Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (46.4 MB, 93 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG

Tên

đề tài:

Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ

ơ x y

hóa Fe(II), khử nitrate

trong một số mơi trường sình thái và khả năng ứng dụng của chủng

Mã sổ:

QG. 07. 23

Chủ trì đề tài:

TS. Đinh Thúy Hằng

Cơ quan:

Viện Vi sinh vật & Công nghệ

Sinh học - ĐHQGHN

' H Ọ C

Quoc

GIA HA N Ọ I

tNJG TÁM THỎNG TIN THƯ VIỆN

o ự ẹ i u

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

BÁO CÁO KÉT QUẢ THỰC H Ệ N ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CÁP DHQG

BÁO CÁO TÓM TẮT

1. Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vỉ khuẩn kỵ khí ơxy hoả Fe(II), khử nitrate trongmột số môi
trường sinh thái và khả nâng ứng dụng của chúng.

2. Mã số: QG.07.23

3. Thời gian thực biện: 2 năm (2007 - 2009)

4. Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà nội

5. Chủ trì đề tài: TS. Đinh Thuý Hằng

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN

Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email:
6. Cán bộ tham gia: CN. Nguyễn Thị Tuyền

ThS. Nguyễn Minh Giảng
7. Mục tỉêu và nội dung nghiên cứu

M ục tiêu:

- Nghiên cứu vả so sánh đa dạng sinh học của vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử NO3- tại một số môi
trường sinh thái khác nhau.

- Phân lập các nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số trong mỗi loại môi trường sinh thái và
nghiên cứu các đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá của chúng.

- Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng vi khuẩn phân lập được vào việc kết hợp loại bỏ
Fe2+, Mn2+, NO3” trong môi trường ô nhiễm.

Nội dung nghiền cửu:

- Mau trầm tích ở đáy hồ, mẫu đất ở ruộng lúa ngập nước và mẫu trầm tích ven biển sẽ được 
lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ơxy), đưa về phịng thí nghiệm và giữ ở
4°c cho đến khi tiến hành phân tích vi sinh vật.

- Số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe(II)/khử NO3- sẽ được xác định theo phương pháp MPN (Most

Propable Number) trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) làm nguồn điện tử và NO3- là chẩt
nhận điện tử trong điều kiện kỵ khí hồn tồn. Thành phần khống của môi trường đàm bào
tương ứng với môi trường sinh thái tại địa điểm lấy mẫu.

- Đa dạng về thành phần loài ttong các mẫu khác nhau sẽ được xác định thông qua phương
pháp sinh học phân tử, tách DNA tổng số trục tiếp từ các lơ thí nghiệm ở nồng độ pha loãng
khác nhau trong dãy MPN và phân tích tính đa dạng cùa một đoạn gen 16S rARN cùa tập
đoàn vi sinh vật thu được trong mỗi !ô bằng phưomg pháp PCR/DGGE.

- Các chùng vi khuẩn ơxy hoả Fe(ÍI)/khừ NCV đại diện, chiếm đa số tại mỗi địa điểm lấy mẫu
sẽ được phàn lập từ ống pha lỗng cao nhất có vi sinh vật phát triển cùa dăy MPN bằng
phương pháp ống thạch bán lòng.

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

chùng cỏ hoạt tính sinh học (khả năng chuyển hóa Fe(II) và NO3- ) cao và nghiên cứu khả
năng ứng dụng của chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe(II), Mn(II), NO3- trong môi trường ô
nhiễm.

8. Các kết quả đạt được

- Ba dạng mơi trường khác nhau gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước và trầm tích ven
biển được chọn để tiến hành nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn ơxy hố Fe(II) khử NO3- .
Đây là những dạng mơi trường trong đó vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hố sắt và nitơ
đóng vai trị quan trọng. Mầu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) tại các môi trường sinh thái
kể trên được thu thập và sử dụng để phân tích nhóm vi khuẩn kỵ khí này.

Sổ lượng vi khuẩn ơxy hố Fe(II), khử NO3- đã được xác định bằng phương pháp MPN trong
môi trường dịch thể nước ngọt (đối với mẫu ao và mẫu ruộng lúa) hoậc nước lợ (đối với mẫu
trầm tích ven biển) chứa Fe(II) làm chất cho điện tử, NO3' làm chất nhận điện tử và
acetate/C0 2 làm nguồn cacbon. Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong các ống MPN được nhận
biết thông qua thay đổi màu sắc của môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu do Fe(II) bị ơxy

hố thành Fe(III).

- DNA tổng số từ các ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển được tách chiết và sử dụng
làm khuôn trong phân ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6S rDNA có độ dài 550 bp. Phân tích
điện đi biến tính đoạn gen trên cho thấy tính đa dạng khá cao của vi khuẩn trong các ống
MPN. Một số băng điện di đại diện được cắt và thôi gel để đọc trình tự, qua đó đã xác định
được các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu, cụ thể là
Anaeromyxobacter, Pseudomonas và Paracoccus.

- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện oxy hoả
Fe(II) khử NO3- trong các dãy MPN thông qua phương pháp lai in situ sử dụng các đầu dò 
huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn a-, 0- và y-Proteobacterỉa.

12 chùng vi khuẩn kỵ khí được phân lập và tinh sạch (4 chùng đối với mỗi dạng môi trường
sinh thái). Tính đa dạng cùa các chủng này về mật di truyền được xác định thơng qua phân
tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA đài 1500 bp sừ dụng hai enzyme Mspỉ và 
Haeììl. Các chùng đại diện cho các nhóm ARDRA được giải trình tự để xác định vị trí phân 
loại của cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện.

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

- Các kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 02 bài báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham
gia hội nghị về sinh thái sinh vật và 02 trình tự gen đăng ký trong GenBank.

- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học
9. Tình hình sử dụng kỉnh phí

- Tổng kinh phí của đề tài được duyệt: 60.000.000 VNĐ

- Tổng kinh phí của đề tài đã chi: 60.027.400, bao gồm các mục:

+ Chi phí thuê mướn: 24.000.000

+ Chi phí nghiệp vụ chun mơn: 29.522.400

+ Văn phịng phẩm: 505.000

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

SUMMARY

1. Project title: Diversity o f anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in
some ecological environments and their potential use.

2. Code: QG.07.23

3. Duration: 2007 - 2009

4. Organizer: Vietnam National University Hanoi (VNUH)
5. Project leader: Dr. Dinh Thuy Hang

Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH
6. Key participants: BSc. Nguyen Thi Tuyen

MSc. Nguyen Minh Giang
7. Objectives and study contents

Objectives

- Comparatively study biodiversity of Fe(II) oxidizing - nitrate reducing bacteria in some
ecological environments in Vietnam.

- Isolate representative strains that dominate in each environment and study their physiological,
and phylogenetic characteristics.

- Study the application potential o f the isolates in elumination o f Fe(II), Mn(II) and NO3- in
contaminated water sources.

Study contents

- Collect anaerobic mud samples from representative environments in Vietnam and keep at 4 °c 
as the sources for microbiological studies.

- Determine the number of Fe(II) oxidizing-nitrate reducing bacteria in these environments by
using MPN method carried out in anoxic liquid media containing Fe(II) as electron donor,
N 0 3- as electron acceptor and trace acetate as corbo source. Mineral content of the media
would respect to the natural conditions where the samples have been collected.

Species composition of the microbial communities in these environments would be analyzed
via PCR-DGGE method applied for 16S rDNA of the samples of the MPN series.

- Isolate representative strains from the MPN tube of the highest dilution by performing
dilution series in semi-liquid agar tubes.

Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study
o f application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3- in contaminated waters.

8. The obtained results

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

involvement o f bacteria in Fe and nitrogen cycles. Samples at 10 cm depth below the
sediment surface were used for this study.

Number o f Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method
earned out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater

pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine
environment). These media contained Fe(II) as electron donor, NO3- as electron acceptor and
trace acetate as carbon source. Growth of bacteria in the MPN series was recognized by
colour changing in the media, from white (Fell precipitation) to dark brown (Felll
precipitation).

Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments
to amplify 550 bp fragments of the V3 region o f the 16S rDNA and used for analyzing
diversity of bacteria in the communities with DGGE method. Most prominent DGGE bands
were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the
respective baterial groups.

Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ 
hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the a-, P- and y-Proteobacteria.

12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment).
Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of Ỉ6S rDNA with two
endonucleases Mspl and HaelU. 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups 
were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic
affiliation of the ARDRA groups.

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I. TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn tham gia chu trình Fe 2

1.2. Vi khuẩn oxy boá Fe(II) ở pH trung tính 3

1.2.1. Vi khuẩn hiếu khí oxy hố Fe(II) 3

1.2.2. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hố Fe(II) 3

1.2.3. Vi khuẩn khử nitrate oxy hoá Fe(II) 4

1.3. Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 4

1.3.1. Ảnh hưởng của nhiễm nitrogen trong các nguồn nước 4

1.3.2. Ảnh hưởng của nhiễm sắt trong các nguồn nước 5

1.3.3. Khả năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 6

CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u 7

2.1. Nguyên vật liệu 7

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 7

2.1.2. Hoá chẩt 7

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 7

2.2. Phuxmg pháp nghiên cứu 7

2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate 7

2.2.2. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 8

2.2.3. Tách DNA tổng sổ từ mẫu quần thể và từ chùng vi sinh vật 9
2.2.4. Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phương pháp ARDRA 9

2.2.5. Phưcmg pháp điện di biến tính DGGE 9

2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 10

2.2.7. Phương pháp FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 11

2.2.8. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate 12

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1. Xác định sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại ] 5
các môi trường Dghiên cứu

3.2. Phân tích cấu trúc quần thể bằng điện di biến tính (DGGE) 16
3.3. Mức độ oxy hóa Fe(II), khử nitrate của vi sinh vật trong các mẫu 17
3.4. Phản lập vi khuẩn oxy hóa Fe(ll) khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 17
và đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập.

3.5. Phân tích đa dạng vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu 21

bằng phương pháp FISH

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

của các chủng vi khuẩn đại diện

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Các trình tự gen

Phụ lục 2. Tham gia đào tạo khoa học

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

DANH MỤC CÁC CHỬVIÉT TẮT

ALF968 Fluorescence probe against a -Proteobacteria
ARDRA Amplified ribosomal DNA restriction analyses

BET42a Fluorescence probe against fi-Proteobacteria

BSA Bovin serum albumin

Cl Chloroform - isoamylalcohol

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DAP1 4’,6-diamino-2-phenylindole

DNA Acid deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis

EDTA Ethylene-diamine-tetraacetic acid

FISH Fluorescence in situ hybridization

GAM42a Fluorescence probe against y-Proteobacteria

MPN Most probable number

MQ Milli Q water

PBS Phosphate buffered saline

PCI Phenol-chloroform-isoamylalcohol

PCR Polymerase chain reaction

OD Optical density

rDNA Ribosomal DNA

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecy] sulfate

TAE Tris/Acetate/EDTA

TBE Tris/Borate/EDTA

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

MỞ ĐẦU

Trong tự nhiên sát là một trong những nguyên tố cỏ mặt với hàm lượng đáng kể, sau
carbon, nitơ, phospho và lưu huỳnh (Ehlich, 1996). Là một nguyên tố kim ioại, sất tồn tại ở các
dạng ion với điện thế oxy hoá khử khác nhau, gồm Fe(II) và Fe(III). Trong hai dạng kể trên chi
có Fe(II) tồn tại ở dạng hồ tan trong nước. Tuy nhiên, do có tính khử cao, Fe(II) nhanh chóng bị
oxy hố thành Fe(III) trong phản ứng hố học với oxygen khơng khí. Do vậy ion Fe(II) thường
chỉ được tìm thấy trong các điều kiện mơi trường khơng có oxygen, ví dụ như ở đáy các thuỷ vực,
các tầng nước ngầm hay mơi trường có pH thấp (Konhauser, 1997; Nealson, Saffarini, 1994).

Trong khi oxy hoá Fe(II) bằng oxygen theo con đường sinh học chỉ diễn ra ờ mơi trường
có pH thấp thì oxy hố Fe(II) bằng nitrate là q trình diễn ra ở điều kiện pH trung tính (Ehrlich,
1996). Trong tự nhiên, q trình oxy hố sắt (II) với chất nhận điện từ là nitrate chủ yếu diễn ra ở
ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (khơng có oxygen) trong lớp trầm tích ở đáy các thuỷ
vực. Oxy hoá Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trị quan trọng trong mơi trường ô
nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxygen) và NƠ3- cao (đo chất hữu cơ bị phân huỳ tạo
thành) (Weber et aL, 2006b). Các loài vi khuẩn với khả năng tiến hành phàn ứng oxy hố khử 
này có thể cùng một lúc thực hiện được hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hoà tan trong
nước về dạng Fe(III) kết tủa, và hai là loại bỏ NO3-, chuyền thành dạng N2 khơng độc hại.

Nhiều cơng trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm vi
khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate với mật độ khá cao (106 tể bào/g trầm tích) trong các điều kiện
mơi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa iý khác
nhau trên thế giới (Straub, Buchholz-Cleven, 1998). Tuy nhiên ờ Việt nam cho đến này chưa có
cơng trình nghiên cứu nào đề cập đến quá trình sinh học dùng Fe(II) để khử NO3” cũng như các
loài vi khuẩn đảm nhiệm quá trình này. Do vậy, đề tài ' Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ k h í 
oxy hoả Fe(IĨ), kh ử nitrate trong một sổ môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của 
chúng ’’ được đặt ra với mục tiêu nghiên cứu tính đa dạng của vi khuẩn khử nitrate sử dụng Fe(II) 
là nguồn điện tử duy nhất trong một sổ dạng môi trường sinh thái đặc trung ở Việt Nam, đồng

thời tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý các nguồn nước nhiễm ion sắt kim
loại và nitrogen.

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn tham gia chu trình Fe

Sắt là một trong những kim loại phổ biến nhất và là nguyên tố có mặt trên trái đất với hàm
lượng lớn thứ tư, sau carbon, oxygen và nitrogen. Thông thường sắt tồn tại ờ đạng Fe2Ơ3 ít tan
trong nước và có màu vàng nâu. Trong mơi trường pH trung tính, dạng hịa tan trong nước Fe(II)
chi tồn tại ở điều kiện khơng có oxygen, ví dụ như ở đáy các thủy vực, nơi oxygen hòa tan trong
nước đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử đụng đề phân hủy các hợp chất hữu cơ. Q trình oxy hóa -
khử giữa Fe(II) và Fe(III) có vai trị thiểt yếu trong chu trình sinh địa hóa mơi trưởng và là một
trong những quá trình chuyển hoá vật chất quan ưọng có mặt từ rất sớm trên ưái đất. Fe(II) là
thành phần của các dạng khoáng phổ biến như siderite (khoáng chất có chứa FeCƠ3), vivianite
(Fe3(PC>4)2.8H2 0) hoặc pyrite (Fe$2), trong mơi trường kỵ khí có tính acid yểu đến mơi trường
trung tính (Straub et ai, 2001). Oxy hóa sắt diễn ra theo cả hai con đường hoá học và sinh học, 
trong đó các q trình sinh học cỏ vai trò đặc biệt quan trọng tại nhiều dạng mơi trường sinh thái
khác nhau (hình 1.1). Với thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) là +770 mV đối với môi trường
acid và +200 mV dối với môi truờng trung tính, Fe(II) có thể được sử dụng như chất cho điện tử
để cung cấp đương lượng khử cho các q trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi
khuẩn oxy hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, cịn Fe(III) có thể được sử dụng như
là chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí để oxy hoá các hợp chất hữu cơ (Weber et 
a i, 2006a).

Hình 1.1. Chu trình chuyển hoá sắt trong tự nhiên (Ehrlich, Newman, 2008).

1 - Vi sinh vật trong môi trường acid; 2 - Vi sính vật kỵ khỉ ở mơi tnxờng trung tính (khừ nitrate, quang hợp kỵ khi)' 
3 - Q trình hóa học trong môi trưcmg trung tinh với nồng độ oxygen cao; 4 - Quá trinh hóa học; 5 - Quá trình sinh 
học; 6 - H2S từ vi sinh vật; 7 - + 0 2, quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - -“-CO}2", quá trinh hóa học; 9 - chuyền H+

quá trình sinh học hoặc hỏa học; Í0 - Ọ trình sinh học hoặc hóa học.

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) bao gồm nhiều nhóm có các đặc điểm sinh lý khác nhau, ví dụ
như tự dưỡng và dị dưỡng, quang dưỡng và hóa dưỡng, ưa acid và trung tính, hiếu khí và ky khí.
Mặc dù vai trị của q trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trường là rất lớn nhưng
những hiểu biết hiện nay về sinh lý cũng như sinh hóa của nhóm ví sinh vật này cịn nhiều giới
hạn. Hầu hết các nghiên cứu và công bổ về quá trinh oxy hóa Fe(II) đều tập trung vào các vi
khuẩn hiếu khí ưa acid như Thiobacciỉlus ferrooxidans (Temple, Colmer, 1951; Ehrlich, 1996), 
phát triển trong môi trường có pH 1-2, nơi có Fe(II) và Fe(III) ờ dạng ion hòa tan. Tuy nhiên, ở
pH trung tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hịa tan, điều này gây khó
khăn cho việc nghiên cửu sinh ]ý của các vi sinh vật tham gia (Straub et a i, 2001). Mặc dù vậy, 
vi khuẩn tham gia chuyển hoá sắt ở điều kiện mơi trường trung tính, bao gồm oxy hoá Fe(II) và
khử Fe(III) lại rất đa dạng và đóng vai trị quan trọng hơn trong chu trình vật chất trong tự nhiên.

1.2. Vi khuẩn oxy bố Fe(II) ở pH trung tính

1.2.1. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II)

Mặc dù q trình oxy hóa Fe(II) bằng oxygen khơng khí tại pH trung tính xảy rất nhanh,
nhiều nghiên cứu cho thấy oxy hố Fe(II) bằng cịn đường sinh học hồn tồn có thể cạnh tranh
với q trình hố học. Vi khuẩn hiếu khí oxy hố Fe(II) ở pH trung tính được mơ tả đầu tiên là
các đại điện thuộc ba chi Gaỉỉionelỉa, Leptothrix và Marinobacier (Kuetzing, 1919; Ehrenberg, 
1919). Ngoài ra, theo các nghiên cứu gần đây, một số vi khuẩn oxy hố Fe(II) hiếu khí mới tìm
thấy được xếp vào các phân lớp a-, p- và Ỵ- Proteobacterìa (Edwards et a l, 2003; Emerson, 
Weiss, 2004; Dhillon et a i, 2005; Rentz et a i, 2007). Nhu vậy cùng với sự phát triển của các 
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, bức tranh đa dạng của nhóm vi sinh vật này ngày càng trở
nên phong phú hơn.

1.2.2. Vi khuẩn quang họp ky khí oxy hỏa Fe(II)

Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có the cũng được tạo thành thơng qua hoạt tính
oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khà năng sử dụng Fe(II) như một nguồn điện tử để tạo
các đương lượng khử cho q trình đồng hóa carbon vơ cơ (Weber et aỉ., 2006a). Vi khuẩn quang 
hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hỏa Fe(II) kỵ khí được biết đến đầu tiên (Widdel et aỉ., 1993). Hiện 
nay nhóm vi khuẩn này đã được mô tà với nhiều đại diện thuộc các chi Chỉorobium, Rhodobacier, 
Thiodictyon, Rhodovuỉum, Rhodomicrobium (Ehrenreich, Widdel, 1994; Heising, Schink, 1998; 
Heising et aì., 1999; Straub et a l, 1999; Kappler, Newman, 2004).

Tuy nhiên quá trình oxy hóa Fe(II) bàng quang hợp trong mơi trường tự nhiên bị giới hạn
ở độ sâu 200 um trong đất và trầm tích do hạn chế ánh sáng (Ciani et a l, 2005). Hơn nữa, những 
nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rầng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) khơng có khả năng sử dụng
Fe(II) ờ dạng khoảng mà chi có thể oxy hóa Fe(II) ở dạng hịa tan (Kappler, Newman. 2004), do
đó, chúng khơng đỏng vai trị đáng kể trong chu trình chuyển hố sắt trên cạn.

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

1.2.3. Vi khuẩn khử nitrate, oxy hóa Fe(II)

Vi khuẩn oxy hố Fe(II) kỵ khí đóng vai trị quan trọng trong chu trinh chuyển hoá sắt,
đặc biệt trong các lóp trầm tích nơi vi sinh vật bị hạn chế về oxygen hồ tan (Lack al., 2002; 
Weber et al., 2001; Senn, Hemond, 2002; Straub et al., 2001; Weber et a i, 2006c). Với hiệu điện 
thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7 vào khoảng +200 mV, Fe(ll) có thể ừờ thành nguồn điện
tử cho q ưình hơ hấp kỵ khí, khử nitrate thành N2 do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub
et a i, 1996; Benz et a i, 1998; Weber et a i, 2006c). Q trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate được 
tóm tát theo phương trình phản ứng như sau:

10 Fe2+ + 2 N 0 3“ + 24 H20 = 10 Fe(OH)3 ị + N2 T + 9 H2 1

Trong tự nhiên, q trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chù yểu diễn ra ở
ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (khơng có oxygen) trong lớp trầm tích ờ đáy các thủy
vực. Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate được phân lập đầu tiên từ các
lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen (Đức) năm 1996 (Straub et a i, 1996). Một số cơng

trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt phổ biển của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao
(1 0 6 tế bào/g trầm tích) trong các điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm cà nước ngọt, nước
lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub et a l, 1998). Các loài vi 
khuẩn phổ biến nhất trong nhóm nảy được biết đến hiện nay lả các lồi thuộc chi
Chromobacteríum và Klebsiella (Benz et aỉ.y 1998; Senko eí a i , 2005; Weber etaỉ., 2006b).

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phần lớn sinh trường dị dưỡng, phụ thuộc vào chất
hữu cơ (vi dụ như acetate) để cung cấp nguồn carbon cho việc tổng hợp thành phần tế bào
(Straub et al., 1996; Benz et a l, Ỉ998). Bằng phương pháp MPN, người ta đã xác định được vi 
khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate nói chung, trong đó
nhóm sinh trưởng dị dưỡng thường gặp hơn nhóm sinh trưởng tự dưỡng (Straub et a l, 1998). Vi 
khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dưỡng mới chỉ được biết điến với hai đại diện là
Ferroglobus pỉacidus, một vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Hafenbradl et a l, 1996), và một vi khuẩn ưa 
ấm thuộc phân lớp p-Proteobacteria (Weber et a l, 2006b). Đối với lịch sừ tiến hoá, các sinh vật 
sinh trường tự dưỡng vơ cơ như nhóm vi khuẩn oxy hoả Fe(II) khử nitrate tự dưỡng đóng một vai
trị quan trọng, góp phần tạo nguồn carbon hữu cơ ban đẩu để duy trì sự sống.

1.3. Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
1.3.1. Ảnh hưởng của nhiễm nitrogen trong các nguồn nước

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Ảnh hưởng tới môi trường sinh thái

- Ả n h hưởng độc hại: Nitrogen ammonia ở dạng ammonia rất độc hại đối vói các lồi 
thủy sinh, đặc biệt là cá. Ở pH trang tính, 99% N-ammonia tồn tại ở dạng N Rị+, trong
khi đó khi pH ở khoảng trên 9, dạng NH3 tăng đảng kể. Do vậy mức độ độc hại của N-
ammonia rất nghiêm trọng khi pH trong môi trường tăng, thường là hậu quả sau khi có
lượng nước thải với độ kiềm cao đổ ra ngồi mơi trường.

- Giảm oxygen hịa tan trong các thủy vực: ammonia thường dẫn đến việc tăng nhu cầu 
oxygen cho các quá trình sinh hóa ở các thủy vực. Theo tính tốn, 1 mg ammonia thải ra

ngồi mơi trường địi hỏi lượng oxygen hòa tan tăng thêm 4,6 mg, chủ yếu do hoạt động
của nhóm vi khuẩn tham gia vào q trình nitrate hóa. Hậu quả của việc tăng nhu cầu về
oxygen này là làm thiếu oxygen cho các lồi thủy sinh khác cùng sống trong mơi trường.
- Gây hiện tượng p h ủ dưỡng trong các ao hồ: việc tăng hàm lượng nitrogen trong các 
ao hồ kéo theo sinh trưởng rầm rộ cùa tảo và các thực vật thủy sinh, dẫn đến tâng nhu
cầu oxygen về đêm và làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của các động vật thủy sinh.
- Làm giảm hiệu quả của chỉorỉn: ammonium kết hợp với chlorin tạo hợp chất

chloramin có tác dụng kháng khuẩn kém hom so với chlorin ở dạng tự do.

- Ầ n mòn: ammonium ở nồng độ trên 1 mg/L có thể gây ăn mòn cho các đường ống dẫn 
nước và các cơng trình kim loại dưới nước.

Ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng

- Gây bệnh thiếu máu: nitrate là nguyên nhân gây bệnh thiếu máu (Methemoglobinemia) 
ở người do bị khử thành nitrite trong hệ đường ruột, sau đó liên kết với hemoglobin
dưới dạng methemoglobin, không cỏ khả năng vận chuyển oxygen. Ở người khỏe mạnh,
hàm lượng methemogỉobin trong máu được giữ ổn định ở mức 1 - 2% nhờ enzyme 
methemoglobin reductase. Trè em dễ bị ảnh hường cùa bệnh này hơn so với người
trưởng thành vì có độ pH trong dạ dày cao hom, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn
khử nitrate sinh trưởng. Vitamin c được biết đến với khả năng bảo vệ và giữ nồng độ
methemoglobin ở mức thấp.

- Gây bệnh ung thư: nitrite được tạo ra từ nitrate cịn có thể kết hợp với các amine thứ 
cấp để tạo thành nitrosamine, là tác nhân gây đột biến gen và một số bệnh ung thư như
ung thư dạ dày, ung thư bàng quang (Tricker, Preussmann, 1991; Lundberg, 2004).
Theo quy định quốc tế, giới hạn nitrate trong nước uổng là 10 mg/L.

1.3.2. Ảnh hirởng của nhiễm sắt trong các nguồn nước

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

oxygen cho cơ thể). Ngoài ra sắt còn tham gia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử như
cataỉase, peroxydase vả các cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể).
Sắt đóng vai trị quan ưọng trong việc sản xuất ra năng lượng oxy hoá, vận chuyển oxygen, hô
hấp của ty lạp thể và bất hoạt các gốc oxy hóa cỏ hại. Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây
ứ đọng sắt tại các mô như tim, gan, tuyến nội tiết..., dẫn đến rối loạn trầm trọng chức năng các cơ
quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006).

Cơ thể hấp thu sắt ở dạng Fe(II). Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển
thành dạng gắn với các acid amine hoặc đường. Acid chlohydric khử Fe(III) thành Fe)II) để hấp
thu. Vì vậy nên lượng sắt dư thừa trong nước uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy
hiểm cho con người.

Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh cãi. Người ta cho
rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trong mô não là một trong những
nguyên nhân của các bệnh về thần kinh như Parkinson và Alzheimer, sắt còn được coi như là
một chất gây ung thư rất mạnh, thường gặp nhất là ung thư gan. sắt du thừa tích luỹ trong tim và
các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim hoặc phá vỡ động mạch, sắt thừa lắng đọng trong
lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insulin và gây ra bệnh đái tháo đường nghiên trọng.

1.3.3. Khả năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1. Nguyên vật liệu

2.1.1. Dối tượng nghiên cứu

Mầu bủn vả trầm tích được thu thập ờ ba môi trường sinh thái đại diện khác nhau: mầu
bùn đáy ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước được thu ở Từ Liêm, Hà Nội, mẫu trầm tích nước

lợ được thu ở ven biển Vân Đồn, Quảng Ninh. Mâu chân ruộng và ữầm tích ven biển được thu
thập ừong các ống thủy tính nút xốy cho phép khoan sâu tới 60 cm dưới bề mặt trầm tích (hình
2.1). Mẫu đáy ao được thu thập trong binh thuỷ tinh, sau đó bổ sung nước vào tồn bộ thề tích để
giảm thiểu sự ảnh hường cùa oxygen trong khơng khí. Mầu được bảo quản ở nhiệt độ 4 °c cho
đến khi tiến bành các thí nghỉệm tiếp theo.

Ỉ

Hình 2.1. Mẫu bùn và trầm tích thu thập ngồi mơi trường tự nhiên, được đảm bảo kỵ khí
nghiêm ngặt.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất được sừ đụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu
chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn nhu Merck (Đức), Sigma (Mỹ). Hoá chất và
một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas
(Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cửu

Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN, sử
dụng các thiết bị chuyên môn dùng ừong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích đạt
tiêu chuẩn quốc tế.

