Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của một số hợp chất tự nhiên bằng phương pháp tính toán

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

TRẦN THỊ HÀ THÁI

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH TỐN

CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ HĨA HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2006


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học:
1. TS. Phạm Thành Quân
2. ThS. Lê Thanh Hưng

Cán bộ chấm nhận xét 1:
PGS.TS. Lê Ngọc Thạch

Cán bộ chấm nhận xét 2:
PGS.TS. Bùi Thọ Thanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày . . . . . tháng . . . . năm 2006


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do - Hạnh phúc

Tp. HCM, ngày . . . . tháng . . . . năm 2006
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: TRẦN THỊ HÀ THÁI ....................................Phái: Nữ
Ngày, tháng, năm sinh: 30/4/1981 .............................................Nơi sinh: Tiền Giang
Chuyên ngành: Công nghệ Hóa Hữu cơ ....................................MSHV: 00504122
I- TÊN ĐỀ TÀI:
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của của một số hợp chất tự nhiên
bằng phương pháp tính tốn
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
1. Khảo sát mối liên hệ giữa độ bền của một số gốc tự do phenolic với mức độ
phân bố đều của electron độc thân của nó.
2. Tìm phương pháp tính tốn thích hợp
3. Khảo sát mối liên hệ giữa độ bền của các gốc tự do và khả năng kháng oxy
hóa của các gốc tự do flavonoid. So sánh với các giá trị tính tốn khác.
4. Khảo sát gốc tự do catechin trà xanh và khả năng kháng oxy hóa của chúng
5. Khảo sát cơ chế quét gốc tự do của hợp chất kháng oxy hóa họ phenolic
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ (Ngày bắt đầu thực hiện LV ghi trong Quyết định
giao đề tài): ...................................................................................................................
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:.................................................................

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Phạm Thành Quân ; ThS. Lê Thanh Hưng
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MÔN
QL CHUYÊN NGÀNH

TS. Phạm Thành Quân
ThS. Lê Thanh Hưng
Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thơng qua.
TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH

Ngày
tháng
năm 2006
TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH


Lời cảm ơn
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Thành Quân và ThS. Lê Thanh Hưng,
các thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành tốt luận văn.
Cảm ơn Quý thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đã có những nhận xét quý báu cho các
kết quả của luận văn.
Cảm ơn Quý thầy cô, các anh chị ở Phịng Thí nghiệm Hóa tính tốn, bộ mơn Cơng
nghệ Hóa Hữu cơ đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo tất cả điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện
tốt đề tài.
Cảm ơn Quý thầy cô, các anh chị ở Cơ quan Văn phịng ĐHQG-HCM đã giúp đỡ
nhiệt tình trong q trình học tập và thực hiện luận văn.
Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, hỗ trợ tơi hồn thành tốt luận văn.
Trân trọng,

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2006
Trần Thị Hà Thái


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Sử dụng phương pháp hàm mật độ nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của các
hơp chất tự nhiên phenolic, đặc biệt là hợp chất flavonoid. Đề tài ở đây tập trung
nghiên cứu mối liên hệ giữa mật độ phân bố electron độc thân trên cấu trúc tự do và độ
bền của các gốc tự do cũng như khả năng bắt giữ gốc tự do của các hợp chất flavonoid.
Tất cả tính tốn được thực hiện trong pha khí và trong nước.
Kết quả đạt được như sau:
1. Gốc tự do càng bền khi electron độc thân càng phân bố đều trên cấu trúc của nó,
tương ứng với giá trị mật độ phân bố electron cao nhất trên nguyên tử (Highest
Spin Density – HSD) là nhỏ nhất.
2. Đối với gốc tự do phenolic, giá trị HSD nhỏ hơn 0.5. Đối với hợp chất flavonoid,
các gốc tự do bền có giá trị HSD từ 0.31 – 0.37 trong pha khí, 0.29- 0.37 tính
trong nước.
3. Độ bền của gốc tự do là một yếu tố quan trọng xác định khả năng kháng oxy hóa
của các chất.
4. Tính tốn HSD phù hợp với kết quả tính tốn BDE và IP ở các nghiên cứu khác
nhưng khối lượng tính tốn lại đơn giản hơn nhiều.
5. Trong thực nghiệm, khả năng kháng oxy hóa thường được đo bằng khả năng quét
gốc tự do, đặc trưng bởi tỉ số nradical/nantioxidant. Tính tốn giá trị HSD cho kết quả
tương quan tốt với tỉ số nradical/nantioxidant. Chất kháng oxy hóa mạnh có tỉ số
nradical/nantioxidant càng lớn và giá trị HSD của gốc tự do là càng nhỏ
6. Đối với các phân tử catechin trà xanh, các gốc tự do bền có giá trị HSD nằm gần
nhau, 0.37 – 0.38 trong pha khí và 0.33 – 0.34 trong nước. Tính tốn HSD phù
hợp với các kết quả thực nghiệm, giải thích được khả năng kháng oxy hóa của các
chất.
Về cơ bản, tính tốn giá trị HSD có thể giải thích độ bền gốc tự do, khả năng bắt

giữ gốc tự do cũng như hoạt tính kháng oxy hóa của các hợp chất.


