ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------------
HỒ CƠNG TRỰC
NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TRÍCH LY PACLITAXEL
VÀ 10 – DEACETYL BACCATIN III BẰNG
DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN ỨNG DỤNG TRONG
DƢỢC PHẨM ĐIỀU CHẾ THUỐC TRỊ UNG THƢ
Chuyên ngành: Q trình - Thiết bị Cơng nghệ Hóa học
Mã ngành: 605277
LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2011
i
CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học:
Tiến sĩ Lê Thị Kim Phụng
Chữ ký:.........................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 1: ...............................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 2: ...............................................................................................
Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày
17 tháng 8 năm 2011.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. . ...............................................................................
2. . ...............................................................................
3. . ...............................................................................
4. . ...............................................................................
5. . ...............................................................................
Xác nhận của Chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và bộ môn quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn
Bộ môn quản lý chuyên ngành
ii
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
PHÕNG ĐÀO TẠO SĐH
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
______________
___________________
Tp. HCM, ngày … tháng … năm …
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên:
HỒ CÔNG TRỰC
Ngày tháng năm sinh:
Phái:
Nơi sinh: Vĩnh Long
1983
Chuyên ngành: Quá trình - Thiết bị Cơng nghệ hóa học
I.
nam
MSHV: 09290134
TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TRÍCH LY PACLITAXEL VÀ 10 –
DEACETYL BACCATIN III BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN ỨNG DỤNG
TRONG DƢỢC PHẨM ĐIỀU CHẾ THUỐC TRỊ UNG THƢ.
II.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG
So sánh khả năng trích ly Paclitaxel và 10 – Deacetyl baccatin III của các
phƣơng pháp khác nhau.
Khảo sát ảnh hƣởng của áp suất, nhiệt độ, lƣu lƣợng dung mơi siêu tới
hạn lên hiệu quả trích ly Paclitaxel và 10 – Deacetyl baccatin III.
Tối ƣu hóa q trình trích ly Paclitaxel và 10 – Deacetyl baccatin III.
III.
NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 7 năm 2010
IV.
NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 7 năm 2011
V.
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN:
Tiến sĩ LÊ THỊ KIM PHỤNG
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
(Họ tên và chữ ký)
KHOA QL CHUYÊN NGÀNH
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)
(Họ tên và chữ ký)
iii
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng tri ân sâu sắc đến Tiến Sĩ Lê Thị Kim Phụng, ngƣời
đã tận tình truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức nghiên cứu khoa học quý báu
cũng nhƣ tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi trang bị thêm vững chắc nền tảng tri
thức và hoàn thành tốt luận văn này.
Gia đình ln là hậu phƣơng vững chắc, là động lực to lớn giúp tơi vƣợt qua mọi
khó khăn trong học tập và cuộc sống.
Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn của mình đến q thầy cơ bộ mơn Q
trình - Thiết bị, thầy cơ Khoa Kỹ thuật Hóa học và cán bộ phịng Thí nghiệm Trọng
điểm Cơng nghệ hóa học và Dầu khí - Trƣờng Đại học Bách khoa đã hết lòng truyền
đạt kiến thức và giúp tơi có đƣợc những điều kiện thí nghiệm tốt nhất.
Xin cảm ơn tập thể lớp cao học Quá trình - Thiết bị Cơng nghệ hóa học khóa
2009 và những ngƣời bạn của tôi đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời
gian học tập tại trƣờng cũng nhƣ khi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo khoa Khoa Học Nông
nghiệp, quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm - Trƣờng Đại học Cửu Long đã
nhiệt tình ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành nhiệm vụ.
iv
ABSTRACT
Annually, Viet Nam has to import a considerable amount of anticancer drug that
is made from Paclitaxel (Taxol) and 10 – Deacetyl baccatin III (10 – DAB III), a
precursor of Taxol which are present in Taxus wallichiana Zucc. in Viet Nam as well
as other regions in the wolrd. Taxol and 10 – DAB III are usually extracted by some
methods such as soaking, Soxhlet used conventional solvent and supercritical fluid
extraction. This study compared the effect of above methods, estimated the influence
of factors as well as their co-operation and optimized the supercritical fluid extraction
of Taxol and 10 – DAB III.
First of all, in comparision with different extracting methods, experiments of
soaking, Soxhlet used ethanol as a solvent and supercritical CO2 extraction used
ethanol, methanol as cosolvents were taken. The outcome showed that the supercritical
extraction with cosolvents which obviously have the most advantages of all as high
yield, short extracting time, high selectivity and the selectivity can be adjusted.
Moreover, despite the high yield of supercritical extraction used methanol as a
cosolvent, ethanol has higher selectivity and less toxic than methanol.
Three factors that were pressure (140 – 300 bar), temperature (313 – 333 K) and
solvent flow rate (10 – 20g/min), were observed to assess the process with constant
cosolvent proportion of 12% ethanol. The result indicated that the pressure and solvent
flow rate greatly affect the yield of Taxol and 10 – DAB III; pressure, temperature,
solvent flow rate complexly impact on selectivity.