2.2. Phirong pháp nghiên cứu

2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate được xác định thông qua phương pháp MPN
(American Public Health Association, 1969) trong môi trường dịch thể kỵ khí hồn tồn có thành
phần khống tương úmg với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc
nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển) (bàng 2 .1).

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

Băng 2.1. Mơi trường kbống kỵ khí nirớc ngọt và nước lợ cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử 
nitrate (Ratering, 1999).

Thàob phần Nước ngọt Nước lợ

Nước cất 1 lít 1 lít

NaCl 1 g 13,7 g

MgCl2.6H20 0,4 g 5,9 g

CaCl2.2H20 0,15 g 0,81 g

KC1 0,5 g 0,58 g

KBr - 0,05 g

MgS04.7H20 0,25 g 0,25 g

NH4CI 0,25 g Hỗn hợp NH4CI (0,25 g) và

KH2PO4 0 , 2 g KH2PO4 (0,25 g) được chuẩn

bị trước trong 50 ml nước cất
Khử trùng ờ 121 °c trong 25 phút, lấy ra ờ 80 °c, sục khí N2 trong 5 phút, làm nguội trong
nước máy, sau đó thêm các dung dịch sau (đã khử trùng riêng bằng nhiệt hoặc màng lọc):

Hỗn hợp Vitamin 1 ml 1 ml

Hỗn hợp vi lượng 1 ml 1 ml

Vitamin BI (Thiamin) 1 ml 1 ml

Vitamin B12 0 , 1 ml 0 , 1 ml

Vitamin B2 1 ml 1 ml

Na-Acetate 1 M I ml 1 ml

NaNƠ3 I M (chất nhận điện tử) 5 ml (5 mM) 5 ml (5 mM)
FeS04 1 M (chất cho điện tử) 10 ml (10 mM) 1 0 ml (10 mM)

NaHC03 1 M 30 ml 30 ml

Chuẩn pH ở 7-7,2, sau đó chia mơi trường sang các bình serum và ống nghiệm rồi sục khí N2)
đậy bình và ống nghiệm bầng nút cao su có kẹp nhơm hay nút vặn có lỗ hở.

Mẩu được bổ sung vào ống MPN đầu tiên với tỷ lệ 10% thể tích. Thí nghiệm được ủ tại
28 °c trong 8 tuần, sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua đổi màu
môi trường từ trắng đục (màu của Fell) sang vàng nâu (màu cùa Felll).

2.2.2. Phân lập vỉ khuẩn kỵ kh ío xy hoả Fe(IỈ) kh ử nitrate

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

ngược đầu tại 28°c trong bóng tối. Khuẩn lạc đom phát triển trong các ổng pha loãng được tách
bằng pipet Pasteur và chuyển sang mơi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ).

2.2.3. Tách DNA tồng sổ từ mẫu quần thể và chủng vi sinh vật

DNA tổng số của quẩn thể vi sinh vật từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp

do Zhou và cộng sự (1996) mô tà với cải biến về nồng độ đệm phosphate là 120 mM thay cho
100 mM và nồng độ proteinase K là 14 mg/ml thay cho 10 mg/ml. DNA genome của các chủng
đom được tách theo phương pháp cùa Marmur (1961). Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được
hoà tan trong nước và bảo quản tại - 2 0 °c.

2.2.4. Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phương pháp AKDRA

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) đuợc sử dụng để nghiên cứu
mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng
enzyme giới hạn (Ravenschlag et a i, 1999). Gen 16S rDNA của các chủng đơn được khuếch đại 
trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27 F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) và 1492R
(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T), sau đó được xử lý bàng hai enzyme giới hạn Mspỉ và 
HaeIII (Fermentas) (bảng 2.2). Sản phẩm DNA sau khi đã xử lý enzyme được phân tách bằng 
điện đi trên gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút. Các chủng vi khuẩn sẽ được xếp
nhỏm đựa trên sự tương đồng về phổ các băng điện di.

Bảng 22. Phản ứng cắt gen Ỉ6S rDNA bằng các enzyme giói hạn Mspl và Hall

Nước cắt vơ trùng 18 ụl

1 Ox đệm R (hoặc đệm Tango) 2 p.1

Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37 °c trong 3 giờ

2.2.5. Phương pháp điện di biến tính DGGE

Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA: Vùng V3-V5 của gen I6S rDNA với độ dài 550 bp (hình 2.2)
được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG)
và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer et a i, 1993). “Touch-down” PCR được 
sừ dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sàn phẩm phụ trong phản ứng khuyeechs

đại. Đẻ tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC
khoảng 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G)
được gắn vào đầu 5’ cùa mồi GM5F.

Sản phầm PCR

Enzyme Hae III (hoặc Msp I)

10^1 (0,1 -0,5 p.g ADN)
1 |il (1 0u/|il)

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

6U 5f

£<*># Tuel “ . / A. ___ ^ miEc1f *

16S rDNA 0

VI V2 V3 , V4 j V5

i. ♦

+ EcS1BrL a c ĩ WIAB2 WBAC7 £*1406

HÕA2 ♦

itw

Hình 2.2. Vùng V3-V5 và vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillusplantarum
Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại đoạn V3-V5 ờ vi khuẩn như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại vùng V3-V5 của

gen 16S rĐNA

Thành phần phản ứng Thể tích (jil) Chu kỳ nhiệt (touch-down PCR)

h2 0 m q 27 Taq polymerase được đưa vào phàn ứng sau

IOx Taq b u ffe r 5 bước biến tính đầu tiên ờ 94 °c trong 1 phút

BSA 5 khi nhiệt độ đạt 80 °c. Nhiệt độ gắn mồi

MgCl2(20 mM) 4 được đặt cao hon 1 0 °c so với nhiệt độ lý

dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 thuyết (tức là 65 °C). Sau mỗi chu kỳ nhiệt
Mồi GM5F-GC (50 pmol/nl) 1 độ gắn mồi giảm đi 0,5 °c cho tới khi đạt
Mồi 907R (50 pmol/fi.l) 1 tới 55 °c, ờ nhiệt độ này phản ứng tiến hành

ADN khuôn 2 thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi

Taq polymerase 1 cùa môi là 3 phút.

Tổng thể tích phản ứng 50

DGGE: Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính
urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di Dcode™
System (BioRad) ở nhiệt độ 60 °c tại 200 V trong 3,5 h. Sau khi điện di, gel polyacrylamide
được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và
chụp ảnh duới tia u v trên máy GelDoc (BioRad). Băng điện di được cắt và thôi trong nước qua
đêm tại 4 °c. Dịch thôi DNA được dùng lảm khuôn để thục hiện phản ứng PCR như chu trình
nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE với cặp mồi GM5F (khơng có kẹp GC) và 907R. Sàn phẩm

PCR tiếp theo được tinh sạch và giải trình tự.

2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

3110 Avant Appied Biosystems. Trinh tự gen sau đó được phân tích so sánh với trình tự 16S
rDNA của các lồi có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng
phần mềm BLAST Search. Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining
(Saítou, Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều
(Felsenstein, 1985).

2.2.7. Phương pháp F ISH (Fluorescence In Situ Hybridization) (Amann et al., 1992)

Nguyên lý: FISH là phương pháp lai sử dụng các đầu dị thích hợp bắt cặp với rRNA nhàm xác
định phả hệ cùa vi sinh vật trong quần thể một cách trực tiếp, không qua bước phân lập và ni

Chuẩn bị bóa chất:

Formaldehyde 37% PBS I Ox

5 M NaCl I M Tris-HCl

0,5 M EDTA SD SỈ0%

Formamide DAPI (0,02 mg/ml)

Đầu dò: là các đoạn oligonucleotide đài 18-20 nucleotide gán chất huỳnh quang
sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bước sóng 552 nm). Các đầu dò đã sử dụng trong nghiên
cứu này được liệt kê trong bảng dưới đây (nồng độ 2 ng/^1).

Bảng 2.4. Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu

Tên đầu dò Đối tượng bắt cặp Trình tự (5’-> 3’) Formam ide (%)

ALF968 a -Proteobacteria GGTAAGGTTCTGCGCGTT 2 0

BET42a p -Proteobacíeria GCCTTCCCACTTCGTTT 35

GAM42a y-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC 35

Bảng 2.5. Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa

Dung dịch gổc Thê tích

2 ml đệm lai 50 mi đệm rửa

5 M NaCl 360 9 ml 900 mM

1 M Tris/HCl 40 ụ\ 1 ml 20 mM

Form amide % phụ thuộc từng đâu dò

0,5 M EDTA 0,5 ml 5 mM

Nước cât vô trùng dân tới 2 ml dân tới 50 mi

SDS 10% (bô sung cuối

cùng để tránh kết tủa) 2 ịil 50 ịiị 0,0 1%

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

- Hoà 0,5 g mẫu đất/bùn ưong 1,5 ml PBS lx

- Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4 °c trong thời gian ít nhất
ỉà 30 phút nhưng không quá 24 h.

- Ly tâm, loại phần dịch và rửa lại cặn tế bào bàng PBS IX

- Ly tâm, loại PBS lx và bổ sung 1,5 ml hồn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1)
- Bảo quản tế bào đã cố định tại -2 0 °c.

Lai với đầu dò:

- Lấy 15 - 20 mẫu hồ vớí 2 ml nước cất vơ trùng vả đưa lên màng polycarbonate (0 , 2 ịim).
- Để khơ mẫu trong khơng khí và bảo quản trong hộp kín tại -2 0 ° c cho đến khi sử dụng.
- Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đường kính 25 mm có thể chia
làm 6 - 8 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau). Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số).
- Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ổng eppendorf (bảng 2.5)

- Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 fil đầu dò (2 ng/|il) với 18 jnl đệm lai trong ống eppendorf
0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sảng.

- Đặt một miếng giấy thẩm vào ống Falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống.

- Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên trên. Các mẫu lai với cùng một
đẩu dị có thể đặt cùng trẽn một lam kính.

- Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên các mẫu và đặt tồn bộ lam kính vào ổng falcon có miếng giấy lọc
thấm đệm lai đã chuẩn bị trước (ở tư thế nằm ngang) và lai ờ 46°c trong thời gian ít nhất là
90 phút (nhưng không quá 3 h).

- Chuẩn bị 50 ml đệm rửa trong ống falcon 50 ml

- Chuyển nhanh mẫu sau khi lai vào đệm rửa đã được làm nóng trước đó trong bể ổn nhiệt tại
48 °c trong 15 phút. Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa Petri. Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua
nước cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khơ (mật có mẫu ở trên).

Nhm đối chửng và quan sát:

- Đe nhuộm đối chứng, nhỏ 50 nl dung dịch DAPI lên mồi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó
rửa nhanh trong nước cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khơ trong khơng khí (đặt
trong hộp tối). Mầu có thể được bảo quản trong -2 0 ° c trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh
quang khơng bị thay đổi.

- Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

2.2.9. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate

Định Iưựng Fe(II) bằng thuổc thử phenanthroiin {DIN 38406 E1-], 1983)

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

Chuẩn bị:

Dung dịch HC1 25% (rửa dụng cụ): dụng cụ thủy tinh thí nghiệm phải được rửa qua dung
dịch HC125% sau đó tráng bằng nước cất trước khi sử dụng.

Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4
Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):

CH3COONH4 40 g

CH3COOH 50 mi

Nước cất đủ 100 ml

Dung dịch phenanthrolin 21 mM (tạo phức):
C12H9C1N2.H20 0,5 g

Nước cất đủ 100 ml

(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần)
Dung dịch chuẩn:

FeS04.7H20 2,78 mg

HC1 25% 6,25 ml

Nước cất đù 100 ml

Tiến hành:

- Sau khi thu mẫu, ngay lập tức hạ pH tới 1 bàng dung dịch H2SO4 loãng (1% thể tích)

- Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate, trộn đều bàng vortex. Hỗn hợp
phải có pH nàm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5).

- Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều.

- Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Đo OD tại bước sóng 510 nm.

- Đường cong chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(C) trong khoảng từ 5 - 50 ỊiM.
Định Iưọng nitrate bằng tbuổc thử acid disulfofemic (Lê Đức, 2004)

Nguyên lý: ĩon NƠ3~ tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, phàn ứng với
ammonia (NH3) đặc tạo thảnh phức có màu vàng, xác định được ở bước sóng 410 nm. Nồng độ
NO3- cho phép là 0,5 - 5 mg/L.

Chuẩn bị:

Dung dịch acid disulfofemic:

Phenol tinh khiết không màu 25g
H2SO4 đặc (tinh khiết) 150 ml
H2SO4 bốc khói (oleum) 75 ml

Trộn đều, đun sơi cách thủy trong bình cầu gắn ống sinh hàn hồi lun trong 2 giờ.
Dung dịch chuẩn:

K N 03(đ ã sấ y k h ô ờ 105 °C) 0,1631g

Nước cất 500 mỉ

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

CHClj lml

Nước cất dẫn đủ 1000 ml

Tiến bành:

- Mầu nước (chúa không quá 5 mg/L NO3) lấy vảo ống nghiệm, trung hòa đến pH 7.
- Chuyển mẫu sang chén sứ, cô cạn bằng đun cách thủy.

- Thêm 2 ml dung dịch acid disulfofemic, hòa tan phần cặn bằng đũa thủy tinh.

- Thêm 20 ml nước cất, 6 ml NH3 đặc hoặc 6 ml KOH 12N.

- Thêm nước cất cho đủ 50 ml (trong bình định mức).
- Đo OD tại bước sóng 410 tun.

- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng từ 0-10 mM.
Định lượng M n(n) bằng thuốc th ử formaldoxime (Brewer and Spencer, 1971)

Nguyên lý: Mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) trong môi trường
kiềm tạo thành phức có màu cam đị đậm, xác định ờ bước sóng 450 nm. Để khơng hình thành
các kết tủa hydroxiđ, pH tối ưu cùa phương pháp này lả 8 , 8 - 8,9.

Chuẩn bị:

Dung dịch formaldoxime:

20g Hydroxygenlamine hydrochloride hòa tan trong 450 ml nước cất, thêm 10 ml dung
dịch formaldehyde 37% và thêm nước đến 500m].

Dung dịch ammonia (NH3)

Hỗn hợp formalđoxime:ammonia theo ti lệ 5:2 (thể tích)
Dung dịch chuẩn (100 )ag mangan/ml):

Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMn04) trong 100 ml nước cất, thêm 3 ml dung
dịch H2SO4 đầm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 trong nước) cho đán khi dung dịch mất
màu. Đun sôi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa sau đó iàm lạnh. Bổ sung nuớc cho đù 1 lít.

Tiến hành:

- Đưa 35 mi mẫu về pH = 8 , 8 - 8,9

- Thêm 3 ml hỗn hợp Formaldoxime/Ammonia vào lắc xoay tròn, đều.
- Sau 2 - 30 phút đo quang phổ hấp thụ ờ bước sóng 450 nm.

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

CHƯƠNG IU. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xấc định số lưọng vi ldraẩn oxy hỏa Fe(]I), khử NO3' tại các mỏi trưừng nghiên cứu

Ba môi trường đại diện được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bủn đáy ao nước
ngọt, chân ruộng lúa ngâp nước và trầm tích nước lợ ven biển. Đây là những mơi trường có hoạt
động vi sinh vật trong chu trình chuyển hố sắt và nitrogen cao (Ratering, Schnell, 2000). số

lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO 3" trong các mẫu thu thập được xác định thông qua

pbưcmg pháp MPN sử dụng môi trường địch thể chứa FeSC>4 làm chất cho điện tử và NaNƠ3 làm
chất nhận điện tử cuối cùng. Thành phần khống trong mơi tnrờng tương ứng với điều kiện nước
ngọt (đối với mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (đối với mẫu bùn ven biển).
Sự phát triển của vi sinh vật sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(n) trong các ống MPN được nhận biết
thông qua biến đổi màu sắc của môi trưởng từ ừấng xanh (màu của Fe(II)) sang màu vàng nâu
(màu của Fe(ni)) (hình 3.la).

Hình 3.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử N O3- trong các môi trưởng

sinh thái khác nhau, (a) - Nhận biết sự có mặt của vĩ khuẩn trong các ống MPN
thông qua biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (Fell) sang vàng nâu
(Felll). (b) - Sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử N (V xác định thƠDg qua

phương pháp MPN.

Kết quả cùa thí nghiệm MPN (hình 3.1b) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử
NO3 cao nhất trong mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 X 103 tế bào/g bùn), cao hcm hẳn so với
mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 X 103 tế bào/g trầm tích) và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (1,5 X
1 0 3 tế bào/g bùn). Mật độ và mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV
với các điều kiện môi trường tại mỗi vùng sinh thái như trên cũng đã được tìm thấy ữong một số
nghiên cứu trước đây (Weber et al., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000; Hauck et al., 2001; 
Ratering, 1999; Straub et a i, 1996).

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

3.2. Phân tích cấu trú c quần thể bằng điện di biến tính DGGE

Để Xác định các nhóm vi khuẩn oxy hố Fe(II)/khử NO3- chiếm ưu thế tại các môi trường
nghiên cứu, chúng tơi tiến hành phân tích cấu trúc quần thể trong các ống MPN ở độ pha loãng
10" 3 (là nồng độ gần tới hạn cùa dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bẳng phương pháp PCR-DGGE
đoạn gen 16S rDNA (hình 3.2). Các băng điện di đuợc cắt từ gel và sử dụng lảm khuôn cho phản
ứng PCR tiếp sau để xác định trình tự và so sánh với các trình tự 16S rDNA đã công bố trong
ngân hàng đữ liệu GenBank.

R lì

•+• Pseudomonas sp.
Paracoccus SD. -►

Anaeromvxobơcter

SV.+-Hình 3.2. Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn gen Ỉ6S rDNA của quần thể vi
sinh vật trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu. A - Bùn ao nước ngọt; R
- Bùn chân ruộng ngập nước; B - Bùn trầm tích ven biển.

Cỏ thể thấy rằng các lồi Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên 
cứu. Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp h-Proteobacteria, hiện mới chi có một loài duy

nhất được công bố là A. dehaỉogenans cùng với một sổ đại diện chưa định đanh đến loài. Các

chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trường kỵ khí khử Fe(III), chưa có chùng nào 4
được nghiên cứu về khả năng sinh trưởng khừ NO3”, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude

et ai., 2003; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; Straub et al., 1996). Trong môi trường nuôi cấy sử 
dụng ờ đây (cũng như trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) đo kết quả
chuyển hoá Fe(II) bằng con đường hoá học (phàn ứng với lượng nhò oxygen trong môi trường)
và con đường sinh học (đo các vi sinh vật oxy hoá Fe(II) khử NC>3_). Do vậy, sự có mặt cùa các
lồi sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) như Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trường nghiên 
cứu trên (cũng như trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sẳt tại đây.

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

Pseudomonas là các nhóm vi khuẩn đóng vai trị chính trong việc oxy hoá Fe(II) bằng NO3 . Tuy 
nhiên, trong môi trường nước lợ (và nước biển) bàng phương pháp điện di biến tính hiện chưa
xác định được nhỏm chiếm ưu thế. Nguyên nhân có thể do sự kém cạnh tranh của vi khuẩn khử
NO3- nói chung so với các nhóm kỵ khí khác, đặc biệt là khử sulfate trong môi trường này
(Schlafleigh, 2000).

3 J . Mức độ oxy hoá Fe(II) và khử NƠ3~ của vi sinh vật trong các mẫu nghiên cứu

Nồng độ Fe(II) và NO3” ưong môi trường nuôi cấy được xác định theo thời gian để đánh
giá khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trong các mẫu làm giàu (hình 3.3).

£
3
$

Thời gian (ngày)

1 2 3 4

Thời gian (ngày)

Hình 3.3. Hoạt tính oxy boá Fe(II) (A) và khử N O3 (B) của các quần thể vi sinh vật tại

ba môi trường nghiên cứu sau khi làm giàu bằng phưong pháp MPN. Ký
hiệu: o đối chứng khơng có vi sinh vật; ■ mẫu bùn đáy ao nước ngọt; •m ẫu bùn
chân ruộng ngập nước; A mẫu trầm tích nước lợ ven biển.

Như vậy các quần thể vi sinh vật được làm giàu thể hiện khả năng sinh trường với Fe(II) và
NO3- khá cao. Ở cả 3 mẫu, lưọng nitrate trong môi trường bị khử gần hoàn toàn sau 4 ngày (hình
3.3B), tuy nhiên lượng Fe(II) khơng giảm tương ứng (hình 3.3A). Hiện tượng này cỏ thể lý giải
bằng sự có mặt của nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter trong cà 3 mẫu phân tích, làm chuyển hố 
Fe(III) ngược lại thành Fe(II).

3.4. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3- tử các mẫu nghiên cứu và đánh giá tính đa

dạng của các chủng phân lập

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3" được phân lập theo phương pháp pha loâng trong dãy
ống thạch bán lòng (1%) (Widdel, Bak, 1992) (hình 3.4a). Các khuẩn lạc đom được phân lập dựa
trên sự khác nhau về hình dạng và kích thước khuẩn lạc. Mồi khuẩn lạc được tách riêng và ni
cấy kỵ khí trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và NƠ3“ (5 mM) trong binh serum có
nút cao su và kẹp nhơm (hình 3.4b). 12 khuẩn lạc đơn được phân lập từ các ống MPN ở độ pha

V** hỌC tìU O C GIA HM NỤI

‘VỤNG TÂM THÒNG TIN THỰ VIỆN

</div>
(27)<div class='page_container' data-page=27>

lỗng cao nhếỉ có vi sinh vật phát triển (bảng 3.1) là đại diện cho vi khuẩn oxy hoá Fe(n), khừ

NO3" chiếm đa số tại ba mơi trưởng nghiên cứu.

Hình 3.4. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NOj đại diện tại các môi trườg nghiên

cứu. (a) Phân lập chủng đơn thơng qua phương pháp ống thạch kỵ khí bán lỏng;
(b) Ni cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử NO3” trong môi trường dịch thể
ở điều kiện ky khí hồn tồn.

Bảng 3.1. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khửNC>3 phân lập được từ các mơi tnrịug nghiên cứu

Nguồn phân lập ChÙDg vi khuấn Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Chân ruộng lúa
ngập nước (Tù
Liêm, Hà Nội)

INI Hình trịn, bề mật nhẵn, kích thước 1 -2 mm

EN2 Hình trịn, bề mặt khơng nhăn, kích thước 0,25-0,5 mm
IN 3 Hình trịn, bể mặt xù xi, kích thước 0,25-0,5 mm
IN4 Hình trịn, bề mặt xù xi, kích thước 1 -2 mm

Trầm tích nước lợ
tại biển (Vân Đồn,
Quảng Ninh)

IN5 Hình trịn, bề mặt nhẵn, kích thuớc 0,25 mm

IN6 Hình bầu dực, be mặt nhẵn, kích thước 0,25-0,5 mm
IN 7 Hình trịn, bề mặt xù xi, kích thước 0,8 mm

EN8

Hình trịn tia, mật đọ tể bao ở ngồi ít hơn phía ừong, kích
thuớc 1-1,5 mm

Đáy ao nước ngọt
(Từ Liêm, Hà
Nội)

IN9 Hình trịn, bề mặt xù xi, kích thước 0,5-1 mm

IN10 Hình trịn khơng đều, kích thước 0,5-1 mm
INI 1 Hình trịn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,2-0,3 nun

INI 2 Hình đĩa lồi hai mặt, kích thước 2-2,5 mm

</div>
(28)<div class='page_container' data-page=28>

Hue III \Isp\

Hình 3.5. Phổ điện di gen 16S rDNA của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NC>3~ 
sau khi xử lý bằng các enzyme giới hạn HaeIII và Mspl. INI - IN 12: Kỷ hiệu

cùa 12 chùng đơn phân lập được từ các mẫu nghiên cứu; M: Marker 1 kb (Bioneer,
Hàn quốc)

Từ kết quả phân nhóm ở bảng 3.2 kết hợp với nguồn gốc phân lập 12 chủng này (bảng
3.1), có thể nhận thấy tính đa dạng di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NCV
phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu ban đầu. Mầu trầm tích nước lợ ven biến thể hiện mức độ đa
dạng di truyền cao nhất với 4 chủng phân lập từ mẫu này (IN5, IN6, IN7, ĨN8) thuộc vào 4 nhóm
ARDRA khác nhau (nhóm 2, nhóm 3, nhóm 4 và nhỏm 5). Tiếp đến ỉà mẫu bùn đáy ao nước

ngọt với 4 chủng (IN9, IN 10, INI 1, IN 12) thuộc vào 3 nhóm ARJDRA khác nhau (nhỏm 1, nhổm
2 và nhóm 4). Thể hiện tính đa dạng di truyền thấp nhất !à mẫu bùn chân ruộng ngập nước với 4
chủng (INI, IN2, IN3, IN4) thuộc vào 2 nhóm ARDRA khác nhau (nhóm 1 và nhóm 2).

Bàng 3.2. Tính đa dạng về di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate đã
phân lập (INI - IN 12) dựa trên phân tích ARDRA

Nhỏm

ARDRA Chủng vi khuẩn

Các đoạn DNA tạo ra sau khi xử lý 16S rDNA băng
các enzyme giói hạn (bp)

H aelll Mspl

1 INI, IN2, IN4, INI 1 200, 300 300, 500

2 IN3, IN8 200, 300 500

3 IN5, IN9 200, 300 500, 800

4 IN6, IN 10, IN12 200, 300, 500 300, 500

5 IN7 200, 900 500

Ba chủng IN2, ĨN7 và IN 12 đại điện cho 3 nguồn phân lập và đại diện cho các nhóm
ARDRA chính (bảng 3.2, tên chủng in đậm) được lựa chọn để tiến hành phân tích trình tự đầy đù
của gen 16S rDNA và định danh khoa học. Chùng ĨN2 đại diện cho nhóm ARDRA-1 gồm 4
chùng từ hai dạng môi trường nước ngọt, chiếm trên 30% trong tổng số các chủng phân lập được.

Tương tự, chùng IN I2 đại diện cho nhóm ARDRA-4 gồm 3 chủng từ môi trường nước lợ và ao
nước ngọt, chiếm 25% trong tổng số các chùng phân lập được. Chủng IN7 làm thành một nhóm

</div>
(29)<div class='page_container' data-page=29>

riêng biệt (ARDRA-5), chi tìm thấy ở mơi trường nước lợ ven biển. Kết quả so sánh trình tự 16S
rDNA của các chùng nảy với ngân hàng dữ liệu GenBank cho thấy chủng IN2 có độ tương đồng
cao nhất với Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), chùng IN7 với Pseudomonas stutzeri 
(98%) và chủng IN 12 với Paracoccus ferooxydant (97%) (hình 3.6).

.0.02.

100

100

-B a c illu s su b íiỉis (FJ544386)

f

rLttc
671--- -•

E

Anaeromyxobacíer sp. FAcl2 (AJ504438)

Anaeromyxo bacler dehalogenans 2CP1 (NR027547)

•Aỉtaeromyxobacler clone (AB293367)

IN2

Paracoccus marinus (AB185959)
'aracoccusferooxydant (AY954687)

c

IN12

100 \-P aracoccvs sp (AM 989037)
P seudom onasp u ứ d a (FJ217182) 
P seudom onas stu izeri (EU518705)

TN7

• Ơ-Proteobacteria

a-Proteobacteria

100

ĩ

I— IP seudom onas nitroreducens PS2 (FJ588866)P seudom onas a lcaìigenes X B5 (GQ150490)

y-Proteobacteria

Hình 3.6. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa các chủng IN2, IN7, IN12 và các

lồi gần gũi dựa trên trình tự gen 16S rDNA. Cây được dựng theo phương pháp
neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Knuc trong trình tự nucleotide. Các số hiển thị ờ
các vị trí phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1 0 0 0 phép so sánh (chì
có các giá trị trên 50% được trình bày trên hình). B. subtiỉis là loài vi khuẩn được

chọn làm outgroup. Các ký hiệu hiển thị trong ngoặc kép iả mã của trình tự gen

16S rDNA tại các ngân hàng gen.

Như vậy nhóm ARDRA-4 vói chủng IN 12 làm đại diện là các loài Paracoccus và được 
tìm thấy trong hai dạng môi trường nước lợ ven biển và ao nước ngọt. Paracoccus là chi vi khuẩn 
nằm trong phân lớp a -Proteobacteria, gồm các loài sinh trường kỵ khí tuỳ tiện, hơ hấp bàng 
nitrate hoặc oxygen (Schapleigh, 2000). Kết hợp với kết quả phân tích PCR-DGGE ở trên có thể
thấy rằng Paracoccus và Pseudomonas là hai nhóm chính oxy hố Fe(II) khử NO3” chiếm ưu thế
trong ba dạng môi trường được nghiên cứu, trong đó Paracoccus có vai trị quan trọng hom ờ ao 
nước ngọt và Pseudomonas ở ruộng ngập nước. Đại diện cùa cả hai nhóm này được tìm thấy ờ 
mơi trường nước lợ ven biển, có thể là đo ảnh hường của nguồn nước ngọt từ đất liền.

