Nghiên cứu sản xuất fructooligosaccharide (fos) bởi chế phẩm pectinex ultra sp l cố định trên alginate

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

HUỲNH DUY TÂN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
FRUCTOOLIGOSACCHARIDE (FOS) BỞI ENZYME
PECTINEX ULTRA SP–L CỐ ĐỊNH TRÊN ALGINATE

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, 06/2012


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa–ĐHQG–HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Cán bộ chấm nhận xét 1: .......................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 2: .......................................................................................
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ............................................................
2. ............................................................
3. ............................................................
4. ............................................................
5. ............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KTHH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Huỳnh Duy Tân

MSHV: 10310616

Ngày, tháng, năm sinh: 22/01/1986

Nơi sinh: Bình Dương

Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học

Mã số : 604280

I. TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS) BỞI
ENZYME PECTINEX ULTRA SP–L CỐ ĐỊNH TRÊN ALGINATE

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: ..................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :.................................................................................
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: ...............................................................
IV.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. Huỳnh Ngọc Oanh

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 2012
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

TS. Huỳnh Ngọc Oanh

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

PGS. TS. Nguyễn Đức Lượng
TRƯỞNG KHOA KTHH
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi chân thành gửi lời cảm ơn
đến:
Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh – Bộ môn công nghệ Sinh Học, Đại học Bách
Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Cơ đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình trong suốt
quá trình thực hiện đề tài. Cô luôn động viên tinh thần, chỉ ra phương hướng cho

tơi trong những lúc gặp khó khăn trong công việc và tạo mọi điều kiện thuận lợi
để tơi hồn thành tốt đề tài.
Các Thầy Cơ của tơi – Phó giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đức Lượng, Phó giáo sư
Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương, Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Tiến Sĩ Huỳnh Ngọc
Oanh. Thầy Cô đã dạy tôi suốt thời sinh viên và cao học, luôn luôn tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong việc học tập, Thầy Cô đã truyền đạt cho tôi nhiều kinh
nghiệm làm việc, những kiến thức quý báo về chuyên môn, và quan trọng là về
kỹ năng sống.
Chị Trần Trúc Thanh – là cán bộ phịng thí nghiệm Bộ Mơn Cơng nghệ sinh
học – đã tạo điều kiện thuận lợi về dụng cụ, thiết bị để tơi có thể tiến hành thí
nghiệm.
Các bạn khóa 2004 ngành Cơng Nghệ Sinh Học: Nguyễn Thị Huyền Trang,
Đỗ Thị Hoàng Tuyến, Huỳnh Nguyễn Anh Khoa, Lý Trần Thụy Vi, Lê Tuyết
Minh, đã chia sẻ cho tôi nhiều kinh nghiệm học tập.
Em Nguyễn Thị Hải sinh viên khóa 2007 ngành Cơng nghệ sinh học đã hổ
trợ tích cực cho tơi trong suốt q trình thực nghiệm.
Con xin cảm ơn Ba Mẹ, gia đình và những người thương yêu nhất đã luôn
là chỗ dựa vững chắc, khuyến khích động viên con.

i


TÓM TẮT
Fructooligosaccharide (FOS) từ sucrose, chất ngọt thay thế mới với đặc tính
năng lượng thấp, an tồn cho người bệnh tiểu đường, là một trong các prebiotic,
FOS kết hợp với probiotic tạo thành synbiotic. Chế phẩm Pectinex Ultra SP–L,
trong đó có enzyme fructosyltransferase, xúc tác phản ứng tạo ra các
fructooligosaccharide mạch ngắn. Luận văn này được thực hiện nhằm mục tiêu
nâng cao hàm lượng FOS trong quá trình sản xuất sử dụng enzyme cố định.
Nghiên cứu gồm có 5 phần:

+ Khảo sát điều kiện cố định: sử dụng quy hoạch thực nghiệm –
phương pháp cấu trúc có tâm (CCD) xác định được điều kiện tối ưu cho quá
trình cố định enzyme trên gel alginate. Kết quả thu được: nồng độ alginate
3,3 (%), tỉ lệ enzyme:alginate là 0,79 (g/g), nồng độ CaCl2 3,75 (%), hiệu
suất cố định protein đạt 73,32 (%).
+ Kết quả tối ưu cho điều kiện phản ứng: 60 (oC), vận tốc lắc 90
(vòng/phút), nồng độ sucrose ban đầu 50 (%), pH phản ứng 5,75.
+ Khảo sát điều kiện sản xuất: ở 20 (h) cho hàm lượng FOS cao
nhất đối với hệ thống phản ứng dạng cột. Tổng hàm lượng FOS trong mẫu
sử dụng eznyme cố định sản xuất đạt 47,87 (%), trong đó 1–kestose chiếm
37,06 (%), cịn lại 10,81 (%) là nystose và fructofuranosylnystose. Khả
năng sản xuất FOS của enzyme cố định khi so với enzyme tự do là khá cao,
lên đến 89,49 (%).
+ Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định sau quá trình
sản xuất. Kết quả đối với hệ thống phản ứng dạng lắc ở lần tái sử dụng thứ
4 hoạt tính cịn 48,77 (%). Đối với hệ thống phản ứng dạng cột ở lần tái sử
dụng thứ 11 hoạt tính cịn 49,93 (%).
+ Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản của enzyme cố định.
Kết quả sau 30 ngày bảo quản lạnh (2 oC – 6 oC) hoạt tính enzyme cố định
cịn 84,95 (%), trong khi đó thì enzyme cố định bảo quản trong dung dịch
CaCl2 (2 oC – 6 oC) còn 57,19 (%).