There were some results of optimizing from using separated or combined
functions in order to compare each other. Optimizing both of yield of Taxol and 10 –
DAB III is the most feasible way because of its easily practical operation (300 bar, 333
K, 20 g/min), the high yield of Taxol and 10 – DAB III as well as high desirability.
v
TÓM TẮT
Hàng năm, nƣớc ta phải nhập khẩu một lƣợng lớn thuốc trị ung thƣ đƣợc sản xuất
từ hoạt chất Paclitaxel (Taxol) và một tiền chất của Taxol là 10 – Deacetyl baccatin III
(10 – DAB III), chúng hiện diện trong cây thông đỏ đỏ Taxus wallichiana Zucc. ở Việt
Nam cũng nhƣ một vài lồi thơng đỏ khác trên thế giới. Taxol và 10 – DAB III thƣờng
đƣợc trích ly bằng phƣơng pháp trích ly thơng thƣờng nhƣ ngâm dầm, Soxhlet sử dụng
dung môi thông đỏ thƣờng và một phƣơng pháp mới - trích ly bằng dung mơi siêu tới
hạn. Nghiên cứu này đã so sánh hiệu quả trích ly của các phƣơng pháp trên, đánh giá
của các yếu tố ảnh hƣởng và tối ƣu hóa q trình trích ly Taxol và 10 – DAB III bằng
dung môi siêu tới hạn.
Hiệu quả của các phƣơng pháp ngâm dầm, Soxhlet sử dụng ethanol làm dung
mơi và trích ly bằng CO2 siêu tới hạn có và khơng có dung mơi hỗ trợ đƣợc so sánh.
Kết quả cho thấy, trích ly siêu tới hạn có dung mơi hỗ trợ là phƣơng pháp có nhiều ƣu
điểm hơn các phƣơng pháp còn lại nhƣ hiệu suất trích cao, thời gian trích ly ngắn, độ
chọn lọc cao và có thể điều chỉnh độ chọn lọc bằng cách thay đổi điều kiện trích. Ngồi
ra, khi so sánh hiệu quả trích ly của dung mơi hỗ trợ, ethanol thích hợp hơn methanol
vì độ chọn lọc cao hơn, ít độc hại hơn mặc dù hiệu suất trích thấp hơn methanol.
Ba yếu tố áp suất (140 – 300 bar), nhiệt độ (313 – 333 K), lƣu lƣợng dung môi
(10 – 20 g/phút) với tỷ lệ ethanol không đổi là 12% so với lƣu lƣợng tổng cộng đƣợc
khảo sát để đánh giá q trình trích. Kết quả cho thấy, áp suất và lƣu lƣợng ảnh hƣởng
đến hiệu suất; ba yếu tố áp suất, nhiệt độ, lƣu lƣợng dung môi tác động lên độ chọn lọc.
Tối ƣu hóa đƣợc thực hiện dựa trên từng hàm riêng lẽ hoặc kết hợp giữa các hàm
mục tiêu. Kết quả phƣơng án tối ƣu cả hai hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly Taxol và
10 – DAB III khả thi nhất vì điều kiện trích dễ thực hiện (300 bar, 333 K, 20 g/phút),
phù hợp với yêu cầu thực tế là hiệu suất trích ly và khả năng đáp ứng của hàm mục tiêu
là cao nhất.
vi
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................iii
ABSTRACT .................................................................................................................... iv
TÓM TẮT ........................................................................................................................ v
MỤC LỤC ....................................................................................................................... vi
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .............................................................................viii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH........................................................................................................ x
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU .............................................................................................. 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1
1.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 2
1.3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ............................................................................... 2
1.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................................................. 2
1.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 3
1.6. Ý NGHĨA KHOA HỌC ..................................................................................... 3
1.7. Ý NGHĨA THỰC TIỄN ..................................................................................... 3
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 5
2.1. CÂY THƠNG ĐỎ VÀ THÀNH PHẦN DƢỢC CHẤT .................................... 5
2.1.1.
Mơ tả thực vật, phân bố sinh thái ............................................................. 5
2.1.2.
Thành phần hóa học ................................................................................. 6
2.1.3.
Taxol và 10-DAB III ................................................................................ 8
2.2. TRÍCH LY SIÊU TỚI HẠN ............................................................................. 11
2.2.1.
Lý thuyết siêu tới hạn ............................................................................. 11
2.3.1.
Trích ly bằng dung mơi siêu tới hạn ....................................................... 17
2.3.2.
Ƣu nhƣợc điểm và các yếu tố ảnh hƣởng ............................................... 23
2.3. TRÍCH LY TAXOL VÀ 10-DAB III BẰNG CO2 SIÊU TỚI HẠN ............... 31
2.3.1.
Độ tan của Taxol và 10-DAB III trong các chất lỏng siêu tới hạn......... 31
2.3.2.
Các phƣơng pháp trích ly Taxol và 10-DAB III .................................... 36
2.3.3.
Nghiên cứu trích ly Taxol bằng dung môi siêu tới hạn .......................... 42
CHƢƠNG 3. THIẾT BỊ – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 47
3.1. NGUYÊN LIỆU, HĨA CHẤT, THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM ............................. 47
3.1.1.
Ngun liệu và hóa chất ......................................................................... 47
3.1.2.
