Nghiên cứu thu nhận chế phẩm invertase từ nấm men bia saccharomices carlsbergensis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN THỊ MAI ANH
ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
INVERTASE TỪ NẤM MEN BIA
SACCHAROMYCES CARLSBERGENSIS

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÃ SỐ NGÀNH : 2.11.00

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2005


CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN BÍCH LAM

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. LẠI MAI HƯƠNG

Luận văn được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA , ngày ……………… tháng …………… năm 2005

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

Tp. HCM, ngày .......... tháng ………… năm 2005

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: TRẦN THỊ MAI ANH
Ngày, tháng, năm sinh: 28 / 07 / 1980
Bé
Chuyên ngành: KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
01103249

Phái: Nữ
Nơi sinh: Sông
MSHV:

I. TÊN ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM INVERTASE TỪ NẤM MEN
BIA SACCHAROMYCES CARLSBERGENSIS”
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Phân tích các nguồn nguyên liệu.
- Chọn phương pháp xử lý trích ly Invertase
- Chọn phương pháp thu nhận chế phẩm Invertase
- Nghiên cứu tính chất của chế phẩm
- Nghiên cứu tinh sạch chế phẩm
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ

: 12 / 2004

IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2005
V. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

TS. TRẦN BÍCH LAM

VI. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1: TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN
VII. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2: TS. LẠI MAI HƯƠNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM NGÀNH

TS. TRẦN BÍCH LAM

TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

Nội dung và đề cương luận văn đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.

PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Ngày
tháng
năm 2005
KHOA QUẢN LÝ NGÀNH

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Bích
Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong bộ môn
Công nghệ Thực Phẩm trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ
Chí Minh đã giúp đỡ để em hoàn thành luận văn này.
Cám ơn tất cả các bạn, các anh, chị lớp cao học thực
phẩm K14 đã giúp đỡ, cùng tôi làm việc trong quá trình học
tập.
Con cảm ơn gia đình, bố mẹ và em đã động viên và
ủng hộ con trong suốt thời gian học tập và làm đề tài.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12/ 2005

Trần Thò Mai Anh


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Invertase là enzym thủy phân đường saccharose thành đường glucose và
fructose, hỗn hợp đường đơn sau thủy phân gọi là đường nghịch đảo. Invertase
được ứng dụng chủ yếu trong công nghiệp bánh kẹo, nước giải khát vì sản phẩm
đường nghịch đảo có độ ngọt cao hơn và khó kết tinh hơn so với đường
saccharose.
Trong nghiên cứu này, Invertase được thu nhận từ nấm men bia
Saccharomyces carlsbergensis. Các thông số tối ưu cho quá trình trích ly
Invertase từ nấm men bia là:
Sử dụng hệ đệm Acetat có pH 6,5 để thực hiện quá trình tự phân với tỉ lệ

khối lượng nấm men / dung môi đệm :1/10 (w/v); nhiệt độ tự phân là 30oC;
Toluen được sử dụng như một tác nhân phá vỡ màng tế bào với tỉ lệ Toluen/nấm
men: 1/1 (v/w). Thời gian tự phân là 75 giờ. Đối với bã nấm men chết thì tỉ lệ
Toluen/nấm men giảm: 0,6/1 (v/w) và thời gian tự phân cũng giảm: 50 giờ.
Dung môi kết tủa thu nhận enzym là Ethanol với tỉ lệ dung môi/enzym là
1/1 (v/v).
Chế phẩm Invertase sau khi kết tủa bằng ethanol có nhiệt độ tối ưu là
45oC và pH tối ưu là 6,0
Invertase được tinh sạch bằng phương pháp lọc gel với Sephadex G-100,
thu được phân đoạn có độ tinh sạch cao gấp 32,61 lần so với chế phẩm thô.
Có thể bổ sung chế phẩm Invertase với tỉ lệ 0,02% để chống hiện tượng tái
kết tinh cho dung dịch đường saccharose 75%. Và có thể dùng chế phẩm
Invertase để xác định hàm lượng đường saccharose trong nguyên liệu thực phẩm.


