Nghiên cứu định lượng atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (atractylodes macrophala koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector dad​

dP
ha
rm
ac
y,

KHOA Y DƯỢC

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ine

an

TRẦN NGỌC TUÂN

M

ed
ic

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG
THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


KHOA Y DƯỢC

dP
ha
rm
ac
y,

Người thực hiện : TRẦN NGỌC TUÂN

VN

U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG
THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD

Khóa: QH2014.Y
Người hướng dẫn:

ed
ic

TS. Hồng Lê Sơn

ine

an

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN

dP
ha
rm
ac
y,

VN
U

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng
Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến và PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm
bộ môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu là những

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện
khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội và khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, đã tạo điều kiện để tơi có thể
thực hiện khóa luận này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, các Phòng ban khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội cùng tồn thể các thầy cơ giáo trong khoa đã cho tôi những kiến
thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại khoa.

ine

an

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã ln bên cạnh,
động viên tơi trong lúc khó khắn cũng như trong q trình thực hiện khóa luận này.

tháng

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

Hà Nội, ngày

Trần Ngọc Tuân

năm 2019


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu
Chromatography)

DAD

Máy đo quang (Diode Array Detector)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

ACN

Acetonitrile

USP

Dược điển Hoa Kì

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hồ hố các thủ tục đăng ký dược phẩm sử
dụng cho con người

năng

an
ine
ed
ic
M
of
ho
ol

Sc
@
ht
rig
py
Co

(High

Performance

dP
ha
rm
ac
y,

cao

VN
U

LOD

Liquid


Tên bảng

Bảng

Số trang

Hóa chất thuốc thử dùng trong nghiên cứu.

2

Trang thiết bị, máy móc sủ dụng trong nghiên cứu.

16

3

Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các
chương trình chạy đẳng dịng bằng HPLC-DAD, bước sóng
phát hiện là 220nm.

4

Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu Bạch truật với
Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD.

17

5

Các thông số đánh giá HPLC đối với Atractylenolide III.

18

6

Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng
Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn.

20
21

7

Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp
định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ
26µg/ml.

8

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng
Atractylenolide III với mẫu Bạch truật chiết với Ethanol 96%.

22

9

Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng
trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III.

22

10

Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu
Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc.

23

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

1

py
Co

VN
U

DANH MỤC BẢNG BIỂU

9
9


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Tên hình

Số trang

VN
U

Hình

Cơng thức cấu tạo một số chất chính trong cây bạch truật.

4

2

Cơng thức cấu tạo của Atractylenolide III.

7

3

Sắc ký đồ phân tích ở bước sóng 220nm - 254nm và bước
sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III.

15

4

Sắc ký đồ HPLCđánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
định lượng Atractylenolide III với mẫu thử, mẫu thử
thêm chuẩn và mẫu chuẩn.

28

5

Sắc ký đồ HPLC của Atractylenolide III với nồng độ lần
lượt là 0,065µg/ml và 0,65µg/ml.

19

6

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và
diện tích pic của dung dịch chất chuẩn Atractylenolide
III.

20

7

Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch
truật bằng HPLC-DAD.

24

8

Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu Bạch
truật Việt Nam.

24

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm
ac
y,

1


MỤC LỤC

VN
U

MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN................................................................................................2

dP
ha
rm
ac
y,

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật .................................................................................2
1.1.1. Tên khoa học ............................................................................................................2
1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng ..................................................................................2
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ....................................................................................2
1.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................................3
1.1.5. Tác dụng dược lý .....................................................................................................5

an

1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật ..................................................................................7

ine

1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III ..........................................................................8
1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật .............................8

ed
ic

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 9

2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 9

M

2.2. Trang thiết bị, dung mơi, hóa chất ............................................................................... 9

of

2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 10
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ..................................................................................... 10

ho
ol

2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu ........................................................................................ 10
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích.............................................................................. 10

Sc

2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả ................................................................ 13
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ ................................................................................................... 15

@

3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III .............................................. 15

ht

3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III....................... 15

rig

3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD ..................... 15

Co

py

3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu.............................................................. 17
3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC ................................................................................ 17

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .............................................................................. 18


3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp ............................................................................ 18

VN
U

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ........................................................... 19
3.2.3. Độ tuyến tính ........................................................................................................ 19
3.2.4. Độ thích hợp của hệ thống .................................................................................... 21

dP
ha
rm
ac
y,

3.2.5. Độ lặp lại ............................................................................................................... 21

