Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii giàu hoạt tính lactase và bước đầu thăm dò tạo chế phẩm viên nang probiotic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN KHÁNH VÂN

TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
THU NHẬN SINH KHỐI LACTOBACILLUS
DELBRUECKII SSP. DELBRUECKII GIÀU HOẠT TÍNH
LACTASE VÀ BƢỚC ĐẦU THĂM DÕ TẠO CHẾ PHẨM
VIÊN NANG PROBIOTIC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. PHAN NGỌC HÒA

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.
HCM ngày 15 tháng 08 năm 2014
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. Chủ tịch: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
2. Phản biện 1: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC
3. Phản biện 2: TS. PHAN NGỌC HÒA
4. Ủy viên: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG
5. Thƣ ký: TS. HOÀNG ANH HOÀNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA KTHH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I.

Họ tên học viên: NGUYỄN KHÁNH VÂN

MSHV: 12310762

Ngày, tháng, năm sinh: 13/09/1989

Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh

Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học

Mã số: 60.42.80

TÊN ĐỀ TÀI: Tối ƣu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus delbrueckii
ssp. delbrueckii giàu hoạt tính lactase và bƣớc đầu thăm dò tạo chế phẩm viên nang
probiotic.

II.

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Lên men thu sinh khối Lactobacillus delbrueckii ssp.
delbrueckii giàu hoạt tính lactase bằng cách tối ƣu môi trƣờng dinh dƣỡng (nguồn
carbon, nguồn nitơ) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tỷ lệ cấy giống) theo phƣơng
pháp quy hoạch thực nghiệm; tiến hành sấy phun và bƣớc đầu tạo chế phẩm viên nang
probiotic.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 20/01/2014
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:20/09/2014
V.

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG
TP. HCM, ngày
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

tháng

năm 20

CHỦ NHIỆM BÔ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƢỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập tại trƣờng Đại Học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh và hồn
thành luận văn thạc sĩ, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự động viên và giúp đỡ chân thành.
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến ngƣời thầy kính mến là
PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng. Cơ đã tận tâm, nhiệt tình hƣớng dẫn tơi trong suốt q
trình thực hiện luận văn từ vật chất đến tinh thần. Cơ đã dành nhiều thời gian, cơng sức,
tình cảm và truyền thụ nhiều kiến thức q báu cho chúng tơi trong suốt 6 năm học tại
trƣờng từ đại học đến cao học. Cô luôn quan tâm nhắc nhở, động viên trong q trình làm
luận văn, chia sẽ những khó khăn và giúp đỡ mỗi khi tôi cần.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh Học
trƣờng Đại học Bách Khoa TP. HCM đã nhiệt tình dạy dỗ chúng tơi trong suốt những
năm đại học và cao học. Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các cô PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên,
TS Huỳnh Ngọc Oanh, cô Võ Thị Ly Tao đã quan tâm tạo điều kiện về thiết bị dụng cụ
phịng thí nghiệm và những góp ý trong q trình làm luận văn của tơi. Tơi xin cám ơn
các cán bộ phịng thí nghiệm 102, 108, 117 của Bộ mơn Cơng nghệ Sinh Học, Đại học
Bách Khoa Tp HCM đã giúp đỡ về dụng cụ và hóa chất phịng thí nghiệm cho tôi.
Cảm ơn các bạn Trung, Duy, Văn, Thiện, chị Nhƣ, chị Kim, chị Phúc đã cùng tôi trao
đổi kiến thức, động viên tinh thần và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài
này.
Cảm ơn sự đồng hành và trợ giúp của em Trần Thị Hồng Tím (cơng nghệ sinh học

khóa 2010).
Cám ơn chị Tâm, chị Hƣơng, chị Sƣơng… đã giúp đỡ tơi trong q trình làm luận
văn.
Cuối cùng và trên tất cả, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã ni nấng, dìu dắt, nâng đỡ con rất
nhiều và tạo điều kiện tốt nhất để con học tập.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2014
Nguyễn Khánh Vân