ABSTRACT
Invertase is an enzyme which hydrolyzing saccharose into glucose and
fructose. The mixture of monosaccharides is called invert sugar. Invert sugar is
mainly used in food industry (confectionary, beverage) because it is sweeter and
dose not crystallize as easily as saccharose.
In this study, Invertase was derived from brewer yeast cells
Saccharomyces carlsbergensis. The optimal parameters for invertase extraction
process are as follow.
Brewer yeast cells were disrupted by autolysis in acetate buffer solution
(pH = 6,5) with Toluen as anitiator. The ratio of yeast and acetate buffer is 1/10
(w/v); autolytic temprature is 30oC; the ratio of Toluen and yeast is 1/1 (v/w) and
autolytic time is 75 hours. With brewer yeast cells having high rate of died yeast
cells, the ratio of Toluen and yeast decrease in 0,6/1 (v/w) and the autolytic time
decrease in 50 hours.
Ethanol 96% is used to precipiate Invertase from the extracted enzyme

solution, the ratio of Ethanol and extracted enzyme solution is 1/1 (v/v).
Invertase was then purified by gel filtration on Sephadex G-100. After the
purification process, the purity of Invertase enzyme increased in 32,61 times.
Invertase was added into saccharose liquid 75% with the rate 0,02% for
purpose of anti – crystallization. And we can use it to quantify content of
saccharose in material foods.


MỤC LỤC
Danh mục các bảng ..................................................................................................i
Danh mục các hình .................................................................................................iii
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về Invertase .......................................................................... 4
1.1.1 Tổng quan ....................................................................................................... 4
1.1.2 Đặc tính của Invertase trong tế bào nấm men ............................................... 5
1.1.3 Các nguồn thu nhận Invertase ........................................................................ 6
1.1.3.1

Vi sinh vật ................................................................................................. 6

1.1.3.2

Thực vật ..................................................................................................... 6

1.1.3.3

Động vật .................................................................................................... 6

1.1.4 Ứng dụng của Invertase .................................................................................. 7

1.1.4.1

Trong công nghiệp thực phẩm ................................................................... 7

1.1.4.2

Trong y học................................................................................................ 9

1.2 Nấm men............................................................................................................. 9
1.2.1 Cấu tạo tế bào nấm men ................................................................................. 9
1.2.2 Thành phần hóa học của nấm men ............................................................... 13
1.3 Các phương pháp thu nhận enzym ................................................................ 14
1.3.1 Phương pháp vật lý ....................................................................................... 17
1.3.1.1

Phương pháp cơ học ................................................................................. 17

1.3.1.2

Phương pháp sốc nhiệt ............................................................................. 18

1.3.2 Phương pháp hóa học .................................................................................... 18
1.3.3 Phương pháp sinh học ................................................................................... 18


1.4 Một số phương pháp tinh sạch enzym ............................................................ 19
1.4.1 Phương pháp tách enzym dựa trên tính hòa tan ............................................ 19
1.4.1.1

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ................................................................. 20

1.4.1.2

Kết tủa bằng muối trung tính................................................................... 21

1.4.2 Phương pháp sắc ký rây phân tử ................................................................... 21
1.4.3 Phương pháp điện di ..................................................................................... 23
PHẦN 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu ...................................................................................................... 26
2.2 Thiết bị sử dụng ............................................................................................... 26
2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 27
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 27
2.3.2 Quy trình tách chiết thu nhận enzym Invertase........................................... 28
2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân nấm men................. 29
2.3.3.1 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm ........................... 29
2.3.3.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tự phân .. 30
2.3.3.3 Phương pháp xác định tỉ lệ dung môi Toluen ........................................ 30
2.3.3.4 Phương pháp xác định tỉ lệ dung dịch đệm
để trích ly và thu hồi enzym.................................................................. 31
2.3.3.5 Phương pháp khảo sát hoạt tính Invertase
của các nguồn nấm men khác nhau ...................................................... 31
2.3.4 Phương pháp kết tủa enzym ........................................................................ 32
2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đặc tính chế phẩm Invertase ............................... 32
2.3.5.1 Khảo sát yếu tố nhiệt độ ........................................................................ 32
2.3.5.2 Khảo sát yếu tố pH ................................................................................ 33
2.3.6 Nghiên cứu quá trình tinh saïch Invertase .................................................... 33


2.3.7 Ứng dụng định lượng đường saccharose trong nguyên liệu ......................... 34
2.3.7.1 Xác định độ lặp lại của phương pháp..................................................... 34