ABSTRACT
A density functional - based method has been applied to study the antioxidant
activity of phenolic compounds, especially flavonoids. The study has concerned the
determination of the Highest spin density –HSD- according to the stability of radicals
and the scavenging activity of antioxidants. All HSD values were calculated in gas
phase and water solution.
The achieved results of the thesis are:
1. The radicals that had the smallest value of HSD were referred to the most
stable radical species.
2. The HSD values were less than 0.5 for phenolic radicals in gas phase. For
flavonoid radicals, the HSD values of the stable radicals lied at 0.31 – 0.37 in
gas phase, and 0.29- 0.37 in water solution.
3. The stability of radicals was found to be an important factor to determine the
scavenging activity of antioxidants.
4. There was a correlation between the HSD values and computed BDE and IP
values: strong antioxidants had the low HSD, BDE and IP values.
5. The antioxidant activity of phenolic compounds was represented by free
radical scavenging activity which was measured by the molar ratio
(nradical/nantioxidant). A good correlation between the HSD value and molar ratio
was found. It was observed that an active antioxidant had the smallest HSD
value and the biggest molar ratio.
6. For green tea stable radicals, the stable radicals had similar values in HSD,
lied at 0.37 – 0.38 in gas phase and 0.33 – 0.34 in water. The HSD values
were found to be in good agreement with experimental data. Thus, the
antioxidant activity of green tea catechins could be explained.
On the basic of the computed HSD values, the stability of radicals can be
explored and give a relative trend of the activity and scavenging of antioxidant

radicals.


i

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN ................................................................................. 3

1.1

Đại cương về các hợp chất tự nhiên kháng oxy hóa ................................... 3

1.1.1 Q trình oxy hóa và khả năng kháng oxy hóa của cơ thể .......................... 3
1.1.2 Giới thiệu các hợp chất kháng oxy hóa........................................................ 5
1.1.3 Cơ chế phản ứng của các chất kháng oxy hóa ............................................. 6
1.1.4 Các phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa............................................. 9
1.2

Hợp chất flavonoid và khả năng kháng oxy hóa của chúng .................... 11

1.2.1 Giới thiệu về hợp chất flavonoid.............................................................. 11
1.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất flavonoid .................................... 14
1.2.3 Ảnh hưởng của cấu trúc đến khả năng kháng oxy hóa của flavonoid ....... 16
1.2.4 Khả năng kháng oxy hóa và hoạt tính sinh học của flavonoid .................. 17

1.3

Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa của flavonoid ................ 19

1.3.1 Các nghiên cứu bằng phương pháp thực nghiệm....................................... 19
1.3.2 Các nghiên cứu bằng phương pháp tính tốn............................................. 23
1.4

Hóa học tính tốn – Cơ sở lý thuyết........................................................... 25

1.4.1 Phương trình Shrưdinger............................................................................ 25
1.4.2 Giải phương trình Schrưdinger bằng phương pháp Hartree-Fock ............. 26
1.4.3 Các phương pháp bán thực nghiệm và sau Hartree-Fock .......................... 28
1.4.4 Mật độ phân bố của eleclectron độc thân (spin density)............................ 29
1.4.5 Các thơng tin thu được từ tính tốn. .......................................................... 30
CHƯƠNG 2

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................... 33

2.1

Đặt vấn đề ..................................................................................................... 33

2.2

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 34

2.3

Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 35

2.3.1 Khảo sát sự tương thích giữa HSD và độ bền của gốc tự do phenolic ...... 35
2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp tính đến kết quả HSD ................... 36


ii

2.3.3 Khảo sát khoảng giá trị của HSD tương ứng cho các gốc tự do của hợp
chất kháng oxy hóa họ flavonoid .......................................................................... 36
2.3.4 Khảo sát độ bền của các gốc tự do catechin trà xanh và khả năng kháng
oxy hóa của chúng................................................................................................. 37
2.3.5 Khảo sát khả năng phản ứng xảy ra theo cơ chế chuyển electron ............. 38
CHƯƠNG 3
3.1.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN......................................................... 39

Khảo sát sự tương thích giữa HSD và độ bền của gốc tự do ................... 39

3.1.1 Khảo sát độ bền của các gốc tự do hợp chất CX3 . .................................... 40
3.1.2 Khảo sát độ bền các gốc tự do dẫn xuất của phenol ................................. 41
3.1.3 Khảo sát gốc tự do của hợp chất polyphenol ............................................. 43
3.1.4 Nhận xét ..................................................................................................... 46
3.2.Ảnh hưởng của phương pháp tính đến giá trị Highest spin density - HSD 48
3.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp tính và basis set .......................................... 48
3.2.2 Ảnh hưởng của dung môi đến giá trị HSD ................................................ 49
3.3.

Khảo sát khoảng giá trị HSD tương ứng cho các gốc tự do của hợp các

chất kháng oxy hóa họ flavonoid ........................................................................... 51
3.3.1. Giá trị HSD của các gốc tự do 4’-OH họ flavonoid .................................. 51
3.3.2. Ảnh hưởng của dung môi đến giá trị HSD ................................................ 55
3.3.3. So sánh sự tương thích của kết quả tính tốn với các kết quả nghiên cứu
trước đó ................................................................................................................. 57
3.3.4. Nhận xét ..................................................................................................... 60
3.4.

Khảo sát độ bền của các gốc tự do catechin trà xanh .............................. 62

3.4.1 Cấu trúc bền của các gốc tự do phân tử catechin....................................... 63
3.4.2 Quan hệ giữa năng lượng tương quan và mức độ phân bố electron .......... 69
3.4.3 Kết luận về độ bền và khả năng kháng oxy hóa của catechin trà xanh ..... 71
3.5.