TĨM TẮT
Enzyme lactase có nhiều ứng dụng quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Vi
khuẩn lactic đƣợc chứng minh là có ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe con ngƣời và đƣợc sử dụng
rộng rãi trong các sản phẩm lên men. Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic cũng là thành phần của
nhóm vi khuẩn đƣờng ruột. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn chủng vi khuẩn lactic
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii làm đối tƣợng cung cấp sinh khối vi sinh vật giàu
hoạt tính lactase. Các yếu tố điều kiện ni cấy và môi trƣờng dinh dƣỡng đã đƣợc khảo sát
theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm thu đƣợc sinh khối có hoạt tính lactase cao.
Kết quả thực nghiệm thu đƣợc lên men trong môi trƣờng cảm ứng sinh lactase (cơ chất
lactose 10g/l) với các điều kiện sau: glucose 2,17g/l; pepton 24,37g/l; cao nấm men 3,39g/l,
cao thịt 10g/l; nhiệt độ 32,9oC; pH 6,7 và tỷ lệ cấy giống 4,5%. Theo giá trị suy ra từ mơ hình
hoạt tính lactase đạt đƣợc 6,9771 U/ml và mật độ tế bào 1,326.109 CFU/ml. Thử nghiệm ni
cấy với các điều kiện của mơ hình, ứng với thời điểm 24 giờ - thời điểm thu sinh khối có hoạt
tính enzyme cao nhất, hoạt tính lactase đạt 96,92% hoạt tính ƣớc lƣợng từ quy hoạch thực
nghiệm trong khi đó mật độ tế bào thu đƣợc cao hơn so với chỉ tiêu từ mơ hình là 100,65%.
Sau đó, lƣợng sinh khối này đƣợc phối trộn với 4 loại môi trƣờng trƣớc khi sấy phun. Thử
nghiệm cũng xác định mơi trƣờng hỗ trợ q trình sấy phun tối ƣu nhất trong 4 mẫu là skim
mlik salt 30% buffer pH 6,8 + lactose 15% (w/v). Mật độ tế bào Lactobacillus delbrueckii
ssp. delbrueckii trong mẫu tối ƣu là 8,76 logCFU/g và độ ẩm là 8,50%. Cuối cùng chúng tôi
tiến hành thử nghiệm tạo chế phẩm viên nang với khối lƣợng mỗi viên là 500mg.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong cơng trình nào khác.
Ngƣời viết
Nguyễn Khánh Vân


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................... i
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1
1 Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1
2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2
3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
1.1 Bệnh bất dung nạp lactose ................................................................................... 3
1.2 Enzyme lactase .................................................................................................... 4
1.2.1 Nguồn gốc ..................................................................................................... 5
1.2.1.1 Nguồn lactase từ động thực vật............................................................... 5
1.2.1.2 Nguồn enzyme lactase từ vi sinh vật ...................................................... 6
1.2.2 Tính chất hóa lý .......................................................................................... 10
1.2.3 Cấu trúc enzyme lactase ............................................................................. 12
1.2.4 Cơ chế thủy phân lactose ............................................................................ 13
1.2.5 Sự thủy phân lactose ................................................................................... 14
1.2.5.1 Thủy phân bằng acid ............................................................................ 14
1.2.5.2 Thủy phân bằng enzyme ....................................................................... 14

1.2.6 Ứng dụng của enzyme lactase trong công nghiệp ...................................... 17
1.3 Vi khuẩn lactic và vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii ..................................... 17
i


1.3.1 Vi khuẩn lactic ............................................................................................ 17
1.3.2 Lactobacillus delbrueckii ........................................................................... 19
1.3.2.1 Cấu trúc gen ......................................................................................... 19
1.3.2.2 Cấu trúc tế bào và chuyển hóa ............................................................. 20
1.4 Tạo chế phẩm vi sinh vật bằng phƣơng pháp sấy khô ...................................... 20
1.4.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sống sót trong q trình sấy khô ....... 20
1.4.2 Phƣơng pháp sấy phun ................................................................................ 22
1.4.3 Phƣơng pháp đóng gói và bảo quản ........................................................... 23
1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về enzyme lactase .................................. 23
1.5.1 Các nghiên cứu trong nƣớc ......................................................................... 23
1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................................ 25
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƢƠNG PHÁP ................................................................... 28
2.1 Địa điểm – Thời gian thực hiện ......................................................................... 28
2.2 Vật liệu – Hóa chất – Thiết bị – Mơi trƣờng ..................................................... 28
2.3 Nội dung thí nghiệm .......................................................................................... 29
2.3.1 Sơ đồ tổng quát thí nghiệm ......................................................................... 29
2.3.2 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 31
2.3.2.1 Các khảo sát tiền đề ............................................................................. 31
a. Dựng đƣờng cong sinh trƣởng .................................................................. 31
b. Vị trí lactase .............................................................................................. 31
2.3.2.2 Khảo sát tại tâm điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối hoạt tính lactase
cao….. ........................................................................................................................ 31
a. Khảo sát nhiệt độ thích hợp ....................................................................... 32
b. Khảo sát pH thích hợp ............................................................................... 32
ii

c. Khảo sát tỷ lệ cấy giống thích hợp ............................................................ 32
2.3.2.3 Khảo sát tại tâm môi trƣờng thu sinh khối có hoạt tính lactase cao ..... 32
a.Khảo sát nguồn cacbon thích hợp .............................................................. 32
b.Nồng độ nguồn cacbon ............................................................................... 32
c.Nồng độ pepton .......................................................................................... 32
d.Nồng độ cao nấm men ................................................................................ 33
e.Nồng độ cao thịt ......................................................................................... 33
2.3.2.4 Đồ thị biến động hoạt tính lactase và sinh khối ................................... 33
2.3.2.5 Sấy phun sinh khối L. delbrueckii ssp. delbrueckii ............................. 33
2.3.2.6 Xác định độ ẩm của mẫu sau sấy phun ................................................ 34
2.3.2.7 Đánh giá khả năng sống sót sau khi sấy phun ..................................... 35
2.3.2.8 Thử nghiệm tạo viên nang ................................................................... 35
2.3.3 Một số phƣơng pháp phân tích ................................................................... 35
2.3.3.1 Phƣơng pháp vi sinh ............................................................................ 35
2.3.3.2 Phƣơng pháp hóa sinh .......................................................................... 37
2.3.3.3 Các phƣơng pháp khác ......................................................................... 39
a. Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm ....................................................... 39
b.Phƣơng pháp xử lý số liệu .......................................................................... 43
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................................... 44
3.1 Kết quả khảo sát tiền đề .................................................................................... 44
3.1.1 Quan sát đại thể và vi thể ............................................................................ 44
3.1.2 Tái định danh .............................................................................................. 45
3.1.3 Vị trí enzyme lactase .................................................................................. 46
3.1.4 Đƣờng cong sinh trƣởng ............................................................................. 47
iii