ii


ABTRACTS
Fructooligosaccharides (FOS) from sucrose, new alternative sweeteners
with functional properties such as low calories, no cariogenicity, safety for
diabetics, prebiotics, combine with probiotics: synbiotics. Pectinex Ultra SP–L,
a commercial enzyme preparation containing fructosyltransferase activity, was

immobilized onto alginate gel and was used for the production of
fructooligosaccharides. Condition optimum of immobilization is 3,3 (%) alginate
(w/v), rate 0,79 (g) enzyme : 1 (g) alginate, 3,75 (%) CaCl2. The immobilized
enzyme showed in activity for 11 batch reactions. Optimum conditions were
affected by immobilization, and the optimum pH, temperature, shaking for
immobilized enzyme were 5,75, 60 (oC) and 90 (rppm), respectively.
Immobilized enzyme was more stable at high temperatures. The amount of
fructooligosaccharides produced from 50% (w/v) sucrose solution using the
immobilized enzyme was determined to be approximately 47,87 (%) of the total
sugar in the reaction mixtures. Production possibility FOS by immobilized
enzyme in comparison with free enzyme be well high, go up to 89,49 (%) and
immobilized enzyme retains its activity for 30 days.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan rằng, ngoại trừ các kết quả tham khảo từ các cơng trình khác như đã
ghi rõ trong luận văn, các cơng việc trình bày trong luận văn này là do chính tơi
thực hiện và chưa có phần nội dung nào của luận văn này được nộp để lấy một bằng
cấp ở trường này hoặc trường khác.
Tp.HCM, ngày…..tháng…..năm 2012.
Huỳnh Duy Tân

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
TÓM TẮT ............................................................................................................... ii

ABTRACTS ........................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ viii
DANH MỤC ẢNH ................................................................................................. ix
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. ix
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... xi
DANH MỤC SƠ ĐỒ............................................................................................. xii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2. Luận điểm mới của đề tài ................................................................................ 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2
1.4. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1. Tổng quan về FOS .......................................................................................... 4
2.1.1. Khái niệm FOS ....................................................................................... 4
2.1.2. Nguồn gốc và cấu tạo FOS ..................................................................... 5
2.1.3. Tính chất của FOS .................................................................................. 7
2.1.4. Ảnh hưởng của FOS với sức khỏe con người .......................................... 8
2.1.5. Tính an tồn và ứng dụng của FOS ....................................................... 13
2.1.6. Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam ........................................... 14
2.1.7. Một số nghiên cứu sản xuất FOS trên thế giới ...................................... 15
2.2. Tổng quan về enzyme fructosyltransferase .................................................... 20
2.2.1. Khái niệm chung về enzyme ................................................................. 20
2.2.2. Enyme fructosyltransferase ................................................................... 21
2.3. Enzyme cố định ............................................................................................ 22
2.3.1. Sơ lược về enzyme cố định ................................................................... 22
2.3.2. Phương pháp cố định enzyme ............................................................... 23
2.3.2.1. Phương pháp nhốt enzyme ............................................................. 23
2.3.2.2. Phương pháp liên kết enzyme với chất mang .................................. 23
2.4. Vật liệu cố định enzyme ................................................................................ 25
2.4.1. Phân loại chất mang.............................................................................. 25

v


2.4.2. Khái quát về alginate ............................................................................ 26
2.4.2.1. Cấu trúc hạt gel khi cố định enzyme ............................................... 29
2.4.2.2. Ứng dụng của alginate .................................................................... 30
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 32
3.1. Vật liệu và thiết bị ......................................................................................... 32
3.1.1. Vật liệu ................................................................................................. 32
3.1.2. Thiết bị ................................................................................................. 32
3.2. Phương pháp ................................................................................................. 32
3.2.1. Phương pháp xác định các thông số cơ bản ........................................... 32
3.2.1.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp
Bradford ......................................................................................... 32
3.2.1.2. Phương pháp xác định đường khử bằng DNS ................................. 32
3.2.1.3. Xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra
SP–L tự do và cố định .................................................................... 32
3.2.2. Phương pháp tính tốn .......................................................................... 34
3.2.3. Phương pháp tiến hành nghiên cứu ....................................................... 36
3.2.3.1. Quy hoạch thực nghiệm.................................................................. 36
3.2.3.2. Quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SP–L trên chất mang
alginate........................................................................................... 41
3.2.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất sucrose
ban đầu, vận tốc lắc đến hoạt tính của enzyme ............................... 43
3.2.3.4. Sản xuất FOS từ chế phẩm enzyme cố định .................................... 45
3.2.3.5. Tái sử dụng chế phẩm enzyme cố định ........................................... 45
3.2.3.6. Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm enzyme cố định ............ 45
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................... 46
4.1. Đường chuẩn................................................................................................. 46
4.1.1. Đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose .......................... 46

