Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (ngs) để phân tích gen hbb ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh b thalassemia​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN ------

Ngơ Kim Ngân

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)
ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN
GÂY BỆNH β-THALASSEMIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------

Ngơ Kim Ngân

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)
ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN
GÂY BỆNH β-THALASSEMIA

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. DƯƠNG QUỐC CHÍNH
TS. TRẦN ĐỨC LONG

Hà Nội – 2020


Lời cảm ơn
Để thực hiện thành cơng khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu
sắc đến Tiến sĩ Dương Quốc Chính, Trưởng khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện
Huyết học – Truyền máu Trung ương cùng với Tiến sĩ Trần Đức Long người đã
hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian em thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Lê Anh, Thạc sĩ Trần Tuấn Anh
cùng toàn thể nhân viên khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương đã luôn giúp đỡ chia sẻ những kiến thức chuyên môn,
thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực
hiện luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy
cho em nhiều kiến thức quý báu. Em xin cảm ơn Bộ mơn Di truyền học, Phịng sau
đại học, Phịng cơng tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi
cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ.
Xin cảm ơn dự án “Nghiên cứu sản xuất chip sinh học trên nền DNA
microarray để chẩn đoán một số bệnh ở người” mã số 01/2017/CNC_HDKHCN
của công ty BIMEDTECH đã hỗ trợ tôi thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã động
viên, bên cạnh em trong thời gian em thực hiện luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm
2020
Sinh viên

Ngô Kim Ngân

Viết tắt
bp
DNA
Cluster

HbA
HbA2
HbE
HbF
Index

kb
MCH
MCV
PCR
RNA
WHO


MỤC LỤC
Chương 1.
1.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................... 2
Đại cương về β-thalassemia........................................................................................ 2

1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia........................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia......................................................... 3
1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia............................................................................... 5

1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia.......................................................................... 6
1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia........................................... 11
1.2.

Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia....................13

1.2.1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System)....13
1.2.2. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay).......15
1.2.3. Giải trình tự................................................................................................................... 16
1.3.

Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina - MiSeq ..............................20

1.3.1. Lịch sử phát triển........................................................................................................ 20
1.3.2. Nguyên tắc hoạt động............................................................................................... 21
1.4.

Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở Việt Nam.....24

1.4.1. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR................................. 24
1.4.2. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử........................................................... 25
Chương 2.
2.1.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................... 28
Đối tượng, hóa chất và thiết bị................................................................................ 28

2.1.1. Đối tượng....................................................................................................................... 28
2.1.2. Hóa chất......................................................................................................................... 28
2.1.3. Trình tự mồi sử dụng................................................................................................. 29

2.1.4. Thiết bị............................................................................................................................ 29
2.2.

Phương pháp nghiên cứu........................................................................................... 29

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................................ 29
2.2.2. Quy trình thí nghiệm................................................................................................. 30
Chương 3.
3.1.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................................... 37
Kết quả tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB trên hệ thống NGS..........37

i


3.1.1. Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng PCR................................................................ 37
3.1.2. Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu........................................................................... 40
3.2.

Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở các mẫu nghiên cứu...............42

3.2.1. Thông tin lần chạy máy MiSeq............................................................................. 42
3.2.2. Kết quả phân tích đột biến gen HBB.................................................................. 42
3.2.3. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB kiểm chứng lại bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger.............................................................................................. 46
3.2.4. Giá trị của các chỉ số sàng lọc trong nghiên cứu............................................ 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 50
PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB........................ a
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG

NGHIÊN CỨU...................................................................................................................................... b