3.2.6. Độ đúng................................................................................................................. 22
3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ Bạch truật .............. 23
CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN ................................................................................................ 25
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 26

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

TÀI LIỆU THAM KHẢO


MỞ ĐẦU

VN
U

Bạch truật là vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ
Compossitae), có vị trí quan trọng trong các bài cổ phương hoặc đơn độc tại Đông
Á trong hơn một ngàn năm nay để điều trị một số chứng bệnh như đau dạ dày, bụng

dP
ha
rm
ac
y,

trướng đầy, ung thư, chứng loãng xương và béo phì. Khoảng hơn bảy mươi hợp
chất được xác định cấu trúc hóa học trong đó đa phần thuộc về nhóm
sesquiterpenoid, phenolic acid và polyacetylene nhưng mối liên hệ với tác dụng trên
lâm sàng là chưa rõ ràng. Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết đều thể hiện tác dụng
dược lý mạnh như cải thiện hệ tiêu hóa thơng qua thế bào IEC-6, kháng một số
dịng tế bào ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, và MKN-45, kích thích miễn dịch,
kháng viêm, chống oxy hóa, và cải thiện khả nhớ của chuột. Với những lợi ích trên

an

lâm sàng và hiệu quả điều trị đã được chứng minh, cây Bạch truật bắt đầu di thực về

ine

Việt Nam từ những năm 1970 và giờ được trồng phổ biên tại Lào Cai, Sơn La, Hà
Giang, Hà Nội và Lâm Đồng. Hiện tại, các nghiên cứu công bố về hàm lượng dược

ed
ic

chất có trong Bạch truật di thực vẫn cịn hạn chế. Do đó, chúng tơi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật

M

(Atractylodes macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp

-

of

detector DAD” với hai mục tiêu dưới đây:
Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây

-

ho
ol

Bạch truật bằng phương pháp HPLC-DAD.
Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III trong

Sc

mẫu Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc.

@

Lựa chọn chất nghiên cứu là Atractylenolide III giữa các hoạt chất chính thể hiện
tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa, chống lỗng xương, cải thiện trí nhớ, và kháng

ht

viêm trên các mơ hình dược lý được giải thích như sau. Hàm lượng Atractylenolide

rig

III thấp hơn so với atractylenolide I và II có thể gây khó khăn q trình định lượng

py

nhưng điều này phản ảnh một thực tế tác dụng của cao dịch chiết Bạch truật lại tốt
hơn đơn chất riêng biệt. Kiểm sốt chất nhỏ hơn sẽ có lợi ích hơn trong trường hợp

Co

này.

1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

VN
U

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật
1.1.1. Tên khoa học.

dP
ha
rm
ac
y,

Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc
(Compossitae) [1].
1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng

Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất. Thân thẳng, cao
0.3-0.8m, đơn độc hoặc phân nhánh ở bộ phận trên, phần dưới thân hóa gỗ. Lá mọc
cách, dài. Lá ở phần dưới của thân có cuống dài, phần trên có cuống ngắn, gốc lá
rộng, bọc lấy thân. Phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, thùy giữa rất lớn, hình trứng trịn,

an

hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc không đối xứng.

ine

Các lá ở gần ngọn thân có phiến ngun, hình thn hoặc hình trứng mũi mác, mép

có răng cưa. Đầu lớn, phần dưới có một lá bắc hình lá xẻ sâu, hình lơng chim. Bao

ed
ic

hình chng, có lá bắc mỏng xếp thành 7 hàng. Lá bắc dưới nhỏ hình trứng tam
giác, to dần ở phía trên. Hoa nhiều, tràng hình ống, phần dưới màu trắng, phần trên

M

màu đỏ tím, xẻ làm 5 thùy hình mũi mác, xoắn ra ngoài. Năm nhị hàn liền nhau (có

of

nhị bị thối hóa), chỉ nhị hình sợi dẹp. Bầu thon mặt ngồi có lơng nhung, màu nâu
nhạt, đoạn trên có lơng hình lơng chim. Vịi hình chỉ màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành

ho
ol

2 thùy nơng hình đầu, mặt ngồi có lơng ngắn. Quả bế, thn, dẹp, màu xám [2].

ngà [2,10].

Sc

Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng

@

1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Đến những năm 1970, Bạch truật

ht

đã bắt đầu di thực và hiện nay được trồng tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và

rig

Lâm Đồng [2,10].

py

Thu hái và sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11

Co

(thường từ 8-22/11). Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ từng cây nhẹ
nhàng. Sau khi nhổ, lấy dao cất bỏ thân cây đem củ về chế biến [1,10].