Thiết bị thí nghiệm ................................................................................. 49
3.2. LÝ THUYẾT QUY HOẠCH VÀ THỐNG KÊ THÍ NGHIỆM ...................... 54
vii
3.2.1.
Lý thuyết quy hoạch thực nghiệm .......................................................... 54
3.3.2
Sơ lƣợc lý thuyết tối ƣu .......................................................................... 65
3.3. THIẾT LẬP THÍ NGHIỆM ............................................................................. 68
3.4. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ............................................................................ 71
3.4.1.
Quy trình thí nghiệm .............................................................................. 71
3.4.2.
Giải thích quy trình................................................................................. 72
3.4.3.
Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)......................................... 73
CHƢƠNG 4. TRÍCH LY TAXOL VÀ 10 – DAB III BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI
HẠN, NGÂM DẦM, SOXHLET .................................................................................. 76
4.1. MƠ TẢ THÍ NGHIỆM ..................................................................................... 76
4.1.1.
Phƣơng pháp ngâm dầm ......................................................................... 76
4.1.2.
Phƣơng pháp Soxhlet.............................................................................. 77
4.1.3.
Trích ly bằng dung môi siêu tới hạn ....................................................... 78
4.2. KẾT QUẢ ......................................................................................................... 78
CHƢƠNG 5. KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ.................................. 82
LÊN HIỆU QUẢ TRÍCH LY TAXOL VÀ 10-DAB III ............................................... 82
5.1. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ................................................................................ 82
5.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH................................................................................... 87
5.2.1.
Phân tích biến (ANOVA) ....................................................................... 87
5.2.2.
Ảnh hƣởng các yếu tố lên hiệu suất trích ly Taxol và 10 – DAB III ..... 90
5.2.3.
Ảnh hƣởng của các yếu tố lên độ chọn lọc Taxol và 10 – DAB III ....... 97
CHƢƠNG 6. TỐI ƢU Q TRÌNH TRÍCH LY TAXOL VÀ 10-DAB III DỰA
TRÊN PHƢƠNG TRÌNH HỒI QUY THỰC NGHIỆM ............................................. 104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................... 110
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... xiv
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... xxix
viii
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CP: Critical point
EtOAc: Ethyl acetate (CH3COOC2H3)
HPLC: high pressure liquid chromatography
NCI: National Cancer Institute
PVT: Pressure Volume Temperature
SFE: Supercritical Fluid Extraction
TP: Triple point
VLC: vacuum normal phase liquid chromatography
ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Đặc điểm của một số chất ở trạng thái tới hạn .............................................. 13
Bảng 2.2: Tính chất vật lý của chất ở trạng thái khí, lỏng và siêu tới hạn..................... 14
Bảng 2.3: Một số đặc điểm của CO2 .............................................................................. 15
Bảng 2.4: Khối lƣợng riêng CO2 ở các giá trị nhiệt độ và áp suất khác nhau (kg/m3) .. 16
Bảng 2.5: Các yếu tố ảnh hƣởng đến trích ly siêu tới hạn [4] ......................................... 27
Bảng 2.6: Độ tan của Taxol trong CO2 và N2O siêu tới hạn.......................................... 33
Bảng 2.7: Một số loài nấm sản xuất Taxol trên vật chủ xác định .................................. 38
Bảng 2.8: Trích ly Taxol từ vỏ Taxus brevifolia ở 318 K.............................................. 44
Bảng 2.9: Trích ly Taxol từ vỏ Taxus brevifolia ở 318 K.............................................. 45
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ......................................................... 48
Bảng 3.2: Bảng quy hoạch thí nghiệm ........................................................................... 57
Bảng 3.3: Bảng quy hoạch thí nghiệm ........................................................................... 59
Bảng 3.4: Ma trận quy hoạch thực nghiệm .................................................................... 65
Bảng 3.5: Các biến khảo sát ........................................................................................... 69
Bảng 3.6: Hàm đáp ứng.................................................................................................. 70
Bảng 3.7: Pha dung dịch chuẩn 10 – DAB III ............................................................... 73
Bảng 3.8: Pha dung dịch chuẩn Taxol ........................................................................... 73
Bảng 4: Hiệu quả trích ly của các phƣơng pháp ............................................................ 79
Bảng 5.1: Kết quả thí nghiệm ........................................................................................ 83
Bảng 5.2: Tổng hợp các giá trị quan sát......................................................................... 86
Bảng 5.3: Kết quả đánh giá ý nghĩa phƣơng trình hồi quy ............................................ 87
Bảng 5.4: Kết quả phân tích hiệu suất trích ly Taxol ..................................................... 91
Bảng 5.5: Kết quả phân tích hiệu suất trích ly 10 – DAB III......................................... 92
Bảng 5.6: Hệ số hồi của quy hàm đa thức bề mặt đáp ứng độ chọn lọc Taxol .............. 97
Bảng 5.6: Hệ số hồi của quy hàm đa thức bề mặt đáp ứng độ chọn lọc 10 – DAB III . 98
Bảng 6: Kết quả tối ƣu quá trình trích ly Taxol và 10 - DAB III ................................ 104
x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Thơng đỏ đỏ Taxus wallichiana Zucc trồng ở Đà Lạt. .................................... 5
Hình 2.2: Cấu trúc phân tử Paclitaxel (Taxol) ................................................................. 8
