuẩn bị giống nấm men, hoạt hóa giống, cấy giống vào mơi trường lên
men, thực hiện quá trình lên men nhân giống nấm men ở qui mơ phịng thí nghiệm;
+ Thu nhận sinh khối nấm men;
+ Xác định hiệu suất của quá trình lên men.
<b>1.2. Kiến thức lý thuyết </b>
</div>
<span class='text_page_counter'>(13)</span><div class='page_container' data-page=13>
bằng thay đổi thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, hoặc bằng thay đổi di
truyền của chủng giống vi sinh vật; môi trường lên men sản xuất sinh khối có thể tận
dụng nguồn nguyên liệu phi protein, rẻ tiền (phế liệu, phụ phẩm của một số ngành
công nghiệp và nông nghiệp như rỉ đường, dịch đường khi thủy phân gỗ tạp, rơm rạ,
bã mía…) góp phần làm giảm giá thành sản phẩm và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường do chất thải và nước thải.
Trong số các vi sinh vật hữu ích cho sản xuất protein đơn bào, nấm men thường
được ứng dụng. Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, sinh sản theo
lối nảy chồi và có khả năng sinh sản nhanh. Tế bào nấm men chứa hàm lượng cao
chất dinh dưỡng: Hàm lượng protein có thể lên đến 40 - 60%, trong đó có nhiều loại
axit amin không thay thế; hàm lượng vitamin khá cao với hoạt tính hơn gấp 2 - 3 lần
vitamin tổng hợp... Hiện nay, có khá nhiều lồi nấm men được sử dụng làm giống
<i>cho sản xuất thu nhận protein như: Endomyces fibuligera, Torulopsis utilis, Candida </i>
<i>tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula capsulata, Monilia candida, </i>
<i>Mycotorula japonica…, trong đó các chủng nấm men thuộc giống Torulopsis, </i>
<i>Candida, Saccharomyces được sử dụng phổ biến. </i>
<b>1.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>1.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
<i><b>- Giống vi sinh vật: Các ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae. </b></i>
<b>- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật như: peptone, </b>
glucose, K2HPO4, MgSO4.7H2O, các vitamin như Thiamine HCl…
<b>- Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que cấy vi sinh vật đầu tròn, </b>
cuvet, lam kính, lamen…
<b>- Thiết bị: box cấy vơ trùng, nồi hấp khử trùng, tủ định ôn nuôi cấy vi sinh vật, </b>
máy so màu quang phổ, kính hiển vi quang học, máy li tâm, cân phân tích…
<i><b>1.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>1.3.2.1. Pha chế mơi trường nhân sinh khối nấm men </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(14)</span><div class='page_container' data-page=14>
<b>Thành phần </b> <b>Hàm lƣợng </b>
Peptone 10 g
Glucose 20 g
K2HPO4 3 g
MgSO4 .7H2O 2 g
Inositol 100 mg
Biotin 1 mg
Thiamine HCl 2 mg
Nước cất Dẫn đến 1.000 ml
pH 6,5
<i>Lưu ý: Cân, đong chính xác từng chất rồi hịa tan vào nước cất. Sau khi cân </i>
đủ hóa chất thì dẫn nước cất đến đủ định mức và điều chỉnh pH môi trường bằng
máy đo pH.
- Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào các bình tam giác 250 ml (50
ml/bình) và 500 ml (100 ml/bình). Dán nhãn ghi tên mơi trường, ngày pha chế mơi
trường, người pha mơi trường lên từng bình mơi trường. Làm nút bơng và nút giấy
cho các bình môi trường.
- Khử trùng môi trường ở 118ºC trong 30 phút.
- Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ đựng môi
trường ở nhiệt độ phịng.
<i>1.3.2.2. Cấy và hoạt hóa giống nấm men </i>
<i>- Dùng que cấy đầu tròn lấy giống nấm men Saccharomyces cerevisiae </i>
trong ống giống.
</div>
<span class='text_page_counter'>(15)</span><div class='page_container' data-page=15>
- Ni hoạt hóa nấm men trên máy lắc ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút
trong 12h.
<i>1.3.2.3. Nhân sinh khối và thu nhận sinh khối nấm men </i>
- Cấy giống nấm men đã hoạt hóa sang bình tam giác dung tích 500 ml chứa
môi trường nhân sinh khối nấm men đã chuẩn bị.
- Nuôi cấy nấm men trong máy lắc ổn nhiệt ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút
và thu hồi sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm: Sau 0h, 0,5h, 1h, 3h, 6h, 9h,
12h, 15h, 18h, 24h, 36h, 48h, 60h và 72h lên men.
<i>Lưu ý: Ở mỗi thời điểm thu nhận sinh khối nấm men, các bình lên men chứa </i>
sinh khối nấm men được mang vào box cấy vô trùng. Dùng pipet vô trùng hút 3 - 5
ml dịch nấm men từ bình lên men sang một ống nghiệm vơ trùng để kiểm tra lượng
sinh khối nấm men tạo thành. Tiếp theo đậy nắp bình nhân giống nấm men và tiếp
tục nuôi cấy trong tủ định ôn cho thu hồi sinh khối ở các thời điểm tiếp theo.
<i>1.3.2.4. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men </i>
<i>a. Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành </i>
Xác định lượng sinh khối tạo thành để vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men
bằng một trong hai phương pháp sau:
<i>Phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng </i>
<i><b>- Nguyên tắc: Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Có thể đo </b></i>
độ tán xạ ánh sáng bằng máy so màu quang phổ (spectrophotometer). Nồng độ nấm
men càng tăng thì độ đục của canh trường ni cấy cũng tăng theo và làm cản trở ánh
sáng đi qua dịch nuôi.
- Các bước thực hiện:
</div>
<span class='text_page_counter'>(16)</span><div class='page_container' data-page=16>
<i>Phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào </i>
- Ngun tắc: Sấy khơ tế bào nấm men, sau đó xác định khối lượng khô của
sinh khối nấm men thu nhận ở các thời điểm khác nhau bằng cân trên cân phân tích.
- Các bước thực hiện:
+ Sấy khô và cân xác định trọng lượng của ống li tâm trên cân phân tích;
+ Hút dịch nấm men vào ống li tâm, tiến hành li tâm thu nhận sinh khối tế bào
nấm men ở 6.000 vòng/phút trong 15 phút;
+ Loại bỏ dịch nổi, thu nhận sinh khối nấm men ở dưới đáy ống li tâm;
+ Rửa tế bào nấm men với nước cất vô trùng;
+ Ly tâm lần 2, thu hồi sinh khối ở đáy ống li tâm;
+ Sấy khô sinh khối nấm men trong tủ sấy ở 50ºC;
+ Cân xác định trọng lượng khô của sinh khối nấm men được tạo thành (trọng
lượng khô của sinh khối nấm men bằng trọng lượng của ống li tâm chứa sinh khối
khô của nấm men trừ trọng lượng của ống li tâm khi không chứa tế bào nấm men).
<i>b. Kiểm tra chất lượng nấm men bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi </i>
<i>quang học </i>
Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với Xanh
methylen Loeffler. Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x40 và x100.
Cách thực hiện:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính;
+ Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;
+ Đặt lá kính lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh khơng tạo thành bọt khí (để một
mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống). Nếu giọt dịch nhiều
quá tràn ra ngoài phần tiếp xúc của lá kính và phiến kính thì dùng giấy thấm bớt nước đi;
+ Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi.
</div>
<span class='text_page_counter'>(17)</span><div class='page_container' data-page=17>
<i>Lưu ý: Tế bào nấm men chết là tế bào bắt màu xanh của thuốc nhuộm; tế bào </i>
sống không cho thuốc nhuộm thấm qua thành và màng tế bào nên không bắt màu
<i>xanh của thuốc nhuộm; tế bào nảy chồi là các tế bào đang phát triển và có nhiều chồi </i>
mọc chồng chất lên nhau (Hình 1).
<b>Hình 1.1. Hình thái tế bào nấm men quan sát dƣới kính hiển vi quang học </b>
<b>1.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải chuẩn bị được 1 lít mơi
trường lên men, cấy giống nấm men đạt yêu cầu, tiến hành lên men đúng kỹ thuật và
đánh giá được hiệu suất của quá trình lên men trong từng cơng thức.
- Báo cáo kết quả thí nghiệm (thực hiện tại lớp, 1 bài báo cáo/1 nhóm) tuần tự
theo các nội dung như sau:
</div>
<span class='text_page_counter'>(18)</span><div class='page_container' data-page=18>
Thu nhận sinh khối nấm men ở
các thời gian sau lên men (h) tạo thành (ODLượng sinh khối nấm men 600nm hoặc g/L)
0
0,5
1
3
6
9
12
15
18
24
36
48
60
72
(ii) Vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men trong một hệ thống kín dựa
trên lượng sinh khối nấm men tạo thành đã xác định ở các thời gian thu hồi sinh
khối khác nhau.
(iii) Đánh giá chất lượng nấm men bằng phương pháp làm tiêu bản và quan sát
dưới kính hiển vi khi giống đang ở pha phát triển, thống kê kết quả vào bảng:
Tiêu
bản
Tổng
số TB
quan
sát
Số TB
sống Tỷ lệ TB sống (%)
Số TB
nảy
chồi
</div>
<span class='text_page_counter'>(19)</span><div class='page_container' data-page=19>
<i>Lưu ý: Giống nấm men đạt yêu cầu để sử dụng làm giống trong các quá trình </i>
lên men phải có chất lượng: tỷ lệ tế bào nảy chồi > 10%; tỷ lệ tế bào chết ≤ 4%.
- Trả lời các câu hỏi sau:
+ Trong điều kiện nhân sinh khối nấm men đã thực hiện, thu nhận sinh khối
nấm men ở thời điểm nào cho phép thu nhận được nhiều sinh khối nấm men nhất?
Giải thích?
</div>
<span class='text_page_counter'>(20)</span><div class='page_container' data-page=20>
<b>Bài 2 </b>
<b>ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƢƠNG NỞ BỘT MÌ </b>
<b>2.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Giúp sinh viên nắm vững cơ sở khoa học, nguyên tắc và yêu cầu cơ bản trong
quá trình sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì.
Yêu cầu
<i>- Nắm được, trình bày được vai trò và cơ chế hoạt động của nấm men trong quá </i>
trình làm trương nở bột bánh mì.
- Củng cố và hình thành kỹ năng:
+ Bố trí nguồn ngun liệu bột mì;
+ Phối trộn bột mì, một số chất phụ gia, nấm men;
+ Tạo điều kiện thích hợp để nấm men hoạt động làm trương nở bột mì hiệu
quả nhất.