Khảo sát khả năng phản ứng xảy ra theo cơ chế chuyển electron.......... 73

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN CHUNG.................................................................. 77

KIẾN NGHỊ

......................................................................................................... 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………… 80


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Sơ đồ 1.1 Cơ chế q trình oxy hóa lipid ...............................................................................3
Sơ đồ 1.2 Sơ đồ q trình oxy hóa lipid .................................................................................4
Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của flavonoid ...............................................................................11
Hình 1.4 Cấu trúc của flavonoid, phân loại dựa vào vịng C .............................................12
Hình 1.5 Vị trí các hợp chất flavonoid gắn các ion kim loại .............................................15
Hình 1.6 Cơ chế bắt gốc tự do ROS của flavonoid ............................................................15
Hình 1.8 Phản ứng hai giai đoạn của quercetin và gốc tự do galvinoxyl tạo thành
dạng quinone ............................................................................................................................20
Hình 1.9 Cơng thức cấu tạo của Trolox ................................................................................22
Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo của quercetin .........................................................................23
Hình 1.11 Phản ứng giữa gốc tự do .OOH và coenzyme Q ...............................................24
Hình 1.12 Phản ứng giữa gốc tự do và a-tocopherol .........................................................25
Hình 1.13 Sơ đồ các bước tính tốn cơ bản của Hóa tính tốn .........................................30
Hình 1.14 Mẫu file input tính tối ưu hóa cấu trúc ...............................................................31
Hình 1.15. Kết quả đọc ở file out put....................................................................................31
Hình 1.15 Mẫu file output tính tối ưu hóa cấu trúc .............................................................31
Hình 3.1 Cấu trúc khảo sát nhóm I và giá trị HSD của chúng ..........................................40
Hình 3.2 Cấu trúc khảo sát nhóm II và giá trị HSD của chúng .........................................41
Hình 3.3 Cấu trúc khảo sát nhóm III và HSD của chúng ...................................................43
Hình 3.4 Cấu trúc khảo sát nhóm IV và HSD của chúng ...................................................45
Hình 3.5 Cấu trúc gốc tự do C6H5O. .....................................................................................48
Hình 3.6 Cấu trúc các hợp chất flavonoid khảo sát ............................................................51
Hình 3.7 Sự phân bố electron độc thân trên cấu trúc của gốc 4’-OH flavonoid .............53
Hình 3.8 Giá trị HSD trong pha khí, dung mơi ethanol và nước. .....................................56
Hình 3.9 Quan hệ giữa giá trị HSD và các giá trị thực nghiệm .........................................59
Hình 3.10 Cấu trúc của bốn loại catechin chính trong trà xanh. .......................................62
Hình 3.11 Sự phân bố electron của các gốc tự do 4’-OH catechin trà xanh ...................69
Hình 3.12 Tương quan giữa giá trị HSD và Erel tính trong pha khí và trong nước .........70
Hình 3.13 Cơ chế phản ứng giữa gốc tự do .OH và phenol ...............................................73

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3. 1 Năng lượng và mức độ phân bố electron của các cấu trúc từ 1 đến 9. ..........40
Bảng 3. 2 Năng lượng và mức độ phân bố electron của các cấu trúc từ 10 đến 16. ......42
Bảng 3. 3 Năng lượng và mức độ phân bố electron của các cấu trúc từ 17 đến 23. ..... 43
Bảng 3. 4 Năng lượng và mức độ phân bố electron của các cấu trúc từ 24 đến 32. .....45
Bảng 3. 5 Năng lượng và giá trị HSD của phenoxyl theo các phương pháp tính ..........48
Bảng 3. 6 Năng lượng và giá trị HSD của phenolxyl trong các dung mơi .....................49
Bảng 3. 7 Kết quả tính tốn giá trị HSD gốc tự do 4’-OH của hợp chất flavonoid .......52
Bảng 3. 8 Giá trị HSD của một số chất kháng oxy hóa tổng hợp ....................................52
Bảng 3. 9 Giá trị HSD tính tốn trong các dung mơi khác nhau ......................................55
Bảng 3. 1So sánh giá trị HSD với giá trị BDE và IP (pha khí) ..................................... 57
Bảng 3. 11So sánh giá trị HSD với các giá trị thực nghiệm .......................................... 59
Bảng 3. 12Năng lượng tổng cộng của các gốc tự do catechin trong pha khí ..................63
Bảng 3. 13Năng lượng tương quan và giá trị HSD của các gốc tự do catechin .............64
Bảng 3. 14 Năng lượng của các chất trong phản ứng giữa phenol và OH. theo cơ chế

hình thành gốc tự do (cơ chế chuyển H) và cơ chế hình thành ion gốc tự do (cơ chế
chuyển điện tử). .......................................................................................................................74
Bảng 3. 15Năng lượng của các chất trong phản ứng giữa phenol và gốc tự do .OCH3

theo cơ chế chuyển H và cơ chế chuyển electron............................................................... 75
Bảng 3. 16Năng lượng phản ứng giữa phân tử phenol và gốc tự do .OC2H5 theo cơ chế
chuyển H và cơ chế chuyển electron ....................................................................................76