Hình 2.3: Cấu trúc phân tử 10 – Deacetyl baccatin III (10 – DAB III) ........................... 9
Hình 2.4: Cấu trúc hóa học của nhóm N-benzoyl-3-phenylisoserine ............................ 10
Hình 2.5: Bán tổng hợp Taxol từ 10-DAB III................................................................ 10
Hình 2.6: Cấu trúc phân tử Taxotere .............................................................................. 10
Hình 2.7: Giản đồ PVT của một cấu tử tinh khiết và hình chiếu lên mặt phẳng PT ..... 12
Hình 2.8: Giản đồ pha của CO2 ...................................................................................... 16
Hình 2.10: Sơ đồ trích ly nguyên liệu lỏng bằng chất lỏng siêu tới hạn ........................ 20
Hình 2.11: Sơ đồ trích ly ngun liệu rắn ...................................................................... 21
Hình 2.12: Sơ đồ hệ thống trích ly ngun liệu rắn gồm nhiều bình trích .................... 22
Hình 2.13: Sơ đồ thiết bị xác định độ tan của Taxol trong hỗn hợp dung mơi .............. 32
Hình 2.14: Độ tan Taxol trong CO2 siêu tới hạn ở các áp suất khác nhau .................... 34
Hình 2.15: Độ tan Taxol ở 313 K, 300 bar .................................................................... 35
Hình 2.16: Độ tan baccatin III ở 313 K, 300 bar ........................................................... 35
Hình 2.17: Quy trình trích ly Taxol bằng methanol của Han, Man, Woo ..................... 39
Hình 2.18: Quy trình trích ly Taxol bằng ethanol của Muraleedharan G. Nair, Okemos,
Mich ............................................................................................................................... 41
Hình 3.1: Cây thơng đỏ Taxus wallichiana Zucc. trồng ở Đà Lạt ................................. 47
Hình 3.2: Cành non và lá thông đỏ đỏ Taxus wallichiana Zucc. đƣợc sấy và xay mịn. 48
Hình 3.3: Thiết bị trích ly siêu tới hạn THAR SFC 100 ................................................ 49
Hình 3.4: Sơ đồ thiết bị trích ly siêu tới hạn .................................................................. 50
Hình 3.5: Thiết bị cơ quay chân khơng Buchi R-210 .................................................... 51
Hình 3.6: Cấu tạo thiết bị cô quay chân không .............................................................. 52
Hình 3.7: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................. 52
Hình 3.8: Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................... 53
xi
Hình 3.9: Cột dùng cho HPLC ....................................................................................... 54
Hình 3.10: Mơ hình quy hoạch đa mục tiêu ................................................................... 55
Hình 3.11: Mơ hình kiểm định ....................................................................................... 57
Hình 3.12: Đƣờng chuẩn 10 – DAB III ......................................................................... 74
Hình 3.13: Đƣờng chuẩn Taxol...................................................................................... 74
Hình 4.1: Dịch trích sau khi cơ quay và hịa tan với CH3OH ........................................ 77
Hình 4.2: Trích Taxol và 10-DAB III bằng phƣơng pháp Soxhlet ................................ 77
Hình 4.3: Hiệu suất trích ly Taxol và 10-DAB III ......................................................... 80
Hình 4.4: Độ chọn lọc Taxol và 10 – DAB III .............................................................. 80
Hình 5.1: Giá trị thực nghiệm so với giá trị dự đoán hiệu suất trích ly Taxol ............... 88
Hình 5.2: Giá trị thực so với giá trị dự đoán hiệu suất 10-DAB III ............................... 89
Hình 5.3: Giá trị thực so với giá trị dự đốn độ chọn lọc Taxol .................................... 89
Hình 5.4: Giá trị thực so với giá trị dự đoán độ chọn lọc 10-DAB III .......................... 90
Hình 5.5: Hàm lƣợng Taxol theo P, T ở Q = 10g/phút .................................................. 94
Hình 5.6: Hàm lƣợng Taxol theo P, T ở Q = 15 g/phút ................................................. 94
Hình 5.7: Hàm lƣợng Taxol theo P, T ở Q = 20 g/phút ................................................. 95
Hình 5.8: Hiệu suất 10 – DAB III theo P, T ở Q = 10 g/phút ........................................ 95
Hình 5.9: Hiệu suất 10 – DAB III theo P, T ở Q = 15 g/phút ........................................ 96
Hình 5.10: Hiệu suất 10 – DAB III theo P, T ở Q = 20 g/phút ...................................... 96
Hình 5.11: Đồ thị độ chọn lọc Taxol theo P, T ở Q = 10 g/phút ................................... 99
Hình 5.12: Đồ thị độ chọn lọc Taxol theo P, T ở Q = 15 g/phút ................................. 100
Hình 5.13: Độ chọn lọc Taxol theo P, T ở Q = 20 g/phút............................................ 100
Hình 5.14: Độ chọn lọc 10-DAB III theo P, T ở Q = 10 g/phút .................................. 101
Hình 5.15: Độ chọn lọc 10-DAB III theo P, T ở Q = 15 g/phút .................................. 101
Hình 5.16: Độ chọn lọc 10-DAB III theo P, T ở Q = 20 g/phút .................................. 102
Hình 6.1: Tối ƣu hiệu suất trích ly Taxol và 10 - DAB III .......................................... 105
Hình 6.2: Tối ƣu hiệu suất trích ly Taxol ..................................................................... 106
xii
Hình 6.3: Tối ƣu hiệu suất trích ly 10 – DAB III ......................................................... 106
Hình 6.4: Tối ƣu hiệu suất và độ chọn lọc Taxol ......................................................... 107
Hình 6.5: Tối ƣu hiệu suất và độ chọn lọc 10 – DAB III............................................. 107
Hình 6.6: Tối ƣu hiệu suất và độ chọn lọc Taxol và 10 – DAB III ............................. 108
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Paclitaxel (Taxol) là một dƣợc liệu có khả năng điều trị hiệu quả nhiều bệnh ung
thƣ nhƣ: ung thƣ phổi, cổ, vú, cổ tử cung…và một tiền chất rất quan trọng để tổng
hợp Taxol là 10 – Deacetyl baccatin III (10 – DAB III). Chúng đƣợc tìm thấy trong
các lồi thơng đỏ nhƣ Taxus brevifolia, Taxus cuspidate, Taxus wallichiana…phân
bố nhiều vùng trên thế giới. Ở Việt Nam, lồi thơng đỏ Taxus wallchian Zucc. có ở
các tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Khánh Hòa, Lâm Đồng.