<b>2.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Hiện nay, giống để sản xuất trong công nghệ làm bánh thường sử dụng các
<i>chủng Saccharomyces cerevisiae. Trong khối bột mì, nấm men Saccharomyces </i>
<i>cerevisiae trước hết sử dụng nguồn carbon là glucose, tiếp theo sử dụng các đường </i>
khác như maltose, sucrose và fructose có sẵn trong bột để lên men. Để hoạt động của
nấm men tốt hơn, loại enzyme phân giải tinh bột thành đường làm nguồn cơ chất cho
lên men như α-amylase bền nhiệt thường được bổ sung vào vật liệu lên men. Quá
trình lên men làm trương nở bột mì dưới hoạt động của nấm men sẽ sản sinh CO2 tạo
các lỗ hổng trong bột. Bên cạnh đó, q trình lên men diễn ra sẽ tạo khoảng 0,5% -
1,4% ethanol trong khối bột mì.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6<b> → 2CH</b>3CH2OH + 2CO2 + 2ATP
</div>
<span class='text_page_counter'>(21)</span><div class='page_container' data-page=21>
bột trương nở càng ngắn thì chất lượng nấm men càng tốt (nấm men chất lượng tốt
thường làm nở bột sau 60 - 65 phút).
<b>Hình 2.1. Kết quả làm trƣơng nở khối bột mì nhờ hoạt động của nấm men </b>
<b>2.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>2.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
<i>- Giống vi sinh vật: Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae đã thu nhận </i>
<i>sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae) được </i>
thu hồi bằng phương pháp li tâm và sấy khô ở nhiệt độ 40ºC.
- Dụng cụ: cốc thủy tinh, thước kẻ chia vạch.
- Thiết bị: tủ ấm, cân phân tích, cân kỹ thuật.
<i><b>2.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>2.3.2.1. Kiểm tra sức sống của nấm men </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(22)</span><div class='page_container' data-page=22>
kính 1 cm, sau đó thả đồng loạt các viên vào cốc nước đã được làm ấm đến 35ºC.
- Quan sát sẽ thấy ban đầu các viên nấm men trộn bột mì (viên bột men) nặng
hơn nước lên nhanh chóng lắng xuống đáy cốc. Sau một khoảng thời gian, viên bột
men sẽ di chuyển từ đáy cốc lên bề mặt nước. Xác định khoảng thời gian cần thiết để
các viên bột men nổi lên trên bề mặt cốc nước ấm.
<i>Lưu ý: Trong các viên nấm men trộn bột mì, dưới hoạt động lên men của nấm </i>
men, các bọt khí CO2 tạo thành và thoát khỏi viên bột men đi lên mặt nước, qua đó
tạo lực đẩy các viên bột men nổi lên bề mặt nước. Thời gian cần thiết để các viên bột
men nổi lên càng ngắn thì nấm men càng có sức sống tốt và có khả năng làm trương
nở bột mì mạnh và ngược lại. Mặt khác, nấm men không hoạt động sẽ khơng tạo ra
bọt khí CO2 trong khối bột men và không tạo lực đẩy khối bột men nổi lên mà vẫn
nằm dưới đáy cốc và dần tan ra hịa vào cốc nước.
<i>2.3.2.2. Hoạt hóa giống nấm men </i>
- Cân 10 g nấm men khô, cho vào cốc chứa sẵn 100 ml nước, đặt vào tủ định ôn
ở 35ºC trong 30 phút.
- Thêm vào cốc 50 g bột mì, trộn đều, tiếp tục đặt vào tủ 35ºC trong 30 phút.
<i>2.3.2.3. Sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì </i>
- Cân 850 g bột mì, 15 g NaCl cho vào cốc thủy tinh dung tích lớn.
- Bổ sung dịch nấm men đã hoạt hóa vào cốc bột mì, thêm 450 ml nước đã
được làm ấm đến 35ºC.
- Nhào trộn đều khối nấm men + bột mì + NaCl + nước bằng tay cho đến khi
bột được hòa tan thật đều với nước và men sữa (bột khơng cịn dính vào tay là được).
- Nặn bột thành hình 1 chiếc bánh lớn và cho vào khn đã đặt sẵn thước có
thang chia vạch. Xác định chiều cao của khối bột lúc ban đầu và tính thể tích của
khối bột khi chưa ủ.
- Đặt khuôn chứa bột nhào trộn nấm men vào tủ ấm ở 35ºC trong 1h.
- Sau thời gian ủ, lấy khối bột ra khỏi tủ ấm, đo chiều cao của khối bột men sau
ủ và xác định thể tích của khối bột men sau lên men.
</div>
<span class='text_page_counter'>(23)</span><div class='page_container' data-page=23>
- Song song làm công thức đối chứng với đầy đủ các bước như cơng thức thí
nghiệm nhưng không bổ sung sinh khối nấm men khô vào nguyên liệu bột mì.
- Kiểm tra chất lượng bánh sau khi nướng (trong quá trình nướng, khi nhiệt độ
trong lị nướng đạt 50 - 60ºC thì nấm men bị giết chết), hoặc sau khi hấp cách thủy
bằng cảm quan.
<b>2.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
- Mỗi nhóm sinh sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải tiến hành nhào trộn, ủ và
sử dụng nấm men để làm trương nở được 1 kg bột mì.
- Viết bài báo cáo kết quả thí nghiệm (thực hiện tại lớp) tuần tự theo các nội dung:
(i) Xác định năng lực làm trương nở 1 kg bột mì của nấm men sau 1h ủ ở 35ºC,
số liệu thống kê ở Bảng sau:
Cơng thức Thể tích khối bột mì (cm
3<sub>) </sub>
Thể tích khối bột mì
tăng lên (cm3<sub>) </sub>
Trước ủ Sau ủ
Đối chứng
(khơng sử dụng nấm
men)
Thí nghiệm
(sử dụng nấm men)
</div>
<span class='text_page_counter'>(24)</span><div class='page_container' data-page=24>
<b>Bài 3 </b>
<b>QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL </b>
<b>3.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Sinh viên nắm vững cơ sở khoa học, nguyên tắc và yêu cầu cơ bản của quá trình
lên men sản xuất ethanol.
Yêu cầu
- Củng cố các kiến thức về vai trò của nấm men, cơ chế của lên men sản sinh
ethanol, các vấn đề cần chú ý trong quá trình lên men để hiệu suất sinh cồn đạt cao nhất.
- Vận dụng kiến thức lý thuyết về quá trình lên men ethanol để định hướng tác
động và điều khiển quá trình lên men theo hướng tạo ra những sản phẩm đồ uống có
cồn với số lượng và chất lượng như mong muốn.
- Thực hành và rèn luyện kỹ năng: chuẩn bị nguyên liệu, các điều kiện cho lên
men ethanol; sử dụng chủng nấm men thuần chủng để lên men, theo dõi quá trình lên
men và xác định các đặc trưng của quá trình.
<b>3.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Nấm men trong điều kiện kỵ khí chuyển hóa glucose thành ethanol trước hết
bằng con đường Embden - Meyerhof theo sơ đồ tổng quát:
C6H12O6 <b> → 2CH</b>3CH2OH + 2CO2 + 2ATP
180 = [2 x 46 = 92] + [2 x 44 = 88]
Theo lý thuyết, mỗi mol glucose được lên men sẽ tạo thành 2 mol ethanol, 2
mol CO2, 2 mol ATP, tương ứng, mỗi gam glucose có thể tạo ra 0,51 gam rượu. Tuy
nhiên, sản lượng ethanol đạt được sau lên men trong thực tế thường không vượt quá
tỷ lệ 90 - 95% so với lý thuyết, do một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để
tổng hợp sinh khối tế bào nấm men và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế
bào. Bên cạnh đó, các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới tạo thành glycerol và
succinate) cũng tiêu thụ tới 4 - 5% cơ chất tổng số trong môi trường dinh dưỡng.
</div>
<span class='text_page_counter'>(25)</span><div class='page_container' data-page=25>
hồ. Thơng thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05 - 0,1 mmHg tính
theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó cũng sẽ kích thích sinh
trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol.
Các chủng nấm men sử dụng cho lên men ethanol qui mô công nghiệp phải có
khả năng lên men tạo hiệu suất ethanol cao, chịu cồn, chịu nhiệt và chịu axit. Các loài
nấm men thường được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol gồm:
<i>Saccharomyces </i> <i>cerevisiae, </i> <i>Saccharomyces </i> <i>uvarum </i> <i>(carbergensis), </i>
<i>Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces. </i>
<b>3.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>3.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
<i>- Giống vi sinh vật: Dịch nấm men Saccharomyces cerevisiae đang sinh trưởng </i>
ở pha logarit trong môi trường lỏng thu nhận sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối
<i>nấm men Saccharomyces cerevisiae). </i>
- Nguyên liệu, hóa chất:
+ Đường glucose, quả cam tươi, (NH4)2SO4, axit xitric, dung dịch NaOH 10%,
dug dịch Ca(OH)2 10%;
+ Thuốc nhuộm Xanh methylene Loeffer.
Thành phần Hàm lượng
Ethanol 96º 300 ml
Xanh methylene 3 g
Hòa tan hỗn hợp rồi lọc trong được dịch lọc 1.
Dịch lọc 1 30 ml
KOH 1% 1 ml
</div>
<span class='text_page_counter'>(26)</span><div class='page_container' data-page=26>
Thuốc thử Fehling A: CuSO4 tinh thể 40 g
Nước cất 1.000 ml
Hịa tan hồn tồn CuSO4 vào nước.
Thuốc thử Fehling B: Kali natri tartrat 200 g
NaOH 150 g
Nước cất 1.000 ml
- Dụng cụ: Bình lên men 500 ml, pipet, bình định mức, ống đong, giấy parafilm,
puret, lam kính, lamen…
- Thiết bị: tủ ấm, cân phân tích, cân kỹ thuật.
<i><b>3.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>3.3.2.1. Kiểm tra chất lượng giống nấm men </i>
<i>Men giống Saccharomyces cerevisiae đang sinh trưởng ở pha logarit (nuôi cấy </i>
trong môi trường dinh dưỡng lỏng ở 28ºC trong 14 - 16h) được kiểm tra chất lượng
bằng phương pháp làm tiêu bản nhuộm đơn tế bào với thuốc nhuộm Xanh methylene
Loeffer.
Tiến hành:
- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính;
- Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;
- Đặt lá kính lên giọt dịch;
- Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40.