4.1.2. Đường chuẩn xác định hàm lượng protein ............................................ 47
4.2. Tối ưu hóa q trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SP–L trên chất mang
alginate ......................................................................................................... 48
4.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của chế
phẩm enzyme tự do ....................................................................................... 56
4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme tự do ........................... 56
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến chế phẩm enzyme tự do ................................... 57

vi


4.3.3.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose ban đầu đến chế phẩm enzyme
tự do ..................................................................................................... 58

4.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của chế
phẩm enzyme cố định ................................................................................... 59
4.4.1. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính fructosyltransferase của chế
phẩm enzyme cố định ........................................................................... 59
4.4.1.1. Bước đầu sử dụng quy hoạch thực nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng
của pH và nhiệt độ.......................................................................... 59
4.4.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm enzyme
cố định ........................................................................................... 62
4.4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm enzyme cố định
....................................................................................................... 63
4.4.2. Ảnh hưởng của vận tốc lắc đến khả năng hoạt động của chế phẩm
enzyme cố định ..................................................................................... 65
4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose đến khả năng hoạt động của chế
phẩm enzyme cố định ........................................................................... 67

4.5. Sản xuất FOS ................................................................................................ 68
4.5.1. Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự do .................................... 68
4.5.2. Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme cố định trong hệ thống phản
ứng dạng lắc ......................................................................................... 71
4.5.3. Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme cố định trong hệ thống phản
ứng dạng cột ......................................................................................... 73
4.5.4. So sánh hiệu quả sản xuất FOS giữa hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ
thống phản ứng dạng cột ....................................................................... 75
4.6. Kết quả phân tích Sắc kí lỏng cao áp (HPLC) ............................................... 77
4.7. Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme cố định ....................... 85
4.8. Khảo sát điều kiện bảo quản của chế phẩm enzyme cố định .......................... 87
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 90
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 90
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 92
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 97

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA: Analysis of Variance – Giải tích phương sai
bđ: ban đầu
CCD : Central Composite Design – Thiết kế đáp ứng tâm
cđ, cd: cố định
Ecđ, Ecd: enzyme cố định
Etd: enzyme tự do
F: fructose
FOS: Fructooligosaccharide
E/Alg, Enzyme/Alginate: tỉ lệ enzyme trên alginate

G: glucose, GF : Sucrose, GF2 : 1–kestose hoặc kestose, GF3 : nytose
GF4 :1F–fructofuranosylnytose hoặc fructofuranosylnytose
h: thời gian (giờ)
HPLC: sắc kí lỏng cao áp
HS cđ enzyme : hiệu suất về hoạt tính của enzyme cố định
HS cđ protein : hiệu suất cố định protein
HS HT : hiệu suất hoạt tính
HT: hoạt tính
HT enzyme cđ : hoạt tính enzyme cố định
HT enzyme td : hoạt tính enzyme tự do
RSM: Response Surface Mothodology – Phương pháp đáp ứng bề mặt
STT: số thứ tự
td: tự do
UI: đơn vị hoạt tính

viii


DANH MỤC ẢNH
Ảnh 4.1: Kết quả phân tích tính tốn ANOVA bằng phần mềm Design – Expert 7.0
(Tối ưu điều kiện cố định)....................................................................... 51
Ảnh 4.2: Kết quả phân tích tính tốn phương trình hồi quy bằng phần mềm Design
– Expert 7.0 (Tối ưu điều kiện cố định)................................................... 52
Ảnh 4.3: Mặt đáp ứng bậc 2 thể hiện sự tổ hợp 2 yếu tố:
tỉ lệ Enzyme/Alginate – Alginate ............................................................. 53
Ảnh 4.4: Mặt đáp ứng bậc 2 thể hiện sự tổ hợp 2 yếu tố: CaCl2 – Alginate ........... 53
Ảnh 4.5: Mặt đáp ứng bậc 2 thể hiện sự tổ hợp 2 yếu tố:
CaCl2 – tỉ lệ Enzyme/Alginate ................................................................ 54
Ảnh 4.6: Chương trình tính tốn và đưa ra dự đốn các điểm tối ưu điều kiện ....... 54
Ảnh 4.7: Kết quả phân tích tính tốn ANOVA bằng phần mềm Design – Expert 7.0