Taxol và 10 – DAB III là những thành phần dƣợc liệu q có trong cây thơng đỏ
đỏ nên hiện nay bên cạnh nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên, các nhà nghiên cứu đã
thành công trong việc nhân giống và trồng cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc. ở
Lâm Đồng. Bƣớc đầu quan trọng này đã tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu
tiếp theo nhằm sớm cung cấp Taxol cho ngành công nghiệp dƣợc để sản xuất thuốc
chống ung thƣ vốn phụ thuộc nhiều vào nhập khẩu. Trong đó, cơng nghệ trích ly là
một trong những khâu có ý nghĩa quan trọng trong dây chuyền từ nguyên liệu đến
sản phẩm cuối cùng. Hơn nữa, bản quyền cơng nghệ trích ly Taxol sẽ hết hạn vào
năm 2012 nên địi hỏi có một cơng nghệ trích ly mới đáp ứng u cầu hiện tại.
Có nhiều phƣơng pháp trích ly Taxol và 10 - DAB III từ nguyên liệu thông đỏ
đỏ. Phƣơng pháp ngâm dầm, trích ly bằng Soxhlet sử dụng các dung môi methanol,
ethanol, …Tuy nhiên, các phƣơng pháp này bộc lộ nhiều nhƣợc điểm nhƣ: thời gian
trích ly kéo dài, dung môi độc hại ảnh hƣởng đến môi trƣờng, lƣợng tạp chất cịn lại
trong sản phẩm cuối cùng là khó tránh khỏi. Trích ly bằng dung mơi siêu tới hạn là
phƣơng pháp trích ly hiện đại với nhiều ƣu điểm nhƣ: thời gian trích ngắn, có thể
điều chỉnh đƣợc độ chọn lọc chất trích của dung mơi, có thể tuần hồn để sử dụng
2
lại dung mơi do đó tiết kiệm đƣợc chi phí, dung môi thân thiện với môi trƣờng, nên
đáp ứng đƣợc với xu hƣớng sản xuất tiên tiến – xu hƣớng sử dụng dung môi xanh.
Từ những yêu cầu thực tế trên thì đề tài “Nghiên cứu q trình trích ly
Paclitaxel và 10 - Deacetyl baccatin III từ cây thông đỏ đỏ Taxus wallichiana Zucc.
bằng dung môi siêu tới hạn ứng dụng trong dƣợc phẩm điều chế thuốc trị ung thƣ”
đƣợc đề xuất thực hiện với sự hợp tác giữa Trƣờng Đại học Bách Khoa Thành phố
Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu Trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt - công ty
cổ phần Y Dƣợc Phẩm VIMEDIMEX và dự án JICA Nhật Bản.
1.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Để đáp ứng yêu cầu của đề tài, đối tƣợng nghiên cứu của đề tài này bao gồm:
Vật liệu nghiên cứu: Cây thơng đỏ đỏ có tên khoa học Taxus wallichiana Zucc.
đƣợc trồng ở Đà Lạt.
Thiết bị trích ly siêu tới hạn Thar - SFC.
Q trình trích ly bằng CO2 siêu tới hạn.
Phƣơng pháp thực nghiệm tìm điều kiện tối ƣu.
1.3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Dựa vào đối tƣợng của đề tài, mục tiêu nghiên cứu bao gồm:
So sánh hiệu quả trích Taxol và 10 – DAB III của các phƣơng pháp khác nhau.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố trích ly bằng dung mơi siêu tới hạn lên hiệu
suất và độ chọn lọc của Taxol và 10 – DAB III.
Tối ƣu hóa q trình trích ly Taxol và 10 – DAB III.
1.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Luận văn đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng Nghệ Hóa học và
Dầu khí, trƣờng Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh thời gian từ tháng 7
năm 2010 đến tháng 7 năm 2011.