<i>Lưu ý: Men giống đủ tiêu chuẩn sử dụng cho lên men ethanol có đặc điểm: </i>
Khơng bị nhiễm vi sinh vật lạ, tỷ lệ tế bào nảy chồi > 10%, tỷ lệ tế bào chết ≤ 4%.
<i>3.3.2.2. Pha chế môi trường lên men </i>
Thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men gồm các chất dinh dưỡng từ
đường glucose, nước cam, đạm sunphat và axit xitric.
</div>
<span class='text_page_counter'>(27)</span><div class='page_container' data-page=27>
Công thức 1: Glucose 20% (w/v) + (NH4)2SO4 0,02% (w/v) + axit xitric 0,2%
(w/v).
Công thức 2: Glucose 20% (w/v) + (NH4)2SO4 0,02% (w/v) + axit xitric 0,2%
(w/v) + nước cam 50% (v/v).
(Dịch nước cam được chuẩn bị như sau: Rửa sạch quả cam tươi dưới vịi nước,
để khơ tự nhiên, vắt lấy nước, loại bỏ hạt và lọc qua giấy lọc).
<i>Lưu ý: Điều chỉnh pH môi trường đến pH 3 - 3,5. Dán nhãn ghi tên cơng thức </i>
thí nghiệm, ngày pha chế môi trường dinh dưỡng, nhóm sinh viên thực hiện; môi
trường lên men sau khi pha chế được khử trùng theo phương pháp Pasteur (đun nóng
môi trường lên 80ºC trong 15 - 30 phút).
<i>3.3.2.3. Cấy giống nấm men và lên men ethanol </i>
Thao tác cấy giống nấm men được thực hiện trong box cấy vơ trùng.
- Rót 475 ml mơi trường dinh dưỡng tương ứng với 2 công thức môi trường lên
men đã chuẩn bị ở mục 3.3.2.2 vào 2 bình lên men dung tích 500 ml (mỗi mơi trường
dinh dưỡng được rót vào 1 bình). Dán nhãn ghi ký hiệu mơi trường lên thành bình.
<i>- Tiếp 25 ml men giống Saccharomyces cerevisiae vào 2 công thức môi trường </i>
với tỷ lệ 5% (v/v).
- Song song bố trí 2 công thức đối chứng tương ứng với 2 loại môi trường dinh
dưỡng (công thức đối chứng không tiếp giống nấm men và thay thế dịch men giống
bằng nước cất vô trùng với tỷ lệ 5%).
- Cân xác định trọng lượng bình lên men.
- Đậy kín nắp bình lên men sao cho khí CO2 tạo thành (sản phẩm của q trình
lên men khơng bị bay ra ngồi.
- Đặt các bình lên men trong tủ điều nhiệt ở 28 - 30ºC trong 14 ngày.
- Quan sát động thái của quá trình lên men sau 48 giờ/1 lần cho đến khi quá
trình lên men kết thúc (bọt khí khơng cịn đi từ đáy bình lên, CO2 không tiếp tục tạo
</div>
<span class='text_page_counter'>(28)</span><div class='page_container' data-page=28>
<i>3.3.2.4. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men ethanol </i>
<i>a. Đánh giá theo cảm quan </i>
Kết quả của quá trình lên men được đánh giá theo cảm quan bằng phương pháp
ngửi, nếm.
<i>b. Phân tích ethanol bằng phương pháp định tính </i>
Định tính sự có mặt của ethanol trong bình lên theo 2 thí nghiệm:
<i><b>Thí nghiệm 1: Dựa vào phản ứng tạo thành indoform của ethanol. </b></i>
Cho vào ống nghiệm: 5 ml dịch lên men, 5 ml NaOH 10%, 0,1 g Iốt tinh thể
dạng bột. Đun nóng ống nghiệm hay ngâm ống nghiệm trong nồi cách thủy ở 60ºC
<i>cho đến khi Iốt tan hết và mất màu. Để nguội sẽ thấy xuất hiện tinh thể indoform màu </i>
vàng (CHI3). Phương trình phản ứng:
CH3CH2OH + I2 → CH3CHO + 2H
CH3<b>CHO + 3I → CI</b>3CHO + 3HI
CI3<b>CHO + NaOH → CHI</b>3 + HCOONa
<i>Thí nghiệm 2: Cho CO</i>2<i><b> đi qua dung dịch Ba(OH)</b></i>2<i><b> hoặc nước vôi trong sẽ làm </b></i>
<i><b>cho dung dịch này bị đục. </b></i>
Cho vào ống nghiệm: 5 ml dịch lên men; 1 ml Ba(OH)2 10%. Dùng kẹp gỗ kẹp
ống nghiệm và đun nhẹ trên ngọn đèn cồn. Để lắng thấy có kết tủa trắng do BaCO3
được tạo thành theo phản ứng:
CO2 + Ba(OH)2 → BaCO3 + H2O
<i>c. Phân tích ethanol bằng phương pháp định lượng </i>
Xác định lượng ethanol tạo thành trong dịch lên men bằng thực hiện các thí
nghiệm:
<i>Thí nghiệm 1: Đo độ cồn trong dịch lên men bằng cồn kế. </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(29)</span><div class='page_container' data-page=29>
Dựa trên nguyên lý tỷ trọng của nước càng thấp thì độ cồn trong nước càng cao.
Độ chìm của cồn kế trong dung dịch sẽ cho biết độ cồn của dung dịch.
Cách thực hiện: Lấy cồn kế thả vào dịch lên men ethanol. Căn cứ vào độ
chìm/nổi của cồn kế, đọc chỉ số trên vạch tương ứng với độ cồn trong dịch lên men.
<i>Thí nghiệm 2: Tính lượng rượu tạo thành, lượng đường lên men và cường độ </i>
lên men từ lượng CO2<i> tạo thành (tính theo lý thuyết). </i>
Để tính lượng CO2, cân khối lượng bình lên men trước và sau khi lên men (đã
mở nắp bình cho CO2 bay đi). Hiệu số của 2 khối lượng, tức là lượng CO2 đã tạo
thành.
<i>Ví dụ: Gọi lượng CO</i>2<i> bay ra trong quá trình lên men là X gam. Vậy: </i>
- Lượng rượu được tạo thành là:
Theo phương trình tổng quát của lên men ethanol thì 88 g CO2 tương ứng với
92 g rượu. Vậy X(g) CO2 tương ứng với Y(g) rượu. Khi đó:
- Lượng đường lên men là:
180 g C6H12O6 cho 88 g CO2
Z (g) C6H12O6 cho X (g) CO2
- Xác định cường độ lên men: Cường độ lên men có đơn vị là %; được tính theo
lượng đường lên men đã xác định được từ lượng CO2 tạo thành.
<i>Ví dụ: Nếu trong 100 ml mơi trường có chứa 15 g đường, mà trong 15 g ấy có </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(30)</span><div class='page_container' data-page=30>
sung vào môi trường lên men và hàm lượng đường khử cịn lại (đường sót) sau q
trình lên men. Hàm lượng đường khử có trong dịch lên men trước và sau lên men
được xác định bằng phương pháp vi lượng của Rodzevich. Từ hàm lượng đường khử
trước và sau q trình lên men có thể tính được cường độ của quá trình lên men.
Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo Rodzevich:
Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm các đường khử (glucose,
fructose, mantose) có thể khử dễ dàng đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ <sub>→ </sub>
Cu1+<sub>) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO</sub>
4 dư (không tham gia phản ứng)
tính được lượng đường khử. Cơ chế của quá trình xảy ra với các giai đoạn sau:
Khi trộn hai dung dịch Fehling A và Fehling B với nhau thì xảy ra phản ứng
giữa chúng theo hai giai đoạn:
Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hidroxit màu xanh da trời:
CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH) 2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Kali natri tartrat tạo thành muối hịa tan có
dung dịch màu xanh thẫm. Phương trình phản ứng:
Muối trên là một hợp chất khơng bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit
hoặc xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản
thân đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling.
Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi
</div>
<span class='text_page_counter'>(31)</span><div class='page_container' data-page=31>
CuSO4 + 4KI +H2SO4 → I2 + CuI2 + 2K2SO4
Chuẩn độ lượng Iôt tạo thành bằng natri thiosunfat (Na2S2O3) chuẩn, qua đó
tính được lượng đường khử có trong dung dịch.
I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI
Tiến hành:
<i>Bước 1: Cho vào bình nón dung tích 50:1 ml dung dịch đã lên men, 2 ml nước </i>
cất, 1 ml dung dịch Fehling A và 1 ml dung dịch Fehling B.
<i>Bước 2: Đun sôi hai phút (kể từ lúc xuất hiên bọt sôi đầu tiên). Sau khi đun sôi, </i>
dung dịch phản ứng phải còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một kết tủa đồng (I)
oxit màu đỏ gạch. Trong trường hợp dịch phản ứng mất màu hoàn toàn chứng tỏ
lượng dung dịch Fehling cho vào khơng đủ để oxi hóa hồn tồn lượng đường có
trong dung dịch mẫu thí nghiệm, khi đó phải pha lỗng dịch lên men (pha lỗng dịch
đường) và làm lại thí nghiệm. Trường hợp dịch phản ứng chỉ có màu xanh của Cu2+
và khơng có kết tủa màu đỏ gạch của đồng (I) oxit thì phải tăng lượng dung dịch lên
men (tăng lượng đường trong dịch phản ứng), giảm nước cất để luôn đảm bảo thể
tích là 5 ml.
<i>Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1 ml H</i>2SO4 25% và 1 ml KI 30%,
lắc đều và giữ trong 20 phút.
<i>Bước 4: Chuẩn độ I</i>2 tạo thành bằng Na2S2O3 0,1N. Song song làm thí nghiệm
đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất.
Hàm lượng đường khử được tính theo cơng thức sau:
X = (a - b) x f x 3,3
Trong đó:
- X: Hàm lượng đường khử (mg);
</div>
<span class='text_page_counter'>(32)</span><div class='page_container' data-page=32>
<i>d. Đánh giá chất lượng nấm men sau lên men </i>
Làm tiêu bản quan sát chất lượng nấm men dưới kính hiển vi: Nhuộm nấm men
với thuốc nhuộm xanh metylen Loeffer. Quan sát nấm men dưới kính hiển vi ở vật
kính x40 theo các tiêu chí sau:
+ Hình thái tế bào;
+ Số lượng tế bào sống, chết;
+ Hình thức sinh sản của nấm men;
+ Khả năng di động...
<b>3.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải chuẩn bị đạt yêu cầu 2
công thức môi trường lên men, tiến hành lên men tạo ethanol thành cơng. Ngồi
ra, sinh viên cịn phải viết báo cáo mơ tả động thái của quá trình lên men quan sát
được và các kết quả nhận được sau khi kiểm tra chất lượng của quá trình lên men.
- Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài) trình bày kết quả của các thí
nghiệm:
(i) Đánh giá quá trình lên men ethanol theo cảm quan: Kết quả thống kê vào
bảng sau:
Công
thức môi
trường
dinh
dưỡng
Tiêu chí quan sát
Kết
luận
Giải
thích
Màu
sắc
Mùi
Sự chuyển
động của
dịch lên
men (CO2)
Lượng
sinh
khối
nấm
men
Mùi
đường
Mùi
ethanol
1
2
</div>
<span class='text_page_counter'>(33)</span><div class='page_container' data-page=33>
(iii) Định tính sự có mặt của ethanol trong dịch lên men: Kết quả thống kê vào
Bảng sau:
Ống nghiệm Thành phần
phản ứng
Kết quả
phản ứng
Kết luận về sự
có mặt của
ethanol trong
dịch lên men
Giải thích
kết quả
(iv) Xác định hiệu suất của quá trình lên men theo lý thuyết và theo thực tế: Kết
quả xử lý và thống kê vào bảng:
Cơng
thức
thí
nghiệm
Khối lượng
bình lên men
(g) Lượng
CO2
tạo
thành
(g)
Lượng
ethanol
tạo
thành
(g)
Hiệu suất lên
men theo
lý thuyết
Hiệu suất lên
men thực tế
</div>
<span class='text_page_counter'>(34)</span><div class='page_container' data-page=34>
- Hoàn thành các câu hỏi sau:
+ So sánh và kết luận về công thức môi trường dinh dưỡng cho hiệu suất lên
men cao trong 2 công thức môi trường lên men đã chuẩn bị?
+ Tại sao để q trình lên men diễn ra hiệu quả, mơi trường dinh dưỡng cho lên
men phải chứa hàm lượng đường cao?
</div>
<span class='text_page_counter'>(35)</span><div class='page_container' data-page=35>
<b>Bài 4 </b>
<b>QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC </b>
<b>4.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
<b>Mục tiêu </b>
Củng cố kiến thức lý thuyết của quá trình lên men lactic, thành phần vi sinh
vật tham gia và các đặc trưng cần theo dõi và đánh giá trong quá trình lên men
lactic.
<b>Yêu cầu </b>
- Củng cố và khắc sâu vai trị, ý nghĩa của q trình lên men lactic trong công
nghệ thực phẩm, đời sống và bảo vệ môi trường.
- Rèn luyện kỹ năng: Phân lập vi khuẩn lactic; xác định số lượng vi sinh vật
trong cơ chất; pha chế môi trường dinh dưỡng cho lên men, phối trộn giống, cách
thức thực hiện thành cơng một q trình lên men có sự tham gia của vi sinh vật.
<b>4.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Quá trình lên men lactic là q trình chuyển hóa đường glucose dưới tác dụng
của vi sinh vật trong điều kiện yếm khí thành axit lactic (C3H6O3 -
CH3CHOHCOOH), một số axit hữu cơ khác và giải phóng năng lượng.
Có hai kiểu lên men lactic chính là lên men lactic đồng hình và lên men
lactic dị hình.
Trong lên men lactic đồng hình thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic đồng hình
<i>như Lactobacterium, Thermobacterium, Streptobacterium, Streptococcus. Glucose </i>
được chuyển hóa theo chu trình Emden - Meyerhof tạo thành axit piruvic và NADH+<sub>. </sub>
Axit pyruvic sẽ tiếp tục bị khử thành axit lactic theo phương trình phản ứng
C6H12O6<b> → 2CH</b>3CHOHCOOH + Q
</div>
<span class='text_page_counter'>(36)</span><div class='page_container' data-page=36>
<i>Hầu hết vi khuẩn lactic thuộc giống Lactobacillus, là vi khuẩn khơng sinh bào </i>
<i>tử, gram dương (trừ lồi Lactobacillus inulinus), khơng di động, thuộc loại yếm khí </i>
<i>hoặc vi hiếu khí (microaerophil). Hình thái vi khuẩn lactic rất đa dạng: hình que </i>
ngắn, que dài, hình cầu…
<b>4.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>4.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
- Vật liệu để pha chế môi trường dinh dưỡng cho lên men lactic: sữa (sữa đặc có
đường/sữa tươi), rau/củ/quả (ví dụ rau cải/củ xu hào/quả đu đủ…).
- Giống vi sinh vật: Nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua thương
phẩm và nhóm vi khuẩn lactic có sẵn trong rau/củ/quả.
- Hóa chất: Phenolphthalein 0,5%, NaCl tinh thể, NaOH 0,1N.
- Môi trường xác định số lượng vi khuẩn lactic:
Thành phần Hàm lượng
Glucose: 20 g
K2HPO4: 2 g
MgSO4.7H2O: 0,58 g
MnSO4.7H2O: 0,2 g
Cao nấm men 5 g
Peptone 10 g
CaCO3: 5 g
Agar: 15 g
Dẫn nước tới 1.000 ml
pH 7,0
Môi trường được khử trùng ở 118ºC trong 20 phút.
- Dụng cụ: bình lên men dung tích 1 lít, đĩa petri, puret, pipet, bình tam giác,
ống nghiệm, ống đong, lam kính, lamen...
</div>
<span class='text_page_counter'>(37)</span><div class='page_container' data-page=37>
<i><b>4.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>4.3.2.1. Lên men lactic tạo sản phẩm sữa chua </i>
Tiến hành quá trình lên men lactic tạo sản phẩm sữa chua từ nguyên liệu là 1 lít
sữa tươi hoặc 1 hộp sữa đặc có đường.
- Pha loãng sữa: Trường hợp sản xuất sữa chua từ sữa tươi thì khơng cần pha
lỗng. Ngun liệu là sữa đặc có đường và sữa bột thì pha lỗng sữa với một lượng
nước thích hợp tùy theo nhu cầu về chất lượng sản phẩm. Ví dụ: 1 hộp sữa đặc có thể
pha lỗng đến thể tích cuối cùng là 1 lít hoặc 1,5 lít…, tương ứng với những thể tích
pha lỗng nhất định sẽ nhận được sản phẩm sữa chua có chất lượng khác nhau.
- Khử trùng sữa láng theo kiểu Pasteur ở nhiệt độ 85 - 90ºC trong 15 - 20 phút.
(Trong sản xuất nhỏ ở quy mơ gia đình, có thể đun sôi nhẹ. Vừa đun vừa khuấy
sữa thật đều để sữa không bị cháy).
- Lọc sữa qua vải lọc để loại bỏ cặn và váng sữa.
- Để sữa nguội tới 35ºC.
- Cấy giống: Khuấy trộn giống (1 hộp sữa chua thương phẩm đều vào trong sữa).
<i>Lưu ý: Trong sản xuất thủ cơng có thể dùng giống là sản phẩm sữa chua của lần </i>
lên men trước được bảo quản trong tủ lạnh hoặc sản phẩm sữa chua bán trên thị
trường. Trong sản xuất ở quy mô công nghiệp cần sử dụng giống vi khuẩn lactic ở
dạng thuần khiết, hoặc giống là gói vi khuẩn lactic dạng đơng khô.
- Lên men sữa ở 30 - 45ºC trong 12 - 16h.
<i>Lưu ý: Trong môi trường lên men, q trình chuyển hóa lactose thành axit lactic </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(38)</span><div class='page_container' data-page=38>
ra khỏi sữa. Có thể bảo quản sản phẩm sữa chua ở 4 - 8ºC. Khi đó, q trình lên men
lactic vẫn xảy ra nhưng chỉ ở mức độ yếu, sữa tiếp tục đông tụ, nước tự do liên kết
với protein làm sữa đông đặc thêm. Quá trình tạo hương cho sữa vẫn được tiếp tục
bởi hoạt động của vi khuẩn tạo mùi thơm khiến cho sữa chua có mùi đặc trưng. Sản
phẩm sữa chua được sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp có thể được bổ sung thêm chất
ổn định, khi đó sữa chua có thể bảo quản và sử dụng trong 3 - 6 tuần. Trường hợp
không thêm chất ổn định, sản phẩm sữa chua chỉ có thể bảo quản và sử dụng trong 24 -
48 giờ.
<i>4.3.2.2. Lên men lactic tạo sản phẩm rau/củ/quả lên men </i>
Tạo sản phẩm muối chua từ một loại rau/củ/quả bằng phương pháp lên men
truyền thống, tận dụng nguồn vi khuẩn lactic có sẵn trong tự nhiên.
- Chuẩn bị một loại rau/củ/quả, để khô, cắt lát.
- Cân 500 g rau/củ/quả và xếp vào bình lên men.
- Bổ sung dung dịch NaCl 3% đến ngập bề mặt rau/củ/quả trong bình.
- Lên men trong tủ ấm ở 37ºC trong 16 - 24h.
- Phân tích các đặc trưng của quá trình lên men hoặc bảo quản ở 4ºC cho đến
khi phân tích.
<i>4.3.2.3. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men lactic </i>
<i>a. Đánh giá kết quả bằng cảm quan </i>
Sản phẩm lên men lactic là sữa chua hoặc rau/củ/quả muối chua là đạt tiêu
chuẩn nếu có các đặc điểm sau:
- Sản phẩm sữa chua lên men có màu trắng ngà, bề mặt mịn, đồng nhất, vị chua
ngọt, thơm dịu;
- Sản phẩm rau/củ/quả lên men có vị chua ngon, màu vàng tươi sáng (không bị
sẫm màu), giịn, chắc, khơng có vị đắng, mùi thơm đặc trưng và khơng có mùi lạ;
</div>
<span class='text_page_counter'>(39)</span><div class='page_container' data-page=39>
<b>Cảm xúc đối với sản phẩm </b> <b>Điểm </b>
Cực kỳ thích 9
Rất thích 8
Thích 7
Hơi thích 6
Khơng thích khơng ghét 5
Hơi ghét 4
Ghét 3
Rất ghét 2
Cực kỳ ghét 1
<i>b. Xác định sự biến đổi về thành phần sinh hóa trong sản phẩm trước và sau lên men </i>
<i> Đo pH của sản phẩm </i>
pH của sản phẩm sữa chua và rau/củ/quả muối chua được đo bằng máy đo pH.
<i> Định tính axit lactic </i>
Nguyên tắc: Chuyển hóa axit lactic thành CH3CHO, dựa vào phản ứng của
CH3CHO với AgNO3 tạo kết tủa bạc có ánh trắng để nhận biết sự có mặt của axit
lactic.