(Tối ưu điều kiện phản ứng).................................................................... 61
Ảnh 4.8: Sự ảnh hưởng của pH kiềm lên cấu trúc của hạt enzyme cố định............. 63
Ảnh 4.9: Hệ thống phản ứng dạng cột.................................................................... 74

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả ................................................. 5
Bảng 2.2: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác..................................... 7
Bảng 2.3: Tình hình sản xuất mía đường của Việt Nam năm 2010–2011 ............... 15
Bảng 2.4: Lượng FOS hình thành theo thời gian phản ứng .................................... 19
Bảng 2.5: Một số ứng dụng của alginate ................................................................ 31
Bảng 3.1: Thí nghiệm tối ưu điều kiện cố định theo mơ hình hóa tối ưu hóa 3 yếu tố
............................................................................................................... 42
Bảng 3.2: Thí nghiệm tối ưu điều kiện phản ứng theo mơ hình hóa tối ưu hóa 2 yếu
tố ............................................................................................................ 44
Bảng 4.1: Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu glucose chuẩn ............................. 46
Bảng 4.2: Hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP–L tự do 47
Bảng 4.3: Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu protein chuẩn ............................. 47
Bảng 4.4: Hàm lượng protein trong mẫu chế phẩm Pectinex Ultra Sp–L tự do ...... 48

ix


Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm khảo sát điều kiện cố định theo mơ hình hóa tối ưu
hóa 3 yếu tố ............................................................................................ 49
Bảng 4.6: Các phương án tối ưu chương trình dự đốn và kết quả khảo sát thực
nghiệm.................................................................................................... 56
Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm khảo sát điều kiện phản ứng của chế phẩm enzyme cố
định theo mơ hình hóa tối ưu hóa 2 yếu tố .............................................. 60
Bảng 4.8: So sánh sự thủy phân sucrose khi chỉnh pH acid và không chỉnh pH ..... 62
Bảng 4.9: Kết quả tối ưu khảo sát nhiệt độ phản ứng của chế phẩm enzyme cố định

............................................................................................................... 64
Bảng 4.10: Kết quả tối ưu khảo sát vận tốc lắc của chế phẩm enzyme cố định ....... 67
Bảng 4.11: Kết quả tối ưu khảo sát nồng độ cơ chất sucrose ban đầu của chế phẩm
enzyme cố định ..................................................................................... 67
Bảng 4.12: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme tự do ........ 69
Bảng 4.13: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme cố định
trong hệ thống phản ứng dạng lắc .......................................................... 72
Bảng 4.14: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme cố định
trong hệ thống phản ứng dạng cột ........................................................... 74
Bảng 4.15: So sánh hiệu quả sản xuất FOS giữa hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ
thống phản ứng dạng cột ....................................................................... 76
Bảng 4.16: Kết quả tính tốn phân tích HPLC của mẫu chuẩn ............................... 83
Bảng 4.17: Kết quả tính tốn phân tích HPLC của mẫu FOS sử dụng chế phẩm
enzyme tự do sản xuất .......................................................................... 83
Bảng 4.18: Kết quả tính tốn phân tích HPLC của mẫu FOS sử dụng chế phẩm
enzyme cố định sản xuất ....................................................................... 84
Bảng 4.19: Kết quả khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme cố định
............................................................................................................. 86
Bảng 4.20: Kết quả khảo sát quá trình bảo quản chế phẩm enzyme cố định ở dạng
khô ......................................................................................................... 88
Bảng 4.21: Kết quả khảo sát quá trình bảo quản chế phẩm enzyme cố định ở dạng
ướt trong dung dịch CaCl2 3,75 (%) ........................................................ 88

x


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cơng thức cấu tạo của FOS ...................................................................... 6
Hình 2.2: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu ..................................................... 9
Hình 2.3: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu.................................................... 9

Hình 2.4: Sự thay đổi nồng độ fructose trong máu ................................................. 10
Hình 2.5: Sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme........................................... 16
Hình 2.6: Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme ................................... 16
Hình 2.7: Hàm lượng sucrose trong quá trình sản xuất fructooligosaccharide ........ 17
Hình 2.8: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP–L
dạng tự do ............................................................................................... 18
Hình 2.9: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP–L
dạng cố định trên chất mang Sepadbead EC–EP5 ................................... 18
Hình 2.10: Cơ chế hoạt động của enzyme .............................................................. 20
Hình 2.11: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của fructosyltransferase........... 22
Hình 2.12: Enzyme trong hệ gel ............................................................................ 24
Hình 2.13: Enzyme trong hệ sợi ............................................................................ 24
Hình 2.14: Cấu tạo hóa học của alginate ................................................................ 26
Hình 2.15: Cấu trúc phân tử của alginate ............................................................... 27
Hình 2.16: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca2+ ...................................... 29
Hình 2.17: Cấu trúc khơng gian mạng lưới gel alginate ......................................... 30
Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng glucose ................................... 46
Hình 4.2: Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein .................................... 47
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme tự do .......................................................................................... 57
Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme tự do .......................................................................................... 58
Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose ban đầu đến
hoạt tính của chế phẩm enzyme tự do ..................................................... 59
Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme cố định ....................................................................................... 64
Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của vận tốc lắc đến khả năng hoạt động
của chế phẩm enzyme cố định ................................................................ 66