ii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến gây
ra bệnh β-thalassemia [7]................................................................................................................... 7
Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường
gặp ở Việt Nam...................................................................................................................................... 9
Hình 3: Mơ tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48]..................................... 11
Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16]........................................................... 12
Hình 5: Sơ đồ mơ tả ngun lý kỹ thuật ARMS-PCR.......................................................... 14
Hình 6: Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina...................................................... 21
Hình 7: Thơng tin lần chạy trên phần mềm Sequencing Analysis Viewer...................23
Hình 8: Kết quả phân tích đột biến trên Miseq Reporter.................................................... 24
Hình 9: Kết quả phân tích đột biến trên phần mềm IGV.................................................... 24
Hình 10: Sơ đồ nghiên cứu............................................................................................................. 30
Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB chưa tối ưu................31
Hình 12: Kết quả blast cặp mồi HBB trên NCBI................................................................... 37
Hình 13: Kết quả điện di sản phầm PCR trước tối ưu trên gel agarose 1,5%.............38
Hình 14: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi điện di trên gel agarose 1.5%.....................38
Hình 15: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB sau tối ưu...................39
Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm sau tối ưu trên gel agarose 1,5%...........................39
Hình 17: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB trước khi tối ưu.................40
Hình 18: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB sau khi tối ưu.....................41
Hình 19: Kết quả giải trình tự NGS mẫu đột biến codon 26............................................. 45
Hình 20: Kết quả so sánh đột biến tại codon 26(G→T) và codon 26 (G→A) với...46
Hình 21: Kết quả kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger.........................47

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31]............................................... 3
Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31]............................... 4
Bảng 3: Trình tự mồi HBB............................................................................................................. 29
Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen HBB................................................. 31
Bảng 5: Kết quả phân tích đột biến gen HBB......................................................................... 42
Bảng 6: Tỷ lệ các loại đột biến phổ biến ở Việt Nam........................................................... 43
Bảng 7: Tỷ lệ các dạng đột biến HbE......................................................................................... 43
Bảng 8: Tỷ lệ các dạng đột biến ít gặp ở Việt Nam............................................................... 44
Bảng 9: Kết quả giải trình tự NGS và Sanger......................................................................... 47
Bảng 10: Tỷ lệ phát hiện đột biến của MCH và MCV......................................................... 49
Bảng 11: Tỷ lệ phát hiện đột biến ở các chỉ số Hb................................................................ 49

iv


ĐẶT VẤN ĐỀ
Beta thalassemia (β-thalassemia) là bệnh thiếu máu, tan máu di truyền gây ra
do giảm hoặc mất tổng hợp hồn tồn chuỗi β-globin, thành phần chính của
hemoglobin do gen HBB nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 quy định. Ở Việt
Nam, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra tình trạng thiếu máu,
tan máu nặng ở trẻ em. Người mắc bệnh β-thalassemia thể nặng đòi hỏi phải được
điều trị bằng truyền hồng cầu thay thế suốt đời và thải sắt định kỳ. Việc điều trị này
khá tốn kém và lâu dài, là gánh nặng lớn cho gia đình, xã hội và làm tăng chi tiêu
ngân sách nhà nước cho lĩnh vực y tế. Đến nay, trên thế giới đã phát hiện hơn 200
đột biến gây bệnh β-thalassemia [11], [17], [43]. Vì vậy, rất cần có một chương trình
tầm sốt bệnh β-thalassemia trong cộng đồng nhằm hạn chế sự phổ biến của gen

bệnh, trong đó việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định chính xác
loại đột biến và kiểu gen của bệnh
Giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện nhiều đột
biến. Next-Generation Sequencing (NGS) là phương pháp giải trình tự thế hệ mới
có ưu thế về hiệu suất, cho phép phát hiện nhiều đột biến cùng lúc và đang dần trở
thành công cụ trong chẩn đoán thường quy [21]. Năm 2011, hãng Illumina đưa ra
thị trường hệ thống giải trình tự thế hệ mới – MiSeq và được sử dụng trong nhiều
phòng xét nghiệm sinh học phân tử với ưu điểm cho phép phân tích ít mẫu hơn
trong mỗi lần chạy, giảm giá thành, thuận lợi hơn cho các xét nghiệm.
Vì vậy, để tăng cường hiệu quả trong việc chẩn đốn bệnh β-thalassemia
chúng tơi thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới
(NGS) để phân tích gen HBB ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh βthalassemia”. Đề tài được thực hiện tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Viện
Huyết học - Truyền máu Trung ương với 2 mục tiêu:
1.
Tối ưu quy trình “ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next
Generation Sequencing – NGS) để phân tích gen HBB”.
2.
Ứng dụng quy trình NGS để phân tích đột biến gen HBB ở một số người
nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-thalassemia.