3
Luận văn đƣợc thực hiện với sự phối hợp giữa trƣờng Đại học Bách Khoa và
Trung tâm nghiên cứu Trồng và Chế biến cây thuốc Đà Lạt - Công ty Cổ phần Y
Dƣợc phẩm VIMEDIMEX.
1.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài bao gồm:
Thực nghiệm so sánh hiệu quả trích ly Taxol và 10 – DAB III của các phƣơng
pháp khác nhau.
Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm xác định ảnh hƣởng của các yếu tố và sự tác
động giữa chúng lên hiệu quả của trích ly Taxol và 10 – DAB III bằng dung môi
siêu tới hạn với sự hỗ trợ của phần mềm DESIGN-EXPERT 7.
Tối ƣu quá trình dựa trên phƣơng pháp leo dốc của BOX-WINSON với sự hỗ trợ
của phần mềm DESIGN-EXPERT 7.
1.6. Ý NGHĨA KHOA HỌC
Nghiên cứu trích ly siêu tới hạn trên đối tƣợng cây thông đỏ đỏ Taxus
wallichiana Zucc. là nghiên cứu đầu tiên đƣợc thực hiện ở Việt Nam dựa trên công
nghệ tiên tiến trong chiết xuất các dƣợc chất thiên nhiên.
1.7. Ý NGHĨA THỰC TIỄN
Hiện nay, Việt Nam phải nhập khẩu một lƣợng lớn thuốc điều trị ung thƣ mỗi năm,
trong đó có thuốc đƣợc sản xuất từ Taxol trong khi Việt Nam có nguồn nguyên liệu
để sản xuất loại dƣợc liệu này. Kết quả của nghiên cứu có thể đƣợc ứng dụng trong
sản xuất thuốc trị ung thƣ ở quy mô công nghiệp, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và
hƣớng đến xuất khẩu.
Nhiều nghiên cứu trồng và nhân giống thông đỏ đỏ đã đƣợc thực hiện, tuy nhiên
lƣợng nguyên liệu chƣa đáp ứng đầy đủ nhu cầu chữa bệnh ngày càng tăng. Vì vậy,
4
kết quả của thí nghiệm tối ƣu có thể đƣợc triển khai và ứng dụng trong quy mơ lớn
góp phần tiết kiệm nguồn tài nguyên có giá trị cao.
Kết quả này là tiền đề để các nghiên cứu tƣơng tự đƣợc thực hiện trên các nguyên
liệu có giá trị khác ở Việt Nam nhƣ quế, gấc, đinh hƣơng, …
5
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. CÂY THÔNG ĐỎ VÀ THÀNH PHẦN DƢỢC CHẤT
2.1.1. Mô tả thực vật, phân bố sinh thái
2.1.1.1.
Mô tả thực vật
Cây to, thƣờng xanh, cao đến 20 m. Thân có vỏ màu hồng xám, phân nhiều cành
mảnh, khi non màu lục. Lá mọc so le, thƣờng xếp hai dãy nhƣ một lá kép, hình dãy rất
hẹp, dáng cong, dài 2,5 – 3,5 cm, rộng 2 – 3 mm, gốc thn, đầu nhọn, mặt trên lõm
nhƣ lịng thuyền, mặt dƣới có hai dãy lỗ khí. Cụm hoa đơn tính, khác gốc, nón đực và
nón cái mọc ở kẽ lá. Quả hình trứng, vỏ cứng, có hạt bao bọc bởi áo màu đỏ để hở đầu.
Hình 2.1: Thơng đỏ đỏ Taxus wallichiana Zucc trồng ở Đà Lạt.
2.1.1.2.
Phân bố sinh thái
Chi Taxus L. có 6 – 7 lồi trên thế giới, phân bố rãi rác ở vùng ôn đới ấm, vùng
cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao bắc bán cầu. Trong đó, có 3 lồi ở khu vực Trung và
Đơng Á, 3 – 4 lồi ở phía bắc châu Mỹ và 2 loài ở Việt Nam là T. chinensis (Pilger)
Rehder thƣờng gọi là “thông đỏ đỏ lá ngắn” và T. wallichiana Zucc. gọi là “thông đỏ
đỏ lá dài”.
6
Thông đỏ đỏ lá ngắn: Phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia và Việt Nam. Ở
Việt Nam, cây phân bố rãi rác ở một số vùng núi thuộc các tỉnh Lào Cai (Hồng Liên
Sơn); Hà Tây (Ba Vì); Nghệ An (Quỳ Châu); Hịa Bình (Mai Châu); độ cao: 900 –
1600 m.
Thông đỏ đỏ lá dài: Phân bố ở Nê pan (vùng núi Himalaya), phía bắc Mianma,
Đơng – Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin và Việt Nam. Ở Việt Nam, loài
này cũng chỉ thấy ở một số vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai (Hồng Liên Sơn);
Khánh Hịa; Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dƣơng); Hà Giang (Thái An – Quảng Bạ); độ
cao phân bố từ 1400 đến 1600 m hoặc hơn.
Bộ phận dùng: cành và lá.
2.1.2. Thành phần hóa học
Trong lá một số thơng đỏ đỏ chứa các tiền chất của Taxan.
-
Taxa 4 (20) 11 dien - 5 - 9 - 10 - 13 tetraol tetraacetat (I).