xi

Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose ban đầu đến
khả năng hoạt động xúc tác của chế phẩm enzyme cố định ..................... 68
Hình 4.9: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử sinh ra theo thời gian phản ứng
đối với chế phẩm enzyme tự do .............................................................. 70
Hình 4.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử sinh ra theo thời gian trong hệ
thống phản ứng dạng lắc ......................................................................... 71
Hình 4.11: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử sinh ra theo thời gian trong hệ
thống phản ứng dạng cột ......................................................................... 75
Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử sinh ra theo thời gian trong hệ
thống phản ứng dạng cột và hệ thống phản ứng dạng lắc ........................ 76
Hình 4.13: Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự do
sản xuất – chạy lần 1............................................................................. 79
Hình 4.14: Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự do
sản xuất – chạy lần 2............................................................................. 80
Hình 4.15: Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu FOS sử dụng chế phẩm enzyme cố định
sản xuất – chạy lần 1............................................................................. 81
Hình 4.16: Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu FOS sử dụng chế phẩm enzyme cố định
sản xuất – chạy lần 2............................................................................. 82
Hình 4.17: Đồ thị so sánh tỉ lệ (%) các loại đường trong mẫu FOS ........................ 84
Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme cố định... 87
Hình 4.19: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của chế phẩm enzyme cố định theo
thời gian trong 2 điều kiện bảo quản ....................................................... 89

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Các bước xác định hoạt tính enzyme fructosyltransferase ..................... 33
Sơ đồ 3.2: Các bước cố định enzyme fructosyltransferase trên chất mang alginate
............................................................................................................... 41

xii


CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Đường chức năng là một trong nhóm thực phẩm chức năng được tập trung

nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây và có tiềm năng trở thành loại chất
ngọt mới thay thế cho sucrose và loại đường truyền thống. Trong đó
fructooligosaccharide (FOS) là chất tạo ngọt năng lượng thấp, có đặc tính
prebiotic. FOS đang dần thay thế vị trí các loại đường truyền thống như đường
kính và syrup giàu fructose, FOS được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm chức
năng, sữa, công nghệ sản xuất bánh kẹo.
FOS mang lại những lợi ích cho sức khỏe người sử dụng như: kích thích
tiêu hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride, chống béo phì, an tồn cho
người bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng… Đặc biệt, FOS còn giúp tăng
khả năng hấp thu Ca, Mg, Fe,…, ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt, cân bằng
ion Mg2+, Ca2+ trong cơ thể, chống loãng xương.
Hiện nay, tại Việt Nam bệnh béo phì, tiểu đường ngày càng có tầm ảnh
hưởng đến cuộc sống. Do đó việc tìm nguồn chất ngọt mang ít giá trị năng lượng
và không làm thay đổi nồng độ glucose trong máu để thay thế cho các chất ngọt
truyền thống là một yêu cầu cấp thiết. Bên cạnh đó công nghiệp thực phẩm chức
năng đang ngày càng phát triển mạnh và mang lại giá trị kinh tế cao. Việt Nam
có nhiều tiềm năng phát triển cơng nghiệp sản xuất FOS với nguồn mía đường
cung cấp nguyên liệu đầu vào cho sản xuất.
Từ thực trạng trên, sản xuất FOS công nghiệp là vấn đề hết sức cần thiết
hiện nay, mang lại lợi ích về sức khỏe con người cũng như nguồn lợi về kinh tế.
Và để sản xuất FOS thì khơng thể khơng nhắc đến enzyme với hoạt tính

fructosyltransferase là một trong những thành phần rất quan trọng trong quá trình
sản xuất.
Việc nghiên cứu và sản xuất enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ
XX đến nay và đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế lớn. Tuy nhiên việc sử dụng
enzyme sao cho đem lại hiệu quả cao nhất và lợi ích về kinh tế là vấn đề được

1


quan tâm hàng đầu trong q trình sản xuất cơng nghiệp. Từ những nhu cầu cấp
thiết đó, enzyme cố định đã được nghiên cứu trên nhiều nước và thu được những
kết quả khả quan. Trong khi các loại enzyme hòa tan khơng có khả năng tái sử
dụng, lẫn enzyme ở sản phẩm cuối làm cho sản phẩm kém tinh sạch và có thể bị
biến tính dưới tác dụng của điều kiện mơi trường thì enzyme cố định có thể khắc
phục được những vấn đề trên. Chính những ưu điểm enzyme cố định mà các nhà
khoa học đã nghiên cứu cố định các loại enzyme khác nhau trên những chất
mang khác nhau nhằm tạo ra enzyme cố định mang lại hiệu quả sử dụng enzyme
cao nhất.
1.2.