</div>
(30)<div class='page_container' data-page=30>

Paracoccus (đại diện là chủng IN6) và Pseudomonas (đại diện là chủng IN7)cũng có mặt trong

dạng mơi trưởng náy.

3.5. Phân tích đa dạng vỉ khuẩn trong các mối trvờng nghiên cứu bằng phưong pháp FISH

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là phương pháp trực tiếp xác định mối liên
quan phả hệ của vi kHiiẩn trong môi trường sống của chúng thơng qua các đầu dị đánh dấu huỳnh
quang có thể bắt cặp với RNA ribosome. Theo kết quả so sánh trình tự gen 16S rDNA, các chủng
đại diện cho các nhóm ARDRA c hính được xếp vào các phân lớp a-, p- và y-Proteobacteria 
(hình 3.6), vì vậy trong thí nghiệm FISH chúng tơi sử dụng ba đầu dò ALF968, BET42a và
GAM42a tương ứng bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn thuộc ba phân lớp trên (hỉnh 3.7).

Hình 3.7. Hinh ảnh hiển vi của tế bào vi khuẩn ưong các mẫu nghiên cứu bắt cặp với các

Tỷ lệ vi khuẩn mỗi nhóm được tính theo tỷ lệ số tế bào bắt cặp với đầu dò tương ứng trên
tổng số tế bào được nhuộm DAPI. Phần khơng bắt cặp với một trong ba đầu dị được sử dụng ở

đây được gọi là phần không xác định (KXĐ). Thí nghiệm lai với các đầu dò chi cho kết quả đối
với mẫu từ hai môi trường nước ngọt là ruộng ngập nước và bùn đáy ao, mẫu trầm tích ven biển
khơng cho kết quả dương tính đối với cả 3 đầu dò. Kết quả thống kê số tế bào bắt cặp với các đầu
dò trên tổng số tế bào nhuộm DAPI được trình bày trên hình 3.8.

Hình 3.8. Kết quả phân tích đa dạng vi sinh vật trong các mẫu bằng phương pháp FISH

Kết quà thu được cho thấy số vi sinh vật không bắt cặp với một trong ba đầu dị sử dựng ờ
thí nghiệm FISH chiếm một phần khá lớn trên tổng số tế bào nhuộm DAPI trong các mẫu ruộng

đầu dò huỳnh quang.

Ruộng ngập nước Bùn đáy ao

ALF968

20%

ALF968 
_ 30%

GAM42a

20%

BET42a

20%

</div>
(31)<div class='page_container' data-page=31>

ngập nước (60%) và bùn đáy ao (50%). Trong phần tế bào có bắt cặp với các đầu dò, nhóm a -

Proteobacteria chiếm 20% và 30% (trên tổng số tế bào nhuộm DAPI) tương ứng trong các mẫu 
ruộng ngập nước và ao. Theo kết quả nghiên cứu bằng PCR-DGGE gen I6S rDNA (phần 3.2), vi
khuẩn thuộc phân lớp a -Proteobacteria với đại diện là chi Paracoccus đâ được tìm thấy chiếm 
đa số trong môi trường ruộng ngập nuớc, nhưng lại khơng được tìm thấy ờ môi trường bùn đáy
ao. Tiểp theo, đầu dị BET42a (p-Proteobacteria) cho kết quả dương tính với 20% tổng số tế bào 
nhuộm DAPI trong mẫu bùn đáy ao nhưng khơng có tín hiệu với mẫu ruộng ngập nước. Điều này
cũng phù hợp với kết quả phân tích PCR-DGGE (phần 3.2), vi khuẩn thuộc phân lớp y-
Proteobacíeria với đại diện là chi Pseudomonas được tìm thấy chiếm ưu thế trong môi trường 
ruộng ngập nước, nhưng khơng tìm thấy trong mẫu bùn đáy ao. Cuối cùng, đầu đò GAM42a (y-
Proteobacterià) cho kết quả duơng tính với 20% tổng sổ tế bào nhuộm DAPI trong mẫu ruộng 
ngập nước nhưng lại không cỏ tín hiệu đối với mẫu bùn đáy ao, tuy nhiên đại diện cùa phân lớp
p-Proteobacteria lại không được xác định trong phân tích PCR-DGGE ở trên. Như vậy việc bổ 
sung thơng tin từ thí nghiệm phân tích FISH đã góp phần làm rõ nét hơn bức tranh đa dạng của vi
khuẩn oxy hóa Fe(II)/khù nitrate ở các mơi trường nghiên cứu.

Đối với mẫu trầm tích nước ]ợ ven biển, cả hai phương pháp phân tích đa đạng khơng phụ
thuộc bước phân lập là PRC-DGGE và FISH đều khơng đem lại thơng tin về tính đa dạng của vi
sinh vật oxy hóa Fe(II)/khử nitrate tại đây. Tuy các đại diện thuộc chi Paracoccus (a- 
Proteobacteria) và Pseudomonas (y-Proteobacteria) đều đã được tìm thấy trong mơi trường này 
(phân tích ARDRA, phần 3.4), nhưng vai trị ưu thế cùa chúng trong mơi trường khơng được xác
định. Sự có mặt của các chủng Paracoccus và Pseudomonas trong mơi trường trầm tích ven biển 
nhiều khả năng do ảnh hường của nguồn nước ngọt từ đất liền. Nhóm vi sinh vật thực sự chiếm
ưu thế trong mơi trường này có thể vẫn nằm ngoài giới hạn đặc hiệu của các đầu dò đã sử dụng
trong nghiên cứu F1SH cũng như cặp mồi sử dụng trong PCR-DGGE.

3.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân hoại và hoạt tính sinh bọc của các chủng vỉ khuẩn 
đại diện

Hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các
môi trường nghiên cứu là Anaeromyxobacter và Paracoccus (phần 3.4). Hơn thế, trong q trình

thí nghiệm có thể nhận thấy rầng đây là hai chùng thể hiện khả năng sinh trường cao nhất trong
số các chủng đã phân lập được. Để tìm hiểu khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hoá
Fe(II) khử nitrate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý cùa hai chủng này.

</div>
(32)<div class='page_container' data-page=32>

của hàm lượng protein tổng số theo thời gian ưong dịch nuôi vi khuẩn với Fe(III) làm chất nhận
điện tò cuối cùng (hỉnh 3.9). Cả hai chủng đều không sinh trường bằng khử SO42".

Thời gian (ngày)

Hình 3.9. Khả năng sinh trưởng bằng khử Fe(III) cùa hai chủng IN2 (■) và IN 12 ( • ) thơng
qua xác đinh hàm lượng protein tổng số trong dịch tế bào biến đổi theo thời gian.
Băng 3.3. Đặc điểm sinh lý của hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12

Đặc điểm sinh lý IN2 IN12

Hơ hấp bằng oxygen (sinh trưởng hiếu khí) - + +

0% - + + +

1% + + + + + +

Sinh trưởng phụ thuộc độ mặn cùa 2% + + + + + +

môi trường (% NaCl) 3% + + + + + +

4% + + + + +

5% + 4- + +

Lactate + + + + + +

Chất cho điên tử (để khử nitrate) Acetate + + + ■+ H—b

Ethanol + + + + + +

Benzoate + + + +

Chất nhận điện tử (để oxy hoá Na-
lactate)

n o3~

Fe(III)
SO42"

+ + +
+ + +

+ + +

Chú thích: + + +: sinh trưởng mạnh; + +: sinh trưởng trung bình; +: sinh trường yếu; không
sinh trưởng.

Đối với các nguồn điện từ khác nhau phục vụ cho quá trình khử nitrate, ngoài Fe(II) đã
được sử đụng để phân lập và nuôi cấy từ ban đầu, lactate, acetate, benzoate và ethanol đều được

</div>
(33)<div class='page_container' data-page=33>

oxy hoá bởi hai chủng IN2 và IN12. Trong trường hợp benzoate, một acid hữu cơ chứa vịng
thơm và thường khó bị oxy hố hơn các hợp chất cịn lại, chủng INI 2 thể hiện khả năng oxy hoá
kém hơn hẳn so với chủng IN2.

Độ mận lả một Ưong các yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh lý cùa vi sinh
vật trong tự nhiên, do vậy ở đây chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hường của nồng độ muối
trong môi trường đối với khả năng sinh trưởng của hai chủng vi khuẩn quan tâm. Kết quả nghiên
cứu cho thấy chủng IN2 có nhu cầu về muối để sinh trưởng, chủng INI2 thi không. Trong khi
chủng IN I2 có thể sinh trưởng trong mơi trường khơng cần bổ sung NaCl thì chủng IN2 chi phát
triển khi NaCl có mặt ở nồng độ 1% trở lên. Tuy nhiên, chủng IN2 lại có khả năng chịu muối cao
hơn IN12, chủng này vẫn phát triển tốt ở nồng độ muối 5% trong khi đó tốc độ sinh trường của
IN 12 bị ảnh hưởng đáng kể ở các nồng độ muối cao hom 3%. Điều này cũng phù hợp với đặc
điểm phân bố của hai chùng vi khuẩn trong tự nhiên, cụ thể là chủng IN2 đại diện cho nhóm vi
khuẩn được tìm thấy ở nhiều dạng môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt và nước lợ,
trong khi đó chùng IN 12 đại diện cho nhóm chi tim thấy ở bùn đáy thuỷ vực nước ngọt.

M
4 &

9 •

r €•

0.02

Hỉnh 3.10.

930

1000
1000

SaciiầíS subttito (FJ544 386)

AnMTomyivbacter clone (AB2933Ổ7) 
Anotromyxìbacter dehabgtnans (EP067314)

KMr

UArumromyìobactor sp. FAcl2 (AJ504438) 
La dehabgenans 2CP1 (NR027547) 
^Anaervmymbacter clone (DQ39499Ố)

Bacúkiĩ subttỈB (FJ544386) 
-Paracoccus arninopMus (D32239)

■Paracoccus aminovorans (D3224Q) 
'aracoccus sp (AM989037)

■Paracoccus marịms (AB185959)
_'Pơracoocus denUrựkans (AI288159)
iĨÕÕÍParacoccus jimoxydant (AY954687)

Hình thái tể bào và vị trí phân loại của hai chủng IN2 và ĨN12. Hình thái tế

bào được quan sát trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 1 0 0 0 lần (đơn vị = 5
Jim). Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đom vị = 0 02
Knuc trong trình tự nucleotide. Các số hiển thị ở các vị tri phân nhánh là kết quả
phân tích bootstrap đối với 1 0 0 0 phép so sánh (chi có các giá trị trên 500 được
trình bày trên hình). B. subtilis là lồi vi khuẩn được chọn làm outgroup.

</div>
(34)<div class='page_container' data-page=34>

GenBank cho phép xếp chùng IN2 vào chi Anaeromyxobacter (!oài gần gũi nhất là A.

dehaỉogenans, 99% tương đồng). Như vậy chùng IN2 được bổ sung vào danh sách chi 
Anaeromyxobacter với tên khoa học là Anaeromyxobacter sp. IN2 và mã trình tự gen 16S rDNA 
trong GenBank là FJ939131 (hình 3.10). Anaeromyxobacter là một chi được biết đến với các đại 
diện sinh trưởng kỵ khí bắt buộc bàng oxy hoá các hợp chất hữu cơ để khử Fe(III) (Treude et aỉ., 
2003). Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên vi khuẩn Anaeromyxobacter mà đại diện là chùng ĨN2 
thể hiện khả năng sinh trưcmg bằng oxy hoá Fe(II)/khử nitrate, tuy nhiên hình thức sinh trưởng
này không vượt trội so với sinh trường kỵ khí khử Fe(III),

Chủng IN12 gồm những tế bào hình oval có kích thước 1,5x1.5-2 um, chuyển động
chậm. So sánh trình tự gần đủ của gen 16S rDNA với ngân hàng dữ liệu GenBank cho phép xếp
chúng IN 12 vào chi Paracoccus (loài gần gũi nhất là p. aminovorans, 98% tương đồng). 
Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp a -Proteobacíeria, gồm nhiều lồi có khả năng hơ 
hấp bằng oxygen (sinh trưởng hiếu khí), đồng thời hô hấp bằng khử nitrate (Shapleigh, 2000).
Nhiều đại diện của chi Paracccus được tìm thấy trong các điều kiện tối ưu cho khử nitrate, như 
đáy các thuỷ vực (Shapleigh, 2000) hay trong các hệ thống xử lý nước thải loại bỏ nitrogen, ví dụ
như P. denitrificans, p. ferooxygendans (Bitton, 1999). Chùng IN 12 được định danh khoa học là 
Paracoccus sp. IN 12 và có mã trinh tự gen 16S rDNA trong GenBank là GU084390 (hình 3.10).

Mặc đù cùng được phân lập thông qua bước làm giàu bàng dãy MPN với chất cho và
nhận điện tử tương ứng là Fe(II) và nitrate, hai chủng IN2 và IN 12 lại đại diện cho hai nhóm vi
khuẩn khác nhau tham gia chu trình sắt ở mơi trường trung tính, cụ thể là oxy hoá Fe(II) thành
Fe(IlI) bằng nitrate và khử Fe(III) thành Fe(II) bàng các hợp chất hữu cơ. Tuy cũng có khả năng
sinh trường cao trong mơi trường có Fe(II) và nitrate nhung chủng IN2 sẽ khỏ có khả năng úng
dụng vào mục đích loại bỏ Fe(II) và nitrate trong các nguồn nước ô nhiễm vì bị ảnh hưởng bởi
khả năng sừ dụng Fe(III) làm chất nhận điện từ cuối cùng để tạo năng lượng. Khác với IN2,
chủng IN12 là một vi khuẩn chi sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(ll) bằng nitrate, khơng có khả năng
khử Fe(III). Hơn thế nữa, chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trường trong nhiều đều kiện mơi
trường khác nhau như có mặt hay khơng có mặt oxygen, thích nghi với nhiều loại nguồn điện tử
khác nhau (như Fe(II), các acid hữu cơ, rượu) và sinh trường tốt trong mơi trường có độ mặn dao
động trong dải 0-3% (đặc trưng cho cả môi trường nước ngọt và nước lợ). Với những ưu điểm kể

trên, chùng IN 12 hứa hẹn có tiềm năng ứng dụng vào việc loại bò nitrogen và Fe(II) trong các
nguồn nước ô nhiễm.

</div>
(35)<div class='page_container' data-page=35>

3.5 3.5

- 3

_

■ 2.5 a

-QJ
Uh

- 2

- 1.5

0 1 2 3 4 5

Thời gian (ngày)

Hình 3.11. Loại bị Fe(II) (•) và N 0 3- (■) trong môi truờng do chủng vi khuẩn IN 12.

Hoạt tính oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của chủng IN 12 được xác định ờ điều kiện kỵ khí
với Fe(II) là chất cho điện từ và nitrate làm chất nhận điện tử cuối cùng. Kết quả xác định nồng
độ các chất cho và nhận điện từ trong môi trường biến đổi theo thời gian cho thấy sự giảm nồng
độ Fe(II) và nitrate diễn ra song song với tốc độ đáng kể (hình 3.11).

</div>
(36)<div class='page_container' data-page=36>

KẾT LUẬN

- Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NOị” trong các mẫu bùn thu thập ở thủy vực nước
ngọt, chân ruộng ngập nước và vùng nước lợ ven biển được xác định nằm trong khoảng
103 - 104 TB/g, trong đó mẫu bùn ờ chân ruộng ngập nước có số lượng tế bào vi khuẩn
này cao hơn cả (9,3 X 103 TB/g).

- Phân tích thành phân lồi bằng phương pháp PCR-DGGE đối với gen 16S rDNA cho thấy 
Anaeromyxobacter là một trong những nhóm chiếm ưu thế có mặt cả ở ba dạng môi 
trường sinh thái trên, đóng vai trị khép kín chu trình chuyển hố sẩt trong các mơi trường
nghiên cứu thơng qua khả năng sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III). Hai nhóm Paracoccus và 
Pseudomonas được tìm thấy tương ứng ở mẫu bùn ao và ruộng, là hai nhóm vi khuẩn 
chính thực hiện quả trình oxy hố Fe(II) khử NƠ3- trong hai dạng môi trường sinh thái kể
trên. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn thuộc chi Paracoccus (ÍN6) và Pseudomonas (IN7) 
cịn được tìm thấy ở môi trường nước lợ ven biển, chứng tỏ các nhóm vi khuẩn này cũng
đóng vai trị nhất định trong mơi trường nước lợ.

- Vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV tại các mơi trường nghiên cứu có tính đa dạng khá cao.
Mười hai chủng đom phân lập từ các mẫu MPN được xếp vào 5 nhóm ARDRA khác nhau
trong phân tích sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII và Mspỉ. Ba chủng đại diện là IN2, 
ĨN7 và IN 12 có ưình tự gen 16S rDNA có độ tương đồng cao với các loài vi khuẩn
Anaeromyxobacíer dehaỉogenans (99%), Pseudomonas stutzeri (97%) và Paracoccus 
ferrooxydant (98%).

- Hai chùng vi khuẩn IN2 và IN 12 đại điện cho hai nhóm tham gia chu trình chuyển hố sắt
tại một số môi trường sinh thái khác nhau ờ Việt nam, trong đó chủng IN2 tham gia khừ
Fe(III) thành Fe(II) bằng các hợp chất hữu cơ và chùng IN 12 tham gia oxy hoá Fe(IÍ)
thành Fe(III) bằng nitrate. Vai ưị sinh thái của hai chủng này được khẳng định thông qua
các đặc điểm sinh lý của chúng, cụ thể là khả năng sinh trưởng với các chất cho và nhận
điện tử khác nhau và mức độ sinh trưởng tại các nồng độ muối khác nhau trong môi

trường.

- So sánh trinh tự gần đủ cùa gen 16S rDNA với các lồi đã cơng bố trên GenBank cho
phép định danh hai chủng vi khuẩn này là Anaeromyxobacter sp. IN2 (mã trình tự đăng
ký trên GenBank là FJ939131) và Paracoccus sp. IN 12 (mã trinh tự đăng ký trên 
GenBank là GU084390).

- Với hoạt tính cao trong việc oxy hố Fe(II) và khử nitrate, chủng IN 12 có tiềm năng úng
đụng thực tế trong việc xử ]ý các nguồn nước nhiễm nitrogen và ion kim loại Fe(II).

</div>
(37)<div class='page_container' data-page=37>

KIẾN NGHỊ

- Nghiên cứu tìm giá thể phù hợp để tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate.
- Nghiên cứu thử nghiệm áp dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate để xử lý nước ngầm

nhiễm sắt và nitơ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Lê Đửc (2004) Một sổ phương pháp phân tích môi trường. NXB ĐHQGHN.

2. Trần Thị Kiều My, Nguyễn Hà Thanh (2006) Chuyền hóa sắt trong cơ thể và quá tải sắt ở
một số bệnh máu. Hội nghị Khoa học ngành Huyết học - Truyền máu Quốc gia

Tiếng Anh

3. Amann RI, Stromley J, Devereux R. Key R, Stahl DA (1992). Molecular and microscopic
identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms. Appl. Environ.

Microbiol. 58: 614-623.

4. American public health association (1996) Standard methods for the examination of water
and waste water including bottom sediments and sludge. 604-609.

5. Benz M, Brune A, Schink B (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at
neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria. Arch Microbiol 169: 159-165.
6. Bitton G. Wastewater Microbiology. Willey-Liss, Inc. Toronto, Canada, 1999.

7. Brewer PG, Spencer DW (1971) Colorimetric determination of manganese in anoxic waters.
Limnology and Oceanography. 16: 107-110

8. Ciani A, Goss KU, Schwarzenbach RP (2005) Light penetration in soil and particulate
minerals. Europ. J. Soil Sci. 56: 561-574.

9. Dhillon A, Edwards K, Webb E, Roger D, Sogin M (2005) Marinobacter aquaeolei gene 
expression studies for clues to neutrophilic iron oxydation. NAỈ 2005 biannual meeting o f 
the NASA Astrology Institute.

10. DIN 38406-EỈ-1 (1983) German standard methods for the examination of water, waste
water and sludge; cation (group E); determination of ừon (El).

11. Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003) Isolation and characterization
of novel psychrophilic, neutrophilic, Fe-oxidizing, chemolithoautotrophic a - and p-
Proteobacteria from the deep sea. Appl. Environ. Microbiol. 69: 2906-2913.

</div>
(38)<div class='page_container' data-page=38>

13. Ehrenberg (1919) Microbiology o f the iron - depositing bacteria, “Gallionella ferruginea".

Ellis D, Methuen & Co. Ltd.

14. Ehrenreich A, Widdel F (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron purple bacteria, a new
type o f phototrophic metabolism. Appl Environ. Microbiol. 60 (12) 4517-4526.

15. Ehrlich HL, Newman DK (2008) Geomicrobiology, 5th Edition, CRC Press.

16. Emerson D, Weiss JV (2004) Bacterial iron oxidation in circumneutral freshwater habitats:
findings from the field and the laboratory. Geomicrobiol. J. 21:405 - 414.

17. Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.
Evolution 39: 783-791.

18. Gounot AM (1994) Microbial oxidation and reduction of manganese: consequences in
groundwater and applications. FEMS Microbiol. Rev. 14: 339.

19. Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossagel p, Burggraf s, Huber H, Stetter
KO (1996) Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., a novel hyperthermophilic archaeum 
that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions. Arch. Microbiol. 166: 308-314.
20. Hauck s, Benz M, Brune A, Schink B (2001) Ferrous iron oxidation by denitrifying

bacteria in profiindal sediments of a deep lake (Lake Constance). FEMS Microbiol Ecol 37: 
127-134.

21. Heising s, Schink B (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium 
vannielii strain. Microbiol. 144: 2263-2269.

22. Heising s, Richter L, Ludwig w , Schink B (1999) Chlorobium ferrooxidans sp. nov., a 
phototrophic green sulfur bacterium that oxidizes ferrous iron in coculture with a
“Geospirillum" sp. strain. Arch. Microbiol. 172:116-124.

23. Hohmann c , Winkler E, Morin G, Kappler A (2009) Anaerobic Fe(II)-oxygendizing

bacteria showAs resistance and immobilize As during Fe(III) mineral precipitation. Environ. 
Sci. Technol.

24. Kappler A, Newman DK (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing
photoautotrophic bacteria. Geochim Cosmochim Acta. 68:1217-1226.

25. Konhauser KO (Ỉ997) Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol. Rev. 20' 
315.

26. Kuetzing (1919) Microbiology o f the iron - depositing bacteria, “Leptothrix ochracea 
Ellis D, Methuen & Co. Ltd.

27. Lack JG, Chaudhuri SK, Kelly SD, Kemner KM, O'Connor SM, Coates JD (2002)
Immobilization of radionuclides and heavy metals through anaerobic bio-oxidation of Fe(II)
Appl. Environ. Microbiol. 6 8: 2704-2710.

</div>
(39)<div class='page_container' data-page=39>

28. Lundberg JO, Weitzberg E, Cole JA, Benjamin N (2004) Nitrate, bacteria and human health.
Nature'. 593-602

29. Lovley D.R. (1991) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Microbiol. Rev. 55: 259.
30. Lovley D.R. (1997) Microbial Fe(III) reduction in subsurface environments. FEMS

Microbiol. Rev. 20: 305.

31. Marmur Ỉ (1961) A procedure for the isolation of deoxygenribonucleic acid from 
microorganisms. JM o l Biol 3: 208-218.

32. Muyzer G, De Waal EC, Utterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial population
by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified
genes coding for 16S rARN. Appl Environ Microbiol 59: 695-700.

33. Nealson K.H, Saffarini D. (1994) Iron and manganese in anaerobic respiration:
environmental significance, physiology and regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48: 311.
34. Ratering s (1999) Iron cycle in Italian rice field soil: localization of the redox processes and

charactarization of the involved microorganisms. PhD Dissertation. Department of 
Microbiology, University of Marburg (Germany).

35. Ratering s, Schnell s (2000) Nitrate-dependent iron(II) oxidation in paddy soil. Environ 
Microbiol 3: 100-109.

36. Ravenschlag K, Sahm K, Pemthaler J, Amann R (1999) High bacterial diversity in
permanently cold marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3982.

37. Renz JA, Kraiya c , Luther GW, Emerson D (2007) Control of ferrous iron oxydation
within circumneutral microbial marts by cellular activity and autocatalysis. Environ. Sci.
Technol. 41: 6084-6089.

38. Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: 406-425.

39. Shapleigh JP (2000) The Denitrifying Prokaryotes. In Dworkin M, Falkow s, Rosenberg E 
Schleifer KH, Stackerbrandt E, eds. The prokaryotes: an evolving electronic resource fo r 
the microbiological community. Springer-Verlag, New York.

40. Senko JM, Dewers TA, Krumholz LR (2005) Effect o f oxidation rate and Fe(II) state on
microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation. ,4/?/?/. Environ. Microbiol 71: 7172- 
7177.

41. Senn DB, Hemond HF (2002) Nitrate controls on iron and arsenic in an urban lake. Science

296: 2373-2376.

</div>
(40)<div class='page_container' data-page=40>

43. Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Enumeration and detection o f anaerobic ferrous
ừon-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments. Appl Environ 
Microbiol 64:4846-4856.

44. Straub KL, Rainey FA, Widdel F (1999) Rhodovulum iodosum sp. nov. and Rhodovulum

robiginosum sp. nov., two new marine phototrophic ferrous-iron-oxidizing purple bacteria. Ị

Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 729-735. 1

45. Straub KL, Benz M, Schink B (2001) Iron metabolism in anoxic environments at near '
neutral pH. FEMS Microbiol Ecol. 34: 181-186.

46. Temple KL, Colmer AR (1951) The autotrophic oxidation of iron by a new bacterium:
Thiobacilỉus ferrooxidans. J. Bacteriol. 62: 605-611.

47. Treude N, Rosencrantz D, Liesack w , Schnell s (2003) Strain FAcl2, a dissimilatory iron-
reducing member of the Anaeromyxobacter subgroup of Myxococcales. FEMS Microbiol

E co l44:261-269.

48. Tricker AR, Preussmann R (1991) Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence,
formation, mechanisms and carcinogenic potential. Mut. Res. 259: 277-289.

49. Vandenebeele J, De Beer D, Germonpre R, Van De Sande R, Verstraete w (1995)
Influence of nitrate on manganese removing microbial consortia from sand filters. Wat. Res.
29: 579.

50. Weber KA, Picardal FW, Roden EE (2001) Microbially catalyzed nitrate-dependent ■
oxidation of biogenic solid-phase Fe(II) compounds. Environ. Sci. Technol. 35: 1644-1650.

51. Weber KA, Achenbach LA, Coates JD (2006a) Microorganisms pumping iron: anaerobic
microbial iron oxidation and reduction. Nature 4: 752-764.

52. Weber KA, Pollock J, Cole KA, O’Connor SM, Achenbach LA, Coates JD (2006b)
Anaerobic nitrate-dependent iron(II) bio-oxidation by a novel Lithoautotrophic
Betaproteobacterium, strain 2002. Appl Environ Microbiol. 72: 686-694.

53. Weber KA, Urrutia MM, Churchill PF, Kukkadapu RK, Roden EE (2006c) Anaerobic
redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms. Environ Microbiol 8: 100-

113.

54. Widdel F, Schneil s, Heising s, Ehrenreich A, Assmus A, Schink B (1993) Ferrous iron
oxygendation by anoxygengenic phototrophic bacteria. Nature 362: 834.

55. Widdel F, Bak F (1992) Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria. In Balows A 
Trilper HG, Dworkin M, Harder w, Schleifer KH eds. The Prokaryotes, 2nd ed. Springer 
Berlin Heidelberg New York: 3352-3378.

56. Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse composition
Appl Environ Microbiol, 62: 316-322.