2.3.7.2 Xây dựng đường chuẩn .......................................................................... 35
2.3.7.3 Định lượng đường saccharose có trong nguyên liệu dứa ....................... 35
2.4 Các phương pháp phân tích ........................................................................... 36
2.4.1 Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Lowry ............................... 36
2.4.2 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS............................. 38
PHẦN 3: KẾT QUẢ – BÀN LUẬN
3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân của nấm men ........ 44
3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và hệ đệm trong quá trình tự phân ............. 44
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tự phân ............................. 46
3.1.3 Xác định tỉ lệ dung môi Toluen tối ưu ......................................................... 48
3.1.4 Khảo sát tỉ lệ dung dịch đệm để trích ly và thu hồi enzym ......................... 49
3.1.5 Khảo sát hoạt tính Invertase của các nguồn nấm men khác nhau............... 49
3.2 Khảo sát điều kiện thu nhận chế phẩm Invertase
từ nguyên liệu nấm men bia Sài Gòn ......................................................... 51
3.2.1 Khảo sát thời gian tự phân .......................................................................... 51
3.2.2 Khảo sát tỉ lệ dung môi Toluen để tự phân.................................................. 53
3.3 Kết quả khảo sát các tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzym...................... 54
3.3.1 Ethanol 96%................................................................................................. 54
3.3.2 Iso propanol ................................................................................................. 55
3.3.3 Aceton.......................................................................................................... 57
3.4 Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzym thô ..................................... 59
3.4.1 Chế phẩm enzym thô thu được từ bã men bia Sài Gòn ............................... 59
3.4.1.1 Xác định nhiệt độ tối ưu của chế phẩm


enzym thô thu từ men bia Sài Gòn ........................................................ 59
3.4.1.2 Xác định pH tối ưu của chế phẩm Invertase SG.................................... 60
3.4.1.3 Khảo sát độ bền nhiệt của Invertase SG theo thời gian xử lý ............... 61
3.4.2 Chế phẩm enzym thô thu được từ bã men bia Bình Tây
3.4.2.1 Khảo sát nhiệt độ tối ưu của chế phẩm Invertase Bình Tây .................. 62

3.4.2.2 Khảo sát pH tối ưu của chế phẩm Invertase Bình Tây .......................... 63
3.5 Nghiên cứu quá trình tinh sạch Invertase .................................................... 66
3.6 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Invertase................................................... 70
3.6.1 Ứng dụng chống hiện tượng tái kết tinh đường............................................ 70
3.6.2 Ứng dụng định lượng hàm lượng đường saccharose trong nguyên liệu ....... 72
PHẦN 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận ............................................................................................................ 76
4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 78
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 81


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tính hòa tan của một số loại đường trong nước ở 20oC .......................8
Bảng 1.2: Các loại gel thường gặp trong phương pháp lọc gel Sephadex..........23
Bảng 2.1: Nồng độ dung dịch protein chuẩn ......................................................38
Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch đường khử chuẩn .................................................41
Bảng 3.1: Kết quả tự phân trong môi trường đệm Photphat ...............................44
Bảng 3.2: Kết quả tự phân trong môi trường đệm Acetat ..................................45
Bảng 3.3: Kết quả tự phân nấm men ở các nhiệt độ khác nhau .........................46
Bảng 3.4: Tính chất của dịch enzym thô trước khi tủa bằng Ethanol .................54
Bảng 3.5: Kết quả thí nghiệm kết tủa Invertase bằng Ethanol ..........................54
Bảng 3.6: Tính chất của dịch enzym thô trước khi tủa bằng Iso propanol .........56
Bảng 3.7: Kết quả thí nghiệm kết tủa Invertase bằng Iso propanol...................56
Bảng 3.8: Dịch enzym thô trước khi tủa bằng Aceton........................................57
Bảng 3.9: Kết quả thí nghiệm kết tủa Invertase bằng Aceton ...........................58
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của Invertase SG..........................60
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát pH tối ưu của Invertase SG ..................................61
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của Invertase SG.............................61
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của

chế phẩm Invertase Bình Tây ........................................................63
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát pH tối ưu của chế phẩm Invertase Bình Tây .......64
Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lọc gel Sephadex G-100..........................................66
Bảng 3.16: Độ tinh sạch của enzym qua các bước thí nghiệm ...........................69
Bảng 3.17: Kết quả ly tâm tách tinh thể đường kết tinh.....................................70
Bảng 3.18: Kết quả kiểm tra độ lặp lại của các kết quả phân tích.....................72
Bảng 3.19: Kiểm tra độ tuyến tính của phép đo.................................................73