Luận điểm mới của đề tài
Hầu hết các nghiên cứu ở nước ngoài chỉ tập trung vào nghiên cứu enzyme

tự do sản xuất FOS và dạng cố định trên chất mang Eupergit C, Sepadbead EC–
EP5.
Đề tài này nghiên cứu sản xuất FOS bằng chế phẩm Pectinex Ultra Sp–L cố
định trên chất mang alginate là một hướng mới, chưa có nghiên cứu nào trong và
ngồi nước nghiên cứu theo hướng này, đồng thời alginate là một chất mang
tương đối phổ biến và giá thành rẻ, có thể ứng dụng trong thực tế sản xuất được.
Ngoài ra đề tài cịn ứng dụng quy hoạch thực nghiệm để tính tốn tối ưu cho các

q trình thực nghiệm.
1.3.

Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu này thực hiện với mục đích dùng phương pháp quy hoạch thực

nghiệm xác định điều kiện tối ưu khi cố định chế phẩm Pectinex Ultra SPL trên
gel alginate trong quá trình sản xuất FOS.
1.4.

Nội dung nghiên cứu
Gồm 5 nội dung:
+ Nghiên cứu sự phụ thuộc của quá trình cố định chế phẩm
Pectinex Ultra SP–L trên gel alginate bởi các yếu tố: nồng độ
alginate sử dụng, tỷ lệ enzyme và alginate, nồng độ CaCl2 bằng
phương pháp quy hoạch thực nghiệm

2


+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất sucrose ban đầu và vận tốc lắc đến hoạt tính của enzyme cố
định
+ Sản xuất FOS
+ Tái sử dụng enzyme cố định
+ Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản enzyme cố định

3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng quan về FOS

2.1.1.

Khái niệm FOS

Gần đây trong dinh dưỡng, người ta chú ý đến carbohydrate trong khẩu
phần ăn, mà trước tiên là chất xơ. Tuy cơ thể khơng lên men tiêu hóa được,
nhưng chất xơ đóng vai trị quan trọng trong cuộc chiến chống lại những bệnh tật
về tim mạch và một số trường hợp ung thư đường ruột [1,13].
Nhiều loại carbohydrate được nghiên cứu đóng vai trị như một prebiotic,
với các đặc tính như:
+ Khơng bị hấp thu ở tuyến tiêu hóa trên.
+ Lên men bởi vi sinh vật trong ruột.
+ Kích thích chọn lọc sự phát triển và hoạt tính của một số vi khuẩn
có khả năng cải thiện sức khỏe.
Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức
năng được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây và có tiềm năng
trở thành loại chất ngọt mới thay thế cho sucrose, loại đường truyền thống.
Có nhiều loại đường chức năng: palatinose, maltitol, sorbitol, lactitol,
fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS),… trong đó, đường
FOS nổi bật từ những năm 1980 và được nghiên cứu nhiều hơn cả, không chỉ vì
cơng nghệ sản xuất đơn giản, mà nó cịn có nhiều đặc tính sinh học có lợi cho sức
khỏe con người: kích thích tiêu hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride,
chống béo phì, an tồn cho người bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng … Đặc
biệt, FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu Ca, Mg, Fe,…, ngăn ngừa bệnh thiếu
máu, thiếu sắt, cân bằng ion Mg2+, Ca2+ trong cơ thể, chống loãng xương [19].

FOS là chất tạo ngọt năng lượng thấp, khơng được hấp thu ở tuyến tiêu hóa
trên, tuy nhiên được sử dụng chọn lọc bởi hệ vi khuẩn đường ruột Bifidobacteria,
nên có đặc tính prebiotic. FOS đang dần thay thế các loại đường truyền thống
như đường kính và syrup giàu fructose, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm
chức năng, công nghệ sản xuất bánh kẹo [37].

4


Việc sử dụng FOS hằng ngày đem lại những lợi ích cho sức khỏe, mỗi ngày
sử dụng 4÷15 (g) FOS giúp cơ thể khỏe mạnh, giảm bệnh táo bón.
2.1.2.