Tiến hành: Lọc dung dịch sữa chua lấy 10 ml dịch trong. Cho dịch lọc vào ống
nghiệm, thêm 10 ml H2SO4 đặc. Đun nóng. Thêm 1 - 3 giọt KMnO4 10% đến khi
xuất hiện kết tủa màu đen. Cho thêm 1 - 2 ml AgNO3. Tiếp tục đun đến khi có ánh
</div>
<span class='text_page_counter'>(40)</span><div class='page_container' data-page=40>
<i>Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner </i>
- Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nước cất và thêm 1 - 2 giọt phenol
phthalein 0,5%.
- Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30
giây thì dừng lại. Ghi lại số ml NaOH đã dùng để chuẩn độ.
Độ axit được tính như sau:
ºT = VNaOH 0,1N x 10
% axit lactic = ºT x 0,009
Trong đó: ºT = Độ Therner.
0,009 là số gam axit lactic tương đương với 1 ml NaOH 0,1N.
<i>c. Xác định thành phần vi sinh vật trong sản phẩm lên men lactic </i>
<i>Quan sát hình dạng nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm dưới kính hiển vi </i>
Tiến hành nhuộm gram để quan sát các tế bào vi sinh vật trong sản phẩm sữa
chua, rau/củ/quả muối chua dưới kính hiển vi.
- Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên phiến kính. Nhỏ 1 giọt dịch sản
phẩm lên men lên giọt nước, hòa trộn đều bằng que cấy đầu trịn vơ trùng. Để vết bơi
khơ tự nhiên trong khơng khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn.
- Đặt 1 miếng giấy lọc lên vết bơi. Nhuộm vết bơi bằng thuốc nhuộm tím kết
tinh qua giấy lọc trong 1 phút. Nhuộm lugol trong 1 phút.
- Rửa nước, tẩy bằng cồn trong 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt
cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa lại bằng nước.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin.
- Rửa nước.
- Làm khơ và soi tiêu bản duới vật kính dầu.
<i>Lưu ý: Vi khuẩn gram dương bắt màu thuốc nhuộm tím, vi khuẩn gram âm bắt </i>
màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung.
<i>Xác định số loại vi sinh vật trong sản phẩm và số lượng tương ứng với từng loại </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(41)</span><div class='page_container' data-page=41>
nhiễm khơng?
Có một số phương pháp xác định số lượng vi sinh vật: Phương pháp xác định trực
tiếp số lượng tế bào bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (buồng đếm hồng cầu);
phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc
mọc trên môi trường thạch (theo nguyên tắc mỗi tế bào vi sinh vật trên mơi trường thích
hợp sẽ phát triển thành một khuẩn lạc, căn cứ vào số lượng khuẩn lạc sẽ tính được số
lượng vi sinh vật trong 1 ml hoặc 1 gam cơ chất).
Tiến hành xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp nào cũng cần tiến
hành pha loãng vi sinh vật.
<b>Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật: </b>
<b>- Xếp 1 dãy ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng; </b>
- Hút 1 ml cơ chất hoặc cân 1 gam cơ chất (tùy theo cơ chất cần xác định số
lượng vi sinh vật là láng hay đặc) cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, có dung dịch
cơ chất được pha loãng đến 10-1<sub> lần; </sub>
- Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch ở nồng độ 10-1<sub> cho vào 9 ml nước cất vô </sub>
trùng ở ống nghiệm thứ hai, lắc đều có nồng độ pha loãng 10-2<sub>; </sub>
- Tiếp tục làm như vậy với các ống nghiệm thứ 3, 4, 5, 6, 7, 8… đến khi có
được dãy pha lỗng cần thiết để ni cấy và xác định số loại vi sinh vật có trong cơ
chất và số lượng của chúng.
<b>Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi sinh vật bằng đếm khuẩn lạc: </b>
- Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng cho vào mỗi đĩa thạch;
- Dùng que gạt thủy tinh gạt đều khắp trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào.
<i>Lưu ý: Với mỗi mẫu cần xác định số lượng vi sinh vật cấy ở 3 nồng độ liên tiếp. </i>
Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri và lấy kết quả trung bình.
- Đặt các đĩa petri cấy vi sinh vật ở tủ ấm 37ºC trong 24 - 48h;
- Xác định số lượng vi sinh vật mọc trên đĩa petri ở nồng độ pha lỗng thích
hợp cho phân tách vi sinh vật dưới dạng khuẩn lạc;
</div>
<span class='text_page_counter'>(42)</span><div class='page_container' data-page=42>
Trong đó:
- N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml dịch mẫu;
- ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa xác định được số khuẩn lạc;
- n1: Số lượng đĩa cấy đếm được khuẩn lạc tại độ pha loãng i;
- V: Thể tích dịch mẫu (ml) đã pha lỗng cấy vào mỗi đĩa;
- di: Độ pha loãng i.
<i>Lưu ý: Nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua mọc trên </i>
<i>môi trường dinh dưỡng agar đã chuẩn bị như sau: Vi khuẩn Lactobacillus cho khuẩn </i>
<i>lạc nhỏ, đường kính 1 - 5 mm, dạng trịn, trắng đục, bề mặt trơn nhẵn, có khả năng tạo </i>
vịng trong quanh khuẩn lạc (do sinh ra axit lactic phân giải CaCO3); vi khuẩn
<i>Streptococcus cho khuẩn lạc trịn, đường kính 0,5 - 3 mm, màu trắng sữa, bề mặt bóng, </i>
mọc lồi trên bề mặt mơi trường. Các khuẩn lạc có đặc điểm của vi khuẩn lactic có thể
tiếp tục cấy chuyển thêm một số lần để phân lập được chủng vi khuẩn lactic thuần
khiết.
<b> 4.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải thực hiện thành cơng 2 q
trình lên men lactic (sản phẩm sữa chua và rau/củ/quả muối chua) và xác định được
các đặc trưng của quá trình lên men.
- Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài) trình bày kết quả của các thí
nghiệm:
(i) Đánh giá chất lượng của sản phẩm lên men theo cảm quan. Kết quả trình bày
vào bảng dưới đây:
Loại sản
phẩm lên
men
Cấu trúc Màu sắc Mùi
Vị
Điểm
chấm
theo thị
hiếu
Trước
lên
men
Sau
lên
men
Trước
lên
men
Sau
lên
men
Trước
lên
men
Sau
lên
men
Sữa chua
Rau/củ/quả
muối chua
</div>
<span class='text_page_counter'>(43)</span><div class='page_container' data-page=43>
Loại sản
phẩm lên
men
pH Nồng độ axit
lactic (% w/v) Nồng độ axit
lactic tạo thành
trong quá trình
lên men
Đánh giá
hiệu quả của
quá trình lên
men
Trước
lên
men
Sau
lên
men
Trước
lên
men
Sau
lên
men
Sữa chua
Rau/củ/quả
muối chua
<i>Ghi chú: Nồng độ axit lactic tạo thành trong quá trình lên men bằng hiệu số của </i>
nồng độ axit lactic trong sản phẩm trước và sau lên men
(iii) Xác định các đặc trưng về thành phần vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn
lactic trong sản phẩm sữa chua (số loại vi khuẩn lactic và số lượng tế bào vi khuẩn
tương ứng với từng loại). Kết quả xử lý và thống kê vào bảng dưới đây:
Ký
hiệu
vi
sinh
vật
Hình thái khuẩn lạc
Số lượng khuẩn lạc
đếm được ở nồng
độ pha loãng Số lượng <sub>tế bào </sub>
(CFU/ml)
Số
lượng tế
bào vi
sinh vật
tổng số
Đường
kính (mm)
Màu
sắc
Hình
dạng 10-7 10-8 10-9
<i>Ghi chú: CFU - Colony Forming Unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc). </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(44)</span><div class='page_container' data-page=44>
Loại sản phẩm
lên men vi khuẩn Ký hiệu Thuộc loại Gram Hình dạng tế bào
Sữa chua
Rau/củ/quả muối
chua
- Hoàn thành các câu hỏi sau:
+ Mơ tả hình dạng của nhóm vi khuẩn lactic?
+ Đa số vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương hay Gram âm?
+ Loại cơ chất khơng thể thiếu cho q trình lên men lactic là gì?
+ Điều kiện mơi trường vật lý thích hợp q trình lên men lactic thực hiện bởi
nhóm vi khuẩn lactic?
</div>
<span class='text_page_counter'>(45)</span><div class='page_container' data-page=45>
<b>Bài 5 </b>
<b>QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETIC </b>
<b>5.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
<i>Củng cố kiến thức về ngun lý và vai trị của nhóm vi khuẩn Acetobacter trong </i>
công nghệ sản xuất giấm ăn và sản xuất axit acetic.
Yêu cầu
Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành quá trình lên men sinh axit acetic từ nguồn
cơ chất ban đầu là bia, qua đó rèn luyện các kỹ năng: thao tác thực hiện quá trình lên
men tận dụng nguồn vi sinh vật có lợi phân bố phổ biến trong tự nhiên, xác định hiệu
suất lên men bằng các phương pháp hóa sinh.
<b>5.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Lên men acetic là một quá trình chuyển hóa hiếu khí để oxi hóa ethanol thành
axit acetic. Phương trình tổng quát của quá trình này diễn ra như sau:
CH3CH2OH + O2 →<b> CH</b>3COOH + H2O + 117 kcal
Các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm nhiều loại, chủ yếu là giống
<i>Acetobacter. Đặc điểm chung của nhóm vi khuẩn Acetobacter là trực khuẩn liên kết </i>
<i>thành chuỗi, gram âm, không sinh bào tử, hầu hết khơng có khả năng chuyển động và </i>
<i>hơ hấp hiếu khí bắt buộc. Khi phát triển các vi khuẩn Acetobacter thường tạo trên bề </i>
mặt dịch lên men một vết láng nhầy màu xám trắng thường gọi là con giấm. Điều
kiện thích hợp cho quá trình lên men tạo axit acetic từ ethanol là mơi trường dinh
dưỡng có pH 3,0, nồng độ ethanol trong khoảng 6 - 12%, ở nhiệt độ 28 - 30ºC.
<i>Trong thực tế các loài Acetobacter được dùng trong công nghiệp thường gặp gồm: </i>
<i>- A. aceti: Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi, khơng di động, có khả </i>
<i>năng chịu được độ rượu khá cao, có màu vàng khi nhuộm lugol; </i>
<i>- A. pasteurianum: Tế bào hình que, có khi xếp thành sợi dài, tạo thành lết váng </i>
<i>khơ nhăn nheo, có màu xanh khi nhuộm lugol; </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(46)</span><div class='page_container' data-page=46>
<b>5.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>5.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
- Hóa chất: phenolphthalein 0,1%, ethanol 96º, NaOH 0,1N, H2SO4 đậm đặc.