-i-


Bảng 3.20: So sánh kết quả định lượng saccharose............................................74
Bảng i: Số liệu phương trình đường chuẩn đường khử........................................81
Bảng ii: Số liệu phương trình đường chuẩn Protein............................................81

-ii-


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu tạo của tế bào nấm men ................................................................9
Hình 1.2: Các phương pháp phá vỡ tế bào vi sinh vật ........................................16
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................27
Hình 2.2: Quy trình tách chiết thu nhận Invertase..............................................28
Hình 3.1: Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến sự tự phân của nấm men ............45
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tự phân của nấm men .......................47
Hình 3.3: Ảnh hưởng của dung môi Toluen đến sự tự phân của nấm men.........48
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ dung dịch đệm đến khả năng thu hồi enzym......49
Hình 3.5: Hoạt tính Invertase ở các nguồn nấm men khác nhau........................50
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hoạt tính của enzym................52
Hình 3.7: Mối tương quan giữa tỉ lệ Toluen và khả năng trích ly enzym...........53

Hình 3.8: Hoạt tính riêng của Invertase khi sử dụng Ethanol kết tủa enzym.....55
Hình 3.9: Hoạt tính riêng của Invertase khi sử dụng
Iso propanol kết tủa enzym ..............................................................57
Hình 3.10: Hoạt tính riêng của Invertase khi sử dụng Aceton kết tủa enzym....58
Hình 3.11: Mối tương quan giữa hiệu suất thu hồi enzym và độ tinh sạch
khi sử dụng các tác nhân kết tủa enzym khác nhau .........................59
Hình 3.12: Độ bền nhiệt của Invertase SG theo thời gian phản ứng ..................62
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym ...................................64
Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzym ...........................................65
Hình 3.15: Chế phẩm Invertase thu nhận từ nấm men bia Sài Gòn ...................66
Hình 3.16: Chế phẩm Invertase sau khi qua cột lọc gel Sephadex G-100.........69
Hình 3.17: Mẫu dung dịch đường saccharose 70%
không bổ sung và có boå sung Invertase ..........................................71

-iii-


Hình 3.18: Mẫu dung dịch đường saccharose 75%
không bổ sung và có bổ sung Invertase ..........................................71
Hình 3.19: Tinh thể đường kết tinh đối với mẫu không bổ sung Invertase ........72
Hình 3.20: Tương quan giữa nồng độ Saccharose và đường khử tạo thành........73
Hình i: Đường chuẩn đường khử.........................................................................81
Hình ii: Đường chuẩn Protein .............................................................................82

-iv-


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

LỜI MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong nửa
cuối thế kỷ XX là các nghiên cứu về enzym, đó là những khám phá về cấu trúc
hóa học và các cơ chế xúc tác kỳ diệu của enzym – xúc tác sinh học. Enzym đóng
vai trò cực kỳ quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại. Cho đến nay,
người ta đã chiết xuất được nhiều loại enzym với độ tinh khiết cao từ động vật,
thực vật và đặc biệt là từ vi sinh vật. Hiện nay, enzym cũng được ứng dụng rộng
rãi trong công nghiệp thực phẩm, trong y dược, trong nông nghiệp và nhiều ngành
công nghiệp khác.
Một trong những enzym có nhiều ứng dụng là Invertase. Đây là enzym
thủy phân đường saccharose thành hai đường khử là glucose và fructose.
Invertase có tác dụng chống kết tinh đường, được ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để làm mềm kẹo, trong sản
xuất nước giải khát. Ngoài ra, nó cũng được ứng dụng nhiều trong lónh vực y học.
Hiện nay, ở nước ta việc sử dụng enzym Invertase còn nhiều hạn chế do
phải nhập enzym từ nước ngoài với giá khá cao khoảng 120 USD/kg chế phẩm
Invertase ( khoảng 1,8 triệu đồng/kg), khá đắt so với các loại enzym khác. Và
nguồn thu nhận Invertase chủ yếu là từ nấm men Saccharomyces cerevisiae và
Sacchromyces carlsbergensis. Trong khi đó ở thành phố Hồ Chí Minh nói riêng
và cả nước nói chung có rất nhiều nhà máy rượu bia, mỗi năm thải ra một lượng
rất lớn nấm men. Cho đến nay, số nấm men này chủ yếu được bán làm thức ăn
gia súc hoặc xả bỏ (đối với các nhà máy có công suất nhỏ). Đây là một lãng phí,
nếu có thể tận dụng nguồn nấm men phế thải này để sản xuất enzym Invertase ở
quy mô công nghiệp thì sẽ mang lại lợi ích và hiệu quả kinh tế to lớn. Chúng ta
có thể sản xuất ra enzym Invertase với giá thành rẻ hơn các sản phẩm nhập