3.2 Kết quả tối ƣu hóa mơi trƣờng và điều kiện ni cấy ....................................... 50

3.2.1Các thí nghiệm tại tâm ................................................................................. 50
3.2.1.1 Kết quả khảo sát tại tâm môi trƣờng dinh dƣỡng ................................. 50
a.Ảnh hƣởng của nguồn carbon .................................................................... 51
b.Ảnh hƣởng của nồng độ nguồn carbon ...................................................... 53
c.Ảnh hƣởng của nồng độ pepton ................................................................. 55
d.Ảnh hƣởng của nồng độ cao nấm men ....................................................... 57
e.Ảnh hƣởng cao thịt ..................................................................................... 59
3.2.1.2 Kết quả khảo sát tại tâm điều kiện nuôi cấy ........................................ 61
a.Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................. 61
b.Ảnh hƣởng của pH ..................................................................................... 64
c.Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấy giống.................................................................... 66
3.2.2 Kết quả tối ƣu hóa mơi trƣờng thu sinh khối có hoạt tính lactase cao ....... 69
3.2.3 . Kết quả tối ƣu hóa điều kiện ni cấy thu sinh khối hoạt tính lactase cao76
3.3 Đồ thị biến động hoạt tính lactase và sinh khối ................................................ 82
3.4 Kết quả khảo sát mật độ tế bào sau sấy phun .................................................... 85
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 89
4.1 Kết luận ............................................................................................................. 89
4.2 Kiến nghị ........................................................................................................... 89
Tài liệu tham khảo ................................................................................................ 91

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Nguồn enzyme β-galactosidase từ vi sinh vật ............................................... 7
Bảng 1.2: Tính chất hóa lý của enzyme từ một số nguồn vi sinh vật ........................... 10
Bảng 1.3 Trọng lượng phân tử của lactase có nguồn gốc từ vi khuẩn ........................ 10
Bảng 1.4: Tính chất của enzyme từ vi sinh vật ............................................................ 11
Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu thử xác định hoạt tính enzyme .................................... 38
Bảng 2.2: Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn phần40

Bảng 2.3: Các mức của ma trận thực nghiệm ............................................................. 40
Bảng 2.4: Ma trận quy hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn phần42
Bảng 2.5: Các mức của ma trận thực nghiệm môi trường .......................................... 43
Bảng 3.1: Mật độ tế bào tại các thời điểm xác định .................................................... 48
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh khối và hoạt tính lactase .............. 51
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn carbon đến sinh khối và hoạt tính lactase 53
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ pepton đến sinh khối và hoạt tính lactase ........... 56
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sinh khối và hoạt tính lactase . 58
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cao thịt đến sinh khối và hoạt tính lactase .......... 59
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối và hoạt tính lactase ....................... 62
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sinh khối và hoạt tính lactase ............................... 64
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến sinh khối và hoạt tính lactase ............. 67
Bảng 3.10: Các mức của ma trận thực nghiệm ........................................................... 70
Bảng 3.11: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố dinh dưỡng ................... 70
Bảng 3.12: Khả năng sinh tổng hợp lactase và sinh trưởng của L. delbrueckii ssp.
delbrueckii từ thực nghiệm tối ưu các yếu tố dinh dưỡng ................................................. 71
v


Bảng 3.13: Các mức của ma trận thực nghiệm ........................................................... 76
Bảng 3.14: Khả năng sinh tổng hợp lactase và sinh trưởng của L. delbrueckii ssp.
delbrueckii từ thực nghiệm tối ưu các điều kiện nuôi cấy ................................................. 77
Bảng 3.15: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố điều kiện nuôi cấy ........ 78
Bảng 3.16 : Sự biến thiên của hoạt tính lactase và mật độ tế bào L. delbrueckii ssp.
delbrueckii theo thời gian .................................................................................................. 83
Bảng 3.17: Kết quả sấy phun ....................................................................................... 86

