Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******  ******




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG
KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Niên khóa: 2003-2007
Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******  ******






SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG
KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)






Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG
Niên khóa: 2003-2007

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007
1
LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến
ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.
 Chân thành cảm ơn!
Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ
Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh.
Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến
độ.
 Chân thành cảm ơn!
Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi
trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
 Chân thành cảm ơn!
TS.Vƣơng Đình Tuấn
TS. Nguyễn Quốc Bình
Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi

trong suốt quá trình làm đề tài.
 Chân thành cảm ơn!
Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Công nghệ
sinh học 29, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề
tài.

Xin chân thành tri ân!
Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG


2
TÓM TẮT
TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng
8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”.
Hƣớng dẫn khoa học:
TS.Vƣơng Đình Tuấn
 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.
 Địa điểm nghiên cứu
Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ .
Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.
 Mục đích nghiên cứu
-Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá
tràm (Acacia auriculiformis). Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các
cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng
nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng
cao.
 Yêu cầu
- Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm.

- Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.
 Phƣơng pháp nghiên cứu
- Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo
lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.
 Kết quả
- Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa
dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân
tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.
 Kết luận
3
- Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770)
có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt.
4
MỤC LỤC

ĐỀ MỤC ...................................................................................................... TRANG
TRANG TỰA ........................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii
TÓM TẮT ............................................................................................................... iv
MỤC LỤC ................................................................................................................ v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................. x
Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài ....................................................... 2
1.4 Giới hạn của đề tài ............................................................................................. 2
Phần 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4
2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học ........................................................................... 4
2.1.1 Định nghĩa ....................................................................................................... 4

2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học ......................................................................... 4
2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................. 4
2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái ............................................................................ 4
2.1.3.2 Đa dạng loài ................................................................................................. 5
2.1.3.3 Đa dạng về di truyền .................................................................................... 6
2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................ 7
2.2.1 Phân loại .......................................................................................................... 7
2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ..................................... 8
2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ..................................... 9
2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) ........................ 10
2.2.5 SSR (Microsatellite) ...................................................................................... 10
5
2.3 Kỹ thuật Microsatellite ..................................................................................... 11
2.3.1 Khái niệm về Microsatellite .......................................................................... 11
2.3.2 Tính chất ........................................................................................................ 12
2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite ......................................................... 13
2.3.4 Giới hạn của Microsatellite ........................................................................... 14
2.3.5 Các loại Microsatellite .................................................................................. 15
2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite ........................................... 15
2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite .............................................................. 15
2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite ........................................................................... 17
2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite ................................................. 18
2.3.7.1 Phƣơng pháp lai ......................................................................................... 18
2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 19
2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 19
2.4.1 Khái niệm ...................................................................................................... 19
2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR ............................. 20
2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR.......................................................................... 23
2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................ 23
2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật ...................................................................... 23

2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......................................... 25
2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di ...................................... 26
2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) .................................. 28
2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) .......................................................................... 28
2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo .......................................................... 28
2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) ........................................................ 30
2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) ........ 32
2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái ............................................................ 33
2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng ............................................................ 35
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 36
6
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 36
3.1.1 Thời gian thực hiện ....................................................................................... 36
3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 36
3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 36
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 36
3.4 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37
3.5 Ly trích DNA ................................................................................................... 37
3.5.1 Hóa chất ....................................................................................................... 37
3.5.2 Quy trình ly trích DNA ................................................................................. 38
3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích ................................................................. 40
3.6.1 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................ 40
3.6.2 Điện di sản phẩm PCR .................................................................................. 42
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 44
4.1 Quá trình ly trích ............................................................................................. 44
4.2 Phản ứng PCR .................................................................................................. 44
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 48
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50
PHỤ LỤC




7
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 µg: microgram
 µM: micromol/lite
 Al: Allele
 bp: base pair
 M:mét
 cm: centimét
 CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide
 DNA: Deoxyribonucleic acid
 dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
 EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid
 EtBt: Ethidium bromide
 Kb: kilobases
 mM: milimolar (milimol/lite).
 PCR: Polymerase chain reaction
 RNA: Ribonucleic acid
 RNase: Ribonuclease
 SSR: Single sequence repeat
 Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
 TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid
 TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)
 Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