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 1

Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

ngoại, giúp các nhà sản xuất thực phẩm trong nước nâng cao chất lượng sản phẩm
và hạ giá thành. Mặt khác, việc tận dụng phế thải công nghiệp này còn góp phần
sản xuất sạch không gây ô nhiễm môi trường tại các nhà máy bia rượu.
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
thu nhận chế phẩm Invertase từ nấm men bia Saccharomyces carlsbergensis”.
Với mục tiêu như vậy, chúng tôi tập trung nghiên cứu vào một số vấn đề sau:
¾ Xác định hoạt tính Invertase của nấm men bia từ các nguồn khác nhau.
¾ Chọn phương pháp xử lý trích ly Invertase
¾ Chọn phương pháp thu nhận chế phẩm Invertase
¾ Nghiên cứu các tính chất của chế phẩm Invertase
¾ Nghiên cứu tinh sạch chế phẩm
¾ Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm.

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 2


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

PHẦN 1
TỔNG QUAN

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 3


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ INVERTASE
1.1.1 Tổng quan: [6], [9], [22]
Invertase được Bertholot tách chiết từ tế bào lần đầu tiên vào năm 1860.
Có thể nói Invertase đã đóng một vai trò khá quan trọng đối với ngành công nghệ
enzym hiện đại. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về tính chất của Invertase
cũng như nghiên cứu về khả năng tách chiết và thu nhận chúng nhưng cho đến
ngày nay người ta vẫn chưa thu được chế phẩm enzym hoàn toàn tinh khiết.
Nguyên nhân chính là do enzym này tồn tại trong tự nhiên ở dạng phức hợp
glycoprotein.
Invertase, còn được gọi là Invertin, Sucrase hay Saccharase, là enzym xúc
tác cho phản ứng thủy phân đường saccharose thành đường glucose và đường
fructose.

Sản phẩm hình thành sau quá trình thủy phân được gọi là đường nghịch
đảo. Sở dó nó mang tên này vì dung dịch sacchrose ban đầu có góc quay cực [α]D
là +66,5o nhưng sau khi thủy phân hỗn hợp monosaccharide có độ quay cực bằng
-20o (+52,5o đối với D(+)-glucose và -92,4 đối với D(-)-fructose). Nghóa là có sự
thay đổi góc quay cực từ phải sang trái.
Invertase còn có tên gọi khác là $-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26), nó
xúc tác cho phản ứng thủy phân đường saccharose từ đầu tận cùng không khử $fructofuranoside. Do đó enzym này còn có thể thủy phân được những