1


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Đại cương về β-thalassemia

1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia
Thalassemia là nhóm bệnh tan máu di truyền, xảy ra do đột biến gen quy

định việc sản xuất hemoglobin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việc
vận chuyển oxy trong cơ thể. Cấu trúc của một phân tử Hb bình thường bao gồm 2
chuỗi α-globin liên kết với 2 chuỗi β-globin (α2β2) và bốn nhân Hem, phân tử này
có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy. Bệnh thalassemia gây ra do sự mất
cân bằng tổng hợp giữa chuỗi α-globin và chuỗi β-globin. Nguyên nhân là do rối
loạn quá trình tổng hợp một trong hai chuỗi dẫn đến gây thiếu hụt một loại chuỗi và
thừa lượng chuỗi còn lại làm thay đổi tỷ lệ của các phân tử huyết sắc tố dẫn đến tình
trạng bệnh lý. Số lượng chuỗi globin thừa sẽ trùng hợp tạo nên các thể vùi huyết sắc
tố. Những thể vùi này khơng có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuống
màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, thể
vùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo của màng cùng với sự gia
tăng diện tích tiếp xúc, dễ bị phá hủy bởi các tác nhân oxi hóa, từ đó dẫn đến hồng
cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương, các thể vùi trên gắn
lên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước khi
trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy xương làm cho
xương bị biến dạng, tăng hấp thụ sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể [13], [14].
Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới với ước tính khoảng 7%
dân số mang gen bệnh [31]. Theo thống kê, ở nước ta, ước tính có khoảng 12 triệu
người đang mang gen bệnh (chiếm khoảng 12% dân số Việt Nam), mỗi năm có trên
8.000 trẻ sinh ra bị bệnh, trong đó có hơn 2.000 trẻ mắc bệnh ở mức độ nặng cần
được điều trị cả đời và hơn 20.000 bệnh nhân đang cần được điều trị theo loại gen
nào bị ảnh hưởng mà phân biệt thành bệnh alpha thalassemia (α-thalassemia) và
beta thalassemia (β-thalassemia) [52].

2


1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia
Bệnh β-thalassemia xảy ra do đột biến gen HBB dẫn đến không tổng hợp
0

0

+

chuỗi globin β (β -thalassemia, ký hiệu β ) hoặc giảm tổng hợp (β -thalassemia, ký
+

++

++

hiệu β ) hoặc giảm rất ít (β -thalassempia ký hiệu β ).
Theo tổ chức y tế thế giới WHO, hiện nay có tới 1,5% dân số thế giới mang
gen bệnh β-thalassemia [20]. Căn cứ vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số
lượng alen bị đột biến, bệnh β-thalassemia được chia thành ba thể: thể nặng, thể
trung bình và thể nhẹ. Đặc điểm của các thể này được mô tả trong bảng 1.
Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31].
Chẩn đốn

β-thalassemia
thể nặng

β-thalassemia
thể trung
bình

β-thalassemia
thể nhẹ

β-thalassemia thể nặng: bệnh thường xuất hiện trong vịng 2 năm đầu đời
với tình trạng thiếu máu nặng, cần phải truyền hồng cầu thường xuyên. Biểu hiện ở
những người không được điều trị hoặc truyền máu là chậm phát triển, xanh xao,
vàng da, cơ bắp kém, viêm gan, loét chân, biến dạng hộp sọ và mặt [20].


3


β-thalassemia thể trung gian: người bệnh có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và
thường xuất hiện muộn hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng truyền
máu [20].
β-thalassemia thể nhẹ: người mắc β-thalassemia thể nhẹ thường khơng có
triệu chứng lâm sàng hoặc đôi khi bị thiếu máu nhẹ. Khi cả hai cha mẹ đều là người
mắc β-thalassemia thể nhẹ, có nguy cơ 25% ở mỗi lần mang thai có con mắc bệnh
β-thalassemia đồng hợp tử [20].
Ngồi ra, cịn có các thể β-thalassemia khác như: thể phối hợp Hemoglobin E
(HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia.
Thể phối hợp β-thalassemia và Hemoglobin E (HbE): HbE là 1 biến thể
của hemoglobin khi gen HBB bị đột biến ở codon thứ 26 (GAG→AAG), làm thay
đổi acid amin thứ 26 là Glutamic thành Lysin. Người có kiểu gen dị hợp tử hoặc
đồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemia chỉ có biểu hiện thiếu máu
nhẹ, chậm phát triển ở mức vừa phải. Ở thể phối hợp, tùy vào thể β-thalassemia mà
mức độ biểu hiện của bệnh trở nên đa dạng và được mô tả trong bảng 2.
Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31].
Thể bệnh