</div>
(41)<div class='page_container' data-page=41>

PHỤ LỤC

IN2 16S rDNA 1429 bp, Ánaeromyxobacíer sp.

t a c a c a t g c a g tc g a g c g a g a a a g c c c g c a a g g g tg a g t a a a g c g g c g c a c g g g t g c g t a a c a c g tg g g t a a tc t g c c

c t a g a g t c c g g a a t a a c t c g c c g a a a g g c g t g c t a a t g c c g g a t g a g a c c a c g g g a g c c t c g g c t c c t g c g g g a a a a g
g t g g c c t c t g t a c a c a a g c t a t c g c t c t a g g a t g a g c c c g c g g c c c a t c a g c t c g t t g g c g g g g t a a t g g c c c a c c a a
g g c a a c g a c g g g ta g c tg g tc tg a g a g g a c g a t c a g c c a c a c t g g a a c tg a g a c a c g g t c c a g a c tc c t a c g g g a g g c
a g c a g t g g g g a a t c t t g c g c a a t g g g c g a a a g c c t g a c g c a g c a a c g c c g c g t g t g t g a t g a a g g t c t t c g g a t c g t a
a a g c a c t g t c g c g a g g g a c g a a t a a g g g a c g g g c g a a c a g t c c g t tt c g a tg a c g g t a c c t c g a g a g g a a g c a c c g g c
t a a c t c t g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c a g a g g g t g c a a g c g t t g t t c g g a a t t a t t g g g c g t a a a g c g c g t g t a g g
c g g c c t a g c a a g t c g g a t g t g a a a g c c c t c g g c t t a a c c g a g g a a g t g c g t t c g a a a c t a c t g g g c t t g a g t a c c g g a
g a g g g t g g c g g a a t t c c c g g t g t a g a g g t g a a a t t c g t a g a t a t c g g g a g g a a c a c c a g t g g c g a a g g c g g c c a c c t g
g a c g g a t a c t g a c g c t g a g a c g c g a a a g c g t g g g t a g c a a a c a g g a t t a g a t a c c c t g g t a g t c c a c g c t g t a a a c g a
t g a g c g c t a g g t g t t g c g g g t g t t g a c c c c t g c a g t g c c g c a g c t a a c g c a t t a a g c g c t c c g c c t g g g a a g t a c g g c
c g c a a g g c t a a a a c t c a a a g g a a t t g a c g g g g g c c c g c a c a a g c g g t g g a g c a t g t g g t t t a a t t c g a c g c a a c g c g c
a g a a c c t t a c c t g g t c t t g a c a t c c t c g g a a t c c c t c a g a g a t g a g g g g g t g c c c g c a a g g g a a c c g a g a g a c a g g t g
c t g c a t g g c t g t c g t c a g c t c g t g t c g t g a g a t g t t g g g t t a a g t c c c g c a a c g a g c g c a a c c c c t g c c g t t a g t t g c
c a t c a t t c a g t t g g g c a c t c t a a c g g g a c t g c c g g c g t c a a g c c g g a g g a a g g t g g g g a t g a c g t c a a g t c c t c a t g g
c c t t t a t g a c c a g g g c t a c a c a c g t g c t a c a a t g g c c g g t a c a g a g g g t c g c c a a g t c g c g a g a c g g a g c t a a t c c c a
g a a a a c c g g t c t c a g t t c g g a t t g g a g t c t g c a a c t c g a c t c c a t g a a g t c g g a a t c g c t a g t a a t c g c g g a t c a g c a
c g c c g c g g t g a a t a c g t t c c c g g g c c t t g t a c a c a c c g c c c g t c a c a c c a t g g g a g t c a g t t g c t c c a g a a g t g g c c g
c g c c a a c c c g c a a g g g a g g c a g g tc

IN12 16S rDNA 1319 bp, Paracoccus sp.

TAACGCGTGGGAATGTGCCCTTCTCTACGGAATAGCCCTGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATACGCC
CTATTGGGGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGC
CTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACNATGNGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGC
GTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAA
GAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTAC
TGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAAC
TGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTC
GTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAA

AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCG
GGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAT
TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC
GCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGCAGGACAGCCCGAGAGATCGGGTCTTCTCGTAAGAGACCTG
TGGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCG
CAACCCACGTCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAAGAAACTGCCGATGATAAGTCGGAG
GAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGG
TGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTT
GGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC
GTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCCAACCTCGCAAGAGGAGGCAGCGGACCA
CGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGT

IN7 I6S rDNA 576 bp, Pseudomonas sp.

TGCAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATAAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAT
CTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGT

</div>
(42)<div class='page_container' data-page=42></div>
(43)<div class='page_container' data-page=43>

Phụ lục 2. Tham gia đào tạo sau đại học

Học viên cao học:

Nguyễn Thị Tuyền

Khoá cao học 2007 — 2009, Bộ môn Vi sinh, ĐHKHTN, ĐHQGHN

Tên đề tài: Vi khuẩn sinh tnrởng nhờ ôxy hoá Fe(II), khử nitrat ở Việt nam: tỉnh đa
dạng và khả năng ứng dụng.

</div>
(44)<div class='page_container' data-page=44>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

Nguyễn Thị Tuyền

VI KHUẨN OXY HÓA Fe(H) VÀ KHỬ NITRATE Ở VIỆT NAM:

TÍNH ĐA DẠNG VÀ T lỂM NĂNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC s ĩ KHOA HỌC

</div>
(45)<div class='page_container' data-page=45>

Phụ lục 3. Các cơng trình khoa học đã cơng bố

STT Tên cơng trình cơng bố Tác giả Noi đăng

1 Đa dạng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử
NO3 tại một số môi trường sinh thái ở
Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyển,
Đinh Th Hằng

Tạp chí Cơng nghệ
Sinh học, VAST

2 Nghiên cứu vi khuẩn ưu thế tham gia
chu trinh Fe trong các điều kiện môi
trưởng khác nhau tại Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyển,
Nguyễn Minh Giảng,
Đinh Th Hằng

Tạp chí Khoa học

Cơng nghệ,

ĐHQGHN
3 Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn oxy hoá

Fe(II), khử N 0 3' tại một số môi trường
sinh thái ở Việt Nam và khả năng ứng
dụng.

Nguyền Thị Tuyền,
Đinh Thuý Hẳng

Poster tham gia Hội
nghị toàn quốc về đa
dạng và sinh thái sinh
vật, Hà Nội 10/2009
4 Trình tự gen 16S rDNA cùa chùng vi

khuẩn Anaeromyxobacter sp. IN2

Nguyên Thị Tuyên,
Đinh Thuý Hằng

FJ939131, GenBank

5 Trinh tự gen 16S rDNA của chủng vi
khuẩn Paracoccus sp. ĨN1 2

Nguyễn Thị Tuyền,
Đinh Thuý Hằng

</div>
(46)<div class='page_container' data-page=46>

Luân vãn t h ạ c * 9 e ĩk h o â học

L Ờ I C Ả M Ơ N

v ề tà i luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đ ể t à i P ặ c biệt cấp

Đại học Quốc gia Hà Nội, mã s ố (3(3.07.23.

Để có th ể hồn thành luận văn này, trước tiên, tôi muốn bày tổ lỏng biết ơn

õâu ôắc tới Tiến õTĐinh Thúy Hằng, Trưởng phòng 5inh thái */i 5inh vật, Viện Vi ỗítih

v ậ t và Công nghệ 5inh học, Đạ\ học Quốc gia Hà Nội dã định hướng nghiên cứu, trực

tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tậ n tình cho tơi trong su ố t thời gian nghiến cứu.

Tôi cũng mong muốn dược 0Ởi lời cảm ơn chân thành n h ât tới Ban lãnh ảạo vằ 
các cán bộ Viện v\ sinh vậ t và Công nghệ Sinh học, Đại học Quôc gia Hà Nội ăẵ tạo

diểu kiện thuận lợi vẩ trang thiất bị và cơ sở v | t c h ấ t cho tôi Hoàn thành nghiên cứu 
này.

Qua đây, 'Dổi cũng muốn được bày tỏ ỉòng biết ơn chân thành tới cấc thầy cô

giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Trường Pại Học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà 
Nội dã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hừu ích cho tơi trong su ố t thời gian học

tậ p tại trường.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn õâu sắ c tới ỳ a đmh, bạn bè thân thiết,

nhữn^ người đã ỉuỗn cổ vũ, độnq viên tôi vượt CỊU

3

mọi khố khăn trong quá trình học 
tập và nghiên cứu.

//à /Vọ/, ngày # tháng ÀA năm S009

Học viên

Nguyễn Thị Tuyển

</div>
(47)<div class='page_container' data-page=47>

Phụ lục 3. Các cơng trình khoa bọc đã cơng bố

STT Tên cơng trìn h cơng bổ Tác giả Nơi đăng

1 Đa dạng vi khuẩn oxy hoá Fe(ỈI), khử
NC>3~ tại một số môi trường sinh thái ở
Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyển,
Đinh Th Hằng

Tạp chí Cơng nghệ
Sinh học, VAST

Nghiên cứu vi khuẩn ưu thể tham gia

chu trình Fe trong các điều kiện môi

trường khác nhau tại Việt Nam

Nguyễn Thị Tuyền,
Nguyễn Minh Giảng,
Đinh Th Hằng

Tạp chí Khoa học

Cơng nghệ,

ĐHQGHN
3 Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn oxy hoá

Fe(II), khử NO3" tại một sổ môi trường
sinh thái ở Việt Nam và khả năng ứng
dụng.

Nguyền Thị Tuyền,
Đinh Thuý Hằng

Poster tham gia Hội
nghị toàn quốc về đa
dạng và sinh thái sinh
vật, Hà Nội 10/2009
4 Trình tự gen I6S rDNA của chùng vi

khuẩn Anaeromyxobacter sp. IN2

Nguyễn Thị Tuyền,

Đinh Thuý Hằng

FJ93913I, GenBank

5 Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi
khuẩn Paracoccus sp. ĨN12

Nguyên Thị Tuyên,
Đinh Thuý Hằng

</div>
(48)<div class='page_container' data-page=48>

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIT NAM

ã ã ằ ô

VIETNAM ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

ISSN 1811-4989

TẠP CHÍ

CƠNG NGHỆ S

inh

h ọ c

</div>
(49)<div class='page_container' data-page=49>

Tọp chí Cõng nghệ Sinh học 7(3): 371-379,2009

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI KHUẨN OXY HÓA Fe(n), KHỬ N 0 3" TẠI MỘT SĨ MƠI

TRƯỜNG SINH THÁI Ở VIỆT NAM

N g n y ễ n T h ị T u y ề n 1, Đ ỉn h T h ú y H ă n g 1

1 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội

2 Viện Vi sừth vật vị cơng nghệ sinh học, Đợi học Qc gừi Hà Nội

TĨMTẲT

V i khuẩn oxy hỏa-Fe(II), khủ NOj_ trong các mẫu bùn thu thập ở thủy vực nước Qgọt, chân ruộng ngập 
nước và vủng nước lọ ven biển được nghiên cứu về số lượng và tính đa đạng về thành phần loài. Kết quả thí 
nghiệm MPN (M ost Probable Number) cho thẩy trong ba dạng môi trưởng Qghiên cứu, mẫu bùn ờ chân ruộng 
ngập nước có sá lượng tể bào vi khuán này cao hơn cả (9,3 ■ 1Ọ3 TB/g), gấp 5 Ịần mẫu bùn thủy vực nước ngọt 
vả 2 Lần so với mẫu bùn ven biển. Dựa trên những khác biệt về hình thái khuẩn lạc, 12 chủng đơn được phân 
Lập từ các mẫu MPN khác nhau. Theo kết quả phân tích ARDRA sử đụng hai enzyme hạn chế H a éĩĩỊ và M spl, 
các chủng náy được xếp vào 5 nhóm di truyền khác nhau, chúng tỏ tỉnh đa dạng khá cao của vi khuân ox y hóa 
Fe(n), khử NO}~ tại các m ôi trường nghiên cửu. Phân tích thành phẩn loài trong quần thể ờ độ pha loãng tới 
hạn cùa dãy MPN bằng phương pháp PCR-DGGE đối với 16S iĐ N A cho thây A naerom yxobacter sp. có mặt ị 
cả ba dạng mơi trường sinh thái trên. Kết hợp với nghiên cửu các chùng đơn phân lập được từ các dạng môi 
trưởng nghiên cứu trên cho thấy, nhóm Paracoccus và Pseudom onas là hai nhỏm vi khuẩn chinh thực hiện quá 
trinh oxy hóa Fe(U), khử NO}’, lương úng đóng vai trị quan trọng bung môi trườnẹ 30 nước Dgọt và chân 
ruộng ngập nước. Giải trình tự 16S rDNA và 50 sánh kêt quả với Qgân hàng dử liệu đôi với ba chủng đại diện 
là IN2, IN7 và IN 12 cho phép xếp các chùng này tương ứng vào các chi vi khuân Anaerom yxobacter,

Pseudomonas và Paracoccus. Ba chi vi khuẩn kể trên là các nhóm chính chiếm ưu thế trong chu trinh chuyển

hỏa sắt tại ba dạng môi tniờng sinh thái được nghiên cửu ờ đây.

T ừ kk ổ a : Anaeromyxobacter, ARDRA, DGGE, khứ NOị~, Paracoccus, Pseudomonas, vi khuẩn o xy hóa Fe(Il), 
ỉ ó S r D N A

MỞĐẰU

sát lả một ừong nhũng kim loại phổ biến nhất
trên trái đất. Thông thường sắt tồn tại ở dạng oxide

Fe(UI) ỉt tan trong oước và có màu vàng nâu. Trong
môi trường pH bung tính, dạng hịa tan trong nước
(Fe(n)) chi tồn tại ở điêu kiện khơng có oxy, ví dụ
như ở đáy các thủy vực, nơi oxy hòa tan trong nước
đã bị cảc vị sinh vật hiếu kỉú sủ dụng để phân hủy
các hợp chât hữu cơ. Với hiệu điện the oxy hóa khừ
Feỉ+/Feĩ+ tại pH 7 vào khoảng +200 mV, ion Fe(n)
có thể trở thảnh nguồn điện từ cho các quá trinh hỏ
hấp kỵ khí, điển hình là khử N03“ thành N2 do một
số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Benz et ai, 1998). 
Q trình oxy hóa Fe(n) bằng NOr diễn ra như sau:

10 Fe2+ + 2 N O f + 24 H20 — 10 Fe(OH) 3 ị +N2 T
+ 9H2 T

Trong tự nhiên, quá trinh oxy hóa Fe(II) với chất
nhận điện tử là NƠ3~ chủ yếu diễn ra ở ranh giới hiếu
khí (có oxy) và kỵ khí (khơng có oxy) tronẹ lớp tràm
tích ờ đáy các thủy vực. Oxy hóa Fe(II) ket hợp với

khử N(V có thể đóng vai trị quan trọng trong mơi
tnrcmg ô nhiễm với Dồng độ Fe(n) cao (do thiếu oxy) 
và N (V cao (do chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành)
(Weber et ai., 2 0 0 6 ). C ác loài v i khuẩn v ó ị khả n ăn g 
tiến hành phản ứng oxy hóa khử nảy có thể cùng một
lúc thực hiện được hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển
Fe(H) hỏa tan trong nước về dạng Fe(in) kết tủa, và
hai là loại bò NO}~, chuyển thành dạng N2.

Vi khuẩn dùng ion Fe(n) làm nguồn cho điện từ

để khử N Ọ r được phân lập đầu tiên từ các lớp trầm
tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen, Đức năm 1996
(Straub et ai, Ị996). Một số công trinh nghiên cứu 
tiếp saụ cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm
vi khuân này với mật độ khá cao (1 0 6 tế bào/g trầm
tích) trong các điêu kiện môi trường khác nhau bao
gôm cả nuớc ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều
vị trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub
Buchholz, 1998). Các loài vị khuẩn phổ biển nhất 
trong nhóm này được biết đến hiện nay là các loài
, thuộc chi C h r o m o b a c te r iu m và K le b s ie lla (Benz et

</div>
(50)<div class='page_container' data-page=50>

Nguyễn Th| Tuyên & Đinh Thuý Hầog

khuẩn nảy ở châu Áu vói điểu kiện sinh thái hoàn 
toàn khác biệt v ớ i n ư ớc ta. T rong n gh iên cứu này, 
chủng tôi tiến hành tìm hiểu tính đa d ạn g cù a vi 
khuẩn khứ N 0 3_ sử dụng Fe(IĨ) là n guồn đ iện từ tại 
một số m ôi trường sinh thái đại đ iện ở V iệ t N am .

VẶT LỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
Phtnnig pbỉp tha mẫu

M ầu đ ư ợc thu thập ở ba m ôi trường sinh thái đại 
diện khác nhau: m ẫu bùn đảy ao n ư ở c Dgọt và chăn 
ruộng ngập nước đ ư ợc thu ờ ngoại thành H à N ộ i, 
mẫu trâm tích nước lợ được thu ở ven biên V ân Đ ôn

- Quáng Ninh. Mầu được thu thập trong các ống thúy

rinh nút xo á y với toàn bộ thê tích binh đ ê giậm thiêu

sự ảnh hưởng cùa oxy không khi tới quân thê vi sinh

vật trong mẫu. M âu được bảo quàn tại nhiệt độ 4 ° c 
cho đến khi tiến hành thí nghiệm .

X ic đ ịn h sổ lư ự n g v ỉ k h u ẩ n o x y h ó a F e (II), k h ử 
NO]" b ằ n g p h ư ơ n g p h á p M P N

S ố lượng vi khuấn ox y h óa Fe(II), khử N C V 
được xác định theo phương pháp M P N (M ost

Propable Num ber), A m erican Public Health

A ssociation, 1969) với thế tích 10% bùn đáy hoặc 
tram tích trong mơi trường khoáng dịch thể chúa

N ạN O ) (5 m M ), FeSƠ4 (1 0 m M ) làm chất nhận và

chất ch o điện tử. M ôi trường dịch thể kỵ khi hồn 
tồn c ó thành phần khoáng tương ứng với nước ngọt 
(dùng ch o mau tù ao til và chân ruộng ngập nước) 
hoặc nước [ợ (dùng ch o m ẫu lấy từ Vân Đ ồn - 
Quảng N in h ) được chuấn bị theo phương pháp do 
W iddel và Bak (1 9 9 2 ) m ô tá. D ảy pha loàng đư ợc 
thực hiện đên độ pha loăng 10‘\ mẫu đ ư ợc ũ trong tủ 
ấm lại 2 8 ° c trong 8 tuần.

Phân lập vi khuẩn o s y hóa Fe(II), k b ử N Ọ T băng

phương pháp ấng thạch bán lỏng

Ó ng M PN ở nồng độ pha loảng cao nhất có vi

khuân oxy hóa Fe{II), khử NOj' phát triền được sử

dụng làm nguồn phân lập cảc khuẩn lạc đơn. V iệc 
phán lập được tiến hành theo phương pháp pha loãng 
trên dày õng thạch bán lón g (1% ) (W idd el, Bak

1992) với mòi trướng có thành phần tương tụ như

mỏi trướng dùng trong phương pháp M PN. Ó ng

thạch bán lóng sau khi bổ sung nguon vi sinh vật
(]0°o) từ ông MPN (nguồn phản lặp) được sục khí
N; và Ú ứ tư the dáo ngược đầu tại 28°c trong bóng
tơi. Khn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng

được tách bằng pippet Pasteur và chuyên sang raôi

trường d ịch th ể th ích h ợ p (n ư ớ c n g ọ t h a y n ư ớ c lợ).

X á c đ ịn h h à m lư ợ n g F e ( I I ) v ì N Ọ f tr o n g môi 
t r ư ờ n g n u ô i c ấ y

Mầu vi sinh vật oxy hóa Fe(II), khử NCV đưọc
nuôi cẩy trong môi trường ky khỉ dạng dịch thể chúa

F e(II) ( 1 0 m M ) và N O j~ (5 m M ) tron g binh serum

đ ậy k in b ăng nút c a o su . M ầu d ịch n u ô i cấ y {1 mỉ) 
đ ư ợ c thu sau m ỗ i 2 4 h đ ể x á c đ ịnh n ô n g đ ộ Fe(II) vả

N03‘. Nồng độ Fe(II) được xác định bằng phương

pháp s o m àu ở b ư ớ c só n g S 1 0 nm , s ử d ụ n g thuốc thừ

phenanthrolin) (DIN 38406-E1-1, 1983). Nồng độ

N 0 3‘ đ ư ợ c xác đ ịn h bàng p h ư ơ n g pháp so màu ở 
b ư ớc só n g 4 1 0 nm , sử d ụ n g th u ôc thử disulfofem ic 
acid (L ê Đ ứ c, 2 0 0 4 ).

T á c h D N A tổ n g số

D N A tổn g s ổ củ a quần th ể v i sinh vật từ các ổng 
M P N đ ư ợc tách ch iế t th eo p hư ơn g pháp đ o Zhou và 
đ ồng tác g iả (1 9 9 6 ) m ô tà v ó i cải b iến v ề nồng độ 
đệm p hosphate v à n ồ n g đ ộ p rotein ase KL D N A 
g en o m e của các cb ủ n g đơn đ ư ợ c tách th eo phương

pháp của Marmur (1961). DNA sau khi tách chiết

đ ư ợc hòa tan trong n ư ớ c và b ảo quản tại - 2 0 ° c cho

các thí nghiệm tiếp theo.

P h â n tích đ a d ạ n g c ủ a c á c c h ủ n g đ ơ n bằng 
pbirữQg p h á p A R D R A

A R D R A (A m p lified R ib o so m a l D N A

R estriction A n a ly se s) là p h ư ơ n g pháp thường được 
sù dụng đ ể n ghiên cứu m ứ c đ ộ đa d ạn g v ề di truyền

cùa vi sinh vặt dựa trẽn phân tích kết quả xừ lý 16S

rD N A bằng en z y m e hạn ch ế. 16S rD N A cùa các 
ch ù ng đ an sau khi đ u ợ c k hu ếch đại trong phản ứng 
PC R Sừ dụng cặp m ồ i 2 7 F (A G A G T T T G A TCC 
TG G C TC A G ) và 1492R (G G T T A C C TT GTT 
A C G A C T T ) đ ư ợ c xử lý b àng hai e n z y m e hạn chế

Ađspl và H a e ỉĩ ỉ (F erm entas). Sản phẩm D N A sau khi 
đã xử lý enzyme được phân tách bàng điện di trên
gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút.

Các ch ù n g vi khuân sẽ đ ư ợc x êp n hóm dựa trên sự 
tiromg đ ôn g về p hổ các băng đ iện di.

P h â n tk h cấ u tr ú c q u ầ n t h ể b ằ n g phuromg p háp 
đ iệ n di b iế n tín h ( D G G E )

Đ oạn 16S r D N A vớ i đ ộ dài 5 5 0 bp đ ư ợ c khuếch

đại ĩ0n g Phàn_ửng PCR sừ d ụ n 8 c*p m°' GM5F
(CCT ACÕ GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG

</div>
(51)<div class='page_container' data-page=51>

Tạp chỉ Công nghệ Sinh học 7(3): 371-379,2009

1 9 9 3 ). Đ ể tạo tính ổ n đ ịnh c h o v iệ c phân tách các 
trinh tự D N A trên g e l đ iện di b iên tính , k ẹp G C gôm 
4 0 bp đ ư ợ c gắn v à o đầu 5 ’ củ a m ồ i G M 5F . Đ iệ n di 
đ ư ợ c tiến hành trên g e l p o ly a cr y la m id e 6% v ớ i dải 
b iến tính u rea/form am id từ 3 0 đ ến 60% . Q uá trinh 
đ iện di đ u ợ c thự c h iện b ằn g b ộ đ iện di D c o d e ™ 
S y stem (B io R a d ) ở n hiệt đ ộ 6 0 ° c tại 2 0 0 V trong 3,5 
h. Sau k hi đ iệu d i, g e l p oly a cry la m id e đ ư ợ c nhuộm 
trong dung d ịch etjiidium b rom id e (5 m g /m l) trong

30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh duới tia u v

trên m áy G e lD o c (B io R a d ). B ă n g đ iện di đ ư ợ c căt và 
thôi D N A ữ o n g nư ớc qua đ êm tại 4 ° c , sau đ ỏ dùng 
làm khuôn đ ể thực h iện P C R v ớ i cặp m ồi G M 5F,

907R. Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch vả

giải trình tự.

Giải trình tự 16S rDNA

Đ o ạ n 16S rD N A củ a các ch ù ng đơn hoặc sàn

phẩm PCR từ các băng điện đi biến tính được tiến

hành phản ứ n g đ ọ c trình tự v ớ i A B l Prism B ig D y e

Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên

m áy tự đ ộn g 3 1 0 0 A van t A p p ied B io sy stem s. Trinh 
tự gen sau đó đư ợc phân tích so sánh v ớ i trình tự 16S 
rD N A cùa các loài có liên quan hiện đã cô n g b ổ trên 
D atabase D D B J/E M B L /G en B an k sừ đụng phần 
m ềm B L A S T Search. C ây phân loại đ ư ợc dựng theo 
phư ơn g pháp n eigh b ou r-join in g (S aitou , N e i, 1987), 
trong đó định d ạn g câ y đ ư ợ c tiên hành dựa trên 1000 
phép s o sảnh đa ch iề u (F elsen stein , 1985).

K Ế T Q U Ả V À T H Ả O L U Ậ N

X á c đ ịn h sổ lư ợ n g v i khuẩn o x y h ó a F e (II), k h ử

N 0 3~ tạ i c á c m ô i tr ư ờ n g n g h iê n cứ u

S ổ lư ợ n g vi khuẩn o x y h óa Fe(II), khử N O f 
trong cá c mẫu bùn đ áy thu thập tại 3 m ô i trường sinh 
thái khác nhau được xác đinh thõng qua phưcmg

pháp MPN sừ dụng môi trường dịch thê chứa FeS04

làm chất ch o đ iện tử vả N a N O j ỉàra chất nhận đ iện 
tử cu ố i cùng. Thành phẩn k h oán g trong m ôi trường

tương ứng với điêu kiện nước ngọt (đối với mẫu bùn

đ áy ao và chân ruộng ngập n ư ớ c) h o ặ c n ư ớc lợ (đối 
vớ i m ẫu bùn ven b iền ). S ự phát triển cùa v i sin h vật

sinh tmờng nhờ oxy hóa Fe(U) trong các ống MPN

được nhận biết thông qua biến đổi màu sắc của môi

trường từ trắng xanh (m àu cù a F e(II)) san g m àu vàng 
nâu (m àu cù a F e(lII)) (H ìn h la ).

Kết q cùa thí nghiệm MPN (Hình lb) cho thấy
sơ lượng vi khuằn oxy hóa Fe(II), khử NOj" cao nhất

trong mẫu bùn chân ru ộn g ngập n ư ớ c (9 ,3 X 1 o 3 tế

b à o /g b ùn ), ca o h ơ n hẳn s o v ớ i m ẫu trầm tích n ư ớ c

lợ v en b iển (4,3 X 103 tể b à o /ẹ trầm tích ) v à mẫu bùn

đ áỵ ao nư ớc n g ọ t ( 1 ,5 * 103 tê b à o /g b ùn ). M ậ t đ ộ và 
m o i tu ơ n g quan giữ a s ố lư ợ n g v i khuân o x y h óa

Fe(n), khử NO-f với các điều kiện môi trường tại

m ỗ i vù n g sin h thái n h ư trên cũ n g đ ã đ ư ợ c tìm thấy 
trong m ột s ố n g h iên cử u trước đầy. R atering (1 9 9 9 ) 
khi n g h iê n cứ u ch u trình ch u y ên h ỏa săt tron g đật

trồng lúa tại Italy đã phát hiện nồng độ các ion sắt

ữ o n g m ôi trường n ày rất ca o vả c á c loài th am g ia

chu trinh chuyển hóa sắt đóng vai ưị quan trọng

trong ch u trình ch u yển h ó a vật ch ất tại đây. B ê n cạn h

đ ó , nhiều n gh iên cứ u khác cũ n g c h o th ây số lư ợ n g vi 
khuần o x y h ó a F e(U ), khử N O ị~ tại n h iề u v ù n g khác 
nhau trên thế g iớ i d ao đ ộ n g trong k h oản g từ 1 • 103 
đến 5 • 10* tế b à o /g m ẫu k h ô (W eb er e i a l., 2 0 0 6 ; 
R atering, S ch n ell, 2 0 0 0 ; H au ck e t a l., 2 0 0 1 ; Straub

et ai, 1996).

P h â n tích c ấ u trứ c q u ầ n th ể b ằ n g đ iệ n d ỉ b iế n 
tín h D G G E

Đ ể x ả c đ ịn h c á c n h ó m v i khuẩn o x y h ỏ a F e(II),

khử N 03" chiếm ưu thể tại các môi trường nghiên

cứ u , ch ú n g tôi tiến hành p hân tích cấu trúc q u ần thể 
trong cảc ố n g M P N ờ đ ộ pha lo ã n g 10 _J (là n ồ n g đ ộ 
gần tới hạn cù a d ãy M P N đ ối v ớ i c à 3 m ẫu ) b àn g 
p h ư ơ n g pháp P C R -D G G E đ oạn 16S r D N A (H ìn h 2 ). 
C ác b ăn g đ iện di đ ư ợ c cắt từ g e l và sử d ụ n g làm 
k hu ôn ch o p hàn ứ n g P C R tiê p sau đ ể x á c đ ịn h trình 
tự và so sánh v ớ i c á c trinh tự 16S r D N A đã c ô n g b ố 
ừ o n g ngân h à n g dữ liệ u G en B an k .