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 4


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

oligosaccharide có nhóm fructose ở cuối mạch như raffinose, stachyose,
verbacose,… Ngoài Invertase, enzym "-D-glucosidase cũng có thể xúc tác cho
phản ứng thủy phân đường saccharose từ đầu tận cùng glucose. Saccharose cũng
có thể bị thủy phân trong môi trường acid mà không cần sự xúc tác của Invertase.
1.1.2 Đặc tính của Invertase trong tế bào nấm men: [22]
Nhiều loài vi sinh vật có thể sinh tổng hợp được Invertase và sử dụng
đường saccharose như một nguồn dinh dưỡng, đặc biệt là nấm men. Hiện nay,
Invertase thương phẩm được sản xuất chủ yếu từ 2 loài nấm men Saccharomyces
cerevisiae hoặc Saccharomyces carlsbergensis.
Invertase tồn tại trong nấm men ở dạng phức hợp mannan – protein. Người
ta nhận thấy nếu tách mannan ra khỏi enzym thì hoạt tính của enzym nhanh
chóng bị giảm đi. Invertase thuộc nhóm enzym thủy phân, nó không cần
coenzym cho hoạt động xúc tác của mình. Trong cùng một loại nấm men,
Invertase có thể tồn tại ở nhiều dạng, Invertase nội bào có khối lượng phân tử
khoảng 135000 Daltons, trong khi đó Invertase ngoại bào có khối lượng phân tử
khoảng 270000 Daltons.
Không giống như một số enzym khác, Invertase có khả năng hoạt động
trong một khoảng pH tương đối rộng từ 3,5 – 5,5 với pH tối thích là 4,5; nhiệt độ
tối ưu khoảng 55oC. Invertase bắt đầu bị vô hoạt ở nhiệt độ 65oC và hoàn toàn bị
vô hoạt ở 80oC. Trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ 2oC – 8oC, enzym

vẫn giữ được hoạt tính trong vòng 1 năm.
Những kim loại nặng như chì, thủy ngân,… là tác nhân gây ức chế enzym.
Ví dụ, Pb2+ có thể phản ứng với nhóm sulfhydryl (-SH) trong phân tử protein:
Protein-SH + Pb2+ + HS-Protein

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Protein-S-Pb-S-Protein + 2H+

Trang 5


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

Liên kết disulfide tạo thành cấu trúc bậc 3 của protein và cấu trúc này
quyết định đến hoạt tính của enzym.
Ví dụ khác, ion Ag+ có thể tấn công vào nhóm Histidine của mạch bên
trong phân tử Invertase làm cho nó bị vô hoạt.
Ngoài ra, nồng độ cơ chất cao, >20% (w/v), cũng có tác động kìm hãm
enzym.
Ngoài tác dụng xúc tác phản ứng thủy phân, Invertase còn có khả năng
xúc tác phản ứng chuyển vị. Tuy nhiên tác dụng phản ứng xúc tác này rất yếu,
chỉ thể hiện rõ khi nồng độ cơ chất tương đối cao.
1.1.3 Các nguồn thu nhận Invertase: [5], [7], [20], [21]
1.1.3.1 Vi sinh vật
−

Vi khuẩn: Bacillus subtilis, Sacchrolytic clostrdia

−

Nấm men: Sacchromyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis,

Sacchromyces italicus.
−

Nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger.

1.1.3.2 Thực vật:
−

Invertase có ở các loài cây như: lúa mạch, củ cải đường, mía,

chuối,…và nhiều loại trái cây khác.
1.1.3.3 Động vật:
− Trong niêm mạc ruột non ở người và nhiều động vật cũng có Invertase.
Trong ruột heo, hàm lượng Invertase tăng dần từ lúc mới sinh và đạt đến cực đại
sau 25 ngày.
− Trong mật ong cũng có enzym Invertase, người ta nhận thấy mật ong được
sản xuất bằng cách ép ong ăn đường saccharose thì có hàm lượng Invertase cao
hơn so với bình thường.

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 6


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

Mặc dù vậy các sản phẩm Invertase thương phẩm hiện nay đều được sản
xuất từ nguồn nấm men là Sacchromyces cerevisiae và Saccharomyces
carlsbergensis.
1.1.4 Ứng dụng của Invertase: [9], [10]
1.1.4.1 Trong công nghiệp thực phẩm:
Trong sản xuất các loại bánh kẹo có pha đường, Invertase có một tầm
quan trọng rất lớn. Cơ chất mà enzym xúc tác là disaccharide, tạo thành đường
đơn glucose và fructose. Dùng làm chế phẩm Invertase có thể là các nấm men:
nấm men rượu, bia và nấm men bánh mì. Chế phẩm Invertase tách từ nấm men
rượu bia đã được Bộ bảo vệ sức khỏe của Liên Xô cho phép dùng trong công
nghệ thực phẩm. Nghiên cứu hệ thống hóa về sản xuất và sử dụng Invertase đã
được thực hiện ở Liên Xô cũ, tại viện nghiên cứu thực phẩm Ukraina từ năm
1946.
Invertase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là
trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo: kẹo dẻo, kẹo bạc hà, kẹo có nhân lỏng
hoặc mềm bằng cách bổ sung trực tiếp vào nhân kẹo để tiến hành quá trình thủy
phân saccharose, tránh hiện tượng tái kết tinh đường trong kẹo. Invertase được
ứng dụng rộng như vậy là do sản phẩm đường nghịch đảo có những ưu điểm sau:
− Sản phẩm đường nghịch đảo cho phản ứng caramen xảy ra ở nhiệt độ thấp
hơn so với đường saccharose, vì vậy sản phẩm bánh kẹo nhanh chóng đạt được
màu sắc mong muốn mà không cần nướng bánh ở nhiệt độ cao hơn.
− Sự nghịch đảo đường làm tăng nồng độ chất khô lên 5,26%. Hỗn hợp
đường sau khi thủy phân có độ ngọt cao hơn so với ban đầu. Đồng thời fructose
có mùi vị rất dễ chịu nên hỗn hợp đường sau khi thủy phân có mùi vị tốt hơn ban
đầu.