2


khi sơ chế có thể tiến hành chế biến 2 loại Bạch truật sau:
-

VN
U

Chế biến: Bạch truật đã loại bỏ tạp chất, rửa sạch, ủ mềm, thái lát dày, làm khô. Sau

Thổ Bạch truật: Lấy bạch truật phiến, dùng bột mịn phục long cán sao đến
khi mặt ngồi có màu đất, rây bỏ đất, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 20 kg

-

dP
ha
rm
ac
y,

bột mịn phục long cán [1].

Bạch truật sao: Lấy cám mật chích, cho vào trong nồi nóng, khi khói bốc lên
thì cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém, có mùi thơm
cháy, lấy ra rây bỏ cám mật chích, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 40 kg
cám mật chích. Có thể sử dụng cám gạo thay cám mật chích [1].

1.1.4. Thành phần hóa học

an

Thành phần hóa học trong cây bạch truật đã được xác định cấu trúc gồm 67 hoạt
chất chính thuộc chia vào các nhóm sau: Sesquiterpenoids, triterpenoids,

ine

polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids, và flavonoid glycosides.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

hơn trong cây bạch truật [7].

ed
ic

Ngoài ra, hai nhóm steroid và benzoquinoneschất chuẩn Atractylennolide III

of

-

M

Chuẩn bị mẫu chuẩn:

trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml.
Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104; 52;

ho
ol

-

32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065µg/ml từ dung dịch mẹ.

Sc

Xử lý mẫu: Cân khoảng 0.2g bột dược liệu chiết với 5ml dung môi Nước, Methanol,

@

và Ethanol 30; 50; 70; 90; 96% bằng phương pháp siêu âm. Sau đó định mức với
bình định mức 5ml bằng dung mơi. Lọc dung dịch qua màng 0,45µl trước khi tiến

rig

ht

hành phân tích định lượng.
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích

py

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”

Co

(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International
Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005, các yếu tố của

10


một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính

VN
U

đặc hiệu, tính tuyến tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [5,6,22,25].
Tính đặc hiệu

Khái niệm: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác

dP
ha
rm
ac
y,

như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Trong phép
phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi

bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
Phương pháp xác định: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu, cách
này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký. Sau khi chuẩn bị mẫu thử và
phân tích mẫu thử trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào

an

mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá

ine

tính đặc hiệu.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vị trí của pic chất chuẩn và sắc

ed
ic

ký đồ của chất nền khơng có pic nào.

M

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Khái niệm: Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp

of

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và khơng cần phải

ho

ol

xác định chính xác hàm lượng.

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất

Sc

phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp.
Phương pháp xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N. LOD là nồng độ mà

@

tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3 và LOQ lại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị

ht

gần bằng 10.

rig

Độ tuyến tính

py

Khái niệm: Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại

Co

lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).

11


quan tuyến tính R2.
Phương pháp xác định:

VN
U

Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương

Khảo sát ở ít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độ khác nhau.

-

Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương

dP
ha
rm
ac
y,

-

pháp.
-

Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu.

Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R2 ≤ 1.
Độ thích hợp hệ thống

an

Khái niệm: Đánh giá độ thích hợp của hệ thống để đảm bảo hệ thống phù hợp để
phân tích. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ

ine

thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng.

ed
ic

Phương pháp xác định: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ
thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Số lần bơm tối thiểu 5 lần

M

phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm.

of

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2%.
Độ lặp lại

ho

ol

Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu
trong quá trình thực hiện.

Sc

Phương pháp xác định: Trong phân tích hàng ngày, cần thực hiện song song tối

@

thiểu 2 lần nhằm tránh được các sai số ngẫu nhiên gặp phải. Đánh giá mức độ chênh
lệch giữa hai lần làm với giá trị trung bình, sự chênh lệch này phải thỏa mãn theo

ht

yêu cầu của từng phương pháp.

rig

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2%.

Co

py

Độ đúng

12

Khái niệm: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị

VN
U

trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là
đúng.

Phương pháp xác định: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc

dP
ha
rm
ac
y,

mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng
phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:
Đối với mẫu thử:

-

Đối với mẫu trắng:

ine

an

-

ed
ic

Trong đó:
R%: Độ thu hồi %

M

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

of

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

ho
ol

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Sc

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại.