 U: Đơn vị hoạt tính của Taq
 UV: Ultra Violet


8
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ..................................................... 16
Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ................................................. 16
Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ................................................... 20
Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) .......................................................... 29
Hình2.5:Hình thái một số loài Keo ........................................................................ 30
Hình 2.6. Keo lá tràm ............................................................................................. 33

9
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) ......... 8
Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose ..................................... 27
Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide ........................ 27
Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) ............ 32
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA .............................. 38
Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 41
Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng .......................................................... 41
Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA ................................................................. 39












10
Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản
phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công
dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát
triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn
toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng
thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn,
phòng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại
sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn
có thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt,
giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ
lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trƣờng...
Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ
Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào
Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn
nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,...
(). Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng
phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng
Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp
sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nông
dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất
lƣợng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết
đặt ra cho ngành lâm nghiệp. Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã đƣợc triển
khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhƣng biện pháp chủ yếu
là nhập hạt giống chất lƣợng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phƣơng pháp cổ
điển của các dòng cây trội. Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử
11
hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu nhƣ chƣa có nhiều. Các phƣơng pháp chọn
giống cổ điển tuy đã góp phần hình thành nên những giống vật nuôi đa dạng, nhƣng
do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa

thƣờng không ổn định và chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi môi trƣờng. Sử dụng chỉ thị
phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động không di truyền đồng
thời theo dõi đƣợc các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình. Hiểu biết về
cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta có cơ sở vững chắc trong việc sử dụng
nguồn tài nguyên thực vật một cách có hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng,
phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của
quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng.
Nhằm góp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm
(Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các
dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis)” đƣợc thực hiện do sự phân công của bộ
môn Công Nghệ Sinh Học và sự hƣớng dẫn chính của TS. Vƣơng Đình Tuấn.
1.2 Mục đích nghiên cứu
-Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo
lá tràm (Acacia auriculiformis). Tƣd đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa
các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh
trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng
chất lƣợng cao.
1.3 Yêu cầu
- Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm.
- Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.
1.4 Giới hạn của đề tài
Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở
việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những
nghiên cứu tiếp theo trong việc hoàn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm.
Và đề tài chỉ thực hiện trên một số mẫu nghiên cứu thu thập đƣợc ở Trạm thực
12
nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Bình Dƣơng) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt
Nam.

13
Phần 2. TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học
2.1.1 Định nghĩa
Thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980)
định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính
đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài
trong một quần xã sinh vật).
Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về
nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002).
Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa
dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật,
động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh
thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”.
2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học
Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vô tận, đó chính

là nguồn cảm hứng sáng tạo và cũng là nguồn kiến thức phong phú của nhân loại.
Sự đa dạng sinh học cung cấp cho con ngƣời nguồn thức ăn phong phú và đa
dạng chủng loại; cung cấp nguồn hàng hoá và nguyên vật liệu phong phú và cần
thiết cho nông nghiệp, cho dƣợc học, cho khoa học công nghệ. Đa dạng sinh học là
nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp. Ngoài ra đa dạng sinh
học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đó tạo cơ sở ổn định kinh tế và
các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta.
2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học
2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái
Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh học.
14
Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều
kiện nhất định và mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi
trƣờng.
Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh.
Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau giữa các quần xã sinh
vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với
nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình) (OTA, 1987; FAO,
1990).
Vậy hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều
kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng.
2.1.3.2 Đa dạng loài
Sự đa dạng loài đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong
một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định theo cấu tạo hình thái của loài hoặc theo
phân loại sinh học().
Theo cấu tạo hình thái của loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có
những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác.
Thƣờng đƣợc vận dụng để định danh loài, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới.
Phân loại sinh học loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có khả
năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm

khác. Cách này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá khảo sát mối quan hệ
về gene.
Theo Rojas và Stanley (1992), những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và
định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn nhiều so với lý thuyết. Một loài
có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu
tạo và hình thái. Nhƣng, đôi khi các phân loài giống nhau đến mức tƣởng nhƣ là
chúng cùng một loài.
15
Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và
định loài của những mẫu vật mới chƣa đƣợc biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và
bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết.
2.1.3.3 Đa dạng về di truyền
Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học.
Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của
tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền là sự đa
dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài
khác nhau (
Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét
cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp
bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Nghiên cứu về đa
dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự
đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hƣởng bởi tập tính sinh sản của các cá
thể trong quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gene khác nhau. Sự
đa dạng về bộ gene này là do các cá thể có các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (Lâm
Vỹ Nguyên, 2006).
Những hình thái khác nhau của gene đƣợc thể hiện bằng những alleles và
những khác biệt do sự đột biến. Những alleles khác nhau của một gene có thể ảnh
hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau.
Những sự khác biệt về gene trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận
đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các gene

trong quá trình sinh sản. Các gene trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp
mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp
thống nhất mới cho con cái.
Tổng các gene và alleles trong một quần thể là vốn gene của quần thể và
những tổ hợp của các alleles mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu gen – kiểu di truyền
(genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện bởi các đặc điểm
16
về hình thái, sinh lý, hoá sinh và đƣợc đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng
môi trƣờng nhất định.
Số lƣợng khác biệt nhau về gene trong một quần thể đƣợc xác định bởi số
gene trong vốn gene đó, thƣờng mỗi gene có nhiều hơn một allele (các gene đa
hình) và số các alleles cho mỗi một gene đa hình. Sự tồn tại của các gene đa hình
cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gene dị hợp tử, có nghĩa là cá thể
nhận đƣợc những alleles khác nhau từ các gene của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về
gene cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng.
2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền
2.2.1 Phân loại
Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào đƣợc dùng để phân biệt hai cá thể,
hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem nhƣ một DNA marker. Những
marker có tính chất nhƣ vậy rất cần thiết vì số lƣợng của chúng lớn hơn rất nhiều so
với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2005).
Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Bài
giảng CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ):
-
Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP.

-
Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP,
SSR, SSCP, RAPD.

Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (CNSH cây
trồng, Phạm Thành Hổ):

-
Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp
tử và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP.

- Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp
tử và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP.

17
Bảng 2.1 : Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005)
Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
AP-PCR Arbitrary Primer-PCR
DAF DNA Amplification Fingerprinting
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
ALP Amplicon Length Polymorphism
SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SNP Single Nucleotide Polymorphism
STS Sequence-Tagged Sites

2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh
giá đa dạng di truyền. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân
đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra
khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) khi có sự thay

đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell và
ctv,1996).
Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền đƣợc sử dụng phổ
biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn
chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ
đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua
màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ) liên kết với một
18
locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt
khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996).
RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng
hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng
marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực
hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (do phải sử dụng
phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng
kỹ thuật này.
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn.
Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát,
sau đó đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các restriction enzyme, điện di và
phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bƣớc lai
phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP.
2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử
dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có
thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng
gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi
của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt (
Powell et al, 1996; Winfield et al, 1998)
Thông thƣờng, trong AFLP sử dụng một cặp restriction enzyme gồm một

enzyme cắt thƣờng xuyên và một enzyme cắt không thƣờng xuyên. Enzyme cắt
thƣờng xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thƣờng xuyên sẽ
nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt. Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI
- MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ
đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2
phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản
19
ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc
khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và
trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm
giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.( Matthes et
al., 1998; Karp et al., 1997)
AFLP nhanh, không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ
gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thông tin di truyền
phải đƣợc biết rõ để chuẩn bị primer tƣơng ứng, và AFLP là một marker trội, điều
này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)
Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi
thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà
không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp,
đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại
các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các
đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác
nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA
giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác
định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình
DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại
hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ
cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều
kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa

hình cao (Harris,1999)
2.2.5 SSR (Microsatellite)
Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có
tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable
number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số
20
lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA nhƣ: (AC)
n
, (AG)
n
, (AT)
n
, (TAT)
n
,
(TCT)
n
, (CAG)
n
… Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá
thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao.
Dựa trên trình tự DNA, microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng loài
cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu
gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích
thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng từ 100 - 200 bp. Kết quả tạo ra các
đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide.
Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất
quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp
phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu
điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội.