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sự thủy phân lactose bằng enzyme lactase. ................................................... 5
Hình 1.2: Cấu trúc enzyme lactase .............................................................................. 12
Hình 1.3: Cơ chế thủy phân lactose bằng enzyme lactase .......................................... 13
Hình 1.4: Phản ứng galactosyl hóa ............................................................................. 14
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii trên môi
trường MRS ....................................................................................................................... 44
Hình 3.2: Đặc điểm vi thể của Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii ................. 44
Hình 3.3: Kết quả định danh bằng bộ kit API 50 CHL ............................................... 45
Hình 3.4: Vị trí enzyme lactase trong Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii ...... 47
Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn L. delbrueckii ssp. delbrueckii ....... 49
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh khối và hoạt tính lactase .............. 52
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn carbon đến sinh khối và hoạt tính lactase 54
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ pepton đến sinh khối và hoạt tính lactase ............ 56
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sinh khối và hoạt tính lactase . 58
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ cao thịt đến sinh khối và hoạt tính lactase ......... 60
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối và hoạt tính lactase ...................... 62
Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến sinh khối và hoạt tính lactase .............................. 65
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến sinh khối và hoạt tính lactase ........... 67
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ glucose và pepton đến hoạt tính lactase và mật độ
tế bào ................................................................................................................................. 73
Hình 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ glucose và cao nấm men đến hoạt tính lactase và
mật độ tế bào ..................................................................................................................... 74
vii


Hình 3.16: Giá trị tối ưu của các yếu tố dinh dưỡng khi nuôi cấy L. delbrueckii ssp.
delbrueckii thu sinh khối có hoạt tính lactase cao ............................................................ 75
Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính và sinh khối ....................... 80
Hình 3.18: Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỷ lệ cấy giống đến hoạt tính và sinh khối ..... 81

Hình 3.19: Điều kiện ni cấy tối ưu cho hoạt tính lactase và mật độ tế bào ............ 81
Hình 3.20: Đường chuẩn lactase ................................................................................. 82
Hình 3.21: Hoạt tính lactase và mật độ tế bào theo thời gian..................................... 84
Hình 3.22: Tỷ lệ sống sót sau sấy phun của 4 mẫu thí nghiệm ................................... 87
Hình 3.23: Thử nghiệm tạo viên nang ......................................................................... 88

viii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮC
CCD: Central composite design
RSM: Response surface methodology
ONPG: ortho-nitrophenyl-β-galactoside
ONP: ortho-nitrophenol
HPLC: High performance liquid chromatography
v/v: volume/volume
w/w: weight/weight
BOD: Biochemical oxygen demand
COD: Chemical oxygen demand

ix


MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Xu hƣớng của con ngƣời ngày nay là quay về sử dụng các sản phẩm mang tính thiên
nhiên, khai thác những kinh nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật hiện đại và hạn chế việc
đƣa hóa chất vào cơ thể. Đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm có bổ sung chủng vi sinh vật
giúp con ngƣời tăng cƣờng sức đề kháng và cải thiện hệ tiêu hóa. Tuy nhiên các sản phẩm
này khơng phải là thuốc mà đƣợc xếp vào nhóm thực phẩm chức năng. Chính vì những lợi

ích trên và theo quan điểm phòng bệnh hơn chữa bệnh, các nƣớc phát triển có xu hƣớng sử
dụng các loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe nhiều hơn là thuốc đặc trị.
Sữa là “thực phẩm chức năng” đƣợc chú ý nhiều nhất. Tuy nhiên, nhiều ngƣời mắc phải
“hiện tƣợng” không dung nạp lactose-thành phần chính trong sữa. Sự khơng dung nạp
lactose gây cảm giác khó chịu sau khi tiêu thụ sữa hay các sản phẩm từ sữa. Ngồi ra sự
khơng dung nạp lactose kèm theo các triệu chứng: khó tiêu, đầy hơi, đau bụng, buồn nôn
hay tiêu chảy. Điều này đƣợc giải thích: lactose khi vào đến ruột sẽ đƣợc thủy phân thành
galactose và glucose nhờ enzyme lactase có ở thành ruột non. Trong trƣờng hợp thiếu
lactase, lactose sẽ không đƣợc thủy phân và tống ra ngoài dƣới dạng tiêu chảy.
Enzyme thủy phân lactose, lactase (hay β-galactosidase, E.C.3.2.1.23) đƣợc chứng minh
là một enzyme quan trọng trong ngành công nghiệp sữa. Trong công nghiệp sữa, lactase
đƣợc dùng để giảm sự kết tinh của lactose, cải thiện độ ngọt và làm tăng độ bền của sản
phẩm sữa. Lactase có thể đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn: thực vật, động vật và vi sinh vật.
Trong đó, vi sinh vật đƣợc đề cập đến nhƣ một nguồn lactase lý tƣởng để thƣơng mại hóa do
khả năng lên men dễ dàng, hoạt tính ổn định và độ bền cao. Các vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp lactase bao gồm: vi khuẩn, nấm men (enzyme nội bào) và nấm mốc (enzyme ngoại
bào). Vi khuẩn lactic (LAB) bao gồm các nhóm nhỏ: lactococci,

streptococci, và

lactobacilli đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu do 3 lý do chính: bệnh nhân khơng
dung nạp lactose có thể sử dụng các sản phẩm sữa lên men mà không có ảnh hƣởng xấu đến
sức khỏe, LAB an tồn cho ngƣời sử dụng nên enzyme đƣợc thu nhận từ chúng khơng phải
trải qua nhiều q trình tinh sạch, một vài chủng có hoạt tính probiotic nên hỗ trợ cho việc
1


hấp thu lactose. Trong số đó, Lactobacillus delbrueckii là một chủng tiềm năng có khả năng
sinh hoạt tính lactase cao đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sữa và dƣợc phẩm
(Laxmi, 2011). Do vậy, tối ƣu các điều kiện cũng nhƣ thành phần môi trƣờng lên men

Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii để thu sinh khối giàu hoạt tính lactase là vấn đề
cần thiết để hỗ trợ cho ngƣời không dung nạp đƣợc lactose.
2 Mục tiêu nghiên cứu
Tối ƣu hóa mơi trƣờng và điều kiện lên men để thu sinh khối Lactobacillus delbrueckii
ssp. delbrueckii giàu hoạt tính lactase và thăm dị bƣớc đầu tạo chế phẩm viên nang bằng
phƣơng pháp sấy phun.
3 Nội dung nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu chính là chủng vi khuẩn đã đƣợc sàng lọc và định danh
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii. Chúng tôi tiến hành tối ƣu điều kiện nuôi cấy
trên môi trƣờng MRS để thu đƣợc lƣợng sinh khối cao nhất để bổ sung vào môi trƣờng cảm
ứng sinh lactase. Điều kiện nuôi cấy ( nhiệt độ, pH, tỉ lệ cấy giống) và thành phần các nguồn
carbon, nito trong môi trƣờng cảm ứng cũng đƣợc khảo sát để vừa thu đƣợc lƣợng lớn sinh
khối và hoạt tính lactase cao. Lƣợng sinh khối này đƣợc nhũ hóa với các thành phần: sữa
gầy trong muối đệm, sữa gầy kết hợp với whey protein, với lactose sau đó sấy phun và xác
định đƣợc công thức tối ƣu bảo vệ tốt nhất sinh khối.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 Bệnh bất dung nạp lactose
Lactose là thành phần tự nhiên với hàm lƣợng cao trong sữa và các sản phẩm sữa. Sữa bò
chứa 4,5-5% lactose, chiếm hơn một phần ba pha rắn trong sữa, 20% trong kem và khoảng
72% trong dịch whey. Lactose không đƣợc hấp thu nhƣng đƣợc thủy phân thành các
monosaccharide dễ hấp thu là glucose và galactose nhờ vào enzyme đƣờng ruột lactase. Khi
thiếu enzyme lactase, đƣờng lactose không phân tách và không đƣợc hấp thu vào máu mà bị
tồn đọng ở ruột, dẫn đến rối loạn tiêu hóa, gọi là bất dung nạp lactose. Áp suất thẩm thấu
trong đại tràng, sự chênh lệch gradient hóa học giữa dịng chất lỏng vào lumen ruột và máu là
nguyên nhân trực tiếp tạo ra các triệu chứng: đầy hơi, đau bụng, buồn nôn và tiêu chảy. Đây

là lý do làm chúng ta khơng uống đƣợc sữa.
Có 3 nguyên nhân cơ bản dẫn đến sự bất dung nạp lactose: bẩm sinh, nguyên phát và thứ
phát. Bẩm sinh là hiện tƣợng đột biến gen hiếm gặp, khi đó enzyme lactase ở nồng độ thấp
hoặc khơng có ngay khi sinh. Nguyên phát là loại phổ biến nhất thƣờng gặp ở ngƣời từ 2-20
tuổi. Đây là quá trình sinh lý bình thƣờng khi nồng độ enzyme lactase ở ruột non giảm. Thứ
phát là một tình trạng tạm thời khi enzyme trong ruột non do một số căn bệnh gây tổn hại
niêm mạc ruột nhƣ virus hay do trong quá trình điều trị ung thƣ. Sự bất dung nạp thứ phát có
thể hồi phục sau khi vấn đề viêm dạ dày ruột đã đƣợc giải quyết. Tuy nhiên, ở trẻ em nếu
bệnh viêm dạ dày ruột không đƣợc giải quyết, men lactase không sản xuất đủ, cơ thể không
hấp thu đƣợc lactose, tình trạng tiêu chảy kéo dài, trầm trọng hơn có thể bị suy dinh dƣỡng
(Zuzana Mlichova, Michal Rosenberg, 2006).
Tất cả các động vật có vú, ngoại trừ sƣ tử biển, lactose là thành phần chính của sữa. Ở
động vật thƣờng vắt sữa, hàm lƣợng lactose khoảng 4-5%. Nồng độ lactose trong sữa ngƣời
là cao nhất, khoảng 7%. Trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ tiêu hóa lactose bằng enzyme lactase. Tuy
nhiên đa số ngƣời lớn đã mất khả năng này và mắc triệu chứng hấp thu lactose kém.