C ó thê thây răng, c á c loài A n a e r o m y x o b a c te r có 
mặt trong cả 3 dạng m ôi trường n g h iê n cứ u . Đ â y là 
nh ỏm vi khuẩn nam trong p hàn lớp Ỗ -P ro te o b a c te ria ,

hiện mới chi có một lồi duy nhất được cơng bổ là A. 
d e h a lo g ẹ n a n s cù n g v ớ i m ộ t số đại d iện ch ư a định

danh đ ên loài. C ác ch ủ n g A n a e r o m y x o b a c te r đã 
c ô n g b ố đ ều sinh trường k ỵ khi khừ Fe(III), c h ư a có 
ch ủ n g nào đ ư ợ c n gh iên cứ u v ề khả n ă n g sin h trường 
khử N O f , sử d ụ n g F e(II) làm ch ất ch o đ iện tư 
(T reud e e t a l., 2 0 0 3 ; Straub, B u c h h o lz -C le v e n , 1998 
Straub e t a l., 1996). T ron g m ôi trư ờn g n u ôi cấy sử 
d ụ n g ớ đ â y (c ũ n ẹ như trong đ iều k iện tự n h iên ), 
F e(III) đ ồ n g thời ton tại v ớ i F e(II) d o kết quà ch u y ển 
h ó a Fe(II) b ăng c o n đ ư ờ n g hóa h ọ c (ph ản ứ n g v ớ i

lượng nhó oxy trong mơi tniờng) và con đưcmg sinh
học (do các vi sinh vật oxy hóa Fe(II), khừ NO3').

D o vậy, sự c ỏ m ặt củ a c á c loài sin h trường k ỵ khí

khừ Fe(III) như Anaeromỵxobacter trong điều kiện

</div>
(52)<div class='page_container' data-page=52>

Nguyễn Thị Tuyển & Đinh

nhiên) là mẩt xích khép kín chu trình chuyến hóa sắt
tại đây.

Nhóm vi khuẩn Pseudomonas chiếm ưu thế 
ơong mẫu bùn ớ chân ruộng ngập nước. Đây là chi
th u ộ c p h â n lớ p Ỵ-pro te o b a c te ria , cỏ n h i ề u đ ạ i diện

sinh trưởng ky khi khứ NƠ3', bạo gồm cả các lồi có
khá năng sú dụng Fe(II) làm chât cho điện từ (Weber

et ai, 2006; Ratering, Schnell, 2000; Schtad 
2000). Đối vởi các mẫu bùn ao và trâm tích vtafl

bằng phương pháp P C R -D G G E thực hiện Ỉ l

chúng tôi chưa xác định được nhóm vi khuỈH
hóa Fe(II) khử N 03~ chiếm uru thê. Tụy nhiên, « 1
thông tin về vẩn đề này sẽ được bổ sung khỉ t]
hành nghiên cứu đa dạng các chủng đcm phầQ|
được từ các môi trường kể trên.

Hlnh 1. Xác định số lượng vi khuần oxy hóa Fe(ll), khử N03' trong các môi trường sinh thái khác nhau. A. Nhận biỉtsựot

mặt của vl khuản trong các ống MPN thông qua biến đồi màu sác của môi trường từ trẳng xanh (Fe(ll)) sang vàngiéi 
(Fe(lll)). B. Số lượng vi khuản oxy hóa Fe(ll), khừ N03' xác định thơng qua phương phảp MPN.

A R B

Pseudomonassp.

Anaeromyxobacter sp.

Hinh 2. Phổ điện di biến tinh (DGGE) phân tích đoạn 16S

rDNA của quần thề vi sinh vật trong các ống MPN của các 
mảu nghién cửu A. Bùn ao nưởc ngọt; R. Bún chần ruộng 
ngâp nước: B Bún trầm tich ven biẻn.

J

Hình 4. Phản lặp vi khuần oxy hóa Fe(ll), khử NOj‘

tại các mơi trưóg nghiên cứu A. Phân lập chửng (ton

qua phương pháp ống thạch kỵ khi bán lỏng; B. Nuởor

chủng đơn vi khuần oxy hóa Fe{ll), khử NO3' trong mfli Iwfr’i

d|Ch thẻ ở điều kiện kỵ khi hoàn tồn.

</div>
(53)<div class='page_container' data-page=53>

Tạp chí Cơng nghệ Smh học 7(3): 371-379,2009

Thời gãn (ngày)

2 3

Thời gian (ngày)
B

Hlnh 3. Hoạt tinh oxy hốa Fe(ll) (A) vả khử NCV (B) của các quần thề vi sinh vật tại ba môi trường nghiên cứu sau khi làm

giàu bẳng phương pháp MPN. Ký hiệu: o. Đối chứng không cỏ VSV; ■. Mẫu bùn đáy ao nước ngọt; Mẫu bùn chân mộng

ngập nước; A , Mău trầm tlch nước lợ ven biển.

Mức độ oxy hóa Fe(n) và khử NO) của vi sinh

vật trong các mSu nghiên cứu

Nồng độ Fe(II) và NO}' ừong môi trường nuôi

cấy được xác định theo thời gian để đánh giá khà
năng sinh tmởng của vi sinh vật trong các mẫu làm
giàu (Hình 3).

Như vậy, các guần thể vi sinh vật được làm giàu
qua dãy MPN the hiện khả năng sinh trường với
Fe(H) và NOị' khá cao. Ở cà 3 mẫu, luợng nitrate
trong môi truờng bị khử gần hoàD tồn sau 4 ngày
(Hình 3B), tuy nhiên lượng Fe(n) không giảm tương
ứng (Hinh 3A). Hiện tượng này cỏ thể lý giải bằng

sự c ó m ặt củ a n hóm v i khuẩn A n a e r o m y x o b a c te r

trong cả 3 mẫu phân tích, làm chuyển hóa Fe(in)
thảnh Fe(Et).

P h â n lậ p v ỉ k h u ầ n o x y h ó a F e ( n ) , k h ử N 0 3~ t ừ

cic m ẫ u n g h iê n cứu v à đ á n b g iá tín h đ a d ạ n g c ủ a

cic chủng phân lập

Vi khuẩn oxy hỏa Fe(ÌI), khử N 03" được phân
lệp theo phương pháp pha lọãng trong dãy ống thạch
bán lỏng (1%) (Widdel, Bak, 1992) (Hình 4a) Các
khuẩn 'lạc đơn được phân lập dựa trên sự khác nhau
về hỉnh dạng, kích thước khuẳn lạc. Mỗi khuẩn lạc
đutợc tách riêng và nuôi cấy kỵ khí trong mơi trường
dịch thể chửa Fe(II) (10 mM) và NO3" (5 mM) ừong
bỉnh serum có nút cao su và kẹp nhôra (Hinh 4b). 12

khuẩn lạc đom được phân lập từ các ổng MPN ở độ
pha lỗng cao nhât có vi sinh vặt phát triển (Bàng 1)

là đại diện cho vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NOj"

c h iế m đa s ố tại ba m ơ i tnrịmg n g h iê n cứ u .

Tính đa dạng của 12 chủng vi khuẩn đã phân lập
ở trên được phân tích bẳng phương pháp ARDRA, sử

d ụ n g hai e n z y m e bạn c h ế H a e ìữ . v à M s p l {H ìn h 5).

Kết quả thu được cho thấy, các chủng này có thể
xếp vào 5 nhóm di truyền khác nhau (Bảng 2). Từ
kết quà phân nhóm ờ bàng 2 kết hợp với nguồn gốc
phân lập 12 chủng này (Bàng 1), có thể nhận thấy
tính đa dạng di truyền của 1 2 chùng vi khuẩn oxy
hóa Fe(H), khử NO3’ phụ thuộc vào địa điểm thu
mẫu ban đầu. Mầu trầm tích nước lợ ven biến thể
hiện mức độ đa dạng đi truyền cao nhất với 4 chủng
phần lập từ mẫu này (IN5, IN6, IN7, EN8) thuộc vào
4 nhóm khác nhau (nhóm 2, nhóm 3, nhóm 4 và
nhóm 5). Tiếp đến là mẫu bùn đáy ao nước ngọt với
4 chủng (IN9, IN10, IN11, IN12) thuộc vào 3 nhóm

k h á c nhau (n h ó m 1, n h ó m 2 v à n h ó m 4 ). T h ể h iện

tính đa dạng di truyền thấp nhất lậ mẫu bùn chân
ruộng ngập nước với 4 chủng (INI, IN2, IN3, IN4)
thuộc vào 2 nhóm khác nhau (nhóra 1 và nhóm 2).

Ba chủng IN2, IN7 và IN12 đại diện cho 3

</div>
(54)<div class='page_container' data-page=54>

Nguyễn Thị Tuyên & Đinh Tbý

n hỏm A R D R A -4 g ồ m 3 ch ủ n g từ m ôi trường nư ớc 
lợ và ao n ư ớ c ngọt, ch iế m 25% trong tổ n g s ố cá c 
ch ủ ng phân lập đ ư ợ c. C hủ ng EN7 làm thánh m ột 
n bóm riên g b iẹt (A R D R A -5^ , ch ỉ tìm th ấy ờ m ôi 
trường nư ớc lợ v e o b iên. K êt quà s o sánh trình tự 
16S rD N A củ a các ch ủ n g n ày v ó i ngân hàng d ữ liệu 
G enB ank ch o thấy, ch ù n g IN 2 c ó đ ộ tư ơ n g đ ồ n g ca o 
nhẩt v ớ i A n a e r o m ỵ x o b a c te r d e h a ỉo g e n a n s (99% ), 
ch ủ n g IN 7 v ớ i P s e u d o m o n a s s tu tz e r i (98% ) và 
ch ủ n g IN 12 vớ i P a r a c o c c u s fe r o o x y d a n t (97% ) 
(H ình 6).

N h ư v ậ y , n h óm A R D R A -4 v ớ i ch ù ng EN 12 làm 
đại diện là c á c loài P a r a c o c c u s và đ ư ợ c tim thây 
trong hai dạng m ôi trường n ư ớc lợ v en b iển và ao 
n ư ớc ngọt. P a r a c o c c u s là ch i v i khuẩn nầm trong

phân lớp a-proteobacterria, g ồ m c á c loài sinh! 
k ỵ k h í tù y tiện , b ô hấp b ằ n g nitrate boệcl 
(S c h a p le ig h , 2 0 0 0 ) . K ết h ợ p v ớ i k ết q u i 
P C R -D G G E ở trên c ó th ể th ấy răng, P a r a

P s e u d o m o n a s là b ỉ i n h ỏm c hinh o x y hóa L A [Ậ

N 0 3" c h iế m ư u th ế trong ba d ạn g m ơi b u ị o g í

n gh iên cứ u , tron g đ ó P a r a c o c c u s c ó vai trò

trọng h o n ở a o n ư ớ c n g ọ t v à Pseudomonas ờ IL,

Dgập n ư ớ c. Đ ạ i d iện củ a c ả hai n h óm nảy đuợcl 
thấy ở m ô i trư ờn g n ư ớ c lợ v e n b iển , c ó thể ỉà dai 
h ư ớ n g củ a n g u ồ n n ư ớ c n gọt từ đ ấỉ liền.

D ự a trên k ết q u ả s o sánh trình tự 16S rONA 
trên, c á c ch ủ n g IN 2 , IN 7 v à EN12 được đ ịn h d M 
lần lư ợ t là A n a e r o m y x o b a c te r sp. EN2, P se u d o m ^ Ế 
sp. IN 7 v à P a r a c o c c u s sp . IN 12.

Béng 1. VI khuản oxy hóa Fe(ll), khử NO3' phân lập được từ các môi trường nghiên cứu.

Nguồn phin lfp Chủng vi khuần Đặc điẻni hình thái khuân lạc

Chân ruộng lúa ngập 
nước (ngoại thánh

Há Nội)

IN1
IN2

Hlnti tròn, bè mặt nhẵn, kich thước 1 - 2 mm

Hình ừủn, bề mặt khdng nhến. Kich thước 0,25 - 0,5 mm

IN3 Hỉnh tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,25 - 0,5 mm

IN4 Hinh trịn, bề mặt xù xỉ, kích thước 1 - 211)171

Trầm tlch nước lợ tại

biển (Vãn Đòn, 
Quảng Ninh)

IN5
IN6
IN7

Hỉnh trịn, bề mặt nhân, kích thưởc 0,25 rrtm

Hlnh bầu đục, bề mặt nhẵn, klch thước 0,25 - 0,5 mm

Hlnh tròn, bè mặt *0 xi, klch thước 0,8 mm

IN8 Hình trịn tía. mật độ té bảo ở ngồi ít han phla trong, klch thước 1 ■

1,5 mm
Đây ao nirớc ngọt

(ngoại thành Há Nội)
IN9
IN10

Hlnh tròn, bề mặt xù xl, ktch thước 0,5 -1 mm 
Hlnh trỏn không đèu, klch thước 0,5 -1 mm

IN11 Hinh tròn, bè mặt nhẵn, kfcti thước 0.2 - 0,3 mm

IN12 Hinh đìa lồi hai mặt, kich thước 2 - 2,5 mm

12 Wl^ n oxy Fe(">- NOì sau khi xử lý bằng cảc * K C fm W

Hàn Ouòc^ ~ ° 9 đơn phâ" lập k các mẫu nghién cưu; M; Master 1 tị(Ejẽynfl«

</div>
(55)<div class='page_container' data-page=55>

Tạp chi C ồ n g nghệ S in h học 7(3): 371-379, 2009

BAng 2. Tinh đa dạng vè <& truyèn của 12 chủng vi khuẩn oxy hỏa Fe(ll), khử NOT đâ phân lập (IN1 - IN12) dựa trén phân tích 
ARDRA.

Nhòm
ARDRA

Chùng vi khuẩn Các đoạn DNAtạo ra sau khi xử lý 16S rONA bằng các enzyme

hạn ché (bp)

H a m MsfA

1 IN1.IN2, IN4. IN11 200.300 300,500

2 IN3, IN8 200,300 500

3 IN5, IN9 200,300 500, 800

4 INS, IN10, IN12 200, 300, 500 300,500

5 BI7 200, 900 500

m .

100

M 2

-B a c illu s sub tU is (F J 5 4 4 3 8 6 )

n
-ịUl/M

I-IN2

Anaeromyxobacter sp FAcl2 (AJ504438)

A n a e r o m y x o b a c te r d e h a ìo g e n a n s 2CP1 (N R 0 2 7 5 4 7 ) Y Ô-Proteobacteria

- A n a e r o m y x o b a c te r clone (A B 2 9 3 3 6 7 )

621--- P a r a c o c c u s m a r im ts ( A B 1 8 5 9 5 9 )

I---Pa° a r a c o c c u s fa r o o x y à a n í (A Y 9 5 4 6 8 7 )

rIN1 2

100 \-P a ra c o c c u s sp. (A M 9 8 9 0 J 7 )

k- a-P roteob acteria

P s e u d o m o n a s p u tid a (F J217182) 
P s e u d o m o n a s s tu ize ri (E U 5 18705)

I N 7

P s e u d o m o n a s a ỉc a h g e n e s X B 5 (G Q 1504 90) 
■Pseudom onas m tr o r s d u c e n s P S 2 (F J588866)

>, T'-Proteobacteria

Hỉnh 6. Cây phân loại mề hiện mối Nén quan giữa các chủng IN2, IN7, IN12 và các loảí gằn gũi dựa trẽn trình tự 16S

rONA. Cây được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đom vị = 0,02 K^c trong trinh tự nucleotide. Các số hiền thị ờ các

vi tri phân nhánh lả Kết quỏ phân tích bootstrap đối với 1000 phép so sánh (chì có các giá tri trên 50% được binh bày trên

hlnh). B. subtilislà loài vi khuẩn được chọn lám outgroup.

K É T L U Ậ N

Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(H), khử N 03
toong các mui bùn thu thập ở thùy vực nước ngọt,
chân ruộng ngập nước và vùng nước lợ ven biển

được x á c đ ịnh Dằm trong k h o ả n g 103 - 104 T B /g ,

trong đó mẫu bùn ờ chân ruộng ngập nưóc cỏ số

lượng tể bào vi khuẩo này cao hơn cả (9 , 3 • 1 0 3
rB/g). Vi khuẩn oxy hóa Fe(ĨI), khử N 03~ tại các
nôi trường nghiên cứu có tính đa dạng khá cao.
tíười hai chùng đơn phân tập từ các mẫu MPN được
tếp vào 5 nhóm ARDRA khác nhau ữong phân tích
ử dụng hai enzyme giới hạn HaeĩU và Mspl Phân 
ích thảnh phàn lồi bằng phương pháp PCR-DGGE

đ ô i v ớ i 16S r D N A c h o thấy A n a e r o m y x o b a c te r là 
m ộ t trong n h ữ n g n h ó m c h iế m ưu th ế c ó m ặt cả ở ba 
d ạ n g m ô i tnrcm g sinJb thái trên, đ ó n g vai trị k h é p k ín 
ch u trinh ch u y ên h ó a sắt trong c á c m ô i trường 
n g h iê n cứ u th ô n g qua k hả n ăng sin h trưởng k ỵ k hí 
k h ử Fe(IH ). K ết h ợ p v ớ i k ết quà n g h iê n cứ u cá c 
ch ủ n g đom phân lập đ ư ợ c từ cá c d ạn g m ô i trư ờn g

n g h ie n cư u trên c h o th ây P a r ữ c o c c u s và

P s e u d o m o n a s là hai n h ó m v i khuẩn ch ín h th ự c h iện

q uá trình o x y h ỏ a Fe<n), k h ử N O f , tư ơ n g ứ n g đ ó n g

vai trị quan trọn g trong m ô i trường a o n ư ớ c n g ọ t v a 
chân ruộng n g ậ p n ư ớ c. B a ch ù n g đ ại d iện la IN 2 
IN 7 v à IN 12 c ó trình tự 16S rD N A c ó đ ộ tư ơ n g đ ồ n g

</div>
(56)<div class='page_container' data-page=56>

Nguyên Thi Iuyén & Đ i n f
d e h a ỉo g e n a n s (9 9 % ), Pseudomonas s tu tz e r i (9 7 % )

và Paracoccus ferrooxydant (98%), do vậy được đặt

tên lần lượt lả Anaeromyxobacter sp. IN2,

Pseudomonas sp. IN7 và Paracoccus sp. IN 12. Hai
chùng IN2 và EN7 là các chủng vi khuẩa có tiềm 
năng ứng dụng trong việc xử lý các nguồn ũ ước
ngầm nhiễm sắt và nitrate.

L ờ i c ả m o n : Nghiên c ứ u n à y đ ư ợ c th ự c hiện n h ờ s ự

hỗ trợ kinh phi từ đề tài QG.07.26. Tác già xin trán 
trọng cám ơn Viện Vi sinh vật và Cóng nghệ sinh 
học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điêu kiện trong 
quả trinh thực hiện để tài.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

American public health association (1969) Standard 
methods for the examination of water and waste water 
including bottom sediments and sludge. 604-609.

Benz M, Bnine A, Schiok B (1998) Anaerobic and aerobic 
oxidation of ferrous iron at neutral pH by 
chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria. Arch 
Microbiol 169: 159-165.

DIN 38406-E1-1 (1983) German standard methods for the 
examination of water, waste water and sludge; cation 
(group E); determination of iron (El).

Felsenstein J (1985) Confidence limits on phytogenies: an

approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791.
Hauck s, Benz M, Brune A, Schink B (2001) Ferrous ừon 
oxidation by denitrifying bacleria in profundal sediments 
of a deep lake (Lake Constance). FEMS Microbiol Ecoi 
37; 127-134.

Lê Đức (2004) Một Jố phựcmg pháp phán tích mơi trường. 
Nhà xt bàn Đại học Qũc gia Hà Nội.

Marmur J (i 961) A procedure for the isolation of 
deoxyribonucleic acid from microorganisms. J Mol BioI 3 
208-218.

Muyzer G, De Waal EC, Utterlindea AG (1993) Profiling 
of complex microbial population by denaturing gradient

ge! electrophoresis analysis of polymerase 
amplified genes coding for 16S rARN.

Microbiol 59: 695-700.

Ratering s (1999) Iron cycle in Italian 
localization of the redox processes and chi 
the involved microorganisms. PhD

Department of Microbiology, University of 
(Germany).

Ratering s, Schnell s (2000) Nitrate-depeodeatl
oxidation in paddy soil. Environ Microbiol Ỉ: I094J

Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining 
new method for reconstructing phylogenetic tm

BiolEvo! 4:40 6 -4 2 5 .

Shapleigh JP (2000) The Denitrifying 
Dworkin M, Falkow s, Rosenberg E, 
Stackerbrandt E, eds. The prokaryotes: t

electronic resource for the microbiological

Springer-Verlag, New York.

Straub KL, Benz M, Scbink B, Widdel F (1996) Ah 
nitrate-dependent microbial oxidation of fenoui nt

Environ Microbiol 62: 1458-1460.

Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Em 
and detection of anaerobic ferrous iron-oxiđiàDti 
reducing bacteria from diverse European sedanofc

Environ Microbiol 64: 4846-4856.

Treude N, Rosencrantz D, Liesack w, ScbndlSI 
Strain FAcl2, a dissimilatory iron-reducing meata

Anaeromyxobacier subgroup of Myxococcda. I 
Microbiol Ecol 44: 261 -269.

Weber KA, Umitia MM, Churchill PF, Kukbàp 
Roden EE (2006) Anaerobic redox cycling flf ãí 
freshwater sediment microorganisms. Environ lit*

8: 100-113.

Widdel F, Bak F (1992) Gram-negative mesoph&i

reducing bacteria. In BaJows A, TrQper HG, Dual

Harder w, Schleifer KH eds. The Prokaryota, Í 
Springer, Berlin Heidelberg New York: 3 3 52-3371
Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA reantf. 
soils of diverse composition. Appl Environ hơơdi 
316-322.

</div>
(57)<div class='page_container' data-page=57>

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(3): 371-379, 2009

STUDY ON DIVERSITY OF ANAEROBIC Fe(II)-OXIDIZING, N O3 -REDUCING

BACTERIA IN SOME ECOLOGICAL ENVIRONMENTS IN VIETNAM

Nguyen Thỉ Toyen1, Dính Thuy Hang2, *

'H a n o i U n iv e r s ity o f S c ie n c e , V N U

2Institute o f Microbiology and Biotechnology, VNJJ

S U M M A R Y

Fe(H)-oxydizing, NOj'-reducmg bacteria in sediment samples collected from freshwater aquifer,

flooded paddy soil and estuarine area were quantified and analysed on species composition. The MPN 
results showed that among the three studied environments, flooded paddy soil had the highest number o f

these bacteria (9.3 • 103g_l), five and two times higher than that of freshwater aquifer and estuarine

sediment, respectively. Based on distinguish colony characteristics, 12 strains of Fe{n)-oxidizing, NOj-- 
reduing bacteria were isolated from MPN series and were set into five genetically different groups as

proposed by ARDRA analyses with two restricition enzymes H aeU l and M spl, showing relatively high

diversity of this bacterial group in the studied environments. Analysing species composition in the 
communities developed in MPN tubes at the highest dilution via PCR-DGGE of 16S rDNA revealed that 
Anaerom yxobacter species presented in all three above environments. In combination with the culture-

dependent studies, it was revealed that Paracoccus and Pseudom onas were dominant groups playing

important roles in freshwater aquifer and flooded paddy soil, respectively. Sequencing of 16S rDNA from 
three representative strains IN2, IN7 and EN 12 suggested that they are respectively belonged to 
Anaerom yxobacter, Pseudom onas and Paracoccus genera.

Keywords: Fe(II)-oxidizing, NO3~-reducing bacteria, DGGE, ARDRA, Anaeromyxobacter, Paracoccus,

Pseudomonas, ỈĨSrDNA

</div>
(58)<div class='page_container' data-page=58>

chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ X X (2009) 0-0

Nghiên cứu vi khuẩn ưu thế tham gia chu trình Fe trong các

điều kiện m ôi trường khác nhau tại V iệt Nam

Nguyễn Thị Tuyền1, Nguyễn Minh Giảng2, Đinh Thúy Hằng2-*

'Khoa Sinh học. Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hù Nội.334 Nguyễn Trãi, Hà Nội

2 Viện Vi s in h v ậ t và Công n g h ệ Sinh h ọ c , Đ ạ i h ọ c Q u ố c g i a H à N ộ i, ì 4 4 Xuân Thúy, Hà N ộ i

Nhận ngày tháng năm

T óm tắt. Hai chúng vi khuấn IN2 và IN 12 được phân lập từ bùn đáy nước ngọt, đại diện ch o hai

nhóm vi khuẩn chính tham gia chu trinh chuyển hoá sảt tại đây, bao gôm khứ Fe(IIl) băng các họp 
chất hữu cơ và oxy hóa Fe(II) bàng nitrate. Hai chủng vi khuấn nói trẽn có các đặc điêm sinh lý

hoàn toàn khác biệt nhau. Chùng IN2 được phân lập từ mẫu bùn chân ruộng ngập nư ớc là trực

khuẩn, sinh trướng ky khí bảt buộc bằng Fe(III) hoặc nitrate, thích hợp với mơi trường có nơng độ

m uối cao hom 1%. Chừng I N I 2 được phàn lập từ mầu bùn đáy ao nước ngọt là vi khuắn kỵ khí tùy

tiện, có tế bào hình oval và thích hợp với m ơi trướng có nồng độ m uối từ 0 - 3%. C húng IN 12 thề

hiện hoại tính khứ nitrate, oxy hóa Fe(II) cao, do đó có tiềm năng ứng dụng thực tế trong việc xừ

lý các nguồn nước nhiềm nitơ và ion kim loại F e(li). G iải trinh tự 16S rA D N và so sánh kết quà

với ngân hàng dữ liệu đối với hai chúng IN2 và IN 12 cho phép định đanh các chúng này tương

ừng tà A n a e r o m y x o b a c te r sp. 1N2 (m ã trình tự F J939131) và P a ra c o c c u s sp. IN 12 (m ã trinh tự

GU084390).

Từ khóa: A n a e r o m y x o b a c le r , P a ra co c cu s, V i khuân khứ F e (lll). V i khuẩn khứ nitrate, o x v hóa 
Fe(II), 16S rADN.

M ỡ đ ầ u

Trong tự nhiên sắt lá một trong những
uyên tổ có mặt với hàm lượng đáng kể. sau
‘bon, nitơ, phospho và lưu huỳnh []]. Là
>t nguyên tố kim loại, sắt tồn tại ở các dạng
I với điện thế oxy hoá khử khác nhau, gồm
[II) và Fe(Ill). Trong hai dạng ké trên chi có

; ỉl) tồn tại ỏ' dạng hoà tan trong nước, tuv

lên. do có tính ,khừ cao. Fe{ll) nhanh chóng

ic giá liên hệ. ĐÌ': t84 4 37547694 
•mail: dlliiiimaAnu.cdu.ui

bị oxy hoá thành Fe(IIl) trong phản ứng hoá
học với oxy khơng khí. Do vậy ion Fe(II)
thường chi được tìm thấy trong các điều kiện
môi trường khơng có oxy, ví dụ như ở đáy các
thuỳ vực hay các tầng nước ngầm hay mơi
trường có pH thấp

[2,3]-Các vi sinh vật tham gia chu trình sắt gồm

c ó ( i ) vi k h u â n OXV lio á Fe(11) bằng oxy n h ư

Thiobaúllus ferro o x yd a m [I], bằng nitrate như

một số loài Chrom obacterium , K leb siella [4]
hay bang quang hợp như Chìorobium ,

</div>
(59)<div class='page_container' data-page=59>

N.T. Tuyên và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học T ụ Nhiên và Công nghệ XX (2009) 0-0

í các lồi Geobacter, Sewanella, 
aeromyxobacter [6, 7, 8]. Trong khi oxy hoá
II) bằng oxy theo con đường sinh học chi
n ra ở mơi trường có pH thấp thì oxy hố
(II) thành Fe(lU) bàng nitrate và khừ Fe(III)
tnh Fe(U) bàng một số hợp chất hữu co là
i quá trình diễn ra ở điều kiện pH trung tính,
ép kín chu trình chuyển hố sẳt tại đây [1].
liều cơng trình nghiên cứu cho thấy sự có
ít khá phả biến của hai nhóm vi khuẩn này ở
iều điều kiện môi trường khác nhau, bao
m cà nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại
iều vị trí địa lý khác nhau trên thế giới [7,

Trong bài báo này chủng tòi trình bày
.ưng kết quả nghiên cứu thực hiện đối với hai
ủng vi khuẩn đại diện cho nhóm vi khuẩn
,y hoá Fe(ll) bang nitrate và khứ Fe(lll),
rợc phân lập từ mơi trirịng thiếu oxy trong
in đáy nước ngọt tại Việt nam.

Nguyên liệu và phương pháp

/. N g u ồ n v i s i n h v ậ t

Các chúng vi khuẩn đưcrc phân lập từ thi
>hiệm nuôi tich lũy trẽn mẫu bùn tự nhiên
Dng mơi trượng kỵ khí sir dụng Fe(ll) và 
Oi" làm chất cho và nhận điện tứ tương ửng
]. Mau bùn tự nhiên được thu thập ò' đáy ao
rớc ngọt và chân ruộng ngập nước ờ ngoại
ành Hà Nội.