2.3 Kỹ thuật Microsatellite
2.3.1 Khái niệm về Microsatellite
Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of
tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thƣờng xảy ra ngẫu nhiên
trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,2005), là một đoạn
DNA đƣợc mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lƣợng bản copy biến thiên (từ một
vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là
đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng
100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí
nào (locus), thƣờng xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có
thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện bởi
PCR , sử dụng primers đƣợc thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của
microsatellite. Khi sản phẩm PCR đƣợc chạy trên gel điện di, alleles đƣợc ghi nhận
khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại,...
21
Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng đƣợc phát hiện
bằng PCR và chúng có khuynh hƣớng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của
genome. Hàng ngàn SSR đã đƣợc lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau.
Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu
tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short
tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward; 1991).
Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thƣớc tại mỗi locus
là 20 - 100 bp. Microsatellite đƣợc tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở
những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome.
Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng
trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một
marker. Tần số đột biến từ 10
4
- 5.10
-6

, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của
microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể đƣợc xác định bằng PCR từ một lƣợng
DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng
trên những loài khác có quan hệ họ hàng.
2.3.2 Tính chất
Những markers này thƣờng hiện diện với mức độ cao của hiện tƣợng đa
hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự đƣợc lặp lại thƣờng
đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tƣơng ứng với việc lặp lại di-, tri-, và
tetranucleotide), và có thể đƣợc lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide
CA xảy ra rất thƣờng xuyên trong bộ gene ngƣời và các loài khác, và đƣợc hiện
diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Nhƣ vậy có sự xuất hiện thƣờng xuyên của
nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thƣờng cung cấp đầy đủ
thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể đƣợc nhận biết dễ
dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tƣởng để xác định nguồn gốc,
nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng
để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn.
22
Microsatellite thƣờng thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung
tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể đƣợc giải thích bởi sự bắt cặp sai
trong bộ phận trƣợt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong
suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra
suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu đƣợc
sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhƣng một vài đột biến có thể không
đƣợc sửa chữa. Kích thƣớc của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự
lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng nhƣ là tính thƣờng xuyên của sự dịch mã
trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến,
có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tƣơng tự này
thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu
sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác
của microsatellites có thể đƣợc khuếch đại.

2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite
Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một
đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid
hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau
đó phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu
huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên
đoạn DNA. Nếu dòng dƣơng tính có thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc
đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác
định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi
trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đoán trƣớc và primers đƣợc thu
nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite
đƣợc trải xuyên suốt genome và có thể đƣợc thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung
của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch
đại thông qua PCR.
Primer microsatellite đặc trƣng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở
những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài. Điều
23
này có thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng
flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn
trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện
trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.
2.3.4 Giới hạn của Microsatellite
Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong
nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite
đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng có thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với
những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di
truyền đƣợc khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di
truyền.
Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể
dẩn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không

thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng
liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo
dài bắt đầu; sự khuếch đại ƣu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên
của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử đƣợc ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ
phận không có giá trị) ( M. J. Hayden and P. J. Sharp, 2001) Sự thất bại của phản
ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù đƣợc khuếch đại.
Tuy nhiên, ảnh hƣởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết
giới tính cũng cần đƣợc xem xét để không đƣa ra giá trị sai của alleles không giá trị
do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thƣớc
allele cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm vào
hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài.
Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng
microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lƣợng hoặc sự
cố trong vùng exon của genes dƣới sự chọn lọc.
Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng
khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhƣng số vị trí khuếch đại thành công