3


Theo Heyman (2006), khoảng 70% dân số tồn cầu, khơng hấp thu lactose ở tuổi trƣởng
thành. Thiếu enzyme lactase thƣờng thấy ở châu Phi, châu Á, Nam Âu và châu Mỹ. Trái lại,
bệnh này lại giảm ở các nƣớc nằm ở Bắc Âu, chỉ có ngƣời dân gốc Bắc Âu, Trung Đơng Bắc
Phi và Bắc Ấn Độ vẫn cịn thể hiện hoạt tính lactase cao trong suốt q trình trƣởng thành. Ở
Mỹ, tỷ lệ không dung nạp lactose chủ yếu thay đổi tùy theo chủng tộc. Ƣớc tính có đến 25%
ngƣời Mỹ da trắng không dung nạp lactose, trong khi ngƣời Mỹ da đen, ngƣời Mỹ bản xứ và
ngƣời Mỹ gốc Á tỷ lệ không dung nạp lactose khoảng 75-90%. 44% những ngƣời phụ nữ
không dung nạp lactose, lấy lại khả năng tiêu hóa lactose trong khi mang thai. Tuổi từ 20 -40
khả năng không dung nạp lactose là cao hơn.
Việt Nam là một trong số những nƣớc có tỷ lệ cao ngƣời mắc bệnh bất dung nạp lactose.
Theo nghiên cứu của Nông Thế Anh và Jack Welsh (1977), cứ 31 ngƣời uống sữa có lactose

từ 1ly/ 1 tháng đến 3 ly/ 1 tuần thì có đến 8 trƣờng hợp có biểu hiện của bệnh khơng hấp thu
lactose (Nong The Anh, 1977).
Ngƣời không dung nạp lactose đƣợc khuyến cáo nên ít sử dụng sữa và các sản phẩm sữa.
Tuy nhiên họ có thể sử dụng sữa lên men và bơ khơng hoặc chứa ít lactose. Hàm lƣợng
lactose của sữa lên men thƣờng thấp hơn khoảng 1/3 so với sữa. Thêm vào đó, lactose trong
sữa lên men dễ hấp thu hơn do sự có mặt của vi khuẩn lactic với hoạt động lactase. Sữa thủy
phân cũng là giải pháp vừa bổ sung nhiều chất dinh dƣỡng vừa giúp cải thiện sự hấp thu
lactose. Đã có các sản phẩm thực phẩm đƣợc xử lý bằng lactase từ nấm men và nấm mốc.
Lactase còn đƣợc bào chế dƣới dạng viên và đƣợc tiêu hóa ngay lập tức trƣớc khi hấp thu các
sản phẩm sữa (Zuzana Mlichova, Michal Rosenberg, 2006).
1.2 Enzyme lactase
Enzyme lactase (EC.3.2.1.23), thƣờng đƣợc gọi là β-galactosidase, xúc tác phản ứng thủy
phân liên kết β-1,4-D-galactoside trong phân tử đƣờng lactose thành glucose và galactose.

4


Hình 1.1: Sự thủy phân lactose bằng enzyme lactase (Ustok Fatma Isik, 2007).

Đây là enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong
ngành công nghiệp sữa bởi các lợi ích thiết thực mà nó mang lại:
 Sản phẩm thủy phân lactose có thể làm giảm vấn đề không dung nạp lactose, một
bệnh phổ biến thƣờng gặp ở hơn một nửa dân số trên thế giới.
 Tạo prebiotic galacto-oligosaccharide trong quá trình thủy phân lactose để tạo điều
kiện thuận lợi cho sự phát triển của nhóm vi khuẩn đƣờng ruột.
 Cải tiến các tính chất liên quan đến kỹ thuật và cảm nhận của thực phẩm chứa
lactose thủy phân.
 Thủy phân sinh học lactose có trong whey, sản phẩm phụ của q trình sản xuất
phơ mai (Zazuna Mlichova, Michal Rosenburg, 2006).
1.2.1

Nguồn gốc

Enzyme lactase đƣợc tìm thấy có nhiều lồi sinh vật nhƣ: thực vật, động vật và vi sinh vật.
1.2.1.1 Nguồn lactase từ động thực vật
Enzyme lactase đƣợc tìm thấy trong nhiều mơ thực vật, có vai trị nhất định liên quan đến
q trình sinh học nhƣ tăng trƣởng của cây, chín trái và thủy phân lactose. Những nghiên cứu
sinh học phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của lactase trong sự sinh trƣởng của cây và sự chín
của trái. Lactase có vai trị quan trọng đối với q trình chín của trái hồng vì làm giảm đáng
kể nồng độ galactosyl trong vách tế bào và thủy phân liên kết pectin. Enzyme lactase từ đu đủ
giúp thủy phân vách tế bào trong suốt quá trình chín.
5