HbE phối hợp
+

β -thalassemia

HbE phối hợp
0

β -thalassemia

4


Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: người có kiểu gen đồng hợp
tử hoặc dị hợp tử β-thalassemia khi kết hợp với α-thalassemia làm giảm chuỗi αglobin dư thừa làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia từ thể nặng sang
thể trung gian [8].
1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia
a. β-thalassemia trên thế giới
β

-thalassemia là loại bệnh di truyền liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dân

tộc, phân bố khắp toàn cầu, song mang tính chất địa dư rõ rệt, số người mang gen
bệnh trên thế giới rất lớn [59]
Những trường hợp thalassemia phát hiện đầu tiên năm 1925 là βthalassemia
ở bờ Địa Trung Hải, là người có nguồn gốc Hy Lạp và Italia. Sau đó bệnh đã được
phát hiện ở rất nhiều nước trên thế giới. Gen bệnh β-thalassemia phân bố rất rộng
trên thế giới, từ vùng Địa Trung Hải, qua khu vực Trung Đông, tới Đông Nam Châu
Á và Bắc Phi. Theo Liên đồn Thalassemia quốc tế (2005) ước tính có 1,5% dân số
thế giới mang gen β-thalassemia, ít nhất có từ 80-90 triệu người mang gen bệnh, và
cứ mỗi năm có tới 60.000 trường hợp mới sinh mang gen bệnh. Tồn Châu Á có
trên 60 triệu người mang gen β-thalassemia. Riêng khu vực Đơng Nam Châu Á
trong đó có Việt Nam, ước tính số người mang gen βthalassemia chiếm tới 50%

người mang gen toàn cầu, khoảng 40 triệu người. Còn ở các nước phát triển, Châu
Âu và Châu Mỹ, ước tính người mang gen βthalasemia chỉ chiếm 10-13% người
mang gen trên thế giới [51][55].
Tần số mang gen β-thalassemia rất cao ở nhiều nước ở bờ Địa Trung Hải,
Châu Âu, như ở Cyprus là 10%, Hy Lạp là 8%, Albania là 8%, Italia là 4,8%. Ở
Châu Mỹ, tỷ lệ mang gen β-thalassemia ở Guyana tới 10% dân số. Ở khu vực Châu
Á tần số mang gen β-thalassemia ở Ấn Độ từ 3-17% dân số, ở Lào là 9,6%, ở Thái
Lan từ 3-9%, ở Indonesia là 4% [56] [57].
Do gen β-thalassemia phân bố rất rộng rãi trên toàn cầu, đồng thời cùng với
việc lưu hành nhiều bệnh hemoglobin khác như HbE, HbS do đó hàng năm sinh ra
một số lớn trẻ bị thể đồng hợp tử β-thalassemia cũng như thể dị hợp tử kép, phối

5


hợp với một hemoglobin bệnh khác như HbE/β-thalassemia, HbS/β-thalassemia.
Đây là những thể bệnh nặng của β-thalassemia, đòi hỏi phải điều trị suốt đời, số
đông phải phụ thuộc vào truyền máu [50] [58].
b.

β-thalassemia ở Việt Nam

Bệnh hemoglobin nói chung và thalassemia nói riêng đã được chú ý khá sớm
ở Việt Nam. Những nghiên cứu ban đầu từ thập kỷ 70, 80 và 90 ở thế kỷ XX, đều
hướng về nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng. Tiếp theo những năm gần đây đã
có một số nghiên cứu tiếp về điều trị, về đột biến gen thalassemia. Các nghiên
cứu cho đến nay ở Việt Nam đều thống nhất bệnh hemoglobin khá phổ biến, phổ
biến là α-thalasemia, β-thalassemia và HbE. Bệnh phát hiện thấy ở tất cả các tỉnh
thành trong cả nước, ở nhiều dân tộc khác nhau [52]. Bệnh phổ biến nhiều hơn ở
dân tộc ít người, ở các tỉnh miền núi và cao nguyên, so với người Kinh và vùng