-
Taxa 4 (20) 11 dien - 5 - 9 - 10 - 13 tetraol 9 , 10 diacetat (II).
-
Taxa 4 (20) 11 dien - 2 - 5 - 9 - 10 - 13 pentaol penta acetat
(III).
-
Taxa 4 (20) 11 dien - 5 - 7 - 9 - 10 - 13 pentaol penta acetat
(IV).
-
Taxa 4 (20) 11 dien - 2 - 5 - 7 - 9 - 10 - 13 hexaol hexa
acetate (V).
-
Taxa 4 (20) - 2 - 5 - 7 - 10 tatraol - 5 - 7 - 10 triacetat - 2
- methyl butyrate (VI).
7
-
Taxa 4 (20) 11 dien - 2 - 5 - 7 - 9 - 10 pentaol - 7 - 9 - 10
triacetat 2 methyl butyrate triacetat - 2 - methyl butyrate (VII).
-
Taxin
-
14 hydroxyl – 10 deacetyl baccatin III.
-
Hai tiền chất loại oxetan taxan diterpen là: 2 debenzoyl - 14 benzoyloxy10 deaccetyl baccatin III (a) và 10, 15 – epoxy – 11 (15 1) abeo-10 accetyl baccatin III (b) cũng đƣợc phân lập và xác định cấu trúc.
-
Taxol (0,045 – 0,13%), 10-deacetyl baccatin III, brevifoliol và các chất:
-
13 deacetyl baccatin IV; 13 acetyl brevifoliol; 7, 13 – diacetyl – 7 –
debenzoyl – 10 - hydroxyl brevifoliol; 7 – acetyl – 10 – deacetyl – 7 –
debenzoyl brevifoliol; 2 acetoxy brevifoliol; 1 hydroxyl baccatin I đều
đƣợc phân lập từ lá.
-
Chất
taxoid
walifoliol,
một
chất
nhựa
lignan
(-)
3
demethyl
secoisolariciresinol, hợp chất phenolic glucosid; Taxusid cũng đã đƣợc xác
định cấu trúc.
-
Các hợp chất flavonoid và biflavonoid nhƣ sciadopitisin, sotetsuflavon
-
Các hydroxyl apocarotenoid đã đƣợc phân lập và xác định là
deglycosylicarisid B4 và 12 dehydrodeglycosylicarisid B4.
-
Lá thông đỏ đỏ cịn có betulosid sciadopitycin, ginkgetin và sequoiaflavon; 4
– coumaroyl – myo – inositol, các acid shikimic, quinic, sitosterol
vomifoliol và dehydrovomifoliol.
Quả thông đỏ đỏ chứa rhodoxanthin, eschscholz xanthon.
8
Vỏ rễ chứa một chất methoxy triterpen là baccatin (nhiệt độ nóng chảy 2190C) và
một hợp chất D có nhiệt độ nóng chảy 1610C.
Gỗ thơng đỏ đỏ chứa các chất nhựa lignan taxiresinol isotaxiresinol và
secoisosolariciresinol.
Trong tất cả các hợp chất có trong thơng đỏ đỏ thì Taxol là chất duy nhất có tác
dụng chống ung thƣ và một tiền chất của Taxol có hàm lƣợng cao trong lá cây là 10 –
DAB III.
2.1.3. Taxol và 10-DAB III
2.1.3.1.
Cơng thức hóa học
Vào những năm 60 của thế kỷ 20, Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) đã phát
hiện ra Taxol từ lồi thơng đỏ Thái Bình Dƣơng (Taxus Brevifolia). Taxol là loại thuốc
mới trong điều trị ung thƣ, kể từ khi đƣợc biết đến, Taxol đƣợc quan tâm ngày càng
nhiều trong nghiên cứu phục vụ y học.
Năm 1971, Wani cùng cộng sự đã phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của
Taxol. Theo đó, Taxol là một diterpenoid có công thức phân tử là C 47H51NO14, khối
lƣợng phân tử là 853 g/mol, có dạng tinh thể bột màu trắng, tan rất ít trong nƣớc và có
cơng thức cấu tạo nhƣ hình 2.2.
Hình 2.2: Cấu trúc phân tử Paclitaxel (Taxol)
9
Tuy nhiên, nguồn cung cấp Taxol chủ yếu từ thiên nhiên nên rất hạn chế. Theo
tính tốn, để thu đƣợc 20 – 25 kg Taxol thì cần đến 50.000 – 62.500 cây thơng đỏ. Việc
trồng cây, trích ly Taxol và các tiền chất của nó nhƣ 10 - deacetyl baccatin III (hình
2.3) có thể giải quyết sự thiếu hụt này.
Hình 2.3: Cấu trúc phân tử 10 – Deacetyl baccatin III (10 – DAB III)
2.1.3.2.
Tổng hợp và bán tổng hợp Taxol
Hàm lƣợng Taxol trong cây thông đỏ tƣơng đối thấp và cao nhất ở vỏ cây (6 - 7
tấn vỏ cây Taxus Brevfolia thu đƣợc 1 kilogam Taxol tƣơng đƣơng 2000-3000 cây).