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS 2,2’-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]
BDE Bond Disociation Enthalpy
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EC

(-) – epicatechin

ECG (-) – epicatechin gallate
EGC (-) – epigallocatechin
EGCG (-) – epigallocatechin gallate
EPR Electron Paramagnetic Resonance
ESR Electron Spin Resonance
HSD Highest Spin Density
HAT Hydrogen Atom Transfer
IP

Ionization Potential

ROS Reactive Oxigen Spieces
SET

Single Electron Transfer


1

MỞ ĐẦU
Kháng oxy hóa, kháng ung thư, kháng lão hóa,… luôn là một vấn đề thời sự

hàng đầu được con người quan tâm. Qua nhiều thập niên, các cơng trình nghiên cứu đã
mang lại rất nhiều hiểu biết về nguyên nhân và cơ chế của các q trình oxy hóa xảy ra
trong cơ thể con người. Trên cơ sở đó nhiều biện pháp kháng oxy hóa đã được nghiên
cứu và áp dụng như kiểm soát chế độ ăn uống, tổng hợp các chất kháng oxy hóa. Tuy
nhiên sau thời kỳ lạm dụng các hóa chất tổng hợp nhân tạo, khuynh hướng hiện nay là
sử dụng các chất hợp chất tự nhiên có chứa các thành phần kháng oxy hóa.
Người ta đã phát hiện ra các chất kháng oxy hóa trong rất nhiều loại rau quả.
Các nghiên cứu ứng dụng tập trung vào việc thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa của
các loại rau quả, phân tích thành phần cấu trúc của các tác nhân kháng oxy hóa, xác
định hàm lượng, phương pháp chiết tách. Tuy nhiên vấn đề cơ bản nhất là cơ chế hoạt
động của các tác nhân kháng oxy hóa, mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính kháng oxy
hóa vẫn là các vấn đề cịn đang được nghiên cứu và chưa có câu trả lời thỏa đáng.
Về nguyên tắc, một chất có khả năng kháng oxy hóa AH là chất có thể phản ứng
với các gốc tự do để ngăn chặn các phản ứng phát triển mạch tiếp theo sau đó làm hủy
hoại các tế bào trong cơ thể. Sản phẩm của phản ứng trên thường là một gốc tự do mới
A. tạo ra theo cơ chế được đề nghị như sau:
HO· + AH ® HOH + A·
và/hoặc

HO· + AH ® HO – + AH +· ® HOH + A·

(1)
(2)

Gốc tự do mới A. phải tương đối bền nếu khơng thì q trình trên chỉ là thay
một gốc tự do hoạt động này bằng một gốc tự do hoạt động khác. Các chất là ứng cử
viên để sử dụng làm chất kháng oxy hóa phải thỏa mãn điều kiện tiên quyết trên. Để
khảo sát vấn đề này nhiều phương pháp đã được đề nghị và sử dụng.
Các nghiên cứu thực nghiệm không dễ xác định được độ bền của gốc tự do.
Người ta phải cho chất quan tâm tác dụng với các nguồn tạo gốc tự do hoạt động để

đánh giá mức độ kháng oxy hóa của nó. Việc này sẽ tốn nhiều thời gian và cơng sức.
Các nhà nghiên cứu sử dụng phương pháp tính tốn thì đề nghị dùng đại lượng năng


2

lượng liên kết A—H để đánh giá. Chất có liên kết A—H càng yếu càng dễ mất hydro
theo cơ chế (1) và tương ứng tạo ra gốc tự do A. bền. Một đại lượng khác cũng được đề
nghị là năng lượng ion hóa. AH có năng lượng ion hóa thấp sẽ dễ dàng tạo thành A.
theo cơ chế chuyển electron và tiếp theo là chuyển proton (2).
Trong luận văn này chúng tơi áp dụng phương pháp tính tốn để khảo sát độ
bền của các gốc tự do bằng cách tính toán sự phân bố của electron độc thân trong gốc
tự do. Gốc tự do có sự phân bố electron độc thân giải tỏa đều trên các nguyên tử sẽ có
độ bền cao. Việc tính tốn đơn giản hơn nhiều so với phương pháp tính năng lượng
liên kết và ion hóa. Kết quả thu được cho thấy đại lượng này rất thích hợp và tin cậy để
ước lượng khả năng kháng oxy hóa của một chất cho trước.


3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về các hợp chất tự nhiên kháng oxy hóa
1.1.1 Q trình oxy hóa và khả năng kháng oxy hóa của cơ thể
Trong suốt q trình trao đổi chất của các tế bào bình thường, khoảng 98% phân
tử oxy chuyển thành nước thơng qua q trình trao đổi electron và sự phosphoryl hóa
oxy hóa, cịn lại 2% chuyển thành dạng anion superoxid (O2-) và hyđrogen peroxide
(H2O2) [6, 18]. Sản phẩm của quá trình khử oxy từng phần này có thể chuyển thành

.

các gốc phản ứng, như gốc hydroxyl ( OH) chẳng hạn. Các gốc tự do này tấn công
vào các phân tử lipid trong màng tế bào, phân tử protein trong các mô hoặc enzyme,
carbohydrate và DNA gây nên sự oxy hóa [1, 6]. Hậu quả là làm hư hỏng màng tế
bào, làm biến đổi protein, làm hại DNA, và là nguyên nhân chính gây ra một số bệnh
như bệnh tim, bệnh đục nhân mắt, ung thư, .[6, 10, 11, 34]. Phản ứng oxy hóa lipid
xảy ra theo cơ chế gốc tự do (Sơ đồ1.1, Sơ đồ 1.2) [14, 33]
Giai đoạn khơi mào:
RH ® H. + R.