?. N g h i ê n c ứ u c á c đ ặ c đ iè tỉì s i n h l ý

Đặc điếm sinh trướng cùa các chủng vi
uẩn được tien liành nghiên cứu trên môi
rờiig kỵ khi dịcli thể. sử dụng các chất cho và
ận điện tử khác nhau (bao gồm cả oxy) và
nồng độ muối khác nhau. Sự sinh trương
ỉ vi khuẩn tại các điều kiện nuôi cấy khác

nhau được đánh giá thông qua thay đổi về độ
đục của môi trường so với đôi chứng không co
vi khuẩn.

2.3. Nghiên cứu hình thái

Hinh thái cùa các chủng vi khuẩn đurợc xác

định đối với tế bào ờ pha sinh trường lũy tiến.
Dịch tế bào được ly tâm 10.000 vòng/phút
trong 5 phút, sau đó sinh khối được hòa trong
200 Ịi! nước muối 0,9% và dùng làm tiêu bản
trên lam kính phù agar. Ảnh tế bào được chụp
duới kinh hiển vi đối pha, độ phòng đại 1 0 0 0
lẩn.

2 .4 . T á c h A D N t ổ n g s ố , n h â n g e n ỉ 6 S r A D N v à 
x á c đ ị n h v ị t r í p h â n l o ạ i

ADN tổng số từ các chùng vi khuẩn được
tách chiết theo phương pháp cùa Marmur
(196 ]). [1 0] với một số thay đổi để tối ưu hóa.
Gen mà hóa cho I6S rARN (1500 bp) được
khuếch đại trong phàn ứng PCR sử dụng cập
mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC
AG) và I492R (GGT TAC CTT GTT ACG
ACT T). Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải
trinh tự với ABI Prism BigDye Terminator
cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy
tự động 3110 Avant Appied Biosystems. Trình
tự gen sau đó được phân tích so sánh với trình
tự 16S rADN cùa các lồi có liên quan hiện đã
công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank
sử dụng phần mềm BLAST Search. Cây phân
loại được dựng theo phương pháp neighbour-
joining [1 1], trong đó định dạng cây được tiến
hành dựa trên 1 0 0 0 phép so sánh đa chiều [1 2].

2 .5 . Đ á n h g i ã h o ạ t t i n h s i n h h ọ c c u a c á c c h u n g

17 khuân

</div>
(60)<div class='page_container' data-page=60>

N.T. Tuyềh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ tập (2009) sõ trang 3
trate (5 mM) íàm chất nhận điện tử và Fe(II)

tặc Mn (II) (10 mM mồi loại) ỉàm chất cho
ện tử trong bình serum đậy kín bằng nút cao
. Mầu dịch nuôi cấy (5 ml) được thu thập sau
ỗi 24 h và xác định nồng độ các nguồn cho
t nhận điện từ trong môi trường. Nồng độ
trate được xác định bằng phương pháp so
àu sử dụng thuốc thử axit desulfofemic [13].
ồng độ Fe(ll) được xác định bàng phương
láp so màu ỡ bước sóng 510 nm, sữ dụng
uốc thử phenanthrolin [14], Nồng độ Mn (II)
rợc xác định theo phương pháp
'imaidoxime [15].

Vi khuẩn kliử Fe(Iỉl) được nuôi cấy trong
ôi trường kỵ khí dịch thể, chứa Fe(IIi) ở
Ịng phức hợp với citrat (tan trong nước) làm
lất nhận điện từ (15 mM) và Na-acetate (10
M) làm chất cho điện từ. Sinh trường cùa vi
luẩn được nhận biết thông qua sự mất màu
ia mòi trường (màu xanh lá cây đậm do
e(lll)-citrate tạo ra).

. Kết quả và thào luận

/ . P h â n lậ p v i k h u â n

Hai chủng 1N2 và INI2 đưọc phân lập từ
í nghiệm làrtí giàu bùn đáy thủy vực nước
;ọt và chân ruộng ngập nước qua dãy MPN
r dụng môi trường kỵ khi dịch thế chứa Fe(l[)
1 NO,- làm chít cho và nhận điện tử tirơng
Ig. Nglìiêtr cíhỊ đa dạng vê đặc điểm di
lyền gen I6S pADN bằng phtrong pháp
3GE và ARDRA đôi với nhóm vi khuân oxy
á Fe(ll) khữ NOi" tại hai môi trường sinh
íi kề trên ở Việt nam cho thấy chùng IN2 đại
ịn cho nhóm vi khn ln có mặt ờ cà 2
■>i trưòng đã nghiên cứu. trong khi đó chùng

1 2 chi tim thây ớ bùn đáy thuy vực nước
?t [16]. Dựa trên tinh đại diện đổi với hai
5m vi khuấn chính tham liia chu trình
ln hố sắt tại các mơi trưịng nghiên cửu,

hai chủng này được lựa chọn đê tìm hiêu sâu
về các đặc tính sinh học cũng như khả năng
ứng đụng thực tế.

3.J. Nghiên cửu các đặc điếm sinh lý của hai 
chúng vi khuân 1N2 và IN I2

Báng ]. Đặc điểm sinh lý cúa hai chúng vi khuẩn 
IN2 va IN 12

Đặc điểm sinh lý 1N2 IN12

Hô hấp bằng oxy

(sinh trường hiếu khí)

-+ -+

0% - + + +

Sinh trưởng 1% + + + + + +

phụ thuộc độ 
mặn của môi 2%

+ + + + + +

trường 3% + + + + + +

(% NaCl) 4% + + + + +

5% + + + +

Lactate + + + + + +

Chất cho 
điên từ

Acetate + + + + + +

(khử nitrate) Ethanol + + + + "4" +

Benzoate + + + +

Chấi nhận 2 ov»

+ + + + 4* +
điện tứ (oxy

hoá lactate)

Fe( III) - + + +

so42~ —

</div>
(61)<div class='page_container' data-page=61>

N.T. Tiạ/ỈH và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ XX (2009) 0-0

ện từ còn chủng INI2 khơng có khà năng
iy. Cả hai chùng đều không sinh trường bằng

lử so/".

Đối với các nguồn điện tử khác nhau phục
cho quá trình khử nitrate, ngoài Fe(ll) đã
irợc sừ dụng để phân lập và nuôi cấy từ ban
ầu, lactate, acetate, benzoate và ethanol đều
trợc oxy hoá bời hai chùng IN2 và [NI2.
rong trường hợp benzoate, một axit hữu cơ

nứa vịng thơm và thường khó bị oxy hố hơn
íc hợp chất cịn lại, chủng IN 12 thể hiện khà
ẫng oxy hoá kém hom hẳn so với chủng 1N2.

Độ mặn là một trong các yếu tố môi trường
uart trọng ảnh hưởng đến sinh lý của vi sinh
ật trong tự nhiên, do vậy ờ đây chủng tỏi tiến
ành nghiên cứu ảnh hưởng cùa nồng độ muối
ong môi trường đối với khả năng sinh trưòng
ủa hai chùng vi khuẩn quan tâm. Kết quả
ghiẽn cứu cho thấy chimg IN2 có nhu cẩu về
tuổi để sinh trưởng, chùng INI2 thì khơng,
'rong khi chùng IN 12 có thế sinh trường trong
lôi trường không cần bồ sung NaCI thì chùng
N2 chi phát triển khi NaCI có mặt ờ nồng độ
% trờ lên. Tuy nhiên, chủng IN2 lại cỏ khả
lăng chịu muối cao hon IN 12, chùng này vẫn
'hát triển tốt ở nồng độ muối 5% trong khi đỏ
3C độ sinh trưởng của IN 12 bị ảnh hường
áng kề ở các nong độ muối cao hom 3%. Điều
ày cùng phù hợp với đặc điểm phân bố của
ai chúng vi kịiuần trong tự nhiên, cụ thể ]à
húng 1N2 đạhdi,ện cho nhóm vi khuẩn được
m thấy ờ í>h(ềủ /Ịạng mơi trường khác nhau,

ỈO g ô m cả nước ngọt và nƯỚC lợ. trong khi đó

lùng IN 12 đại diện cho nhóm chi tim thấy ỏ1
in đáy thuý vực nưóc ngọt [16].

2. Nghiên cứu hình thái tế bào và g ia i trình

‘ gen Ỉ6S rADN cua hai chưng vi khuân ỈN2 
r ỈN ỉ 2

Chúng IN2 gồm nhũng tế bào dạng trực
uẩn, kích thước 1x4-5 |im. chuyến động tích

cực (hình 1); chủng rN 12 gồm những tế bào
hinh oval có kích thước 1,5x1.5-2 fim, chun
động chậm (hình 1).

Giải trình tự gần đủ gen mã hóa cho I6S
rARN (1300 bp) của hai chủng ĨN2 và IN 12 và
so sánh với ngân hàng dừ liệu GenBank cho
phép chúng tôi xếp chủng ỈN2 vảo chi
Anaeromỵxobacler (ioài gân gũi nhât là A. 
dehalogenans, 99% tương đồng) và chùng 
INI2 vào chi Paracoccus (loài gần gũi nhất là 
p. aminovorans, 98% tương đồng).

Anaeromyxobacter là một chi thuộc phản 
lớp Ồ-Proteobacteria, được biết đếnvới các đại 
diện sinh trưởng kỵ khí bắt buộc bằng oxy hoá 
các hợp chất hữu cơ để khừ Fe(IlI) [8]. Trong
ngân hảng dữ liệu về gen 16S rADN cùa chi
này hiện mới có lồi A. dehaỉogenans và một 
số các chùng chưa được định danh đến tên chi.
Chùng IN2 đưọc bổ sung vào danh sách chi
Anaeromyxubacter với tên khoa học là

Anaeromyxobacter sp. IN2 và mã trình tụ gen 
]6S rADN trong GenBank là FJ939I31 (hình
1C). Trong nghiên cứu này, lần đẩu tiên vi
khuân Anaeromyxobơcter mà đại diện [à chùng 
IN2 thê hiện khả năng sinh trưởng bang oxy
hoá Fe([l), khử nitrate, tuy nhiên hình thức
sinh trường này không vượt trội so với sinh
trưởng kỵ khí khử Fe(!il).

</div>
(62)<div class='page_container' data-page=62>

N.T. T ự y á và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ tập (2009) sô'trang

0 02

m

ế ễ v h

P * ■

f %• .

; V

• ;

Ị * / é ,

ệ ^ *

• * Paracoccus sp. IN12

?3Ũ

] 000

1000

-Bãciỉíis subtiìis (FJ544 3SÕ!

- AnơenimvĩữbiKler clone (AB293367)

i Anjenmyrnhjcter dehnii-gi-.'U'S ! EF067314)

1N2

0.02

-Anaeromyxobacter sp FAcl2 (AJ504438)

A dehabgenans 2CP1 (HR027547)

—AnaeromyT&bacter clone (L‘Q394ỹ9ó)

-Bacúkỉs subtiíis (FJ5443S6)

588

—Paracoccus aminophiíus (D32239)
r-Parucoccus aminovonans (D3224Ũ)

■Paracoccus sp (AM939Ũ37)

1Ũ0õCị]V)12

-Panacữccus marinus (AB185959)

IParacoccus d em tn fica n s (/J288159) 
lũũõlParacoccus fcrooxydant (AY954687)

Hinh I. Hình thái tế bào và vị tri phân loại cùa hai chủng IN2 và IN 12. Hình thái tể bào được quan sát trẽn kính 
hiến vi quang học, độ phóng đại 1000 lẩn (đơn vị = 5 Ị.im). Cây phân loại được dựng theo phương pháp 
neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Kmii: trong trinh tự nucleotide. Các số hiên thị ớ các vị trí phân nhánh là kết quả 
phân tích bootstrap đơi với 1000 phép so sánh (chi có các giá trị trẽn 500 được trình bày trên hình). B. subtilis là

loài vi khuẩn được chọn làm outgroup.

3.3. N g h iê n ciiru h o ạ t tin h s in h h ọ c v à k h á n ă n g 
ứ n g d ụ n g c u a c h u n g v i k h u â n I N 12

Trong nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn 
khứ nitrate, oxy hoá Fe(ll) ờ Việt Nam, 
P a r a c o c c u s sp. vói đại diện là chủng IN 12 
chiếm ưu thé trong điều kiện nước ngọt [16]. 
Chủng vi khuân này thẻ hiện khá năng sinh 
trưởng trong nhiều đều kiện môi trường khác 
nhau như có mặt hay khơng có mặt oxy, thích 
nghi với nhiéu loại nguồn điện tứ khác nhau 
(như Fe(II), các axit hữu co, rưọu) và sinh 
trường tốt trong mơi trường có độ mặn dao 
động trong dải 0-3% (đặc trưng cho cả mỏi 
trường nước ngọt và nước lợ). Đây cũng là lý

do để chúng tôi tiến hành tìm hiểu khá năng

ứng dụng của chùng vi khuấn này trong việc 
loại bò nitơ và Fe(II) trong các nguồn nước 
thài õ nhiễm,

</div>
(63)<div class='page_container' data-page=63>

6 NT. Tuyên và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Cõng nghệ XX (2009) 0-0

0 1 2 3 4 5

Thời gian (ngây)

Hlnh 2. Loại bị Fe(ll) (•) vả NO," (■) trong môi

trường do tác động cùa chủng vi khuẩn IN ] 2.

Bên cạnh đó khà năng sử dụng Mn(II) làm
chất cho diện từ để khử nitrate cũng được kiểm 
tra, tuy nhiên chùng IN 12 không thề hiện sinh
trường rỏ rệt trong điều kiện nuôi cấy này. 
Theo một số nghiên cứu đã công bố, hoạt tính 
oxy hố M 11(11). khử nitrate bàng con đường
sinh học được xác định trong một số quẩn thể 
vi sinh vật ỏ đáy các thuỳ vực, nhưng cho đến 
nay chưa có chủng vi sinh vật nào đưọc phán
lập trong phịng thí nghiêm với hoạt tính kể
tren [! 9, 20].

4. Kết luận

Hai chủng vi khuẩn 1N2 và IN 12 đại diện 
cho hai nhóm tham gia chu trình chuyển hố

sắt tại một số mơi trường sinh thái khác nhau ở 
Việt nam, trong đó chủng IN2 tham gia khử 
Fe(ill) thành Fe(ll) bẩng các họp chất hữu cơ
và chùng 1N12 tham gia oxy hoá Fe(ll) thành
Fe(lll) bằng nitrate. Vai trò sinh thái cua hai 
chúng này được khãng định thông qua các đặc 
điềm sinh lý của chúng, cụ thể lả khá nãng sinh
trưởng với các chất cho và nhặn điện tử khác

nhau và mức độ sinh trường tại các nồng độ 
muối khác nhau trong môi trường.

So sánh trinh tự gần đù của gen 16S rADN
với các loài đã công bố trên GenBank cho 
B phép định danh hai chùng vi khuân này là
— Anaeromyxobacter sp. IN2 (mã trình tự đăng
£ ký trên GenBank là FJ939 ] 31) và Paracoccus
sp. IN 12 (mã trình tự đăng ký trên GenBank là
GU084390).

Với hoạt tính cao trong việc oxy hoá Fe(II)
và khử nitrate, chùng IN 12 có tiềm năng ứng 
dụng thực tế trong việc xử lý các nguồn nước 
nhiễm nitơ và ion kim loại Fe(II).

Lòi cảm ơn

Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sự hỗ 
trợ kinh phí từ đề tài ỌG.07.23. Tác già xin chân

thành cảm ơn Viện Vi sinh vật và Công nghệ 
sinh học, ĐHQGHN đã tạo điều kiện trong quá
trình thực hiện đề tải.

Tài liệu tham khảo

[1] H.L. Ehrlich, Geomicrobiology. 3'J Ed. revised

and expanded, Marcel Dekker Inc., New York,

1996.

[2] K.H. Nealson and D. Saffarini, Iron and 
manganese in anaerobic respiration: 
environmental significance, physiology and 
regulation, Annu. Rev Microbiol. 48 (1994) 
311.

[3] K..O. Konhauser, Bacterial iron 
biomineralisation in nature. FEMS Microbiol.

Rev 20(1997)315.

[4Ị K.L. Straub, M. Benz. B. Schink, F. Widdel 
Anaerobic. nitrate-dependent microbial 
oxidation of ferrous iron. Appl Environ.

Microbiol. 62(1996) 145

</div>
(64)<div class='page_container' data-page=64>

N.T. Tuyên và nnk./ Tạp chi Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ tập (2009) só trang 1

oxydationby anoxygenic phototrophic bacteria,

Nature 362 (1993) 834.

[6] D.R. Lovley, Dissimilatory Fe(Ill) and Mn(IV)

reduction, Microbiol. Rev. 55 (1991) 259.
[7] D.R. Lovley, Microbial Fe(lll) reduction in

subsurface environments, FEMS Microbiol

Rev. 20(1997)305.

[8] N. Treude. D. Rosencrantz, w. Liesack. s.

Schnell. Strain FAc12, a dissimilatory iron- 
reducing member of the Anaeromyxobac/er 
subgroup of Myxococcales, FEMS Microbiol.

Ecol. 44 (2003)261.

[9] K.L. Straub, B.E.E Buchholz-Cleven, 
Enumeration and detection of anaerobic ferrous 
iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from 
diverse European sediments. Appl. Environ

Microbiol 64 ( 1998) 4846.

[10] J. Marmur J, A procedure for the isolation of

deoxyribonucleic acid from microorganisms. J

Mol Biol 3 (1961)208.

[11] N Saitou. M. Nei. The neighbor-joining 
method: a new method for reconstructing 
phylogenetic trees. Mol Biol EraI 4 (1987) 
406.

[12] J. Felsenstein. Confidence limits on 
phyloeenies: an approach using the bootstrap.

Evolution 39 (1985) 783.

(1.1] Lê Đức, MỘI so phương pháp phân lich mõi

trường, NXB ĐHỌGHN, 2004.

[14] DIN 38406-E1 - ], German standard methods for 
the examination of water, waste water and 
sludge; cation (group E); determination of iron 
(El )~ 1983.

[15] P.G. Brewer, D.w. Spencer, American Sociaty 
of Limnology and Oceanography, Colorimetric 
determination of manganese in anoxic water, 16 
(1971) 107.

[16] Nguyễn Thị Tuyển. Đinh Thúy Hằng, Đa dạng 
vi khuân oxy hố Fe(ll), khứ N tại một số

môi trường sinh thái ớ Việt Nam, Tạp chí Cóng

nghệ sinh học, 2009 (sẩp đăng).

[17] J.p. Shapleigh, The Denitrifying Prokaryotes. 
In M. Dworkin, s. Falkow, E. Rosenberg, K.H. 
Schleifer, E. Stackerbrandt, eds. The

prokaryotes', an evolving electronic resource 
for the microbiological community, Springer-

Verlag, New York, 2000.

[18] G. Bitton, Wastewater Microbiology, Wiley- 
Liss, Inc. Toronto, Canada. 1999.

ỊI9] A.M. Gounot, Microbial oxidation and 
reduction of manganese: Consequences in 
groundwater and applications, l-'UMS

Microbiology Review 14 (1994) 339.

[20] J. Vandenebeele, D. De Beer, R. Germonpre. R. 
Van De Sande, w. Verstraete. Influence of 
nitrate on manganese removing microbial

consortia from sand filters. Hal Rex. l o t 29

(2) (1995) 579.

Study, bacteria o f the iron cycle that dominate in different

t 6:

environments in Vietnam

Nguyen Thi Tuyen1, Nguyen Minh Giang2, Dinh Thuy Hang

1 Department o f Biology,College ofSciences, Vietnam National University Hanoi, Ì34 Nguven Trai. Hanoi

■ Institute o f Microbiology andBiatechnnlogv, Vietnam National University Hanoi. 144 Xuan thuv. Hanoi

A b s t r a c t . T w o bacterial strains IN 2 and IN 12 w er e isolated from fresh water sediments and

represented for two major groups of the iron cycle in these environments, including the reduction of
Fe(lll) with organic compounds and oxydation o f Fe(II) with nitrate. These two strains possessed

</div>
(65)<div class='page_container' data-page=65>

8 NT. Tuyên và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ XX (2009) 0-0

of rod-shaped cells, grown strictly anaerobicaly with Fe(IH) or nitrate and best growth was observed at
the concentration of NaCI in the medium above 1%. Strain IN 12 was isolated from sediment of a fresh
water aquifer, contained oval cells that were facultatively anaerobic, grown best at the concentration of
NaCI in the medium in the range of 0 - 3%. Strain [N12 showed a high activity of Fe(ll) oxidation
with nitrate, therefore would have application potential in treatment of waters contaminated with
nitrogen and metal ion Fe(II). Sequencing of 16S rDNA and comparative alignment with database
allowed to designate these strains with the names Anaeromyxobucler sp. ]N2 (sequence number 
FJ939I31) and Paracoccus sp. IN 12 (sequence number GU084390).

</div>
(66)<div class='page_container' data-page=66>

V IỆ N K H O A HỌC V À CÔNG N G H Ệ VIỆT N A M

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Ban tổ chức Hội nghị Khoa học Tồn quốc về Sình thái

và Tài ngun sinh vật lần thứ 3

...0 O 0 ... ....

Ban tồ chức Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

ỉần thứ 3 đã nhận được bài poster:

'Đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại một

số môi trường sinh thái ở Việt Nam”

Của các tác giả:

Nguyễn Thị Tuyền

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quôc gia Hà Nội

Đỉnh Thúy Hằng

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quôc gia Hà Nội

Bài poster của các tác giả đã được biên tập và dự kiến sẽ trưng bầy tại Hội

nghị.

</div>
(67)<div class='page_container' data-page=67>

Đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(ll), 
khử nitrate tại một số môi trường

sinh thái ở Việt Nam

N g u y ễ n T h i T u y è n V B in h T h u y h t ịn g 1

'Đ»1 hoc Khoa hoe Tự nínén. Đai hoc Quốc gia Hâ NỘI

1 VHn Vi jmh vậl vi C6ng nghệ Sinh hoc. Đai hpc Quốc gia Hả NỘI

Mờ đẩu

Trong lự nhiện quâ lónh 0* y hôa F e (ll) ch âi rvhôn diện lừ kđ n tra ie chũ yéu
d i ễ n r a ở r a n h Q1Ớ1 h ié u k h i (Củ O xy) v ú k y k h i (K h ô o g c ó 0 * y ) ( /o n g ựjrọ tr á m (ic ti ở
đ é y c i c I h ũ y v ư c O x y t>òd F e ( H ) Kéi h o p vứ< K h ữ n i ir a te c ó t h í S ô n g v a i I rớ q u a n 
t r ọ n g i r o n g mộ< t r ư ơ n g 6 n h iê m vón n ơ n g đ ộ F e (ll> c a o ( ớ o tfi<éu Qxy) v à o ô n g d ỏ
m l r a i * c a o (ỜQ crtA l h ữ u c o tx p h â n H úy t a o t h a n ĩ i ) íV V ebe r e i a l 2 0 0 6 }
C i c I03J VI k r tu á n VỬ1 k h á n â n g t i é n h â n h p h á n ưr»fl 0 »¥ h o a h h ũ n ã y c o t h é C u n g
mơí luc Ih ư c mén đ irợ c ftai Íìíiiệm vụ. (0 crtuyẻo Fe<ll> rtòa la n troog nvrO-c vè
d a n g Fe<lll> k é l l ũ a . v á {a) lo ạ i b ố m i r a l e c rtu y Ể n I h ầ n h d a n g 
N-Q u â tr in h Dxy f i ổ a F e ( l l ) b a n g n i l r a t e d i ỉ n r a n h u - l a u

to Fe;‘ ♦ 2 NO,- * 24 H?0 - >OFe(OHj, 1 ♦ Nj I *9h;Ị

T r o n g n g r tiê n c ứ u n á y c t t u n g tỏ i t i ê n n à n h lir o h i i u l i n h d a <J«rig c ù a VI k h u i n k h ứ
nrtrale sừ đụny Fe(ll) là nguồn diện li/lífc mơi sổ mỗi Irưởng Sính Ihâi dai diện ờ 
V iệ t N a m

Sơ đồ thí nghiệm

c i y m lu
(tìu r OềỊ M Bun ỠArt rLi^r>9 ng ập nưcrc

Trim l< * V«A m/O c lơ)

ỉk r a n p
M o m t u

i MPN(F*tll)iTíO» * A c ru i« i 1

ũ (1

n w u h o n

* r * n o c C=I 1P h â r l*fi oKmg đ» <Ho 1 . PC R D G G £16S fO *tA 1 1 1MI

a ũ

1 APQRAì& SiONA 1 C « M r g ttv ^ 9 * 1
binh tự
rtA ngưng Ị

1 ũ

Kết quả và Thảo luận

số lượng té bào trong các mẫu ngmèn cửu

N íiin b<ếĩ w c o mai CUJ »1 tmuAn 
o>r to a FtlM j Iroog

f.*c 6*B thống Qua b>ếr\ dố»

m t u i i c c u a m ò' iro o f'S lư 1'ềTQ

»*nh (Fe>ii Mf>g vang r»Ju iF filii

S ố lưOi*^ «1 «»y K * 1 4H>1| hfHí
n 4i» le u c Oiríi Ihồng Qua P*^IOtìg ph*p
MPN Sị n /o n g 1* bâo 1 0: - 10* n ong đo
►i » /0 0 5 (♦ bao I'o ng n»i(* lự rư tn g ■»
n ự « >0 '

Nghiên ciru các nhóm vi khuản chièm ưu thé
bẳng PCR-DGGE

P h ố « *» 01 w *« tinh (D O G ỉ) ( M n K h 4 o # n i(3 
rONA eúa q uin Ihề ví tinh vặt Irong cAc ống

MPW cua c *c mếu r ^ iể n c w 
A - §0 fHrti rtọot. R - 8un chén i u V ị n ^ tỉ

<VỨC. 0 - Ệun dèm lích v«n b4 o

Ar>*r/vrr\, o b a tie ' (.vProớôoâ acớfd*j co

•nil Irorg ci } múi (lựong rvạniío (Ui

Ps»ưđtyn»viís P'0/Í0ti»cle''»>cnié»n u

iné (rong m iu b u " o c ^ ả n ruồng n g jp rx/

Đánh giá tinh đa dạng cùa các chùng đơn đâ phân lập
bàng ARDRA

0 ^ c**n rụoog T rim K lỉn u O c Son d*> »0
lu* * Ị Ìữ n ir tc w ^ (a^f\ ryỊM

P lú fl Itc h AROflA 8 *n 16S rũN A C M l ỉ cn u n g «1 fchuln o » y HOI Flrtilj. trtt/

rvlratc «ỈU t h t ir ly blng CMC eruyme J0 1 fun «1 Mtpl 'N1 ãã M I? Kỡ

n>ôv ô y a 12 pí\an <40 đưo< 'ự e*e mÌM ngr.itn c v v M Mame»

<• »2 ngh<r- ÍV I /M đ ư o t » tp v»» 5 r * n rr' di fiv»rè" ►*»ac n n a v '•"»! 4 i -ÍVVỊ o Vư-fệfì e#lu

thvxic *»0 đ • 'f>v n-k- OV' đ*v ni<fi >.v> 'V/OC lơ -,e< 1»^ ln*i da đv>a fi. trtjfin

c*0 ''*'4' '-<c ,r^a ti Dun díy 40 <a i*!Ập \a mk bu''efií'> ‘v-yig ''flit

</div>
(68)<div class='page_container' data-page=68>

K h á n à n g ứ n g d ụ n g của c h ủ n g Paracoccus s p IN 12

A B

::::

n

u

I

’ •

m

Pmữceu* *p I»1J
1 i

Tom *■« |Kf tyi

Hojrt tính oiy hị* khir nHr«4> ỊA) V* hkrrh lh*i 1« Mo cú* chu»9 «12

Kết luận

Ý Ỉ i lượng Ự1 U tuin 0«T F*<llị khư n4rM» Ironfl c t í rn iu bur> IÍH1 IKập ứ m úf w c 'KfOc n g ợ c tiín
rng nọ4fr n ư rx V* «v*fl «wơc <0 v*n b itn đư ơ c a < <íkV> nế*« Vong k hoảng 1 0 ’ »0* (rong dó
m iu txr> à thjkl >uộr«g n0l p nuO>c co t ổ l i M o »1 M 'uifl A tr c*0 rvyn CA (9 3 • lỡ ’ TD'fll

* V tU w in 01) h o t F•<r)> u > j n * |t ô !ã> cc <XềI IrOng n g ti^ n c ư u c o linh đa d«ng Kh* cỞO 12 chung
t o n p N n 4 3 tư CẬC m lu MPN đươc >(p «40 5 nhóm ARDSA »ư^*c níMư Iroog p h in (>C«1 tư đung n il 
'rxrtT* 9«1 nạn M#*m V* Ut4*

tPnftnlttft fftftrn pftftn loa> bịng c+n/png p n tp PCH OOGE ứị\ «01 0*n 16 S íONA cho m iy

4#wwom|rjo6*ct« It rré< bong nNfrnj r t w * OìArri ưu lh£ ca rritt d ò h t mối Kư eng 4rf»fi iru i
rtn, đỏng VN lí* M*p *k> cfxi lilrft tííụyln hc4 »4t lror>fl cầe mử« irưonọ nghiện cưu (nơoo Qua *h»
nấng K t i Irưứrtg k | tư* I f ỳ f Mill] Ké* hop vOi k tt ÍỊ\JÌ ngNt^n c ư u o í c th u n g đ o n pf»jn lip đ ư ơ c lư
E*c d*>9 m6* fiwO«9 r^i4n Cw tfi0 »M|P Paiicoccưt v» Pitưito^ửAii 4 hat nhom w fchuin chim
to re M « q u t líirth 0>r ho* f »{ll| kfx> n tia li lương ư n g dong v » Iro Quan do n g Iroog <ni (<uorvg ao
IW*C ng ôã c*4o luòng ng4p mrức

■>6*<fKx>s 4 » a ^ n t è l k ỉ IN? v i IN1?C0 I/»V> tư ọ t n l6 S rO N A c e a i <ưor\g dốnfl c * o v 9 ì eae loai VI

* n » u tw nynữ 4K *t ơ#u»ỈOQtnttrt (W%J P isu O e m e rtts tỉu i ỉở'1 |9 7 * > VI P »<Ko<tut
60 vẳy đưọc đ * lén h/ơl to A n* ũw rr\yiữ t>»cft *fi \ n ĩ P * iu 9o m o o tt H> >N7 v»

P tr tc ó c c u ta p M U

♦Cn^wni lÉ«*M*g*<Unjềrtajii*fiinến<}ưnQ<lyngnon9 v>*e «v ly c*c rtguổn nv/ừe riỊỊèm «W\4m

»é< «* n rlr«t

X Ỉ N C H Ấ N T H À N H C Ả M Ơ N

N jihu'n lU u n.it tlirữi. it<ựk h iê n "t»t> >ư h ỗ «|Ọ I m li I>hi lự .tè 1 . 1 1 n ' *ôã I.IV
ớôi 'UI ... rOiijiiiin.nl V4ằ Vi »11.1. 'ÔI V., I .1..^ I^j.i Milll l»Ov IUM .UN Ai
I9i>ằ]iộ>i Lifrii <!ô<ã> Im iti iliUv h ié n 'l è «.n

</div>
(69)<div class='page_container' data-page=69>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Đ Ề C Ư Ơ N G

Đ È T À I K H C N T R Ọ N G Đ I Ẻ M / Đ Ặ C B I Ệ T / C Ấ P Đ H Q G H N

Tên đề tài; Đ a dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khỉ ôxy hỏa sắt (II), khử nitrat

trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

Mã số:

QG. 07. 26

Chủ trì đề tài:

TS. Đinh Thúy Hằng

Cơ quan:

Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà nội

</div>
(70)<div class='page_container' data-page=70>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐỀ CƯƠNG

ĐỀ TÀI KHCN TRỌNG ĐIỂM/ĐẶC BIỆT/CÁP ĐHQGHN

1. Tên để tài

Tiếng Việt: Đ a d ạn g sinh học của v i khuẩn kỵ khỉ ôxy hoá sẳ t (II), khử nitrat trongm ột s ổ

môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng.