Nguồn gốc và cấu tạo FOS

FOS có nhiều trong tự nhiên, tồn tại trong các loại rau quả như chuối, mận,
đào, quýt, atiso, cà chua, hành, tỏi, lúa mì, măng tây và mật ong [11,13]. Hàm
lượng FOS ở một số loại rau quả có thể tham khảo ở bảng 2.1 [9].
Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) [9]
Loại cây,

1–Kestose

Nystose

Fructofuranosylnystose

Tổng FOS

quả, rau

(GF2)

(GF3)

(GF4)

(GFn)

Chuối

5,9

0,1

0,0

6,0

Quýt

1,7

0,0

1,11

2,8

Đào

3,5

0,0

0,0

3,5

Lê

0,8

0,0

0,0

0,8

Mận

1,8

0,2

0,0

2,0

Dưa hấu

2,8

0,0

0,1

3,0

Măng

0,3

0,0

0,0

0,3

Rau dền đỏ

0,1

0,0

0,0

0,1

Rau cần tây

0,2

0,0

0,4

0,6

Hành ta

0,4

0,3

0,4

1,1

Dứa

0,5

0,0

0,0

0,5

Cà chua

0,2

0,0

0,4

0,6

Tỏi

8,7

1,2

0,4

10,3

Cây atiso

93,9

94,3

98,1

286,2

Hành tây

15,5

6,7

4,2

26,4

FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phân
tử đường sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kết
–2,1–glucoside. Công thức tổng quát của đường FOS là GFn, trong đó n là số
nhóm n = 2, 3, 4 (G là gốc đường glucose, F là gốc đường fructose), tương ứng là

5


các đường 1–kestose (GF2), nystose (GF3) và fructofuranosylnystose (GF4) với
công thức cấu tạo như hình 2.1 [36, 37, 39]. Tuy nhiên, nhiều nhà nghiên cứu
khác cũng gộp cả các loại đường khác như fructan, glucofructosan và inulin vào
nhóm đường FOS [39].
Fructooligosaccharide chứa 3 loại đường chính: 1–kestose (β–D–fru–
(2→1)2–α–D–glucopyranoside,

GF2),

nystose

(β–D–fru–(2→1)3–α–D–

glucopyranoside, GF3) và fructofuranosylnystose (β–D–fru–(2→1)4–α–D–
glucopyranoside, GF4), liên kết với các gốc fructosyl (F) tại các liên kết β(2→1)
của sucrose(2–4) [17].

Hình 2.1: Cơng thức cấu tạo của FOS [39]
Fructooligosaccharide (FOS) từ đường sucrose, chất ngọt có tiềm năng
thay thế với những tính chất đặc trưng, cũng được gọi là chất xơ, có một số đặc
điểm như năng lượng thấp, an toàn cho người bệnh tiểu đường. FOS cũng được
biết đến như prebiotic, có khả năng kích thích hoạt động của các vi sinh vật

6


probiotic. Việc sản xuất FOS hiện năng đang phát triển mạnh trong suốt nhiều
năm qua [41].
Trong tự nhiên, FOS được hình thành dưới tác dụng của enzyme chuyển
hóa fructose. Q trình trích ly FOS từ những loại thực vật này ở quy mơ cơng
nghiệp khơng có tính kinh tế do nồng độ rất thấp, lượng enzyme lại bị giới hạn
bởi điều kiện thời tiết, vì vậy FOS thương mại được sản xuất bằng phương pháp
tổng hợp hoặc thủy phân [39].
FOS có thể được sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp từ nguồn nguyên liệu
sucrose, với xúc tác là enzyme β–fructofuranosidase thu nhận từ các loại nấm
mốc như Aureobasidiums sp. và Aspergillus niger [39].
2.1.3.

Tính chất của FOS
Bảng 2.2: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác [9]

Đường

Độ ngọt
(Sucrose = 1)

Độ ổn định
Nhiệt độ T
(oC)

pH

Độ nhớt

Tính hút ẩm

Sorbitol

0,7

< 160

2 ÷ 10

Thấp

Cao

Xylitol

0,9

< 160

2 ÷ 10

Rất thấp

Cao

Mannitol

0,5

< 160

2 ÷ 10

Thấp

Thấp

Erythritol

0,65

< 160

2 ÷ 10

Rất thấp

Thấp

Maltitol

0,75

< 160

2 ÷ 10

Cao

Trung bình

Isomalt

0,60

< 160

2 ÷ 10

Cao

Thấp

Lactitol

0,40

< 160

2 ÷ 10

Rất thấp

Trung bình

Maltidex

0,75

< 160

2 ÷ 10

Cao

Trung bình

FOS

0,30

< 160

2 ÷ 10

Cao hơn

Trung bình

Theo Gross, 1–kestose là loại đường kết tinh màu trắng có góc quay cực
[]D20 là +28,50 và nhiệt độ nóng chảy là 199 ÷ 200 (oC). Độ ngọt của 1–kestose,
nystose và fructofuranosylnystose so với sucrose lần lượt là 31 (%), 32 (%) và 16