@

Yêu cầu: Độ thu hồi đạt 98 - 102% và RSD ≤ 2%.
2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

rig

ht

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê với chương trình

py

Excel thơng qua diện tích và thời gian lưu trên peak để xác định giá trị trung bình và

Co

độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Công thức áp dụng xử lý kết quả:

13


Trong đó:
là giá trị trung bình của các phép thử, được tính bằng cơng thức:

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. Trong đó SD được tính theo cơng thức:

dP
ha
rm
ac
y,

-

VN
U

-

an

Cơng thức sử dụng trên Excel: Sử dụng hàm =stdev/average.

Đánh giá kết quả thông qua các thông số: Hệ số kéo đi F, hệ số phân giải R, giá

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối RSD.

14


3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III

VN
U

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ

3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III

dP
ha
rm
ac
y,

Tiến hành khảo sát với mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 6.5µg/ml điều
kiênh cột Supleco C18, tốc độ dòng 1ml/phút, chế độ chạy sắc ký gradient dung môi

an

ACN từ 20 đến 80% trong 60 phút. Kết quả thu được như hình 3.

ine

A

B

ed
ic

Hình 3: Sắc ký đồ HPLC và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III
trong đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn ở bước sóng 1- 254nm và 2- bước sóng 220nm;

M

B – Bước sóng hấp thụ cực đại.

of

Kết quả và nhận xét: Chúng ta thấy mẫu hấp thụ cực đại ở bước sóng 220nm. Dựa
vào sắc ký đị, chúng tơi thấy rằng chất chuẩn Atractylenolide III mà chúng tơi sử

ho
ol

dụng hồn tồn đúng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất với độ tinh khiết 98%.

Sc

3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD
Chuẩn bị 1 mẫu thử với phương pháp xử lý mẫu nêu ở trên bằng dung môi Ethanol

@

96%. Tiến hành sắc ký kháo sát pha động với điều kiện sắc ký khảo sát pha động
với cột pha đảo Supleco C18, tốc độ dịng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 20µl,

Co

py

rig

ht

nhiệt độ phịng 250C và chế độ chạy đẳng dòng. Kết quả thu được như bảng 3:

15


Bảng 3: Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung mơi pha động với các chương trình

Hệ dung mơi

Sắc ký đồ
Dataf ile Name:Et-AMTQ.2.lcd
m AU
220nm ,4nm

MeOH

200

150

100

0-15

7

50

0
0.0

2.5

0

dP
ha
rm
ac
y,

Hệ 1:
Thời gian

VN
U

chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm.

5.0

7.5

10.0

12.5

m in

tR=13,044

Dataf ile Name:EtOH-AM-ACN-20-80.lcd

Hệ 2:

m AU
254nm ,4nm

5.0

CAN

an

Thời gian

2.5

20

ine

0.0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

m in

tR= 27,481

ed
ic

0-30

Datafi l e Name:n-hexan-AM-ACN gradi ent 45-50.lcd

Hệ 3:

100

mAU
220nm,4nm

of

45

ho
ol

0-30

CAN

M

75

Thời gian

Sc

Hệ 4:

@

Thời gian
0-30

CAN
43

50
25
0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

min

tR= 19,835
Dataf ile Name:Et-AM-43ACN.5.lcd
25

mAU
220nm,4nm

20

15

10

5

0

5.0

ht

0.0

10.0

15.0

rig

tR= 23,356

Co

py

tR (phút): Thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III

16

20.0

25.0

min


Kết quả: Chúng tôi thấy hệ dung môi là ACN và Nước tỷ lệ 43:57 cho sắc ký đồ tốt

VN
U

nhất, phân tách rõ ràng, pic khơng có hiện tượng kéo đuôi, thời gian lưu đủ dài để
rửa giải và không làm pic chồng lên nhau.
3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu

dP
ha
rm
ac

y,

Chúng tơi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung môi Nước, Ethanol 30%, 50%,
70%, 96%, Methanol và n-hexane, bằng phương pháp siêu âm. Từ kết quả chạy sắc
ký lỏng hiệu năng cao với các mẫu được xử lý ở trên, chúng tôi thấy rằng việc xử lý
mẫu bằng dung môi Ethanol 96% là tốt nhất.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung dịch Ethanol 96%
chiết bằng phương pháp siêu âm 3 lần trong 3 giờ. Kết quả thu được dưới bảng 4.

an

Bảng 4: Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu bạch với Ethanol 96% khi phân

Lần 1

M

Lần 2

ed
ic

Lần chiết

ine

tích bằng HPLC-DAD.
S pic
216030

24229

Lần 3

ho
ol

of

0

Kết quả: Sau 2 lần chiết, hàm lượng dược chất trong dược liệu đã hết hoàn toàn.
Lần chiết thứ 2, diện tich pic bằng 1/10 diện tích pic chiết lần 1.