- Dụng cụ: bình tam giác, puret, pipet, lam kính, lamen, đèn cồn...
- Thiết bị: tủ ấm, cân kỹ thuật, box cấy vô trùng.
<i><b>5.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>5.3.2.1. Lên men tạo axit acetic </i>
- Chuẩn bị môi trường cho lên men acetic: Cho vào dụng cụ thủy tinh có miệng
rộng (thể tích 100 ml) các chất sau: 30 - 40 ml bia, 0,5 ml rượu etylic.
- Để dụng cụ này ngồi khơng khí vài giờ (tạo điều kiện cho nhóm vi khuẩn lên
men tạo axit acetic trong khơng khí lây nhiễm vào mơi trường), đậy bình mơi trường
bằng vải màn mỏng, cho vào tủ ấm 25 - 30ºC trong 72 - 120h.
- Thu hồi sản phẩm lên men khi thấy xuất hiện một màng mỏng màu xám trắng
<i>do các tế bào vi khuẩn Acetobacter liên kết tạo thành trên bề mặt môi trường, ngửi </i>
bình mơi trường thấy có mùi giấm.
<i>5.3.2.2. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men acetic </i>
<i>a. Đánh giá theo cảm quan </i>
Đánh giá quá trình lên men theo cảm quan bằng quan sát và ngửi mùi.
<i>b. Định tính phát hiện sự có mặt của axit acetic trong dịch lên men </i>
Nguyên tắc: Dựa vào các phản ứng đặc trưng của axit acetic với các chất khác
nhau để xác định sự có mặt của axit acetic trong quá trình lên men.
Thực hiện 2 thí nghiệm định tính axit acetic:
<i>Thí nghiệm 1: Phản ứng tạo thành ethyl acetate. </i>
- Cho vào ống nghiệm các chất sau: 5 ml dịch lên men + 0,5 ml rượu etylic 96%
+ 3 ml H2SO4 đậm đặc.
- Đun nóng ống nghiệm trên đèn cồn và thấy mùi thơm bay ra do ethyl
acetate tạo thành. Điều này chứng tỏ trong thành phần dịch lên men có axit
acetic.
</div>
<span class='text_page_counter'>(47)</span><div class='page_container' data-page=47>
<i>Thí nghiệm 2: Phản ứng tạo thành sắt acetate. </i>
- Cho vào ống nghiệm các chất sau: 3 ml dịch lên men + 1 ml NaOH 20% + vài
giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều ống nghiệm.
- Đun nóng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch có axit acetic thì sẽ
có màu đỏ thẫm do sắt acetate được tạo thành.
Phương trình phản ứng:
CH3COOH + NaOH → CH3COONa + H2O 3CH3COONa + FeCl3 →
Fe(CH3COO)3 + 3NaCl
<i>c. Phản ứng định lượng axit acetic </i>
- Cho vào bình tam giác có thể tích 100 ml: 10 ml dịch lên men; 1 - 2 giọt dung
dịch phenolphtalein 0,1%.
- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền
trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại số ml NaOH đã dùng để chuẩn độ.
Độ axit acetic được tính như sau:
N (% w/v) = VNaOH 0,1N x 10 x 0,006
Trong đó: N = Độ axit acetic (%).
0,006 là hệ số chuyển đổi thể tích NaOH 0,1N thành axit acetic.
<i>d. Quan sát hình dạng nhóm vi khuẩn sinh axit acetic dưới kính hiển vi </i>
- Làm tiêu bản vết bôi vi khuẩn sinh axit acetic lên phiến kính và nhuộm màu vi
khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram (thực hiện theo các bước như ở mục c của
phần 4.3.2.3, bài 4 - Quá trình lên men lactic).
- Quan sát hình dạng nhóm vi khuẩn lên men tạo axit acetic ở vật kính x40 và
vẽ hình dạng của vi khuẩn.
</div>
<span class='text_page_counter'>(48)</span><div class='page_container' data-page=48>
(i) Đánh giá bằng cảm quan và định tính, định lượng axit acetic. Kết quả được
xử lý, thống kê vào bảng:
Thí
nghiệm
Đặc trưng của q trình lên men acetic
Kết luận
Đánh giá bằng
cảm quan Định tính Nồng độ
axit
acetic
(%)
Màu sắc Mùi Phản ứng tạo ethyl
acetate
Phản ứng
tạo sắt
acetate
(ii) Xác định hình dạng tế bào và tính chất Gram của vi khuẩn sinh axit acetic:
Kết quả thống kê vào bảng:
Tiêu bản Thuộc loại Gram Hình dạng vi khuẩn
- Hồn thành các câu hỏi:
+ Giải thích cơ chế của phản ứng tạo thành axit acetic từ ethanol nhờ nhóm vi
khuẩn sinh axit aceitic?
</div>
<span class='text_page_counter'>(49)</span><div class='page_container' data-page=49>
<b>Bài 6 </b>
<b>QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI CELLULOSE NHỜ VI SINH VẬT </b>
<b>6.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Giúp sinh viên củng cố kiến thức về quá trình phân giải cellulose trong thành tế
bào thực vật bởi một số nhóm vi sinh vật trong tự nhiên, và ứng dụng của quá trình
đó trong cơng nghiệp sản xuất giấy, trong cơng nghệ sản xuất ethanol từ nguồn cơ
chất cellulose thực vật.
Yêu cầu
Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành q trình phân giải cellulose hiếu khí nhờ vi
sinh vật có hoạt tính cellulase trong đất.
<b>6.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Cellulose là một phần rất cơ bản của tổ chức thực vật. Tham gia phân giải
cellulose có nhiều nhóm vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Dưới tác
dụng của men cellulase do vi sinh vật tiết ra, cellulose bị phân giải thành cellobiose
và sau đó nhờ men cellobioase bị phân giải tiếp thành glucose theo phương trình:
(C6H10O5) + nH2<b>O → nC</b>12H22O11 + nH2<b>O → nC</b>6H12O6
Trong điều kiện hiếu khí, glucose tiếp tục được oxi hóa bởi nhóm vi sinh vật
hiếu khí thành CO2 và H2O theo phương trình:
Trong điều kiện kị khí, glucose bị phân giải theo cơ chế của quá trình lên men
butyric theo phương trình:
C6H12O6<b> → CH</b>3CH2CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2 + Q
</div>
<span class='text_page_counter'>(50)</span><div class='page_container' data-page=50>
Thành phần Hàm lượng
KNO3 2,5 g
KH2PO4 1 g
MgSO4 0,5 g
NaCl 0,5 g
FeSO4 0,01 g
Mn2(SO4)3 0,01 g
Nước cất 200 ml
Môi trường được khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.
- Dụng cụ: ông nghiệm, giấy lọc.
- Thiết bị: tủ ấm, cân kỹ thuật.
<i><b>6.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
- Cho vào ống nghiệm 4 - 5 ml môi trường Vinogratxki lỏng vô trùng.
- Cắt giấy lọc thành dải hình chữ nhật sao cho đường chiều ngang dải giấy lọc
nhỏ hơn đường kính ống nghiệm.
- Dùng kẹp sắt kẹp một đầu dải giấy lọc đặt vào ống nghiệm chứa môi trường
sao cho một đầu giấy lọc ngập vào môi trường, đầu kia nằm trên miệng ống nghiệm.
- Cho vào ống nghiệm 0,1 g đất (nguồn vi sinh vật).
- Đặt ống nghiệm vào tủ ấm, giữ ở 30ºC trong 7 - 15 ngày.
- Kiểm tra kết quả: Các vi sinh vật phân giải cellulose phát triển, tiết ra men
cellulase phân giải cellulose làm cho giấy bị phân hủy, hóa nhày, có màu vàng,
hồng, lục. Chất nhày có màu sắc chính là sinh khối của vi khuẩn phân giải
cellulose.
<b>6.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
</div>
<span class='text_page_counter'>(51)</span><div class='page_container' data-page=51>
Ký hiệu
mẫu
Vị trí giấy lọc bị phân hủy
Mức độ phân
giải giấy lọc
Số vị trí
bị phân
hủy
Đường kính trung bình
của vùng bị phân hủy
(mm)
</div>
<span class='text_page_counter'>(52)</span><div class='page_container' data-page=52>
<b>Bài 7 </b>
<b>XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT </b>
<b>7.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Củng cố kiến thức về sự hình thành các sản phẩm được tạo ra trong quá trình
trao đổi chất của vi sinh vật như enzyme và vai trò của enzyme việc phân giải cơ chất
trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật.
Yêu cầu
Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành xác định hoạt tính amylase được tạo ra
trong quá trình trao đổi chất của một số lồi vi sinh vật khi ni trong mơi trường
dinh dưỡng lỏng. Qua các thí nghiệm thực hành, sinh viên được hình thành và rèn
luyện kỹ năng: nuôi cấy vi sinh vật, xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật.
<b>7.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Enzyme ngoại bào của vi sinh vật được tạo ra trong tế bào, sau đó tiết vào mơi
trường trong q trình ni cấy để thực hiện chức năng cụ thể, phục vụ các hoạt động
trao đổi chất của vi sinh vật.
Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các vi sinh vật khác nhau có
hoạt tính và tính chất khác nhau. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme
và hiệu suất thu hồi enzyme, ví dụ đặc điểm chủng giống, môi trường và điều kiện
vật lý trong quá trình ni cấy...
<b>7.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>7.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
<i>- Giống vi sinh vật: Các ống giống Bacillus subtilis và Aspergillus niger. </i>
<i>- Môi trường xác định hoạt tính amylase ngoại bào của vi sinh vật: </i>
Thành phần Hàm lượng
NaNO3 1 g
K2HPO4 1 g
</div>
<span class='text_page_counter'>(53)</span><div class='page_container' data-page=53>
Thành phần Hàm lượng
MgSO4 0,5 g
FeSO4 0,01 g
Tinh bột tan 10 g
Nước cất 1.000 ml
<i>Lưu ý: Tinh bột hòa tan vào nước ấm, khuấy đều, đun thành hồ rồi đổ vào hỗn </i>
hợp chất dinh dưỡng của môi trường. Điều chỉnh pH môi trường đến 6,5. Khử trùng
môi trường ở 121ºC trong 20 phút. Phân phối môi trường vào các đĩa petri.