7


(%). Độ ngọt tổng của ba loại đường này (FOS) chỉ bằng 30 (%) độ ngọt của
đường sucrose [39].
Vị ngọt của FOS khoảng 0,3÷0,6 độ ngọt của sucrose tùy thuộc theo cấu
trúc và độ trùng hợp của các oligosaccharide. Đường FOS hút ẩm, nên khó bảo
quản trong thời gian dài. Ở cùng nồng độ FOS có độ nhớt cao hơn so với sucrose
do các phân tử có trọng lượng lớn. Độ nhớt cao làm chậm tốc độ đường tiêu hóa
giúp q trình tiêu hóa và hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn sucrose. Độ bền nhiệt
ổn định lên đến 140 (oC), pH hoạt dộng từ 4,0÷7,0 [13, 12].
Ở dạng lỏng, FOS mạch ngắn là chất lỏng trong, không màu hoặc màu vàng
như syrup, có mùi trái cây và vị ngọt. Ở dạng bột, FOS có màu trắng đến vàng
nhạt, mùi trái cây và vị ngọt. FOS hòa tan trong nước [18, 20, 21, 22].
Một số tác giả nghiên cứu về tính chất hóa lý của FOS đều đưa ra một kết
luận chung là tính chất của FOS tương tự sucrose như độ hịa tan, độ đơng đặc,
nhiệt độ sơi và các thơng số về q trình kết tinh. Khác với sucrose FOS mang lại
nhiều giá trị sinh học và được các nhà nghiên cứu khai thác, ứng dụng trong thực
phẩm, y học [36, 37, 39].
2.1.4.

Ảnh hưởng của FOS với sức khỏe con người

2.1.4.1.

Ảnh hưởng của FOS đến sự chuyển hóa carbohydrate

FOS khơng hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột, nên khi
được bổ sung vào hệ tiêu hóa lượng đường trong máu khơng có sự biến động
nhiều. Những kết quả về sự thay đổi hàm lượng đường và insulin trong máu theo
thời gian sau khi sử dụng FOS ở hình 2.2, 2.3 và 2.4 [9]. Kết quả cho thấy trái
ngược với sucrose khi sử dụng FOS trong cùng một khoảng thời gian sử dụng
lượng đường trong máu khơng hề có sự biến đổi.
Liều lượng FOS cần cho người trưởng thành là 8 (g/ngày) [35]. Từ kết quả
của một số nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người bị mắc bệnh tiểu
đường nếu mỗi ngày ăn 8 (g) FOS, lượng đường trong máu sẽ giảm nhanh trong
vòng 14 (ngày).
Những biến đổi có tính tích cực phát sinh khi chuyển hố glucose và chất
béo trong q trình trao đổi chất với sự hiện diện của FOS. Nguyên nhân của các
8


hiệu ứng này là do FOS khơng bị tiêu hố ở ruột non bởi tác dụng của hệ enzyme
đường ruột, mà bị lên men trong ruột già dưới tác dụng của vi khuẩn
Bifidobacterium (là một chi trong họ Lactobacteraceae, tế bào hình que, phân
nhánh, thẳng hoặc cong, bất động, gram (+), sống kỵ khí, ưa ấm, khơng sinh bào
tử, thường gặp trong ruột già). Kết quả của quá trình là sinh ra các acid béo đoản
mạch như acid acetic, acid propionic và acid butyric. Các chất này sau đó được
thấm vào thành ruột già hoặc chuyển lên gan, ức chế sự gia tăng của glucose và
chất béo trong máu [42].

Hình 2.2: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu [9]

Hình 2.3: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu [9]

9


Hình 2.4: Sự thay đổi nồng độ fructose trong máu [9]
Đối với bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường (có hoặc khơng rối loạn tiết
insulin) ngồi sự bất bình thường về hàm lượng đường trong máu, chất béo trong
máu cũng luôn bị rối loạn. Vì thế việc hạn chế sự gia tăng hàm lượng chất béo
trong máu cũng là một biện pháp để chữa bệnh tiểu đường. FOS đã làm giảm
đáng kể hàm lượng phospholipid và triglyceride trong máu. FOS không chỉ làm
thay đổi hàm lượng chất béo trong máu mà cịn có thể điều chỉnh sự tạo ra các
enzyme tổng hợp acid béo. Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu khi
dùng sucrose nhưng sẽ được bình thường hố bởi sự cung ứng FOS. Như vậy
FOS có vai trị khá tích cực trong việc phịng và chữa bệnh tiểu đường xét ở góc
độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế FOS hiện
nay được dùng nhiều như là một chất ngọt thấp năng lượng đặc biệt dành cho các
đối tượng mắc bệnh tiểu đường [13].
2.1.4.2.

Ảnh hưởng của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruột

Nhiều carbohydrate được cho là prebiotic, trong đó bao gồm cả
fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS). Các prebiotic đã
được định nghĩa là một thành phần khơng tiêu hóa và ảnh hưởng có lợi trên
chủng chủ bằng cách chọn lọc kích thích sự tăng trưởng hoạt độ của vi khuẩn
trong ruột kết. FOS trở thành nguồn năng lượng cung cấp cho sự phát triển của vi
sinh vật. Làm tăng hiệu quả tác động lên các sản phẩm probitic, thay đổi sự cân
bằng của hệ vi sinh vật Bifidobacteria trong ruột làm tăng đáng kể, ngay cả trong

10