(1.1)

(R. - gốc tự do của lipid tại vị trí CH2 của nhóm allylic)
Giai đoạn phát triển mạch:
R. + O2 ® ROO. (gốc tự do peroxyl của lipid)

(1.2)

ROO. + RH ® R. + ROOH (hydroperoxyt của lipid) (1.3)
ROOH có thể bị phân hủy bởi nhiệt, bức xạ hoặc ion kim loại
ROOH + Fe2+ ® RO. + Fe3+

(1.4)

ROOH + Fe3+ ® ROO. + Fe2+

(1.5)

Giai đoạn kết thúc mạch:

R. + R. ® R-R

(1.6)

ROO. + R. ® ROOR

(1.7)

ROO. + ROO. ® ROOR + 1O2 (singlet oxygen)

(1.8)

Sơ đồ 1.1 Cơ chế quá trình oxy hóa lipid


4

hu

sens: chất cảm quang

sens*
1
3

O2

O2

Oxi hóa

xúc tác enzym
RH
3

O2

Quang oxi hóa

LH

ion kim loại
ROOH

lipoxigenase
ROO

OH

nhiệt độ

Phân hủy

RO
ROO

Tự oxi hóa
R
H

ion kim loại RH

Đồng oxi hóa

hu, nhiệt độ

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ q trình oxy hóa lipid
Con người có thể tạo ra hệ thống kháng oxy hóa, chống lại sự hình thành hoặc
làm giảm hoạt tính các gốc tự do. Đó là hệ thống kháng oxy hóa do chính cơ thể con
người tạo ra (nội trường) và hệ thống kháng oxy hóa từ nguồn thức ăn đưa vào cơ thể
(ngoại trường). Hệ thống kháng oxy hóa nội trường bao gồm các enzym như
superoxid dismutase, glutathione peroxidase, catalase, các peroxide kim loại, acid
dihydrolipoic, … ngăn cản sự hình thành các gốc tự do .OH, làm sạch gốc tự do,
…Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hóa của cơ thể không ngăn chặn hết được các gốc
tự do. Một số gốc tự do vẫn tiếp tục gây nguy hại cho tế bào. Ngoài ra, do ảnh hưởng
của các tác nhân như tia tử ngoại, khói thuốc, ơ nhiễm khơng khí, chế độ dinh dưỡng
nhiều acid khơng no cao, …làm giảm khả năng kháng oxy hóa của cơ thể. Vì thế, cơ
thể người cần bổ sung các chất kháng oxy hóa từ bên ngồi thơng qua chế độ dinh
dưỡng hằng ngày [34].
Nhiều hợp chất có khả năng kháng oxy hóa nguồn gốc tự nhiên được nghiên
cứu và sử dụng nhiều trong thực tiễn. Ngoài các nguồn vitamin làm chất kháng oxy
hóa hữu hiệu cho cơ thể, họ phenolic trích từ thảo mộc cũng có tác dụng kháng oxy
hóa, cho nhiều tác dụng sinh học có lợi đối với sức khỏe của con người.



6

1.1.3 Cơ chế phản ứng của các chất kháng oxy hóa
Để thể hiện vai trị kháng oxy hóa, các chất kháng oxy hóa phải phản ứng với
các gốc tự do nhanh hơn các phân tử lipid, từ đó mới có thể ngăn cản được các gốc tự

do tấn công vào tế bào, ngăn cản sự oxy hóa của lipid.
Có 2 cơ chế cho sự oxy hóa lipid mà trong đó các hợp chất kháng oxy hóa thể
hiện tác dụng của mình: cơ chế chuyển H và cơ chế chuyển electron [12, 26].
ă C ch chuyn H: õy l c ch chủ yếu đối với sự oxy hóa của các phân tử
lipid.
Ở giai đoạn khơi mào: nguyên tử hydro ở nhóm α-methyl trong các liên kết
đôi của acid không no sẽ bứt ra, tạo thành gốc alkyl tự do.
RH ® R. + H.

(1.1)

Ở giai đoạn phát triển mạch:
R. + O2 ® ROO.

(1.2)

ROO. + RH ® ROOH + R. (chuyển nguyên tử H)

(1.3)

Trong giai đoạn phát triển mạch, nồng độ gốc tự do peroxyl ROO. sinh ra
cao gấp nhiều lần nồng độ gốc tự do alkoxyl RO. và gốc tự do R.. Các phản ứng
trong giai đoạn này diễn ra đối với nhiều phân tử lipid (RH) cuối cùng chuyển
thành dạng hydroperoxide (ROOH), là sản phẩm của sự oxy hóa, làm hỏng các
acid béo. Phản ứng (1.2) xảy ra rất nhanh (hằng số tốc độ phản ứng khoảng 109
M-1s-1) trong khi phản ứng (1.3) xảy ra chậm hơn (khoảng 101M-1 s-1) [12]
Đối với các chất kháng oxy hóa họ phenolic (ArOH), phản ứng ngăn chặn
giai đoạn phát triển mạch của sự oxy hóa lipid như sau:
ROO. + ArOH ® ROOH + ArO.