Hầu nhƣ pH tối ƣu của enzyme lactase từ thực vật nằm trong khoảng pH acid. Enzyme
lactase từ quả hạnh nhân (Amygdalus communis) có pH tối ƣu 5,5, nhiệt độ tối ƣu 50oC và giữ
đƣợc 89% hoạt tính sau 2 tháng lƣu trữ ở 4oC.
Ở động vật hữu nhũ, enzyme lactase nằm trong đƣờng tiêu hóa, đặc biệt nhiều ở những
động vật mới sinh ra (Husain, 2010).
1.2.1.2 Nguồn enzyme lactase từ vi sinh vật
So sánh với động vật và thực vật, vi sinh vật sinh tổng hợp lactase cho hiệu suất cao, xử lý
dễ dàng góp phần hạ giá thành lactase. Do đó, các nghiên cứu tập trung vào enzyme lactase từ
vi sinh vật.
Nhiều chủng vi sinh vật đƣợc biết đến là nguồn sản xuất lactase thƣơng mại có hoạt tính
cao (Bảng 1.1). Mặc dù nấm men (sinh tổng hợp enzyme nội bào), nấm mốc (sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào) có khả sinh tổng hợp lactase nhƣng vi khuẩn đƣợc ƣu tiên sử dụng nhiều
hơn do quá trình lên men dễ dàng, enzyme có hoạt tính và độ bền cao.
Đặc tính của lactase vi khuẩn phụ thuộc nguồn gốc vi sinh vật, các enzyme phù hợp đƣợc
lựa chọn tùy theo mục đích ứng dụng của nó. Ứng dụng của một enzyme đƣợc xác định dựa
vào khoảng pH tối ƣu của nó. Theo đặc điểm này, enzyme đƣợc chia thành 2 nhóm chính:

enzyme pH acid có nguồn gốc từ nấm mốc và enzyme pH trung tính từ nấm men và vi khuẩn.
Enzyme pH acid từ nấm mốc thích hợp cho ngành cơng nghiệp sản xuất whey acid; enzyme
pH trung tính thƣờng thích hợp trong ngành cơng nghiệp sữa và whey ngọt (Ustok Fatma Isik,
2007).

6


Bảng 1.1: Nguồn enzyme β-galactosidase từ vi sinh vật (Husain, 2010).
Nguồn

Vi sinh vật
Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.
Rittmannii
Arthrobacter sp.
Bacillus acidocaldarius, B.circulans,
Bacteriodes polypragmatus
Bifidobacterium bifidum, B. infantis
Vi khuẩn

Clostridium
acetobutylicum,
thermosulfurogens

C.

Corynebacterium murisepticum
Enterobacter agglomerans, E.coli
Lactobacillus
acidophilus,

L.
bulgaricus, L. lactis, L. themophilus
Leuconostoc citrovorum
Pediococcus acidilacti
Thermoanaerobacter sp.
Thermos rubus
Aspergillus foelidis, A. oryzae
Alternaria alternate
Nấm mốc

Curvularia inaequalis
Penicillum canescens
Streptomyces violaceus
Bullera singularis
Candida pseudotropicalis

Nấm men

Saccharomyces lactis, S. fragilis
Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis,
K. lactis

o Nguồn lactase từ nấm mốc
Enzyme lactase từ nấm mốc có pH tối ƣu nằm trong khoảng 2,5 đến 5,4, do đó có hiệu
quả khi thủy phân lactose trong các sản phẩm có tính acid nhƣ whey. Enzyme từ nguồn này
thƣờng là enzyme chịu nhiệt (55-60oC). Sự kết hợp giữa pH thấp và nhiệt độ cao gây ức chế
7


quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật. Nấm mốc thƣờng sử dụng lactose với tỷ lệ rất thấp với

hai cơ chế chuyển hóa lactose: thủy phân lactose ngoại bào, hấp thu các monomer và hấp thu
luôn disaccharide.
Enzyme lactase từ Aspergillus oryzae đƣợc tinh sạch bằng dung môi 2-propanol trên
DEAE- Sephadex A-50 và Sephadex G-200, có pH tối ƣu với ONPG (ortho-nitrophenyl- βD-galactopyranoside) là 4,5 còn lactose là 4,8. Khoảng pH ổn định từ 4,0 đến 9,0, nhiệt độ tối
ƣu là 46oC. Hằng số Michaelis với ONPG là 7,2 x 10-4 và 1,8 x 10-2 M với lactose. Hg2+,
Cu2+, sodium lauryl sulfate và N-bromo-succinimide là những thành phần kìm hãm hoạt tính
lactase (Husain, 2010).
Tuy nhiên, lactase nấm mốc khơng đƣợc tinh khiết nhƣ lactase thu nhận từ nấm men và vi
khuẩn mà có thể chứa các enzyme khác nhƣ: protease, lipase hoặc amylase. Do đó, enzyme
lactase từ nấm mốc chỉ đƣợc dùng một cách hạn chế trong các sản phẩm acid (Ustok Fatma
Isik, 2007).
o Nguồn lactase từ nấm men
pH tối ƣu của lactase nấm men đƣợc xác định là trung tính (6,0-7,0). Vì vậy, chúng đƣợc
sử dụng rộng rãi trong việc thủy phân lactose trong sữa (pH 6,6) và whey ngọt (pH 6,2).
Lactase từ Kluyveromyces lactis là nguồn thƣơng mại đƣợc ứng dụng nhiều nhất để thủy phân
lactose trong sữa tạo nhiều sản phẩm từ sữa dành cho ngƣời không dung nạp lactose bởi môi
trƣờng sống tự nhiên là môi trƣờng sữa. Sữa cũng cung cấp các ion K+ và Mg2+ cần thiết cho
hoạt tính enzyme lactase. Enzyme lactase chịu lạnh từ nấm men ƣa lạnh Guehomyces
pullulans có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để thủy phân lactose trong các sản
phẩm sữa và whey (Husain, 2010; Ustok Fatma Isik, 2007).
Lactase nấm men có thể đƣợc sản xuất với sản lƣợng cao với giá thành tƣơng đối thấp và
đƣợc xem là an toàn trong thực phẩm. Tuy nhiên, đặc tính quan trọng nhất của enzyme này là
độ bền nhiệt thấp. Nếu nhiệt độ tăng trên 55oC, enzyme lactase sẽ bị bất hoạt nhanh chóng.
Do đó, sản xuất oligosaccharide ở các nhiệt độ cao cần một lƣợng lớn enzyme. Điều này có
thể làm tăng giá thành sản phẩm. Để tránh những hạn chế này, sự thủy phân thƣờng đƣợc tiến
8