đồng bằng [5]. β -thalassemia phổ biến ở người dân tộc ít người miền Bắc hơn.
Hemoglobin E phổ biến ở miền Trung và miền Nam hơn [53] [54]. Ở Việt Nam,
β0 - thalassemia phổ biến hơn β+ -thalassemia [52]
1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia
1.1.4.1. Vị trí, cấu trúc gen HBB
HBB là gen mã hóa phân tử β-globin, nó nằm trên cụm gen dài 70kb trên
cánh ngắn NST 11 [10]. Cụm gen bao gồm các gen chức năng 5’- ε – Gγ – Aγ – ψβ
– δ – β – 3’ được sắp xếp theo thứ tự biểu hiện trong quá trình phát triển của cơ thể
[24], [36].
Gen HBB dài 1600bp, mã hóa cho 146 acid amin gồm vùng 5’ khơng dịch
mã, 3 exon xen kẽ là 2 intron và kết thúc là vùng 3’ khơng dịch mã (hình 1) [7] [36],
[46]. Exon đầu tiên dài 89bp, exon 2 dài 221bp, exon 3 dài 123bp. Intron 1 có kích
thước nhỏ dài khoảng 130bp nằm giữa nucleotide thứ hai và nucleotide thứ ba của
codon 30, intron 2 có kích thước lớn hơn, dài khoảng 850bp nằm giữa codon 104 và
105 [7], [18].

6


Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến
gây ra bệnh β-thalassemia [7].
Trình tự bảo thủ quy định sự biểu hiện của gen HBB được tìm thấy ở các
vùng promoter, vị trí nối intron- exon, vùng 5’ và 3’ khơng dịch mã.
• Promoter của HBB bao gồm 3 trình tự bảo thủ: TATA box (vị trí
−28 đến −31), CCAAT box (vị trí −72 đến −76) và các trình tự CACCC lặp lại (ở vị trí từ −86 đến −90 và từ −101 đến
−105) [7],‐ [23], [46].

•

Vùng 5’ khơng dịch mã (5′ UTR) là vùng dài 50bp nằm giữa vị trí

CAP – vị trí bắt đầu phiên mã và codon mở đầu (ATG). Có hai trình tự được bảo thủ
nổi bật là CTTCTG và CACC [7], [46].
•

Vùng 3’-UTR dài 132bp nằm giữa codon kết thúc (TAA) và đi

poly (A) chứa một trình tự mang tín hiệu để gắn đi poly A là ATAAA [7], [46].
Một số đột biến tại các trình tự này là nguyên nhân gây ra β-thalassemia.
1.1.4.2. Cơ chế đột biến trên gen HBB gây bệnh β-thalassemia
Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột biến đã tìm thấy trên gen HBB chủ yếu
là đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [7], [36]. Các đột biến này xảy ra ở các
trình tự exon, intron, promoter hoặc vùng 3’-5’ khơng dịch mã. Những đột biến này
gây ảnh hưởng tới khả năng biểu hiện của chuỗi β-globin, do vậy người ta chia các
đột biến này thành 3 nhóm:
 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình phiên mã:

7


•

Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay

thế nucleotide tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp 10 - 25% lượng
+

chuỗi β-globin so với bình thường, gây β -thalassemia [48]. Ví dụ: -90 (C→T), -88
(C→T), -28 (A→G); -29 (A→G).
•

Đột biến vùng 5’ khơng dịch mã: làm giảm hiệu suất q

trình dịch mã [48]. Ví dụ: đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm tổng hợp mRNA
33% so với bình thường [41].
Đột biến ảnh hưởng tới q trình cải biến mARN
•

Đột biến tại vị trí cắt- nối intron – exon: q trình cắt nối

intron và exon xảy ra sau phiên mã cần các nucleotide GT (vị trí cho nối) đầu 5’,
AG (vị trí nhận nối) ở đầu 3’ của các intron và vùng bảo thủ xung quanh, gây cản
0

trở việc nối exon, do đó khơng tạo được mARN β-globin nên gây β -thalassemia
[48]
•

như IVS1-1 (G→T).
Đột biến tạo vị trí ghép nối giả tại vùng intron và exon: Dọc

các exon và intron đều chứa những trình tự giống với trình tự bảo thủ ở vùng biên
intron- exon nhưng thường không được sử dụng cho quá trình cắt nối. Các đột biến
này xảy ra tại các vị trí trên tạo ra các trình tự gần giống với trình tự cắt nối bình
thường. Ví dụ: IVS2-654 (C→T), IVS2-705 (T→G) và IVS2-745 (C→G).
•