(1.9)

Để thể hiện tốt vai trị kháng oxy hóa, các chất kháng oxy hóa phải tạo ra
gốc tự do ArO. bền, gốc tự do này có thể phản ứng chậm với phân tử lipid nhưng
phải phản ứng nhanh với gốc peroxyl ROO., gọi là chất kháng oxy hóa phá vỡ
phản ứng dây chuyền (chain – breaking antioxidant). α-tocopherol (α-TOH),
thành phần chính của vitamin E, là một dạng chain – breaking antioxidant hữu
hiệu trong máu người. In vivo, gốc tự do của phân tử α-tocopherol (α-TO.) kết


7

hợp với vitamin C có trong cơ thể chặt đứt phản ứng dây chuyền trong sự oxy
hóa của lipid, và sau đó tiếp tục tạo α-TOH cho cơ thể. α-TOH phản ứng với gốc
tự do peroxyl với hằng số tốc độ khoảng 106 M-1s-1, nhanh hơn tốc độ phản ứng
tạo gốc tự do peroxyl với phân tử lipid (RH) [12].
Tốc độ phản ứng của phân tử lipid với các gốc tự do phụ thuộc vào năng
lượng hoạt hóa của sự dịch chuyển nguyên tử H từ phân tử lipid (RH) (hoặc từ
phân tử ArOH đối với các chất kháng oxy hóa). Phản ứng giữa phân tử ArOH với
gốc peroxyl ROO. là phản ứng tỏa nhiệt, do đó giá trị enthalpy phá vỡ liên kết
(Bond Disociation Enthalpy – BDE) sẽ là yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng
oxy hóa của các chất. Giá trị BDE được định nghĩa là enthalpy ở 2980K của phản
ứng: ArOH ® ArO. + H. (1.10)
Trong đó, ArOH là hợp chất chống oxy hóa, ArO. là gốc tự do phenoxyl. Liên
kết OH càng yếu, tốc độ phản ứng của phân tử ArOH với gốc tự do càng nhanh
hơn [12, 25, 26, 27].
Như vậy, phản ứng (1.9) có giá trị DHpư = BDEAr-OH - BDERO-OH (1.11), do đó
phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa và gốc tự do ROS theo hướng chọn
lọc: giá trị DHpư càng âm thì phản ứng càng dễ xảy ra. Các phân tử H-OH có giá
trị BDE cao hơn các phân tử ROOH (giá trị BDEH-OH là 119 kcal/mol, BDEROOH

là 88 kcal/mol) do đó đối với cùng một phân tử chất kháng oxy hóa ArOH thì
ArOH dễ phản ứng với gốc tự do .OH hơn là gốc ROO. theo phương trình:
HO. + ArOH ® HOH + ArO.

(1.12)

Đối với phản ứng giữa phân tử phenolic với gốc tự do ROO., phân tử phenol
có giá trị BDEphenol = 88 kcal/mol trong khi giá trị BDEa-tocopherol là 77 kcal/mol,
do đó phản ứng (1.11) sẽ dễ xảy ra đối với phân tử a-tocopherol hơn là phenol.
Điều này cũng giải thích vì sao phân tử a-tocopherol có thể ngăn cản sự oxy hóa
lipid cịn phân tử phenol thì khơng [12]


8

ă C ch chuyn electron
Mt c ch khỏc ca s oxy hóa có sự hiện diện của chất kháng oxy hóa là
cơ chế chuyển electron. Các chất kháng oxy hóa có thể làm giảm hoạt tính các
gốc tự do theo cơ chế chuyển electron bằng cách hình thành gốc tự do cation ở
giai đoạn đầu, giai đoạn này diễn ra thật nhanh, kế đó là phản ứng tách proton
thuận nghịch:
ROO. + ArOH ® ROO- + ArOH.+ (chuyển electron) (1.13)
ArOH.+ + H2O « ArO.

+ H3O+ (tách proton)

(1.14)

ROO- + H3O+ « ROOH + H2O (tạo hydroperoxide) (1.15)
Kết hợp các phương trình trên:

ROO. + ArOH ® ROOH + ArO.

(1.9)

Như vậy, cơ chế chuyển electron cho cùng kết quả với cơ chế chuyển H.
Tuy nhiên, gốc tự do cation ArOH.+ cũng có thể tấn cơng phân tử lipid khi có thể.
Do đó, cần phải ổn định gốc tự do cation ArOH.+ để nó khơng phản ứng với phân
tử lipid. Theo cơ chế này, yếu tố năng lượng ion hóa (Ionization Potential - IP)
được dùng để đo khả năng làm sạch gốc tự do của các chất kháng oxy hóa. Giá trị
IP càng nhỏ, khả năng chuyển electron để hình thành gốc tự do cation càng dễ, và
vì thế, khả năng bắt gốc tự do ca cỏc cht khỏng oxy húa cng cao.
ă Cỏc yu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất
phenolic
Ngồi 2 cơ chế chính ở trên, trong một số trường hợp, khả năng kháng oxy
hóa của các các chất phenolic còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như: ảnh hưởng
của các nhóm thế khác gần nhóm -OH, đặc tính của dung mơi, các điều kiện sinh
học như sự chuyển hóa của các mơ đặc biệt, .. Tuy nhiên, yếu tố cấu trúc phân tử
vẫn là yếu tố quyết định thông qua giá trị BDE và IP. Thơng thường, các chất
kháng oxy hóa có khả năng làm sạch gốc tự do cao đều cho giá trị BDE và IP
thấp và nằm trong một giới hạn nhất định [12, 25]. Khi giá trị BDE và IP ở mức
quá thấp, các hợp chất sẽ thể hiện vai trò là chất tăng cường cho sự oxy hóa (pro-