Tuy nhiên, việc lấy vỏ có thể làm cây chết, hơn nữa thời gian trƣởng thành của cây rất
dài. Chính các vấn đề liên quan đến môi trƣờng khi thu hoạch cộng với nhu cầu ngày
càng tăng, đòi hỏi những nỗ lực trong việc phát triển nguồn cung Taxol.
Có nhiều phƣơng pháp tổng hợp Taxol đã đƣợc phát triển trong những năm gần
đây. Nhƣ tổng hợp Taxol bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào (Christen, 1989; Hu,
2003), tổng hợp hóa học (Diels-Alder; Holton, 1994; Nicolaou, 1994; Morihira, 1998),
phƣơng pháp sử dụng nấm men (Stierle, 1993)… Tuy nhiên, do hiệu suất thấp, chi phí
cho các q trình này khá cao nên chƣa có phƣơng pháp tổng hợp nào mang lại hiệu
quả kinh tế. Nguồn cung cấp Taxol chính hiện nay chủ yếu bằng con đƣờng bán tổng
hợp từ 10-DAB III, một tiền chất quan trọng của Taxol hiện diện với hàm lƣợng khá
cao trong lá của các lồi thơng đỏ (0,1 % khối lƣợng khơ trong lá của lồi thơng đỏ
châu Âu (Taxus baccata) và lồi thơng đỏ Hymalayan (Taxus yunnanensis)).
10
Từ phân tử 10-DAB III, gắn nhánh N-benzoyl-3-phenylisoserine vào nhóm
hydroxyl ở vị trí C-13 và nhóm acetyl vào vị trí 10β-hydroxyl sẽ tạo thành một phân tử
Taxol.
Hình 2.4: Cấu trúc hóa học của nhóm N-benzoyl-3-phenylisoserine
Hình 2.5: Bán tổng hợp Taxol từ 10-DAB III
Ngồi ra, từ 10-DAB III có thể bán tổng hợp Taxotere bằng cách gắn nhóm N-tbutoxylcarbonyl-3-phenylisoserine vào vị trí 13-α.
Hình 2.6: Cấu trúc phân tử Taxotere
Xu hƣớng sử dụng sản phẩm sạch, khơng cịn tạp chất đặc biệt là trong sản xuất
dƣợc phẩm ngày càng tăng. Vì vậy, việc lựa chọn một phƣơng pháp trích ly phù hợp,
11
với hiệu suất cao bằng dung môi không độc hại là một yêu cầu cấp thiết. Và phƣơng
pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn đáp ứng đƣợc các u cầu trên.
2.2. TRÍCH LY SIÊU TỚI HẠN
Trích ly siêu tới hạn là quá trình tách một chất hay một thành phần từ một ngun
liệu trong đó, dung mơi đƣợc sử dụng ở một trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới
hạn.
2.2.1. Lý thuyết siêu tới hạn
2.2.1.1. Trạng thái siêu tới hạn
Dung môi đƣợc sử dụng rất nhiều trong các ngành cơng nghiệp hóa học, dƣợc
phẩm, thực phẩm…Trong xu hƣớng tìm kiếm các dung mơi thân thiện với môi trƣờng,
dung môi siêu tới hạn ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn. Chất lỏng hay dung môi
siêu tới hạn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các q trình trích ly, phản ứng hóa học, làm
sạch và nhiều ứng dụng khác nhờ những tính chất đặc biệt của nó.
Các trạng thái vật lý khác nhau của một cấu tử tinh khiết đƣợc mô tả trong giản
đồ không gian ba chiều áp suất – thể tích – nhiệt độ (PVT) nhƣ hình 2.7. Các trạng thái
rắn, lỏng, khí tƣơng ứng với các giá trị đặc biệt của nhiệt độ và áp suất. Theo quy tắc
pha, hai pha (rắn – lỏng, rắn – hơi, lỏng – hơi) của một chất tinh khiết chỉ có một độ tự
do. Vì vậy, áp suất cân bằng trong mỗi trƣờng hợp là một hàm của nhiệt độ. Hình chiếu
PT của các đƣờng cân bằng rắn – lỏng, rắn – hơi, lỏng – hơi đƣợc mô tả bên trái của
hình 2.7.
12
Hình 2.7: Giản đồ PVT của một cấu tử tinh khiết và hình chiếu lên mặt phẳng PT
Đƣờng cân bằng lỏng – hơi bắt đầu từ điểm ba (TP) và kết thúc tại điểm tới hạn
(CP). Bản chất của điểm tới hạn có thể đƣợc hiểu theo những thay đổi tính chất của
chất lỏng dọc theo đƣờng cong áp suất hơi. Khi tăng nhiệt độ, khối lƣợng riêng pha
lỏng giảm, khối lƣợng riêng pha hơi tăng do áp suất hơi tăng. Cuối cùng, chúng hội tụ
tại điểm tới hạn và khi trên nhiệt độ tới hạn thì khơng cịn phân biệt giữa pha lỏng và
pha hơi. Khi cả nhiệt độ và áp suất trên giá trị tới hạn, đó gọi là vùng siêu tới hạn.
2.2.1.2. Đặc điểm của dung môi siêu tới hạn
Đặc điểm tới hạn của một số dung mơi đƣợc trình bày trong bảng 2.1