Đột biến tại vị trí poly A và vùng 3’ khơng dịch mã: vị trí

AATAAA tại vùng khơng dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di

chuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm
+

protein. Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí AATAAA sẽ gây β -thalassemia, như:
AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA.
Đột biến ảnh hưởng tới quá trình dịch mã mARN
•

Đột biến codon mở đầu: là những đột biến liên quan tới codon

ATG mang tín hiệu mở đầu dịch mã.
•

Đột biến vô nghĩa: những đột biến thay thế hoặc thêm, mất

một vài nucleotide tạo ra codon mang tín hiệu kết thúc làm kết thúc sớm chuỗi và
0

tạo sản phẩm β-globin không bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây β -thalassemia
8


như: codon17 (AAG→TAG), codon 35 (TAC→TAA), codon 39 (CAG→TAG)
[45].
•

Đột biến dịch khung: những đột biến thêm hoặc mất một vài

nucleotide làm thay đổi khung đọc mở, làm kết thúc sớm hoặc thay đổi trình tự các
0

codon 41/42 (–TTCT), codon 71/72 (+A) gây β -thalassemia [48].
1.1.4.3. Một số dạng đột biến thường gặp ở Việt Nam
Ở
Việt Nam, có 9 đột biến gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia
gồm:
-28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon 26 (GAG→AAG), IVS1-1 (G→T),
IVS1-5 (G→C), codon 41/42(-TCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-654
(C→T) được mô tả ở hình 2 [43]. Những đột biến này được chia làm 2 nhóm như
sau:

Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia
thường gặp ở Việt Nam.
0

Nhóm đột biến gây β -thalassemia:
•

Đột biến codon 17 (AAG→TAG): đột biến làm thay đổi bộ ba mã
0

hóa acid amin lysin (AAG) thành bộ ba kết thúc (TAG) gây β -thalassemia [15],
[48].
•

Đột biến codon 41/42 (-TCTT): đột biến gây mất 4 nucleotide (0

TCTT) làm thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 59, gây β thalassemia [43], [48].

9

•

Đột biến codon 95 (+A): thêm 1 nucleotide A dẫn đến sự thay đổi
0

khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 101 mới gây β -thalassemia [49].
• Đột biến codon 71/72 (+A): thêm 1 nucleotide A ở giữa codon 71
và
0

72 làm thay đổi khung đọc tạo thành bộ ba kết thúc ở vị trí 72 gây β -thalassemia
[48].
•

Đột biến IVS1 -1 (G→T): đột biến ở intron 1 tại vị trí 1 gây biến đổi
0

G thành T, làm bất hoạt hồn tồn vị trí mối nối nên khơng tạo được mRNA, gây β thalassemia [47].
+

 Nhóm đột biến gây β - thalassemia:
Đột biến -28 (A→G): đột biến thay thế nucleotide ở vị trí -28 biến

•

đổi A thành G làm giảm sự biểu hiện của gen HBB, biểu hiện giảm mức mARN từ 3
đến 5 lần so với mức bình thường, hậu quả làm giảm tổng hợp chuỗi β globin gây
+

β -thalassemia [43].
•

Đột biến IVS1-5 (G→C): đột biến ở intron 1 tại vị trí thứ 5 biến đổi

G thành C, dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được
+

chuỗi β-globin, gây đột biến β -thalassemia.
•

Đột biến IVS2-564 (C→T): đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi

thành T (AAGGCAATA→AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới, gây đột biến
+-

β thalassemia [43].
• Đột biến codon 26 (GAG→AAG): tại vị trí codon thứ 26 thuộc
exon
1
xảy ra đột biến GAG→AAG, sự thay thế một nucleotide này gây ra 2 biểu
hiện:
-

Quá trình cắt intron nối exon xảy ra bình thường, tạo nên chuỗi β-

globin có sự thay đổi ở acid amin thứ 26 là glutamic thành lysin hình thành nên
Hemoglobin E [48].
-

Kích hoạt một vị trí cắt- nối mới trên phân tử tiền mRNA làm ngắn
+

chuỗi β-globin gây nên β -thalassemia (hình 3) [48].