9

oxidant) hơn là vai trị kháng oxy hóa. Ví dụ, methyl gallate có tác dụng tăng
cường cho sự oxy hóa ở pH=7.4 khi có mặt Fe(II), các hợp chất khác chứa nhóm
pyrogallol có thể dẫn đến sự hình thành các anion superoxide (O2-), tăng cường
cho sự oxy hóa.
1.1.4 Các phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa

Trong thực nghiệm, hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng khả năng qt
gốc tự do của phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa với các gốc tự do
hoạt tính. Dựa vào cơ chế của phản ứng oxy hóa trong đó có mặt các chất
kháng oxy hóa, người ta áp dụng các phương pháp đo khác nhau.
Đối với phản ứng theo cơ chế chuyển H (Hydrogen Atom Transfer –
HAT), các phương pháp thường được dùng để đo hoạt tính kháng oxy hóa của
các hợp chất như sau [5, 36]:
- ORAC (Oxygen radical absorbance capacity): phương pháp dựa vào khả
năng hấp thụ gốc tự do oxy.
- TRAP (Total-trapping antioxidant parameter): phương pháp đo hoạt tính
kháng oxy hóa tổng cộng.
- LDL oxidation (Low Density Lipoprotein Oxidation): phương pháp dựa
vào sự oxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp.
- TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity): phương pháp đo khả năng
làm sạch sự oxy hóa tổng cộng.
Đối với cơ chế chuyển electron (Single Electron Transfer – SET), các
phương pháp sau thường được sử dụng [5, 36]:
- FRAC (Ferric Reducing Antioxidant Power): phương pháp khử sắt
- CUPRAC (Copper Reduction): phương pháp khử đồng
Đối với phản ứng theo cơ chế chuyển H và chuyển electron, hoạt tính
kháng oxy hóa thường được đo bằng các phương pháp sau [5, 36]:
- TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity): phương pháp đo hoạt
tính kháng oxy hóa đương lượng Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-


10

tetramethylchroman-2-carboxylic acid). TEAC được định nghĩa là nồng
độ của dung dịch Trolox với hoạt tính kháng oxy hóa tương đương của
1mM nồng độ chất khảo sát

- DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl): phương pháp đo khả năng quét
gốc tự do DPPH.
Mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng và áp dụng cho từng loại
chất oxy hóa. Thơng thường, để xác định phương pháp đo phù hợp, người ta
thường dựa vào các điều kiện như: khả năng phịng thí nghiệm, tính khả thi
trong các hệ thống sinh học, mức độ đơn giản của phương pháp, cơ chế phản
ứng, các loại chất kháng oxy hóa, các hệ thống phân tích, ….Bảng 1.1 tóm tắt
một số đặc điểm chính của các phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa.
Bảng 1. 1 Tóm tắt đặc điểm các phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa (*)
Đặc điểm
STT

Phương pháp

phương
pháp

Trang
thiết bị

Tính khả thi
trong các hệ

Cơ chế

thống sinh học

1

ORAC

++

+

+++

HAT

2

TRAP

---

--

+++

HAT

3

FRAP

+++

+++

--

SET

4

CUPRAC

+++

+++

5

TEAC

+

+

-

SET

6

DPPH

+

+

-

SET

7

TOSC

-

-

++

HAT

8

LDL oxidation

-

+++

+++

HAT

(*) +, ++, +++: mức độ đơn giản

-, - -, - - -: mức độ phức tạp

SET


11

1.2 Hợp chất flavonoid và khả năng kháng oxy hóa ca chỳng
1.2.1 Gii thiu v hp cht flavonoid
ă nh ngha:
Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản kiểu C6 – C3 –
C6, trong đó mỗi C6 là một vòng benzen gắn với C3, đặt tên là vịng A, B, C
(Hình 1.1). Tại các vịng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc
đã thay thế một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính
acid.
3'

2'
8
7
6

1

B

O

A

C

5

4

2
3

1'

4'
5'

6'

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của flavonoid
Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo
thành các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác
trong cây nh cỏc oza (dng glycosid), hoc protein [39]
ă S phõn bố flavonoid trong tự nhiên
Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng nhất trong
thiên nhiên, với hơn 8000 hợp chất. Flavonoid đặc trưng cho các thực vật bậc
cao, song song với acid hydroxinamic và lignin trong cây. Các hợp chất
flavonoid có mặt trong hầu hết bộ phận của cây: hoa quả, lá, rễ, gỗ, … và khu
trú ở các tế bào. Flavonoid tham gia vào sự tạo màu sắc của cây, nhất là hoa,
đây là một trong những chức năng sinh lý quan trọng của flavonoid đối vi
cõy c. [21, 39]
ă Phõn loi flavonoid
S phõn loi cỏc hợp chất flavonoid chủ yếu dựa vào cấu trúc của vịng C

(Hình 1.4) [34].