Sc

Nhận xét: Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết sau âm mẫu Bạch

@

truật 1 lần trong 1 giờ.

ht

3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC

rig

Dựa vào các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xác định được điều kiện chạy sắc ký như

Co

py

sau:

-

Cột pha đảo Supleco C18 (5µm, 250 x 46mm).

-

Tốc độ dòng 1 ml/phút.

-

Nhiệt độ phòng 250C.

17


Bước sóng 220 nm.

-

Pha động là đẳng dịng với hệ dung môi ACN và Nước (43:57) trong 30
phút.

Các thông số của peak được trình bày trong bảng 5.

VN
U

-

dP
ha
rm
ac
y,

Bảng 5: Các thông số HPLC đánh giá đối với Atractylenolide III.
Thông số đánh giá

STT
1

Thời gian lưu, tR

2

Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có nồng

Giá trị
23,356

độ 26µg/ml)
Độ phân giải, R

4

Hệ số kéo đuôi pic

5

Số đĩa lý thuyết

ed
ic

ine

an

3

2452822

26,054
1,244
1662,6

M

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích

of

3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp

ho
ol

Tiến hành phân tích 4 mẫu: Dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử,
dung dịch mẫu thử thêm chuẩn và dung dịch mẫu trắng với điều kiện phân tích
HPLC đã trình bày ở trên, thu được kết quả đánh giá bằng sắc ký đồ tương ứng như

Co

py

rig

ht

@

Sc

hình 4.

Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trong đó: 1Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-Mẫu thử thêm chuẩn; 4- Mẫu chuẩn.

18


Kết quả và nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, thời gian lưu của 3 mẫu

VN
U

Atractylenolid III ở mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn là tương ứng với
nhau và trên mẫu trắng khơng có. Pic Atractylenolid III không bị trùng với các pic
khác. Phương pháp đã được xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân

dP
ha
rm
ac
y,

tích.
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Chúng tôi tiến hành chạy nền với điều
kiện đã xây dựng ở trên. Dựa vào diện
tích pic chất nền, chúng tơi tiến hành
pha lỗng dung dịch chuẩn đến khi S/N=

an

2-3 thì pha lỗng thêm một lần nữa nếu
S/N khơng nằm trong khoảng giới hạn

Hình 5: Sắc ký đồ HPLC của
Atractylenolide III với nồng độ lần lượt là
0,065µg/ml và 0,65µg/ml.

ine

trên thì giá trị đó là giá trị giới hạn phát

ed
ic

hiện LOD, từ đó suy ra giới hạn định
lượng LOQ.

M

Kết quả và nhận xét: Tại nồng độ 0.065 µg/ml tỷ lệ S/N tương ứng là 5. Từ đó

of

chúng tơi suy ra kết quả LOD với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N=3 thì giá trị LOD =
0,039µg/ml. Kết quả thu được như sau:
Giới hạn phát hiện (LOD): 0,039 (µg/ml).

-

Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (µg/ml).

ho
ol

-

Sc

3.2.3. Độ tuyến tính

@

Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ
104µg/ml đến 1,625µg/ml với các điều kiện như đã xây dựng ở trên. Kết quả khảo

rig

ht

sát giữa nồng độ và diện tích pic của dung dịch Atractylenolide tương ướng trong

Co

py

bảng 6.

19


III với dãy nồng độ chuẩn.
Nồng độ (µg/ml)

Diện tích pic (mAU.s)

VN
U

Bảng 6: Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide

Nồng độ tính lại từ đường

3.25

243363

6.5

587771

13

1111158

19.5

1643712

26

2188350

32.5

2797135

2,487
3,824
7,580

13,287
19,095

an

120783

ed
ic

ine

1.625

dP
ha
rm
ac
y,

chuẩn (µg/ml)

52

31,673

4468481

49,899

9566241

105,490

M

104

25,034

y= 91701x – 107362

R2

0,9987

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

Phương trình đường

Co

Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu
chuẩn Atractylenolide III.

20


Kết quả và nhận xét: Độ tuyến tính được đánh giá qua hệ số tương quan R2. R2 =

VN
U

0,9987 cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân
tích định lượng Atractylenolide III.
3.2.4. Tính thích hợp của hệ thống

dP
ha
rm
ac
y,

Tính thích hợp của hệ thống được thực hiện sắc ký tiêm 5 lần với một mẫu chuẩn
nồng độ 26µg/ml. Kết quả được đánh giá thơng qua giá trị độ lệch tương đối RSD
(%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 5 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu
chuẩn Atractylenolide III có nồng độ 26 µg/ml. Kết quả được trình bày dưới bảng7.