Tiếng A n h : D iversity o f anaerobic ferro u s iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in som e

ecological environments and their potential use.

2. Thòi gian thực hiện: 24 tháng (Bắt đầu từ tháng 5/2007 đến tháng 5/2009)

---

(■---3. Đe tài thuộc lĩnh vự c ưu tiên: Công nghệ sinh học mơi trường

4.

Đe tài có trùng vói một đe tài đã

hoặc

đang tỉen hành khơng?

Nêu có, nêu lý do

Để tài cỏ liên quan với đề tài Nghiên cứu cơ bản đăng ký thực hiện từ tháng 1 năm 2006 đến

tháng 12 năm 2007. V ới tiêu đề: “Nghiên cửu m ột s ổ nhỏm v i sinh vậ t tham g ia chu trình

chuyển hố nitơ và phospho trong môi trường ô nhiễm và khả năng ứng dụng của chúng

trong xử lý ô nhiễm m ôi trường", đề

tài nghiên cứu

cơ

bản

đăng ký thực hiện với B ộ

Khoa

học và Công nghệ tập trung nghiên cứu các nhóm vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong q

trình chuyển hố nitơ và phospho như ơxy hố ammonium thành NCV, ơxy hố N 0 2~ thành

NOj-, khử N 0 3" thành N

, tích luỹ phosphat dưới dạng polyphosphat trong tế bào. Trong các

qui trình xừ lý nước thải giàu chất hữu cơ ammonium được tạo ra nhiều do các hợp chất hữu

cơ, đặc biệt là protein bị phân huỷ. Khâu cuổi cùng trong việc loại bỏ các hợp chất nitơ trong

nước thải hữu cơ do vi khuẩn khử nitrat đảm nhiệm. Đây là các loài vi khuẩn sổng kỵ khỉ

hoàn toàn, sử dụng chất hữu cơ trong nguồn nước ô nhiễm để khử nitrat thành khí nitơ và

tích luỹ năng lượng.

</div>
(71)<div class='page_container' data-page=71>

5. Chủ trì để tài (K èm theo L ý lịch khoa học theo biểu m ẫu 02/K H C N /Đ H Q G H N )

- H ọ và tên: Đinh Thuý H ằ n g Nữ

- Năm sinh: ỉ 970

- Chuyên môn đào tạo: Vi sinh vật

- H ọc hàm, học vị: Tiến s ĩ

- Chức vụ: Nghiên cứu viên

- Đơn vị công tác:

Trụng tăm

Câng

nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội

- Đ ịa ch ỉ liên hệ: E2, 144 Xuân thuỷ - c ầ u giấy, H à nội

- Số điện

thoại:

9 Ỉ

10402;

Fax: 7547407;

Email:

Tóm tắt hoạt động nghiên cứu của chủ trì đề tài (Các chương trình, đề tài nghiên cứu

khoa học đã tham gia, các công trình đã cơng bố liên quan tới phương hưởng của đề tài)

Thời gian

Tên để tài/ cơng trình

Tư cách tham gia

Cấp quản lỷ/noi công bố

1/2006-12/2006

Nghiên cứu qui trình sản

xuất chế phẩm vi sinh dùng

trong nuôi trồng thuỷ sản. '

Chủ tri

Cấp Đại học Quốc gia

6/2006-6/2008

Nghiên cứu các nhóm vi

khuẩn tham gia chu trình

nitơ và phospho và khả năng

ứng dụng của chúng trong

xử lý ơ nhiễm mơi trường.

Chủ trì

Bộ Khoa học và Công nghệ

11/2005-nay

Quĩ gen Vi sinh vật

Thành viên tham

gia,

phụ

trách

nhóm Prokaryotes

Đê tài độc lập, Bộ khoa học

và Công nghệ

Tóm tắt hoạt động đào tạo sau đại học của chủ trì đề tài trong 5 năm trở lại đây

Thỏi gian

Tên nghiên cửu sinh

Tên hoc viên cao hoc

• •

. Cơ quan phối hựp và cộng tác viên chính của đề tài (ghi rõ các đơn vị và các cá

nhân đã được mời và nhặr\ ỉệil mờị ịham gia để tài, mỗi cả nhân tham gia Đe tài phải có

bản Lý lịch khoa học

biểu, mâu 02/KHCN/ĐHQGHN, và ý kiến xác nhận đồng ý

tham gia đồng thực hiện ti&ifiiho òếr.

TT

Cơ quan phổi^yp* ...

' 1

* ' l ? ’ 4 •

'

C i - k - i i , ' u b y t A ,

Cộng tác viên

Họ và tên

Chuyên ngành

</div>
(72)<div class='page_container' data-page=72>

Trung tâm CNSH

Nguyễn Thị Vân

Công nghệ sinh học

3

Trung tâm CNSH

Nguyên Thị Kim Quy

Vi sinh vật học

7. T h u yết m inh sự cần thiết hình thành d ự án

- Tổng quan c á c cô n g trình nghiên cửu tron g và ngoài nước liên quan tớ i vấn đề

nghiên cứ u

của

đ ề tà i

(trích dẫn những tài liệu mới nhẩt trong và ngoài nước)

Sắt là một trong những kim loại phổ biến nhất ưên trái đất. Thông thường sắt tồn tại ở

dạng ơxit sát (III) ít tan trong nước và có màu vàng. Trong môi trường pH trung tính,

dạng hồ tan trong nước (Fe2+) chỉ tồn tại ở điều kiện khơng có ơxy, ví dụ như ở đáy các

thuỷ vực, nơi ơxy hồ tan trong nước đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử dụng để phân huỷ

cốc hợp chất hữu cơ. Với hiệu điện thế ơxy hố khử Fe

+/Fe2+ tại pH 7 vào khoảng +200

mV, iông sắt (II) cỏ thể trở thành nguồn điện tử cho các q trình hơ hẩp kỵ khí, điển hình

là khử nitrat thành N

do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Benz và cộng sự, 1998).

Phản ứng ơxy hố khử do vi khuẩn thực hiện như sau:

10 Fe2+ +

NCV + 24 H

2 0

-►

1 0

Fe(OH)3ị + N

t+ 9 H2Í

Trong tự nhiên, q trình ơxy hố sất (II) với chất nhận điện tử là nitrat chủ yếu

diễn ra ở ranh gịới iiiếu khí (có ơxy) và kỵ khí (khơng có ơxy) trong lớp trầm tích ở đáy

các thuỷ vực. ơxy hố sắt (II) kết hợp với khử nitrat có thể đóng vai trị quan trọng trong

mơi trường ơ nhiễm với nồng độ Fe2+ cao (do thiếu ôxy) và NO

' cao (đo chất hữu cơ bị

phân huỷ tạo thành) (Weber và cộng sự, 2006). Các loài vi khuẩn với khả năng tiến hành

phản ứng ơxy hoả khử này có thể cùng một lúc thực hiện được hai nhiệm vụ, thứ nhất là

chuyển Fe2+ hoà tan trong nước về dạng Fe3+ kết tủa, và hai là loại bỏ NO

, chuyển thành

dạng N

không độc hại.

Vi khuẩn dùng iông sắt (II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrat được phân lập đầu

tiên tị các lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen, CHLB Đức năm 1996 (Straub và

cộng sự 1996). Một sổ cơng trình nghiên cứu tiếp sau cho thây sự có mật khá phổ biên

của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (

1 0 6

tế bào/g trầm tích) trong các điêu kiện

môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa

lý khác nhau trên thế giới (Straub và cộng sự, 1998). Các loài vi khuẩn phổ biến nhất

trong nhóm này được biết đến hiện nay là các loài thuộc chi Chromobacterium và

Klebsiella (Benz và cộng sự, 1998; Weber và cộng sự, 2006).

</div>
(73)<div class='page_container' data-page=73>

của Cftung trong việc phát triên chế phẩm sinh học để xử lý các nguồn thải đồng thời

nhiễm kim loại nặng và chất hữu cơ.

- L ý do ch ọn đ ề tà i

Tỉnh th ờ i s ự củ a đ ề tà i

Phân huỷ sinh học là một trong những biện pháp giải quyết ô nhiễm hữu hiệu đã được

kiểm chứng tại nhiều nơi trên thế giới. Yếu tổ quan trọng hảng đầu quyết định thành công

của biện pháp nàỵ thuộc vê các vi sinh vật có khả năng phân huỷ đặc biệt. Để cỏ thể cho

ra đời các sản phẩm sinh học làm sạch môi trường, trước tiên các nhà khoa học phải hiểu

rõ chưc nâng va cơ chc hoạt động của nhiêu nhóm vi sinh vật khác nhau, cũng như sự

phân bô của chúng trong môi trường ô nhiễm và không ô nhiễm. Mặc dù đỏng vai trị

khơng nhỏ trong chu trình chuyển hố vật chất ngồi tự nhiên nhưng các lồi vi khuẩn có

khả năng đùng Fe2+ để khử nitrat còn chưa được đề cập đến trong các nghiên cửu về vi

sinh vật, sinh-địa-hố hay mơi trường ờ Việt nam. Bên cạnh đó, các nghiên cứu đã công

bố trên thế giới mới chỉ đưa ra kết quả khảo sát về nhóm vi khuẩn này ở châu Âu với điều

kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nuởc ta. Do vậy, đề tài được đặt ra không những đề

cập đến một vấn đề còn chưa được nghiên cửu ờ Việt nam mà còn nhàm đem lại những

hiểu biết thêm về vi khuẩn ơxy hố Fe2+ để khừ nitrat cho khoa học nói chung.

Tinh cấp th iết đáp

ứng

nhu cầu p h á t triển kinh tế

- xã

h ội

Mục tiêu thứ hai của đề tài là tìm hiểu khả năng ứng dụng của các lồi vi khuẩn ơxy hố

Fe2+ để khử nitrat phân lập được từ các môi trường khác nhau ở Việt nam. Thông qua

phản ứng ôxy hoá Fe2+ thành Fe3+ và khử N

0 3

~ thành N2, các loài vi khuẩn này có khả

nãng loại bỏ NO

- và Fe2+ cỏ trong môi trường ô nhiễm. Hơn thế nữa, các loài vi khuẩn

phân lập được sẽ dùng để nghiên cứu thêm về khả nãng loại bỏ một số kim loại khác theo

cơ chế tương tự như đổi với sắt, ví dụ như chuyển Mn2+ tan trong nước thành Mn4+ kết tùa.

. Địa bàn tiến hành nghiên cứu (xã, huyện, tỉnh, vùng)

Hiểu biết thực tễ của tác giả về địa bàn nghiên cứu:

Mẩu để nghiên cứu đa dạng và phân lập vi khuẩn ôxy hoả Fe2+/khử N 0 3” sẽ được lấy ờ các

môi trường nước ngọt và nước lợ. Mầu môi trưởng nước ngọt là trầm tích ở đáy các hồ trong

địa bàn Hà nội hoặc chân ruộng lúa ngập nước ờ vùng ngoại thành quanh Hà nội; mẫu mơi

trường nước lợ là mẫu trầm tích ven biển tại vịnh Hạ long.

Tinh đại diện của địa bàn nghiên cửu:

</div>
(74)<div class='page_container' data-page=74>

theo tiêu chí mà để tài đã đặt ra.

9. Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cửu vả so sánh đa dạng sinh học của vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử N 03' tại một sổ

môi trưởng sinh thái khác nhau.

Phan lạp cac nhom VI khuan đại diện, chiêm đa sô trong mỗi loại môi trường sinh thái và

nghiên cửu các đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá của chúng.

- Nghiên cửu khả năng ứng đụng các chủng vi khuẩn phân lập được vào việc kết hợp loại

bỏ Fe2+, Mn2+, NO

" trong mơi trường ơ nhiễm.

10. T óm tắ t nội dung nghiên cứu của đề tài

- Mầu trầm tích ở đáy hồ, mẫu đất ờ ruộng lúa ngập nước và mẫu trầm tích ven biển sẽ

được lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ơxy), đưa về phịng thí nghiệm

và giữ ở 4 °c cho đến khi tiến hành phân tích vi sinh vật.

-

Số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử NO

' sẽ dược xác định theo phương pháp MPN

(Most Propable Number) trong môi trường địch thể chứa Fe2+ làm nguồn điện tử và NO

-

là chất nhận điện tử trong điều kiện kỵ khí hồn tồn. Thành phẩn khống cùa môi

trường dảm bào tương ứng với môi trường sinh thái tại địa điểm lấy mẫu.

- Đa dạng về thành phần loài trong các mẫu khác nhau sẽ được xác định thông qua phương

pháp sinh học phân tử, tách ADN tổng sổ trực tiếp từ các lơ thí nghiệm ở nồng độ pha

loãne khác nhau trong dãy MPN và phân tích tính đa dạng cùa một đoạn gen 16S rARN

của tập đoàn vi sinh vật thu được trong mỗi lô bàng phương pháp PCR/DGGE.

- Các chủng vi khuẩn ôxy hoá Fe

7khử N 0 3~ dại diện, chiếm đa số tại mỗi địa điểm lẩy

mẫu sẽ được phân lập từ ống pha lỗng cao nhất có vi sinh vật phát triển của dãy MPN

bằng phương pháp ống thạch bán lỏng.

- Các chủng vilchuẩn phân lập sẽ được nghiên cứu về đặc điểm sinh lý sinh hoá và phân

loại dựa trên trình tự 16S rADN. Kết quả của nghiên cứu này sẽ làm cơ sở để tuyển chọn

các chủng có hoạt tính sinh học (khả năng chuyển hóa Fe2+ và N 0 3“ ) cao và nghiên cứu

khả năng ứng dụng của chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe2+, Mn2+, N 0 3“ trong môi

trường ô nhiễm.

11. Các chuyên đề nghiên cứu dự kiến của đề tài (ỉẽn và nội dung cùa từng chuyên đề)

1. Nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử N 0 3" trong một sổ môi trường

sinh thải khác nhau.

</div>
(75)<div class='page_container' data-page=75>

trong lỉnh vực môi

mvc tiêu nghiên cứu

3. Tim hiểu khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩrTphanlạịrđ—

trưởng.

Ọc

12. Câu trúc dự kiến báo cáo kêt quả của đê tài (chi tiế th ^ á lả ^ k ^

—---1.

T ổng q u a n tà i liệu:

về vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/ khử NCV và đưa ra^

mục)

2. Vật liệ u và p h ư ơ n g p h á p d ù n g tro n g nghiên cửu:

- Kỹ thuật lấy mẫu kỵ khí và bảo quản mẫu.

Kỹ thuật lây mâu kỵ khí và bảo quản mẫu.

Các phương pháp vi sinh vật: phân lập và nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí định lượn

• kh ẩ

băng phượng pháp MPN, nghiên cửu các đặc tính sinh lý cùa v s v (điều kiện s h trườn

tAi tm ntiA /"*<■* oViát tkí/ili °

mã hóa 16S rARN.

- Các phương pháp phân tích hố học: phân tích một số yếu tố sinh địa hóa trong mơi

trường, đo nồng độ Fe

+/Fe3+ và NO

- trong các thí nghiệm với vi sinh vật

3. K ế t qu ả và thảo luận:

- Xác định số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khừ N 0 3~ thông qua phương pháp MPN

- So sánh đa dạng của nhỏm vi khẩn này tại các địa điểm lấy mẫu khác nhau thông qua

phương pháp PCR/DGGE đoạn gen 16S rARN.

- Phân lập các chủng vi khuẩn đại điện.

- Phân loại các chủng vi khuẩn phân lập được.

- Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được.

- Khả năng ứng đụng cùa các chủng vi khuẩn phân lập được.

4. Kết luận,

s. Kiến nghị

6. Tài liệ u th a m khảo.

13. Tính đa ngành và liên quan của đê tài

Với nội dung đề ra như trên, đề tài sẽ sử dụng chủ yếu các kiến thức về vi sinh vật học, sinh

học phân tử vả công nghệ môi trường.

14. Phương pháp luận và phương pháp khoa học sử dụng trong đe tài

Các vấn đề đặt ra trong khuôn khổ của đê tài được giải quyêt thông qua các phương pháp vi

sinh vật học truyền thống kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử tiên tiến

</div>
(76)<div class='page_container' data-page=76>

Đề tài sẽ được thực hiện trong điều kiện trang thiết bị và cơ sờ vật chất hiện cỏ của Trung

tâm Cồng nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội, đặc biệt là các trang thiết bị của phòng

Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật.

16. Khà năng hợp tác quoc te

- Đề tải cô sự trợ giúp cổ vấn khoa học từ viện Max Planck Vi sinh vật biển Bremen CHLB

Đức và Viện Kỹ thuật & kiểm tra chất lượng Quốc gia (NITE) Nhật bản.

17. C ác h o ạ t động nghiên cứu của đe tài

- Nghiên cứu lý thuyết: tổng quan tài liệu về vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử N 0 3'

- Điêu tra khảo sát: xác định sô lượng và đa dạng vê thành phần loài của vi khuẩn ơxy hố

Fe2+/khử N 0 3“ trong các môi trường sinh thái khác nhau.

- Viết báo cáo khoa học: đưa ra bức tranh tổng quát về sự phân bổ của vi khuẩn ơxy hố

Fe2+/khử NO

” trong tự nhiên và vai trị của chúng trong chu trình chuyển hoá vật chất

- Nghiên cứu khả năng ứng đụng các chủng vi khuẩn phân lập được từ đề tài vào việc loại bỏ

Fe2+, NO

- và Mn2+ trong môi trường ô nhiễm

18. Kết quả dự kiến

18.ĩ K ê t qu ả k h o a học

- Có khả năng bổ sung các lồi vi khuẩn mới cho khoa học ở Việt nam và thế giới

- Dự kiến sẽ công bổ kểt quả nghiên cứu thu được từ đề tài trong 2 bài báo khoa học

18.2 Kết quả ứng dụng

- Các kết quả điều tra và đánh giá thu được từ đề tài sẽ làm cơ sở khoa học cho việc phát

triển sinh phẩm làm sạch ô nhiễm môi trường.

- Các chủng vi khuẩn thu được ừong đề tài nhiều khả năng là nguồn nguyên liệu để phát

triển sinh phẩm.

18.3 Kết quả đào tạo

- Số cử nhân được đào tạo trong khuôn khổ của đề tài:

0 1

- Số thạc sĩ được đào tạo trong khuôn khổ của đề tài:

0 1

18.4 Kết quả về tăng cường tiềm lực cho đơn vị

- Thông qua đề tài các cán bộ tham gia sẽ có cơ hội củng cô kỹ năng làm việc với nhỏm vi

sinh vật kỵ khí tiếp cận với các phương pháp sinh học phân tử tiên tiến dùng trong nghiên

cứu đa dạng, sinh thái và phân loại vi sinh vật.

19 Nội dung và tiến độ thực hiện cùa đề tài (các cơng việc cân triêrì khai, thời hạn thực

hiện và sản phẩm đạt được)

</div>
(77)<div class='page_container' data-page=77>

TT

Hoạt động nghiên cứu

Thời gian thực hiện

Sản phẩm

khoa học

Từ thảng

Đến tháng

Thu thập và viét tổng quan tài liệu

1/2007

3/2007

Tông quan tài

liệu

Xây dựng để cương nghiên cứu chi tiết

2/207

3/2007

Đê cương KH

Chuyên đê 1: Nghiên cứu sự đa dạng của

vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/ khử N O f trong

một số môi trường sinh thái khác nhau.

Chuyên để 2: Phân lập, phân loại và

nghiên cửu đặc điểm sinh lý sinh hoả của

các chủng vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/ khử

NOj" từ một số môi trường sinh thái khác

nhau ở Việt nam.

Chuyên đề 3: Tìm hiểu khả năng ứng

dụng của các chủng vi khuẩn 'phân lập

được trong lĩnh vực môi trường.

3

Lây mâu, đặt thí nghiệm, xử lý kêt quả

3/2007

9/2008

Chuyên đê 1: Nghiên cứu sự đa dạng của

vi khuẩn ơxy hố Fe2+/ khử N 0 3~ trong

một sổ môi trường sinh thái khác nhau.

4/2007

10/2007

Báo cáo chuyên

đề, viết

bài

báo khoa học

Chuyên đề 2: Phân lập, phân loại và

nghiên cứtr-đặc điểm sinh lý sinh hoá của

các chủng vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/ khử

N 0 3' từ một sổ môi trường sinh thái khác

nhau ờ Việt nam.

10/2007

4/2008

Báo cáo chuyên

đề, viết

bài

báo khoa học

C h u y ê n đề

3: Tìm hiểu khả năng ứng

dụng của các chủng vi khuân phân lập

được trong lĩnh vực môi trường.

4/2008

8/2008

Xừ ]ý kêt quả

8/2008

9/2008

4

Viết báo cáo các chuyên đê

8/2008

9/2008

Hoàn chinh các

báo cáo chuyên

đề

</div>
(78)<div class='page_container' data-page=78>

5

Bổ sung số liệu/thử nghiệm/ứng dụng

9/2008

11/2008

Tống kết số liệu

11/2008

12/2008

Viêt báo cáo tông hợp

11/2008

12/2008

Hội thảo lân ci

Hồn thiện báo cáo

7

Nộp sản phẩm

11/2008

12/2008

Nghiệm thu để tài

1/2009

20. Phân bo kỉnh phí (Tưỳ theo đặc điêm chuyên môn của từng đề tài, các mục/tiểu mục

trong bảng sẽ có những thay đổi cho phù hợp)

TT

Nội dung

Kinh phí

Năm thử 1

Năm thử 2

1

Điểu tra khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu

12 000 000

Th khốn cơng lao động trong nước

1 2 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0

2

Thuê, mua săm trang thiêt bị, nguyên vật liệu

14 500 000

Mua vật tư, hoá chât dùng cho chuyên môn

14 500 000

3

Chi khác

3 500 000

Mua văn phòng phâm

500 000

In

ân,

photocopy

500 000

Q uản lý phí 3 000 000 3 000 000

4 T ông kinh phí

30 000 000

21. Tài liệu tham khảo để viết đề cương

- Tài liệu tiếng Việt

. Báo cáo khoa học. Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà nội 1999. Nhà xuât

bản Khoa học và Kỹ thuật.

2. Bộ khoa học công nghệ và môi trường. Tuyển tập các báo cáo khoa học tại hội

nghị mơi trường tồn quốc, năm 1998. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

- Tài liệu tiến g A n h

1 K L Straub M. Benz, B. Schink, F. Widdel. Anaerobic, nitrate-dependent

m icro b ial oxidation o f ferrous

iron.

A p p lied a n d E nvironm ental M icrobiology

(1996). 62: 1458-1460.

2 M Benz A. Brune, B. Schink. Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at

neutral

p H by chem oheterotrophic nitrate-reducing bacteria. Archives o f

</div>
(79)<div class='page_container' data-page=79>

3. K.L. Straub and B.E.E. Buchholz-Cleven. Enumeration and detection of anaerobic

ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments.

Applied and Environmental

M icrobiology

(1998) 64: 4846 - 4856.

4. J.M. Senko, T.A. Dewers and L.R. Krumholz. Effect of oxidation rate and Fe(II)

state on microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation.

A p p lied

Environmental Microbiololy (2005), 71: 7172-7177.

5. K. A. Weber, J. Pollock, K.A. Cole, S.M. O’Connor, L.A. Achenbach and J.D.

Coates. Anaerobic nitrate-dependent iron (II) bio-oxidation by a novel

lithoautotrophic betaproteobacterium, strain 2002. Applied and Environmental

Microbiology (2006), 72: 686-694.

6. K.A. Weber, M.M. Urrutia, P.F. Churchill, R.K. Kukkadapu and E. E. Roden.

Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment Microorganisms.

Environmental Microbiology (2006), 8: ỈOO-Ỉ13.

7. K. Zengler, 2000. Anaerobic, nitrate-dependent utilization of hydrocarbons by

marine members of the alpha and, gamma subclass of Proteobacterỉa.

Luận vãn

Tiến sỹ, Đại học Bremen, CHLB Đức.

Ngày 26 thảng 01 năm 2007

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

Đinh Thuý Hằng

Ngày 'ỉ tháng

năm 2007

THÙ TRƯỞNG ĐƠN VỊ

</div>
(80)<div class='page_container' data-page=80>

L U

---Số-stfâl

/KHCN

CỘNG HÒA XẢ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT

n a m

'

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày ũẫ. tháng 5 ” nâm 2007

QUYẾT ĐỊNH CỬA GIÁM

Đ ố c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Về vỉệc phê duyệt danh mục đé tài đăc biệt cấp ĐHQGHN năm 2007

củá Trung tầm Công nghệ Sinh học

GIÁM ĐỐC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Căn cứ Nghị định số 07/2001/NĐ-CP ngày

tháng 2 năm 2001 của Chính phù về Đại học

Quốc gia;

Căn cứ Quyết định số 14/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng 2 năm 2001 của Thủ tướng Chính phủ

về việc tổ chức lại Đại học Quốc gia Hà Nội;

Căn cứ vào Quy chế Tổ chức và Hoạt động của Đại học Quốc gia được ban hành theo Quyết

định số 16/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng 2 năm 2001 của Thủ tướng Chính phủ;

Căn cứ Hướng đẫn số 973/KHCN ngày 19/3/2007 của Giám đốc ĐHQGHN về “Quản lý

các đề tài khoa học và công nghệ ở ĐHQGHN";

Theo đề nghị của Hội đồng ngành/liên ngành và Ông Trường Ban Khoa học - Công nghệ,

ĐHQGHN.