12
R'

R'
3'

2'
8

HO

4'

O
2
3

6

5

8

HO

5'

7

5

4

OH

5'
2
3

R
6

OH

O

Flavanols
R = R' = H Kaempferol
R= H, R'= OH quercetin
R= R' = OH Myricetin

Flavones
R=H, R'=OH apigonin
R'

R'
OH

2'
8

HO

5'
2
3

6

5

4

8

HO

R

6'

OH

2'

4'

O

7

R

6'

4

OH

O

OH
4'

O

7

6'

3'

2'

OH

O

7
6

OH

OH

6'

R

4

OH

Flavanoid
R= H, R'= OH catechin
R= R' = OH gallocatechin

5'
2
3

5

4'

O

Flavanone
R= R' = H Naringenin
R=H, R' = OH, Eriodictyol

R'
OH

2'
8

HO

O

7
6

4

O

5'
2
3

5

HO

4'

6'

R'

R

OH

OH

O

OH

OH

Anthocyanidin
R= R' = H Pelargonidin
R=OH, R'=H Cyanidin
R=OH, R'=OH Delphinidin

Isoflavone
R= R' = H Genistein

R

Hình 1.4 Cấu trúc của flavonoid, phân loi da vo vũng C
ă Vai trũ ca hp cht flavonoid
· Các phản ứng sinh hóa

Các nhóm phenol của flavonoid có vai trị trong sự hịa tan các chất vì di
chuyển dễ dàng qua các màng sinh học. Một số flavonoid có tác dụng như
một chất kháng oxy hóa, bảo vệ acid ascobic, một thành phần quan trọng
trong tế bào thực vật. Một số có tác dụng ức chế các enzym và các chất độc
của cây.


13

· Vai trị ức chế và kích thích sinh trưởng
Nhiều cơng trình nghiên cứu về tác dụng ức chế và kích thích sinh
trưởng cây của flavonoid. Nhóm chức hydroxy có vai trị quyết định về tác
dụng này. Ví dụ: trong cây ổi, các flavonoid có nhóm OH ở vị trí 4’ làm tăng
cường hoạt tính của enzym trong khi các flavonoid có OH ở 3’ và 4’ lại có
tính ức chế. Flavonoid cịn tham gia vào sự hơ hấp quang hợp.
· Vai trị tạo màu sắc
Flavonoid đóng vai trị tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy
sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả. Sâu bọ, nhờ hệ thống thị giác đặc
biệt, chúng rất nhạy cảm đối với màu sắc của cây cỏ [34].
Trong việc tạo màu, các flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng
trong khi các anthocyanin cho các màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm.
· Vai trò là chất bảo vệ cây
Một số flavonoid khơng màu trong lá đóng vai trị một chất bảo vệ cây,
ngăn trở đối với các động vật ăn cỏ. Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm
cho động vật khi ăn phải mất cảm giác ngon và không thớch n cỏc loi cõy
c ny [21, 34].
ă Vai trũ trong y học
Các dẫn xuất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO.,
ROO.. Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra
cạnh AND thì sẽ gây ra ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế

bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa.
Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại
này là xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa. Thành phần của màng tế bào có
các chất lipid dễ bị peroxyd hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao
đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào. Đưa các chất kháng oxy hóa như
flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như:
xơ, vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa tổn thương do bức xạ, thối hóa
gan [21].


14

Flavonoid cùng với các acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động
của enzym oxy- hóa khử. Flavonoid cịn ức chế tác động của hyaluronidase.
Enzym này làm tăng tính thấm của mao mạch. Khi enzym này thừa sẽ gây ra
hiện tượng xuất huyết dưới da còn gọi là bệnh thiếu vitamin P. Thực nghiệm
cho thấy các flavonoid có nhóm -OH tự do ở vị trí 3’, 4’ có tác dụng tốt đối
với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch.
1.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất flavonoid
Với đặc tính kháng oxy hóa, hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học mạnh,
gắn liền với nhiều tính chất như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm, …
Trong các nghiên cứu in vitro, hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất flavonoid
được khảo sát bằng cách cho phản ứng với các chất tương ứng, thông thường là
các gốc tự do như ABTS (2,2’-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]),
DPPH

(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl),

AAPH

(2,2’-

azobis

(2-

amidinopropane) dihydrochloride), .O, .OOH, .OH, … trong các mơi trường
khác nhau [30, 36].
Tác dụng kháng oxy hóa của hợp chất flavonoid là khả năng ngăn chặn sự
hình thành các gốc tự do phản ứng (reactive oxygen species – ROS, bao gồm
superoxide O2-, peroxyl ROO., alkoxyl RO., hydroxyl .OH, nitric oxide NO.), và
làm sạch các gốc tự do này và điều chỉnh lại khả năng kháng oxy hóa của cơ
thể.
Flavonoid ngăn cản các enzyme tạo thành các gốc tự do phản ứng như
xanthine oxidase, protein kinase C, cyclooxygenase, lipoxygenase, …Trong mơi
trường có ion kim loại sắt và đồng, do các ion này có thể tham gian phản ứng
oxy hóa khử với H2O2 và protein tỷ trọng thấp sinh ra các gốc tự do phản ứng,
flavonoid sẽ tạo phức với kim loại ở nhóm catechol của vịng B, vị trí 3,4 của
vịng C và vị trí 4,5 của vịng A để ngăn cản sự hình thành các gốc tự do này
(Hình 1.5) [34].