hành ở nhiệt độ 4 - 6oC trong 16 - 24 giờ, tại điều kiện sự bất hoạt các vi sinh vật đƣợc giảm
đến mức tối thiểu (Ustok Fatma Isik, 2007).

Nguồn lactase từ K.lactis đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới các tên Maxilact (DSM Food
Specialties, Delft, The Netherlands) và Lactase (SNAM Progetti, Italy), còn Lactozym (Novo,
NordiskA/S, Bagsvaerd, Denmark) là sản phẩm thƣơng mại từ K.fragilis (Parmjit S. Panesar,
2010).
o Nguồn lactase từ vi khuẩn
Lactase từ vi khuẩn có pH tối ƣu trung tính, khoảng nhiệt độ tối ƣu tùy theo các loại vi
khuẩn khác nhau và các dòng khác nhau của cùng một loại vi khuẩn.
Enzyme lactase từ vi khuẩn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thủy phân lactose vì dễ lên men,
hoạt tính enzyme cao và ổn định. Vi khuẩn lactic gồm các nhóm lactococci, streptococci và
lactobacillus đƣợc xem là đối tƣợng của nhiều nghiên cứu bởi 3 lý do sau:
-

Khi sử dụng enzyme này thủy phân lactose trong các sản phẩm lên men thì ít
hoặc khơng gây phản ứng phụ.

-

Vi khuẩn lactic thƣờng đƣợc coi là an tồn, vì vậy nguồn enzyme từ chúng có
thể đƣợc sử dụng trực tiếp mà khơng cần phải tinh sạch.

-

Nhiều chủng thuộc nhóm vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic (Husain, 2010).

Các chủng Lactobacilli thƣờng đƣợc dùng trong công nghiệp nhƣ là probiotic. Lactase từ
các vi khuẩn lactic là enzyme nội bào và nó khơng đƣợc giải phóng ra ngồi tế bào dƣới điều
kiện lên men thƣờng. Các nguồn vi khuẩn cung cấp lactase tiềm năng nhƣ: L. lactis, L.
acidophilus, L. bulgaricus. Trong đó, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 11842 đƣợc
sử dụng trong việc sản xuất yogurt có khả năng sử dụng trong việc sản xuất lactase nội bào
cao hơn các loại vi sinh vật khác đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp sữa.

Nguồn vi sinh có khả năng chịu nhiệt thƣờng sản xuất các enzyme lactase có tính bền
nhiệt tốt. Ví dụ lactase từ S. thermophilus có nhiệt độ tối ƣu vào khoảng 55oC.

9


Tuy nhiên, bất lợi của việc sử dụng những enzyme này là hiệu suất thấp; thấp hơn khoảng
10 lần so với các enzyme từ nấm men. Điều này có thể đƣợc cải thiện thơng qua q trình tối
ƣu hóa điều kiện nuôi cấy hoặc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp (Ustok Fatma Isik, 2007).
1.2.2

Tính chất hóa lý

Enzyme có nguồn gốc khác nhau thì có các đặc tính khác nhau nhƣ trọng lƣợng phân tử,
chiều dài chuỗi protein và vị trí trung tâm hoạt động. Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây
cho rằng lactase từ những nguồn khác nhau đều có tác nhân cho proton và phản ứng là acid
glutamic (Ustok Fatma Isik, 2007).
Bảng 1.2: Tính chất hóa lý của enzyme từ một số nguồn vi sinh vật (Ustok Fatma Isik,
2007)
Nguồn gốc enzyme

K. lactis

E.coli

A. niger

Chiều dài (AA)

1025

1023

1006

Tác nhân cho proton

Glu482

Glu461

Glu200

Tác nhân phản ứng

Glu551

Glu537

Glu298

Trọng lƣợng phân tử enzyme lactase khác nhau giữa các lồi vi sinh vật, ví dụ E.coli có
khối lƣợng phân tử là 116353 kDa mỗi monomer ƣớc tính khoảng 540 kDa mỗi phân tử. Khối
lƣợng phân tử của enzyme từ một số vi khuẩn đƣợc trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3: Trọng lượng phân tử của lactase có nguồn gốc từ vi khuẩn (Ustok Fatma Isik,
2007)
Nguồn gốc

Khối lƣợng phân tử (kDa)

Streptococcus solfataricus

240

Streptococcus thermophilus

530

Lactobacillus acidophilus

570

Lactobacillus lactis

500

10