10


Hình 3: Mơ tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48].
Đột biến tại codon 26 kích hoạt mối nối mới giữa vị trí cho nối GT của codon 25
trên exon 1 với vị trí nhận nối AG của codon 30 thuộc exon 2 làm mất 16 nucleotide trên
+

phân tử mRNA, làm ngắn chuỗi β–globin gây ra β -thalassemia.
+

Đột biến này vừa tạo nên biến thể HbE vừa gây β -thalassemia. Chính vì vậy
đột biến tại codon 26 gây bệnh HbE là một thể β-thalassemia đặc biệt.
1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia
Những phương pháp trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia được chia
làm 3 nhóm chính tương ứng với 3 giai đoạn trong q trình sàng lọc. Một là nhóm
phương pháp sàng lọc ban đầu bao gồm những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, chi
phí thấp, thời gian thao tác nhanh, áp dụng với lượng mẫu ít và có thể dễ dàng áp
dụng ở cả các cơ sở y tế. Hai là nhóm phương pháp phân tích và định lượng
hemoglobin cho phép phân loại bệnh thalassemia với 2 kỹ thuật là điện di mao quản
và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Ba là nhóm phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh
học phân tử nhằm xác định cụ thể những đột biến gây bệnh. Sơ đồ sàng lọc cụ thể
được mô tả ở hình 4.

11


Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16].
1.1.5.1. Phân tích tế bào máu ngoại vi
Hầu hết các quy trình chẩn đốn bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử dụng
phương pháp phân tích các chỉ số hồng cầu để để sàng lọc người mang gen bệnh
thalassemia. Hai chỉ số cần quan tâm là thể tích trung bình hồng cầu (MCV) và
lượng hemoglobin trung bình hồng cầu. MCV < 80 fL trong trường hợp thiếu máu
thiếu sắt hoặc bị thalassemia, MCH < 27pg có nghĩa là hồng cầu nhược sắc. Khi
MCH < 27 pg kết hợp với MCV < 80fL sẽ có đặc điểm thiếu máu nhược sắc, đây là
biểu hiện đặc trưng của bệnh thalassemia (hình 4) [16]. Tuy nhiên ở một số nơi có
tỷ lệ mắc bệnh cao nhưng nguồn lực còn hạn chế và cơ sở vật chất không đầy đủ
như khu vực nông thôn ở Đông Nam Á, Ấn Độ và các quốc gia Nam Á thì việc sử
dụng xét nghiệm tủa HbE (Dichlorophenol Indophenol)- DCIP để sàng lọc HbE là
lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [13].

12


Tuy vậy, DCIP lại có tỉ lệ dương tính giả rất cao, những người dương tính sẽ phải
tiếp tục tầm soát bằng huyết đồ.
1.1.5.2. Điện di huyết sắc tố
Tất cả những mẫu có kết quả xét nghiệm tế bào máu ngoại vi MCV < 80fL,
MCH < 27 pg phải tiếp tục kiểm tra bằng điện di huyết sắc tố. Kết quả điện di huyết
sắc tố cho biết lượng huyết sắc tố bình thường cũng như sự xuất hiện của các huyết
sắc tố bất thường trong máu.
Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của cơ thể.
Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, được tạo thành từ

2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2). Sau khi sinh, chuỗi γ không được
tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β tạo hemoglobin ở người trưởng thành gồm
HbA1 (α2β2) và HbA2 (α2δ2) [3]. Trong bệnh β-thalassemia, chuỗi β-globin không
được tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ, α dẫn tới tình trạng giảm
HbA1, tăng HbF và HbA2. HbA2 ≥ 4.0% là chỉ số thường được dùng để chẩn đốn
β-thalassemia. Trường hợp có HbA2 ≥ 4,0% và các chỉ số hồng cầu MCH, MCV
đều giảm sẽ nghi ngờ mang gen bệnh β-thalassemia [13]. Còn khi HbA2 > 4.0%
nhưng chỉ số hồng cầu bình thường thì có thể gặp trong trường hợp thiếu vitamin
B12/folate, trong bệnh gan hoặc nhiễm HIV. Các trường hợp có HbA2 từ 3.3-3.9%
cần khẳng định thêm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Đối với các trường hợp có
đột biến codon 26 (G→A) gây thể HbE sẽ xuất hiện HbE ≥ 25%. Do đó, HbA1,
HbF, HbA2 và HbE được coi là các tiêu chuẩn sàng lọc trong điện di hemoglobin
đóng vai trị quyết định để chẩn đốn bệnh β-thalassemia (hình 4) [3].
1.2.

Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia

1.2.1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System)
1.2.1.1. Nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR
ARMS-PCR là PCR đặc hiệu alen hay PCR khuếch đại alen đặc hiệu, được
sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện đột biến điểm [33], [42], [44].

13


Kỹ thuật này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3’
của mồi bắt cặp với nucleotide trên sợi khn. Nếu nucleotide ở đầu 3’ của trình tự
mồi khơng bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể kéo dài để tổng
hợp sợi mới được. Do đó, kỹ thuật này địi hỏi nucleotide đầu 3’ phải mang tính đặc
hiệu [33]. Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-PCR bao gồm mồi bình thường và

mồi đột biến. Mồi bình thường đặc hiệu cho trình tự DNA bình thường, khơng
khuếch đại được trình tự DNA đột biến và ngược lại (hình 5). Sự có mặt của đột
biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA được khuếch đại với các kích thước đã biết
trước. Trong phản ứng ARMS-PCR cịn có một cặp mồi nội chuẩn nhằm khuếch đại
vùng gen đích khơng có đột biến để tránh trường hợp âm tính giả do các nguyên
nhân như: quá ít hoặc quá nhiều khuôn DNA, chất lượng DNA không tốt, không có
mồi, khơng có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức
chế phản ứng PCR [33], [39].

Hình 5: Sơ đồ mơ tả ngun lý kỹ thuật ARMS-PCR
Hai cặp mồi được thiết kế để khuếch đại kiểu đột biến và kiểu bình thường có một mồi chung
Forward (F) và hai mồi Reverse riêng biệt (Rm và Rw). Sự khác nhau của hai mồi này nằm ở vị trí
đánh dấu X. Mồi dành cho đột biến chỉ khuếch đại được DNA có chứa đột biến X và ngược lại.

1.2.1.2. Ưu điểm
− Phù hợp để phát hiện các đột biến điểm.
− Cho phép phát hiện thể thường với thể đột biến đồng hợp đột biến và dị
hợp.

14


− Nhanh, ít tốn kém, khơng u cầu mồi phải đánh dấu hay hệ thống phát
hiện phức tạp [33].
1.2.1.3. Nhược điểm
− Kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến và đa hình đã biết. Do
đó, muốn phát hiện một đột biến hoặc đa hình chưa biết cần kết hợp với các
phương pháp chẩn đoán phân tử khác như giải trình tự.
− Đối với phản ứng đơn ARMS-PCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ
có thể phát hiện được một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém. Để giải quyết

vấn đề này, kỹ thuật multiplex ARMS-PCR đã được phát triển cho phép phát
hiện nhiều đột biến trong cùng một phản ứng [33].
1.2.2. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay)
1.2.2.1. Nguyên lý:
Các bazơ nitơ giữa hai mạch đơn của sợi DNA liên kết với nhau theo nguyên
tắc bổ sung (A liên kết với T và G liên kết với C) thông qua các mối liên kết hydro
để tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Dưới các yếu tố biến tính như: nhiệt độ cao,
kiềm... liên kết hydro có thể bị phá vỡ, phân tử DNA sợi kép có thể tách thành các
sợi đơn. Khi các yếu tố biến tính bị loại bỏ, hai mạch đơn có thể tái liên kết thành
dạng sợi đôi. Hiện tượng các sợi đơn DNA từ các nguồn khác nhau và có trình tự
tương đồng, chúng có thể bắt cặp với nhau được gọi là hiện tượng lai [50].
Kỹ thuật lai điểm ngược thường được dùng để đột biến điểm. Các cặp đầu dò
(probe) là các oligonucleotide đặc hiệu có trình tự bổ sung với trình tự DNA thường
và DNA đột biến được gắn cố định trên màng. DNA khuôn bao gồm DNA thường
và DNA đột biến được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đánh
dấu bằng biotinylate. Sản phẩm PCR được lai với các oligonucleotide trên màng.
Khi bổ sung streptavidin- horseradish peroxidase lên màng, chất này sẽ tạo màu với
biotinylate và dễ dàng nhận thấy bằng mắt thường [32].
Strip assay là bộ kit xây dựng dựa trên hai kỹ thuật Multiplex PCR và lai
DNA ngược (Reverse hybridization), sử dụng thanh test strip có đính nhiều đầu dị
để phát hiện đồng thời nhiều đột biến và xác định tính đồng hợp/ dị hợp tử của đột

15