Điều ỉ : Phê duyệt danh sách đề tài đặc biêt cấp ĐHQGHN nẫm 2007 của Trung tâm Công

nghệ Sinh học (Phụ lục kèm theo).

Điều 2 : Kinh phí của các đề tài đặc biệt nói trên sẽ được chuyển vào tài khoản của Trung

tâm Công nghệ Sinh học.

Điều 3: Giám đốc Trung tâm Cơng nghệ Sinh học có trách nhiệm:

- Lập hội đổng thẩm định để cương đối với các đề tài có mức kinh phí 100 triệu đồng.

- Ký hợp đổng với chủ nhiệm đề tài sau khi có đề cương chi tiết đã được ĐHQGHN phê duyệt.

- Cấp kinh phí cho chủ nhiệm đề tài theo Quyết định này.

- Theo dõi và quản lý việc triển khai thực hiện đề tài; Đánh giá tiến độ và chất lượng triển

khai đề tài sau

năm thực hiện.

- Báo cáo lãnh đạo ĐHQGHN và đề xuất kiến nghị cho phép đề tài tiếp tục hoặc đình chỉ

việc nghiên cứu tiếp tục năm 2008.

Điểu 4 : Ông Chánh Vãn phịng, ơng Trưởng Ban Khoa học - Công nghệ, Giám đốc Trung

tâm Công nghệ Sinh học và chủ nhiệm đề tài có trách nhiệm thi hành quyết định này.

QUYẾT ĐỊNH

</div>
(81)<div class='page_container' data-page=81>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

* * * Độc lập - Tự do — Hanh phúc

Đơn vị: Trung tâm Công nghệ Sinh học = = = = = = = = =

Số: /HĐ-KHCN

HỢP ĐỒNG THỰC HIỆN ĐẺ TÀI KHCN CỦA ĐHQGHN

(DÀNH CHO CÁC ĐÊ TÀI ĐẶC BIỆT, CẤP ĐHQGHN, NCCB, CÁP c ơ SỞ)

• Căn cư quyet đinh so 1562/KHCN ngày 02 tháng 05 năiĩỉ 2007 củâ Giám đốc Đậi học Quốc gia

Hà nội về việc thành lập đề tài và bổ nhiệm chủ nhiệm đề tài NCKH cấp ĐHQGHN.

- Căn cư vào bản dê cương nghiên cứu của đê tài mã số QG.07.26 và số kinh phí đã được phê
duyệt.

Chúng tơi gồm:

Bên giao (Bên A, đơn vị chủ ữì): Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Đại diện: TS. Dương Văn Hợp

Chức vụ: Giám đốc

Bên n h ận (Bên B, chủ trì đề tài): TS. Đinh Thúy Hằng

Đom vị công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Điện thoại: +4 911 04 02

Là chủ nhiệm để tài NCKH của ĐHQGHN, mã số QG.07.26

Hai bên thỏa thuận như sau:

Điều I : Bên B chịu ưách nhiệm tổ chức triển khai các nội dung nghiên cứu ừong năm 2007 - 
2009 cụ thể dưới đây:

- Nghiên cứu sự đa dạng cùa vi khuẩn ồxy hỏa Fe2+/khừ N O 3 ' ữong một số môi trường sinh
thái khác nhau ở Việt nam.

- Phân lập, phân loại và nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chùng vi khuẩn ơxy
hóa Fe2+/khử N o r đại diện.

- Tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn phân lập được trong lĩnh vực môi
trường.

Điều 2: Bên B nộp cho bên A các sản phẩm khoa học theo nội dung và tiến độ thực hiện cùa đề 
tài theo 2 đợt: đợt 1 trước ngày 01/06/2008 và đựt 2 trước ngày 01/06/2009.

Đợt 1: Báo cáo tiến độ

Đợt 2: Báo cáo nghiệm thu vả các sản phẩm cùa đề tài (theo đề cương)

Điều 3: Kinh phí cùa đề tài:

</div>
(82)<div class='page_container' data-page=82>

— l±J —

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT

n a m

'

Độc lập - Tự do - Hanh phúc

S Ố ^ a / K H C N

Hà Nội, ngấyŨẴ. tháng

5*

năm 2007

QUYẾT ĐỊNH CỦA GIÁM

Đốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

v ể việc phê duyệt danh mục để tài đặc biệt cấp ĐHQGHN năm 2007

củá Trung tám Công nghệ Sinh học

GIẮM ĐỐC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Căn cứ Nghị định số 07/2001/NĐ-CP ngày 1 tháng 2 năm 2001 của Chính phù về Đại học

Quốc gia;

Căn cứ Quyết định số 14/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng 2 năm 2001 của Thủ tướng Chính phủ

vé việc tổ chức lại Đại học Quốc gia Hà Nội;

Cản cứ vào Quy ch ế Tổ chức và Hoạt động của Đại học Quốc gia được ban hành theo Quyết
định số 16/2001/QĐ-TTg ngày 12 tháng 2 năm 2001 của Thủ tướng Chinh phủ;

Căn cứ Hướng dẫn số 973/KHCN ngày 19/3/2007 của Giám đốc ĐHQGHN về “Quản lý

các

để

tài khoa học và công nghệ ở ĐHQGHN” ;

Theo để nghị của Hội đổng ngành/liên ngành và ồ n g Trường Ban Khoa học - Công nghệ,
ĐHQGHN.

Điều 1 : Phê duyệt danh sách đề tài đặc biệt cấp ĐHQGHN năm 2007 cùa Trung tâm Công

nghệ Sinh học (Phụ lục kèm theo).

Điều 2: Kinh phí của các đề tài đặc biệt nói trên sẽ được chuyển vào tài khoản của Trung

tâm Công nghộ Sinh học.

Điểu 3 : Giám đốc Trung tâm Cồng nghệ Sinh học có trách nhiộm:

- Lập hội đồng thẩm định đề cương đối với các đề tài có mức kinh phí 100 triệu đổng.

- Ký hợp đồng với chủ nhiệm đề tài sau khi có đề cương chi tiết đã được ĐHQGHN phê duyệt.

- Cấp kinh phí cho chủ nhiệm đề tài theo Quyết định này.

- Theo dõi và quản lý viêc triển khai thực hiên đề tài; Đánh giá tiến độ và chất lượng triển

khai đề tài sau

năm thực hiện.

- Báo cáo ỉãnh đạo ĐHQGHN và đề xuất kiến nghị cho phép đề tài tiếp tục hoặc đình chi

việc nghiên cứu tiếp tục năm 2008.

Điêu 4 : Ơng Chánh Vãn phịng, ông Trưởng Ban Khoa học - Công nghệ, Giám đốc Trung

tâm Công nghê Sinh học và chủ nhiộm đề tài có trách nhiệm thi hành quyết định này.

QUYẾT ĐỊNH

</div>
(83)<div class='page_container' data-page=83>

Đại học Q uốc gia Hà Xôi

DANH SÁCH ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT ĐUỢC PHÊ DƯYỆT NĂM 2007
(Kèm theo quyết định số 4S6& /KHCN ngày QÍL tháng 5"năm 2007)

Đơn vị kinh phí: triệu đồn

TT Mã sơTTẻn đề tài/Chủ trì Tổng

kinh phí

Kinhp
2007

1. QG.07.23

Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí oxy hố sắt 2, khử nitrat trong
các môi tnrờng sinh thái khác nhau và khả năng ứng dụng của chúng
TS. Đinh Thúy Hằng

60 30

2. QG.07.24

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả nãng phân huỷ độc tố của
một số chủng Microcystis phân lập ở hổ Hoàn Kiếm, Hà Nội

TS. Nguyễn Thị Hoài Hà

100 50

</div>
(84)<div class='page_container' data-page=84>

Đ ẠI H Ọ C QƯÓC GIA HÀ NỘI CỘNG HÒA X Ã HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

--- M A - — —

Độc lập — Tự do - Hạnh phúc

Đ on vị: Trung tâm Công nghệ Sinh học = = = = = = = = =

Sổ: /HĐ-KHCN

HỢP ĐỎNG T H ự C HIỆN ĐÈ TÀI KHCN CỦA ĐHQGHN

(DÀNH CHO CÁC ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT, CẤP ĐHQGHN, NCCB, CẮP c ơ sở)

- Căn cứ quyết định số 1562/KHCN ngày 02 tháng 05 năm 2007 của Giám đốc Đại học Quốc gia

Hả nội về việc thành lập đề tài và bổ nhiệm chù nhiệm đề tài NCKH cấp ĐHQGHN.

- Căn cứ vào bàn đề cương nghiên cứu của đề tài mẵ số QG.07.26 và số kinh phí đã được phê

duyệt.

Chúng tơi gồm:

Bên giao (Bên A, đơn vị chủ ừì):

Trung tâm Cơng nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Đại diện:

TS. Dương Văn Hợp

Chức vụ: Giám đốc

Bên nhận (Bên B, chủ tri đề tài):

TS. Đinh Thúy Hằng

Đơn vị công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Điện thoại: +4 911 04 02

Là chủ nhiệm đề tài NCKH của ĐHQGHN, mã sổ QG.07.26

Hai bên thỏa thuận như sau:

Điều ỉ : Bên B chịu trách nhiệm tổ chức triển khai các nội dung nghiên cứu trong năm 2007 - 
2009 cụ thể dưới đây:

Nghiên cửu sự đa dạng của vi khuẩn ơxy hóa Fe2+/khử NO3- trong một số môi trường sinh
thái khác nhau ờ Việt nam.

- Phân lập, phân loại và nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa cùa các chùng vi khuẩn ơxy

hóa Fe /khừ NOj đại diện.

-

Tỉm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn phân lập được trong lĩnh vực môi

trường.

Điều 2: Bên B nộp cho bên A các sản phẩm khoa học theo nội dung và tiến độ thực hiện của đề 
tài theo 2 đợt: đợt 1 trước ngày 01/06/2008 và đợt 2 trước ngày 01/06/2009.

Đợt 1: Báo cáo tiến độ

Đợt 2: Báo cáo nghiệm thu và các sản phẩm của đề tài (theo đề cương)

Điều 3: Kinh phí cùa đề tài:

</div>
(85)<div class='page_container' data-page=85>

- Kinh phí năm 2007 - 200«: 30 000 000 (Ba mươi triệu đồng).

- Kinh phí năm 2008 - 2009:30 000 000 (Ba mươi triệu đồng).

Kinh phí nảy bao gồm những khoản đổng góp nghĩa vụ theo qui định hiện hành của Nhà nước.

Sổ kinh phí này chủ trì đề tài sỗ nhận tại Phịng Tài vụ của đơn vị.

Điều 4: Bên B có trách nhiệm chi tiêu kinii phí được cấp theo đúng mục đích, đúng ché độ tài

chính hiện hành và quyết tốn vói phồng tài vụ, chậm nhất trước n g à y ...

Điều 5ỉ Hai bên cam kết thực hiện đúng các điều khoản đã được ghi trong hợp đồng. Trong quá

trình thưc hiện hợp đồng, hai bên phải thông báo cho nhau những vấn đề nảy sinh vả cùng nhau
bàn bạc giải quyết.

Điều 6: Hợp đồng này làm thành 4 bản, Bên A giữ 2 bàn, Bên B giữ ỉ bàn, 1 bản gửi đến Phòng

Tài vụ cơ quan.

Hà nội, ngày 14 tháng 5 năm 2007

ĐẠI DIỆN BÊN B

</div>
(86)<div class='page_container' data-page=86>

Đ ẠI H Ọ C Q U O C G IA H A NỤ1

Vỉện VI sinh vật và Công Bghệ *áni» học

CỘNG HOÀ XẢ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

PHIẾU ĐỀ NGHỊ

THAY ĐỔI TRONG QƯÁ TRÌNH THựC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN CỦA ĐHQGHN

1. Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khí ôxy hoả sẳt (II), khử nitrat trong một sổ

môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng cùa chủng

2. Mă số đề tài:

QG.07.26

3. Chủ tri đề tài:

TS. Đinh Thúy Hằng

4. Cơ

quan

chủ trì:

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội

5. Những thay đổi về tiến độ, thời gian nghiên cứu:

Xỉn lui lai thời gian nghiệm thu đề tài 4 tháng (từ tháng 6/2009 sang tháng 10/2009) do chủ trì

đề tài nghỉ gián đoạn 4 tháng (từ 9/2008 đến hểt tháng 12/2008) theo chế độ của nhà nurớc

dành cho Đà Mẹ và ừẻ sơ sinh.

ố. Những thay đổi khác:

- Xin rút không đăng ký hưởng dẫn sinh viên làm khoá luận tốt nghiệp do đối tượng nghiên

cửu là vi khuẩn kỵ khí địi hỏi kỹ năng thí nghiệm cao và thời gian dài, khó phù hợp với loại

hình đào tạo này (đã đề xuất trong báo cáo tiến độ giữa kỳ tháng

năm 2008).

- Hoạt động khoa học thay thể: gửi bài tham gia hội nghị khoa học quốc gia về sinh thái và tài

nguyên sinh vật.

Ngày thảng năm 2009

Ngày ì/ tháng ) nám 2009

Ngày 18 tháng 3 năm 2009

C ơ quan chủ quản duyệt Cơ quan chủ tri Chủ nhiệm đe tài

</div>
(87)<div class='page_container' data-page=87>

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - T ự d o - Hạnh phúc

BIÊN BẢN HỌP

HỘI ĐỒNG KHOA HỌC NGHIỆM THU CAP c ơ SỞ

ĐẾ TÀI ĐẶC BIỆT CAP ĐHQGHN MÃ số : QG.07.23

1.Tin đ é tài:

Đa dạng sinh học của vi khuẩn kị khí oxy hóa sắt

n,

khử nitrate trong 1 số môi trường sinh

thái và khả năng ứng dụng của chúng

2. Chủ trì: T $ , &ĩ'ỵUL

3. Q uyết định th ành lậ p H ộ i đ ồn g K h oa h ọ c

nghiệm thu đề tài số 149 /QĐ-CNSH ngày

23 tháng 10

năm 2009

4. Ngày họp H ộ i đồng: 28/1012009

5. Danh sách các th àn h viên của H ộ i đồng:

1. TS. Dương Văn Hợp
2. TS. Lê Thu Hiền

3. TS. Nguyễn Huỳnh M inh Quyên

4. TS. Đào Thị Lương

5. TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
6. TS. Nghiêm Ngọc Minh
7. TS. Nguyễn Thị Hoài Hà

Chủ tịch Hội đồng
Phản biện 1

Phản biện 2
Thư ký
ủ y viên
ù y viên
ử y viên

Có

mạt; Ỷ

người

b.

Vắng m ặt

0

ngưòi

6. người trình b à y báo cáo:

Họ và tê n - 7 S t W i TLi. >.'ij

7. K ết q u ả đánh g iá :

Sô phiêu phát ra:

Số phiếu hợp lệ:

7-Kết quả: -ffí

</div>
(88)<div class='page_container' data-page=88>

8. Tháo luận của Hội đồng

-

7 $ .

Ì^Cị\u.yCrỉ t h iy iĩỉì ki n\t} C\

I U |

'ì) dec

✓ A ù / ;

M\a7viị Ìàtì

Hu ì d (>\*Ị á c \ t \ h <\ <^y3 fc ít' J

- C ^ v u ' K t / i H-D >vìiA (Or/j

' Ì ^

i

Í

i

/

ị

I r u ~ r t K ' ừ \ .

~ *7~ s . -0 » » \./j ^ / u ì t / ) /vny i'l n t? Ă ĩ

N

K a o X í ' f G<Uy H ũ ỉ

doxjj

— Ị)

I

\ A o b t £ * ; i ,

Till

T A l t f C o

-V* i ) ỉ f r \ . ị t o Y O u ị Í i i O I C Ìk-c s\ c v a h < r ) C í K O

+ 'Ỵĩửr^Ị ỢítCi n <4 à y

W\n ỵj f i n

•+ í \ ĩ c I f ^ w < . K ( - i í " i r u Ậ} C i i f í ^ u o n Ậ i \ f i . n h 1 c 1 r a i . 1\ Ĩ > I ít / i

J ,

ơ

>

J

'WC \Ắ

vi '1 O . U u

A

m

‘V T Ai

,

, , ..

• l \ U v f z . 7- i t A c £ A 0 ^ + Í V | ũ Oi-.-) (■•Ki ỷi > f ^ir>*

</div>
(89)<div class='page_container' data-page=89>

V c . c L ^ .ís ^ A n (VC,,

C í l c < v í v ^ i ; _ \ / ị £ C Ỵ ( _J ự a ( I I I ) á <\ ể à J c . { M J y ^ o i y

l<^ n ù ó c 7 e ù c l * f c f i i a o ' n K o i ) V ' / C / Ui y 7

)<^L . H o rT u -H''-A*Wt sCi.t2x.-f 9 A t >1 ^ 1' * ->J '.'ii fV *? .'Vi

PJuih it*iTíJ

i

T S' A/'juiyio ^ i ‘*y»i/> /Iíim6

+■ C o VỊ IV (virf* if/. , ^ j n (. w \ "KvvvC A ôã i) r ( I.

4 / ^

■4 ICiTf ^ I f i c-v i\ + k r \ i L l ; - I* /- <r. > r,t<- u ù ' r lIIIV. * y ' ' ỹ ^ ' '

' r ' i \ II ',

1 iU t ' 1 ■' ' , IM r ì.; ( )»w t o r / H /, < ;,,, ,u ; yl / i f .
* ỹ lv ã.) ' t m ^ h i ‘ Vj V -u f c i u , k y ctưC (c Ọ J./1/J ci U 1 i-\ I~ x rí n

t

C ( ũ | l v o i : D i t ,(1 ^ Ki'ii.^j- ivjCift]' CH A

ht hi pj * *

1 n U f j ; x

J ir> J

j :tr

fc L . ( V >.' r I • I \ I\ IV 11 ( f \ c M il I J , k I

/ > '• • ' ■ > ' • • ■,

;■ u . j U . ' ( i „ K .j U ^ '.M -, u " <‘f ^ H ^ ( r

1 >

) c iV Í j I I I ^ Í > J v -. *. t. ; 1 I / \ I *■ > j ' < ' )

• N í í í ì I A . ’ f X , .-J r " , ^ : " J ( w W O l ( ' - ■■•

K L

■ỉnt .;

. k c - ;

1 -"M

f\ t v J )

■ + v

‘ j 1 1 Uv

^ i I \ I A 1 » >

f

7 c

iV <

u ^ (

/■

•1

■

V

..

t

HI

I ^ ằj'ô'

ã

^ t \ p X i

jl 1 A x'

V

c ^ . 'i c

1 <;

rv:0 ltll <

«\ 1 ^ ~

</div>
(90)<div class='page_container' data-page=90>

V ! t ' C ị • Ị

ÌẴịi

' 7 $ ^ !(J í C A | ù l / | ■
• T t ' T q f u o . l i Ể* c „ / , y ^ • 'r
l T . . . . > . /.

■ỉ. - ' •

t ĩ o a - ị r<t.i ^Vĩ r ri it tu /Ị f t <4:-ì

cVv^ q f u a . l i Ể * c „ / , y H \ . c t r ị f <~ì'ỳ ^ i i > i '7

u^i.ữL V IC I c J a i’ II v'À »ii ^ • • '■ ‘ ■1 ^

« I&/vtiV'jj t-ì JCÍm b A J it io c c J -ct-i1. c ^ i '1 y h s t i x A »vr c. l

</div>
(91)<div class='page_container' data-page=91>

Kết luận

của Chả tịch

Hội đổng:

. .

p j * 7 n ~ p . - r ' í : o 4 ; »\

2 T V<5vì f í X ■ i i u ' c H u Ị r h p -fi }'l c* ■•/

- D l ' f r J o U - ^ i «1 ^ 1 -Ij CÌ<Ả H-ỡ ^ ' v í o r i M A

THƯKÝ HỘI ĐỔNG
(Họ, tên và chữ ký)

Y

' f t t ' w ĩ ì i ì ừ í m
1

</div>
(92)<div class='page_container' data-page=92>

PHIÉU ĐĂNG KÝ

KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐẺ TÀI KHCN

Tên đề tài:

Mã sổ:

Cơ quan quẳn lý đề tài:

Địa chi:
Điện thoại:

Ctf quan chủ trì đề tài:
Địa chi:

Điện thoại:

Tổng chi phí thực chi:
Trong đó:

- Từ ngân sách NN:
- Nguồn khác:
Thời gian nghiên cú u:

- Thời gian bất đầu:
- Thời gian kết thúc:
Tên các cán bộ phối họ p

- Chù trì đề tải:
- Cán bộ tham gia:

Đa dạng sinh học của vi khuân kỵ khí oxy hỏa Fe(]l). khừ nitrate trong
một sô môi trường sinh thái vả khà năng ừng dụng cùa chúng.

QG.07.23

Đại học Quốc gia Hả Nội

144 đường Xuân Thủy, cầu Giấy - Hà Nội
37 54 86 64

Viện Vi sinh vật vá Công nghệ sinh học. ĐHQGHN
Nhà E2. 144 Xuân Thúy, cầu Giấv - Hà Nội

37 54 74 07
60.027.400

100%

khơng có.
2 năm
6/2007

10/2009
nghiên cứu:

TS. Đinh Thúy Hằng
CN Nguyễn T hị Tuyền
ThS. Nguyền Minh Giáng

Sô đăng ký đê tài Sị chứng nhận dãrití ký KQNC Bào mậi

A. Phơ biến rộng rãi

Ngày Ngày

Tóm tắt ý nghĩa, kết quả nghiên cứu:

- Ba dạng môi trường khác nhau gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước và irầm tích ven biến
được chọn đê tiến hành nghiên cứu sự đa dạng cua vi khuân òx> hoá Fe(ll) khứ NO','. Đáy là
những dạng môi trường trong đó vi khuân tham gia chu trinh chun hố sắt và nitơ đóng vai trò
quan trọng. Mầu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) tại các mòi trường sinh thái kẻ trên được thu
thập và sử dụng đê phân tích nhóm vi khn kv khí này .

</div>
(93)<div class='page_container' data-page=93>

DNA tổng số tử các ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển được tách chiết và sử dụng làm
khuôn trong phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6S rDNA có độ dài 550 bp. Phàn tích điện di
biến tính đoạn gen trên cho thấy tính đa dạng khá cao cùa vi khuấn trong các ống MPN. Một số
băng điện di đại diện được cắt và thôi gel để đọc trình tự, qua đó đã xác định đưọc các nhóm vi
khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu, cụ thê là Anaeromvxobacter 
Pseudomonas và Paracoccus.

- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật sinh trường trong điều kiện oxy hoá Fe((l) 
khừ NO} trong các dãy MPN thông qua phương pháp tai in situ sứ dụng các đầu dò huỳnh 
quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuân CX-. P- và ỵ-P roieobacteria.

12 chủng vi khuân kỵ khí được phân lập và tinh sạch (4 chúng đối vói mỗi dạng mơi trường sinh
thái). Tính đa dạng của các chúng này về mặt di truyền được xác định thơng qua phân tích
ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA dài 1500 bp sừ dụng hai enzvme M.spị và Haeìỉỉ. Các 
chùng đại diện cho các nhóm ARDRA được giài trình tự đè xác định vị trí phân loại cùa cá
nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện.

- Bằng phương pháp xác định lượng Fe(II) và NO}' trong mơi trường ni cấy theo thời gian,
chúng vi khuân IN 12 đã được chúng minh cỏ khá năng chuyên hoá hai hợp chất này khá cao,
như vậy chủng này có tiềm năng sử dụng trong lình vực mơi trường. Bên cạnh đó khá năng sừ
dụngMn(I!) thay cho Fe(ll)cũngđã được nghiẻn cứu, tuv nhiên chung IN 12 không thê hiện kha
nãng ứng dụng để loại bó Mn(IỈ) trong mơi trưịng.

- Các kết quà nghiên cứu đã được công bố trong 02 bài báo khoa học. 0 1 báo cáo Poster iham gia

h ội n g h ị v ề s in h th á i s in h v ặ t v à 0 2 trin h tự g e n d ă n tỉ ký tr o n g G e n B a n k .

- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học

Kiến nghị về qui mô và đối tuọng áp dụng kết quá nghiên cứu:

- Nghiên cứu tìm giả thể phù hợp đè tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxlì Fe(II) khư nitrate.

- Nghiên cứu thừ nghiệm áp dụng vi khuân oxy hóa Fe(II) khư nitrate dề xử lý nước ngầm nhiễm
sắt và ni tơ.

Chức vụ Chù nhiệm đê tài Thú trường cơ
quan chù trì đe tài

Chủ tịch hội đơiiii
đánh uiá chính thức

ĩ i lii-'f/Mj

Thu trưởng cơ quan

Họ và tên Đinh Thúy Hăng Dươníì Vãn Họp Dưong Vãn Hợp p

Học vị TS

Ký tên

Đóng dấu

ý h ị

V SINH H O ầ y ậ ìì

V '•*.-»‘'71

i \ V --

</div>

Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

<b>ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI</b>

<b>BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN </b>

<b>ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG</b>

<b>Tên </b>

<i><b>Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ </b></i>

<i><b>hóa Fe(II), khử nitrate</b></i>

<i><b>trong một số mơi trường sình thái và khả năng ứng dụng của chủng</b></i>

<b>Mã sổ: </b>

<b>QG. 07. 23</b>

<b>Chủ trì đề tài: </b>

<b>TS. Đinh Thúy Hằng</b>

<b>Cơ quan: </b>

<b>Viện Vi sinh vật & Công nghệ </b>

<b>Sinh học - ĐHQGHN</b>

Quoc

<b>Ỉ</b>

E

c

<b>ĩ </b>

<b>- 3 </b>

<b>_</b>

<b>- 1.5</b>

<b>ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI </b>

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN</b>

<b>Nguyễn Thị Tuyền</b>

<b>VI KHUẨN OXY HÓA Fe(H) VÀ KHỬ NITRATE Ở VIỆT NAM: </b>

<b>TÍNH ĐA DẠNG VÀ T lỂM NĂNG ỨNG DỤNG</b>

<b>Chuyên ngành: Vi sinh vật học </b>

<b>Mã số: 60 42 40</b>

<b>LUẬN VĂN THẠC s ĩ KHOA HỌC</b>

3

<i><b>//à /Vọ/, ngày # tháng ÀA năm S009 </b></i>

<b>Học viên</b>

<b>Nguyễn Thị Tuyển</b>

<b>Nghiên cứu vi khuẩn ưu thể tham gia </b>

<b>chu trình Fe trong các điều kiện môi </b>

<b>VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIT NAM</b>

<b>VIETNAM ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY</b>

<b>ISSN 1811-4989</b>

TẠP CHÍ

<b>CƠNG NGHỆ S</b>

<b>inh</b>

<b>h ọ c</b>

J

<b>Nghiên cứu vi khuẩn ưu thế tham gia chu trình Fe trong các </b>

<b>điều kiện m ôi trường khác nhau tại V iệt Nam</b>

<b>Nguyễn Thị Tuyền1, Nguyễn Minh Giảng2, Đinh Thúy Hằng2-*</b>

<b>lử so/".</b>

<i>m</i>

<b>ế ễ v h</b>

<b>; V </b>

<b>Study, bacteria o f the iron cycle that dominate in different </b>

<i><b>t 6: </b></i>

<b>environments in Vietnam</b>

<b>Nguyen Thi Tuyen1, Nguyen Minh Giang2, Dinh Thuy Hang</b>

<b>V IỆ N K H O A HỌC V À CÔNG N G H Ệ VIỆT N A M </b>

<b>VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT</b>

<b>Ban tổ chức Hội nghị Khoa học Tồn quốc về Sình thái </b>

<b>và Tài ngun sinh vật lần thứ 3</b>

<b>Ban tồ chức Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật </b>

<b>ỉần thứ 3 đã nhận được bài poster:</b>

<b>'Đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại một </b>

<b>số môi trường sinh thái ở Việt Nam”</b>

<b>Của các tác giả:</b>

<b>Nguyễn Thị Tuyền</b>

<i><b>Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quôc gia Hà Nội</b></i>

<b>Đỉnh Thúy Hằng</b>

<i><b>Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quôc gia Hà Nội</b></i>

<i><b>Bài poster của các tác giả đã được biên tập và dự kiến sẽ trưng bầy tại Hội </b></i>

<i><b>nghị.</b></i>

<b>n</b>

<b>u</b>

<b>I </b>

<b>m</b>

<b>ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI</b>

<b>Đ Ề C Ư Ơ N G </b>

<b>Đ È T À I K H C N T R Ọ N G Đ I Ẻ M / Đ Ặ C B I Ệ T / C Ấ P Đ H Q G H N</b>

<i><b>Tên đề tài; Đ a dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khỉ ôxy hỏa sắt (II), khử nitrat </b></i>

<i><b>trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng</b></i>