Bảng 7: Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng

an

Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml.
Diện tích pic ( mAU.s)

STT

2

23,169

2572585

23,152

2604363

23,363

M

3

2611305

ed
ic

ine

1

Thời gian lưu ( phút )

of

4

Trung bình

23,398

2687905

23,445

2620537

23,305

1,621

0,582

Sc

RSD (%)

ho
ol

5

2626525

@

Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian
lưu đều nhỏ hơn 2%, kết quả cho thấy tính thích hợp của phương pháp đã xây dựng

rig

ht

đạt.

3.2.5. Độ lặp lại

py

Độ lặp lại được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên. Độ lặp lại được

Co

đánh giá thông qua chỉ sô độ chệch tương đối (RSD) của hàm lượng dược chất
trong dược liệu

2%. Kết quả thu được trình bày trong bảng 8.

21


III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96%.
Lần 2

Lần 3

Khối lượng dược liệu (g)

0,2019

0,1975

0,1532

Hàm lượng Atractynolide III (%)

0,0822

TB hàm lượng (%)

Lần 4

Lần 5

0,1989

0,1512

dP
ha
rm
ac
y,

Lần 1

VN
U

Bảng 8: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide

0,0800

0,0789

0,0805

0,0808

0,0836
1,2691

RSD (%)

Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp

an

xây dựng có độ lặp lại cao.

ine

3.2.6. Độ đúng

ed
ic

Độ đúng được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên. Độ đúng được đánh
giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III là 98-102% theo quy
định của ICH và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 3 lần lặp lại mẫu đánh giá độ

M

thu hồi  2%. Kết quả được trình bày dưới bảng 9.

of

Bảng 9: Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng trong mẫu thử

ho
ol

thêm chuẩn Atractylenolide III.

Nồng độ

Nồng độ thêm

Nồng độ dược

dược chất

thêm chuẩn

mẫu chuẩn

chất thu hồi

(µg/ml)

(µg/ml)

19,5

rig

ht

@

(µg/ml)

Sc

Nồng độ

Co

py

24,2

23,9

Độ thu hồi

RSD

(µg/ml)

(%)

(%)

44,080

19,8801

101,95

44,097

19,8970

102,04

44,021

19,8209

101,65

47,711

23,5112

98,37

0,20

1,79
47,974

23,7744

22

99,48


101,86

54,204

29,9667

101,96

54,084

29,8840

101,68

54,067

29,8671

101,62

VN
U

24,3452

0,19

dP
ha
rm
ac
y,

29,39

49,027

Kết quả và nhận xét: Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng
Atractylenolide III trong dược liệu bạch truật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
đạt trong khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao.
3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ bạch

an

truật

Phân tích hàm lượng Atractylenolide III trên 3 mẫu dược liệu Việt Nam và Trung

ine

Quốc bằng phương pháp đã xây dựng. Kết quả được trình bày trong bảng 10 và so

ed
ic

sánh sắc ký đồ hai mẫu bạch truật Việt Nam truật và Trung Quốc dưới hình 8.
Bảng 10: Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu bạch truật Việt

Mẫu

ho
ol

Mẫu Việt Nam

of

M

Nam và Trung Quốc.
Hàm lượng Atractylenolide III(%)

M1

0,0628

M2

0,0822

Co

py

rig

ht

@

Sc

Mẫu Trung Quốc

Tên Mẫu

23

VN
U
dP
ha
rm
ac
y,
B

A

Hình 7: Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng HPLC-

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

DAD trong đó A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạch truật Trung Quốc.

Hình 8: Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu bạch truật Việt Nam.

Sc

Nhận xét: Dựa vào kết quả cho thấy trong bạch truật trồng tại Việt Nam và Trung
Quốc có hàm lượng Atractynolide III lần lượt là 0,06 và 0,08%, tương ứng. So sánh

@

phổ đồ, trong bạch truật Việt Nam xuất hiện một số pic khác (UV trong hình 8),
điều này cho thấy, bạch truật Việt Nam cần một số nghiên cứu khác về thành phần

ht

hóa học. Điều này lý giải tại sao áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông lại

Co

py

rig

thất bại trên mẫu dược liệu Việt Nam.

24