- Thuốc nhuộm Lugol: 1 g I2 hòa tan trong 100 ml dung dịch KI 2%.
- Dụng cụ: đĩa petri, que cấy vi sinh vật, thước chia vạch.
- Thiết bị: tủ ấm điều nhiệt, cân phân tích, cân kỹ thuật.
<i><b>7.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>Xác định khả năng sinh amylase ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis và </i>
<i>nấm mốc Aspergillus niger bằng phương pháp cấy chấm điểm và đo đường kính </i>
vịng phân giải cơ chất xung quanh khuẩn lạc.
Tiến hành:
<i>- Dùng que cấy hình thước thợ lấy giống vi sinh vật (Bacillus subtilis, </i>
<i>Aspergillus niger) và cấy vào môi trường thạch đĩa thành những điểm (cấy chấm điểm); </i>
- Đặt các đĩa petri vào tủ ấm 30ºC trong thời gian 3 - 5 ngày đến khi vi sinh vật
phát triển tạo khuẩn lạc;
- Lấy đĩa cấy ra khỏi tủ ấm, rót dung dịch Lugol lên bề mặt thạch trong đĩa petri;
- Quan sát đường kính vịng phân giải tinh bột của amylase ngoại bào của các
chủng vi sinh vật (amylase ngoại bào do vi sinh vật tiết ra môi trường sẽ làm phân
giải tinh bột xung quanh các khuẩn lạc tạo thành vịng thủy phân khơng màu, trong
khi phần cịn lại trên đĩa có màu xanh do tinh bột phản ứng với I2 trong dung dịch
Lugol;
</div>
<span class='text_page_counter'>(54)</span><div class='page_container' data-page=54>
<b>7.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành cơng thí
<i>nghiệm kiểm tra khả năng sản sinh amylase ngoại bào của Bacillus subtilis và </i>
<i>Aspergillus niger. </i>
- Báo cáo kết quả thực hành: Quan sát, thống kê, xử lý kết quả và ghi vào bảng
dưới đây:
Loại vi sinh vật kiểm
tra hoạt tính enzyme
ngoại bào
Đường kính
vịng thủy
phân tinh
bột 1%
(D, mm)
Đường kính
khuẩn lạc
(d, mm)
Tỷ lệ
D/d Kết luận
<i>Bacillus subtilis </i>
<i>Aspergillus niger </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(55)</span><div class='page_container' data-page=55>
<b>Bài 8 </b>
<b>XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA VI SINH VẬT </b>
<b>8.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Giúp sinh viên củng cố kiến thức về khả năng sinh chất kháng sinh của vi sinh
vật, nắm vững phương pháp xác định hoạt tính sinh chất kháng sinh của vi sinh vật.
Yêu cầu
- Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh của hai loại
<i>vi sinh vật là vi khuẩn Bacillus subtilis, xạ khuẩn Actinomyces. </i>
- Hình thành và rèn luyện kỹ năng xác định khả năng sinh chất kháng sinh của
vi sinh vật; phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính kháng sinh cao.
<b>8.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Chất kháng sinh (antibiotic) là các chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng
ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc các vi sinh vật khác.
Trong tự nhiên, việc tổng hợp các chất kháng sinh sẽ tạo ưu thế cạnh tranh cho
các chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh, qua đó ức chế hoặc tiêu diệt sự phát triển
của các vi sinh vật khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái.
Trong công nghệ sản xuất chất kháng sinh, các nhà khoa học đã áp dụng phối
hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến để tạo ra những biến chủng cơng
nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh với hàm lượng cao gấp nhiều
lần so với các chủng tự nhiên. Các chủng vi sinh vật thường được khai thác khả năng
<i>sinh tổng hợp chất kháng sinh chủ yếu thuộc chi/loài: Penicillium chrysogenum, </i>
<i>Streptomyces, Cephalosporium, Acremonium, Streptococcus, Bacillus... </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(56)</span><div class='page_container' data-page=56>
<i>và xạ khuẩn Actinomyces; </i>
<i>+ Các ống giống vi sinh vật kiểm định gồm: vi khuẩn Escherichia coli, </i>
<i>Staphylococcus aureus, nấm mốc Fusarium, Aspergillus niger. </i>
<i>- Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy và xác định hoạt tính kháng </i>
sinh của vi sinh vật:
<i>+ Môi trường LB nhân giống vi khuẩn Bacillus subtilis: </i>
Thành phần Hàm lượng
Peptone 10 g
NaCl 5 g
Dịch chiết nấm men 5 g
Dẫn nước tới 1.000 ml
pH 7,0
Agar 20 g
<i>+ Môi trường Gause nhân sinh khối xạ khuẩn Actinomyces: </i>
Thành phần Hàm lượng
KNO3 1 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 0,5 g
NaCl 0,5 g
FeSO4 0,01 g
Tinh bột tan 20 g
Dẫn nước tới 1.000 ml
pH 7,0
</div>
<span class='text_page_counter'>(57)</span><div class='page_container' data-page=57>
+ Môi trường thạch - thịt - peptone xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật:
Thành phần Hàm lượng
Peptone 10 g
Cao thịt 5 g
pH 7,0
Agar 20 g
Sau khi pha chế, môi được hấp khử trùng ở 121ºC trong 20 phút, để nguội đến
50ºC sau đó phân phối vào các đĩa petri vơ trùng (thao tác trong box cấy).
- Dụng cụ: bình tam giác, đĩa petri, que cấy vi sinh vật…
- Thiết bị: tủ ấm ni vi sinh vật, cân phân tích, cân kỹ thuật.
<i><b>8.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>8.3.2.1. Nhân giống vi sinh vật sinh chất kháng sinh </i>
<i>- Lấy giống vi khuẩn Bacillus subtilis và xạ khuẩn Actinomyces trong ống </i>
nghiệm.
<i>- Cấy giống vi khuẩn Bacillus subtilis vào môi trường LB agar và xạ khuẩn </i>
<i>Actinomyces vào môi trường Gause agar trong đĩa petri. </i>
<i>- Nuôi cấy trong tủ ấm ở 37ºC trong 48h đối với vi khuẩn Bacillus subtilis và </i>
<i>120h đối với xạ khuẩn Actinomyces. </i>
<i>8.3.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật </i>
<i>- Cấy giống vi sinh vật kiểm định (vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus </i>
<i>aureus, nấm mốc Fusarium, Aspergillus niger) vào môi trường thạch - thịt - peptone </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(58)</span><div class='page_container' data-page=58>
các vi sinh vật kiểm định.
<i>Lưu ý: Có thể đặt có thể đặt sấp hay ngửa khối thạch. Đặt sấp khối thạch để xem </i>
tác dụng trực tiếp của kháng sinh do vi sinh vật tạo ra; đặt ngửa khối thạch để xác
định sự tiết kháng sinh ra ngồi mơi trường.
- Đặt các đĩa cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 30ºC trong thời gian 3 - 5 ngày.
- Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật bằng đo đường kính vịng vơ
khuẩn xung quanh khối thạch (nếu vi sinh vật sinh chất kháng sinh thì chất kháng
sinh sẽ tiêu diệt hoặc ức chế vi sinh vật kiểm định và tạo thành vịng vơ khuẩn xung
quanh khối thạch. Vịng vơ khuẩn càng lớn thì hoạt tính kháng sinh của chủng vi
sinh vật càng mạnh).
<b>8.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành cơng q
trình xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật.
- Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài). Trong bài thu hoạch trình bày
rõ kết quả về hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật và thống kê kết quả vào bảng dưới đây:
Vi sinh vật
sinh kháng
sinh
Vi sinh vật
kiểm định
Đường kính
vịng phân giải
(D, mm)
Đường kính lỗ
thạch
(d, mm)
Hoạt tính
kháng sinh
D - d (mm)
</div>
<span class='text_page_counter'>(59)</span><div class='page_container' data-page=59>
- Hoàn thành các câu hỏi sau:
+ Đánh giá về hoạt tính kháng sinh của hai chủng vi sinh vật là vi khuẩn
<i>Bacillus subtilis và xạ khuẩn Actinomyces? </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(60)</span><div class='page_container' data-page=60>
<b>Bài 9 </b>
<b>ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG QUÁ TRÌNH </b>
<b>PHÂN HỦY RÁC HỮU CƠ </b>
<b>9.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Giúp sinh viên hiểu rõ vai trị của vi sinh vật trong cơng nghệ vi sinh ứng dụng
không chỉ giới hạn bởi các sản phẩm của quá trình lên men thực phẩm, sản xuất
thuốc dùng trong y - dược, sản xuất thuốc trừ sâu… mà cịn đóng vai trị rất lớn trong
cơng nghệ xử lý rác thải, mơi trường.
u cầu
Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành thành cơng một thí nghiệm xử lý rác thải
hữu cơ với sự tham gia của các thành phần vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên, thực
<i>hiện trong điều kiện in vivo. </i>
<b>9.2. Kiến thức lý thuyết </b>
Từ xưa đến nay, các hoạt động do sinh hoạt và sản xuất công nghiệp của con
người vẫn tạo ra một lượng lớn rác thải mỗi ngày. Tuy nhiên, môi trường sống của
con người không bị ngập, nguồn nước và khơng khí khơng bị ơ nhiễm nặng bởi
những khối lượng rác thải khổng lồ. Bởi vì sao? Trước khi đề cập đến các biện pháp
tích cực của con người nhằm xử lý ơ nhiễm mơi trường đất, nước, khơng khí, cần
xem xét một hiện tượng rất quan trọng trong tự nhiên, giúp cho môi trường sinh thái
và môi trường sống được cân bằng, đó là q trình tự phân hủy rác thải rác thải và tự
làm sạch nguồn nước do các yếu tố sinh học, mà trong đó vi sinh vật đóng một vai trị
rất quan trọng.
</div>
<span class='text_page_counter'>(61)</span><div class='page_container' data-page=61>
trong những trường hợp thuận lợi nhất của mơi trường. Nói cách khác, vi sinh vật có
khả năng khống hóa một cách hồn tồn rất nhiều chất bẩn hữu cơ có trong rác thải.
<b>9.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>9.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
- Chế phẩm vi sinh phân giải rác hữu cơ chứa một số nhóm vi sinh vật như vi
<i>khuẩn Bacillus, vi khuẩn lactic, nấm mốc… </i>
- Dụng cụ: quốc, xẻng, nhiệt kế, nilon.
<i><b>9.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
Thực hành xử lý rác thải hữu cơ theo hai biện pháp: (i) Thực hiện phương pháp
ủ để tự phân hủy nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên (phân bố trong rác); (ii) ủ
rác hữu cơ với chế phẩm vi sinh vật phân hủy rác thải.
Cách thức tiến hành:
- Đào 2 hố vuông, mỗi hố có diện tích 1 m2<sub>; </sub>
- Thu rác thải hữu cơ gồm xác động thực vật, thức ăn thừa… đổ đầy 2 hố;
- Hố thứ nhất sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên phân hủy theo kiểu truyền thống;
- Hố thứ hai rắc đều vào đống rác chế phẩm vi sinh vật xử lý rác thải;
- Ủ kín bề mặt đống rác với mảnh nilon (chèn chặt với nilon);
- Sau 4 tuần ủ. Thống kê các chỉ tiêu ở mỗi đống rác:
+ Nhiệt độ đo được trong mỗi đống ủ: Đo bằng nhiệt kế;
+ Dung lượng rác trước và sau khi ủ: Đo thể tích rác trong đống ủ;
+ Nhận xét bằng cảm quan: quan sát, ngửi;
+ Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi: Làm tiêu bản và quan sát hệ vi sinh vật
ở vật kính x40;
+ Xác định sơ bộ số lượng vi sinh vật: Bằng phương pháp pha loãng và cấy trải
trên môi trường dinh dưỡng agar trong đĩa petri;
</div>
<span class='text_page_counter'>(62)</span><div class='page_container' data-page=62>
Cơng thức thí nghiệm
Nhiệt độ
đống ủ
(ºC)
Dung lượng rác
trong đống ủ (cm3<sub>) </sub> Hình thái các nhóm vi sinh <sub>vật chủ yếu </sub>
Trước ủ Sau ủ Vi khuẩn Nấm mốc
Phân hủy nhờ hệ vi sinh
vật có sẵn trong
tự nhiên
Phân hủy bằng chế
</div>
<span class='text_page_counter'>(63)</span><div class='page_container' data-page=63>
<b>Bài 10 </b>
<b>THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC TỪ VI KHUẨN </b>
<i><b>BACILLUS THURINGIENSIS </b></i>
<b>10.1. Mục tiêu và yêu cầu </b>
Mục tiêu
Giúp sinh viên nắm vững và hiểu thấu đáo về vai trò và hiệu quả của việc sử
<i>dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) để diệt trừ sâu hại cây nông - lâm nghiệp, </i>
và việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt trong canh tác sẽ giúp phát triển một nền
nông nghiệp xanh - sạch - bền vững.
Yêu cầu
Mỗi nhóm sinh viên phải thực hành để rèn luyện các kỹ năng:
- Kỹ năng nhân giống vi khuẩn Bt trong môi trường dinh dưỡng lỏng;
- Kỹ năng làm tiêu bản, xác định hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của vi
khuẩn Bt;
- Xác định hiệu quả diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bt trong phịng thí nghiệm.
<b>10.2. Kiến thức lý thuyết </b>
<i>Trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học thì thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bacillus </i>
<i>thurigiensis (thuốc trừ sâu Bt) luôn được ưu tiên sử dụng bởi hiệu quả diệt sâu mạnh, </i>
phổ kháng rộng với nhiều loại cơn trùng, đặc biệt có khả năng diệt mạnh nhiều loại
sâu ăn lá.
<i>Bacillus thurigiensis (Bt) là vi khuẩn đất, gram (+), có khả năng sinh nội bào tử </i>
và tinh thể độc, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí khơng bắt buộc, tế bào hình que (kích
thước khoảng 3 - 6µm), có tiêm mao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng
<i>đơn độc hoặc xếp thành chuỗi. Bacillus thurigiensis sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 - </i>
30ºC, pH 6,8 - 7,2.
</div>
<span class='text_page_counter'>(64)</span><div class='page_container' data-page=64>
<b>10.3. Nội dung thực hành </b>
<i><b>10.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu </b></i>
<i>- Giống vi sinh vật: Các ống giống vi khuẩn Bacillus thurigiensis thuần khiết. </i>
- Sâu ăn lá: Chuẩn bị 2 loại sâu ăn lá cây lâm nghiệp hoặc cây nơng nghiệp. Ví
<i>dụ: Sâu hại Dưa chuột, Dưa hấu thuộc loài Spodoptera litura Fabricius; sâu hại Cải </i>
<i>bắp và Su hào thuộc loại sâu tơ Plutella xylostella Linnaeus. Tương ứng với mỗi loại </i>
sâu cần chuẩn bị ít nhất 30 cá thể sâu đồng đều về kích thước và tuổi sâu.
- Thức ăn của sâu ăn lá: Tương ứng với loại sâu ăn lá được thu thập thì
chuẩn bị loại lá là thức ăn cho loại sâu đó. Ví dụ thu thập sâu ăn lá Dưa chuột thì
chuẩn bị thức ăn cho sâu là lá Dưa chuột. Lá tươi sau khi thu thập về được rửa
sạch và để khô tự nhiên.
<i>- Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng lỏng nhân sinh khối vi khuẩn Bt. </i>
Thành phần Hàm lượng
Cao thịt bò 10 g
Peptone 10 g
CaCl2 0,01 g
KH2PO4 . 7H2O 0,02 g
ZnSO4 . 7H2O 0,001 g
Dịch chiết nấm men 5 g
Glucose 10 g
Dẫn nước tới 1.000 ml
pH 7,0
Hóa chất được hịa tan vào nước và dẫn tới vạch định mức, điều chỉnh pH và
phân phối mơi trường dinh dưỡng vào các bình tam giác 250 ml (100 ml/bình). Khử
trùng mơi trường ở 118ºC trong 20 phút.
</div>
<span class='text_page_counter'>(65)</span><div class='page_container' data-page=65>
Trộn dung dịch 1 và 2 lại rồi pha loãng 5 lần.
- Dụng cụ: đĩa petri, bình tam giác 250 ml, pipet, cốc đong, lam kính, lamen,
panh, que cấy vi sinh vật…
- Thiết bị: box cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt ni vi sinh vật, kính hiển vi, cân
phân tích, cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử trùng…
<i><b>10.3.2. Thực hiện thí nghiệm </b></i>
<i>10.3.2.1. Nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus thurigiensis </i>
Thao tác cấy giống cho nhân sinh khối vi khuẩn Bt được thực hiện trong box cấy.
- Sử dụng que cấy vi sinh vô trùng lấy giống vi khuẩn Bt trong ống giống, cấy
vào bình chứa mơi trường dinh dưỡng lỏng.
- Ni các bình giống vi khuẩn Bt trong máy lắc ở 28ºC, tốc độ lắc 220
vòng/phút trong 72h.
<i>10.3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của vi khuẩn Bacillus </i>
<i>thurigiensis </i>
- Làm vết bơi sinh khối vi khuẩn trên lam kính.
- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin đậm đặc trong 1 phút.
- Rửa nhẹ bằng ethanol 10%, sau đó rửa với nước cất.
</div>
<span class='text_page_counter'>(66)</span><div class='page_container' data-page=66>
<b>Hình 10.1. Hình dạng bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn </b>
<i><b>Bacillus thurigiensis </b></i>
<i>10.3.2.3. Xác định khả năng diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bacillus thurigiensis </i>
- Sử dụng panh vô trùng gắp lá nhúng vào dịch môi trường dinh dưỡng chứa
sinh khối vi khuẩn Bt đã được nhân lên.
- Gắp lá ra khỏi môi trường, để ráo bớt dịch sau đó cho vào các đĩa petri. Trên
thành đĩa petri ghi rõ chủng Bt, nồng độ pha lỗng, ngày thí nghiệm...
- Thả sâu vào các lơ thí nghiệm với số lượng 10 sâu/đĩa.
- Đậy các đĩa petri bằng vải màn thưa để đảm bảo mơi trường trong đĩa ln
được thống khí.
- Đặt các đĩa thí nghiệm trong phịng có nhiệt độ 25ºC.
- Ở lô đối chứng, thức ăn của sâu được nhúng vào môi trường lên men vô trùng
đã chuẩn bị sẵn (khơng có vi khuẩn Bt) và tiếp cho sâu ăn với lượng thức ăn và lượng
sâu như tiến hành với các lơ thí nghiệm có dịch Bt.
- Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24h, 48h, 72h
ở tất cả các lơ thí nghiệm.
</div>
<span class='text_page_counter'>(67)</span><div class='page_container' data-page=67>
Trong đó:
- A: Tỷ lệ (%) sâu chết;
- C: Số sâu sống sót ở lơ đối chứng;
- T: Số sâu sống sót ở lơ thí nghiệm.
<b>10.4. Kiểm tra, đánh giá </b>
- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành cơng các thí
nghiệm: Nhân sinh khối vi khuẩn Bt, xác định hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể
độc của vi khuẩn Bt; xác định khả năng diệt sâu ăn lá của Bt.
- Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài). Trong bài thu hoạch trình bày
rõ kết quả của các thí nghiệm:
(i) Làm tiêu bản quan sát vi khuẩn Bt dưới kính hiển vi, xác định hình dạng
tế bào, bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn Bt. Kết quả thí nghiệm trình bày trong
bảng:
Tiêu bản Hình dạng tế bào Hình dạng bào tử Hình dạng tinh <sub>thể độc </sub>
1
2
3
(ii) Xác định khả năng diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bt, kết quả thống kê ở
bảng:
</div>
<span class='text_page_counter'>(68)</span><div class='page_container' data-page=68>
- Hoàn thành các câu hỏi sau:
+ Cơ chế diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bt?
+ Đánh giá và rút ra kết luận về hiệu quả diệt sâu hại cây trồng của Bt?
+ Lợi ích của việc sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong bảo vệ thực vật?
</div>
<span class='text_page_counter'>(69)</span><div class='page_container' data-page=69>
<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO </b>
<i>1. Kiều Hữu Ảnh (2010). Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm. NXB Giáo dục Việt Nam. </i>
<i>2. Lương Đức Phẩm (2012). Giáo trình cơng nghệ lên men. NXB Giáo dục Việt Nam. </i>
<i>3. Ngơ Đình Bính (2005). Thuốc trừ sâu vi sinh. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. </i>
<i>4. Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành Hóa sinh học. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. </i>
<i>5. Trần Thanh Thủy (1998). Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học. NXB Giáo dục </i>
Việt Nam.
<i>6. McNeil B, Harvey L (2008). Practical fermentation technology. John Wiley & </i>
Sons, Ltd.
<i>7. Morello JA, Granato PA, Mizer HE (2003). Laboratory Manual and Workbook in </i>
<i>Microbiology. The McGraw - Hill Companies. </i>
</div>
<!--links-->