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 7


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

− Đường nghịch đảo có tính háo nước, do đó sản phẩm chứa đường nghịch
đảo sẽ không bị khô, nứt mà vẫn duy trì được kết cấu mềm láng.
− Do fructose có độ hòa tan cao hơn saccharose nên với sự có mặt của đường
nghịch đảo hàm lượng đường tổng trong dung dịch syrup có thể tăng từ 67% lên
đến 83% mà vẫn không xảy ra hiện tượng hồi đường.
− Mặt khác, đường fructose có độ ngọt cao hơn gấp 1,4 lần so với đường
saccharose nên sẽ giảm được lượng đường sử dụng trong quá trình sản xuất.
− Ngoài việc được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, hỗn hợp
đường nghịch đảo còn được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước giải khát.
Bảng 1.1: Tính hòa tan của một số loại đường trong nước ở 20oC
Đường

Độ hòa tan,
g/100 g nước

Saccharose

204

Fructose

375

Glucose

107

Maltose

83

Lactose

20

Hiện nay, bên cạnh việc sử dụng Invertase làm nghịch đảo đường, tăng độ
ngọt thì người ta còn sử dụng enzym glucose isomerase có khả năng chuyển
đường glucose thành fructose với giá thành rẻ hơn.

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 8


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

1.1.4.2 Trong y học
Invertase được dùng để chẩn đoán và chữa bệnh, ví dụ như bệnh thiếu
sucrase. Invertase được bổ sung cùng với nhiều chế phẩm enzym khác như
amylase, lactase,… sử dụng như một loại dược phẩm để hỗ trợ khả năng tiêu hóa.

Vì mục đích sức khỏe và tính chất cảm quan của sản phẩm mà Invertase
sử dụng trong công nghiệp thực phẩm cũng như trong y học đòi hỏi phải có độ
tinh sạch cao.
1.2 NẤM MEN
1.2.1 Cấu tạo tế bào nấm men: [6], [8], [26]

Hình 1.1: Cấu tạo của tế bào nấm men
Tế bào nấm men có cấu tạo rất phức tạp gồm: vỏ tế bào, màng tế bào, tế
bào chất, valutin, ty thể (mitochondria), riboxom, không bào, nhân tế bào có
màng nhân, nhiễm sắc thể.

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 9


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

Vỏ tế bào (cell wall) là một thành mỏng, trong suốt và có tính đàn hồi, có
nhiệm vụ bảo vệ tế bào khỏi tác động bên ngoài, đồng thời điều chỉnh mức độ
thẩm thấu chất dinh dưỡng và thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất.
Lớp vỏ này được cấu tạo chủ yếu từ polysaccharide kiểu hemicellulose
gồm glucan và manan. Ngoài ra thành thành tế bào còn chứa một lượng rất nhỏ
chất béo, protid, chất khoáng và kitin.
Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài là màng nhẵn dày 10 nm đến 30 nm
gồm chủ yếu lypoprotein. Lớp tiếp theo chứa phức hợp manan protein dày 100
nm. Lớp trong cùng có thể là chất keo hoặc sợi li ti dày từ 10 nm đến 250 nm, cấu
tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucose và khoảng 6% hexoamin.

Ở thành tế bào nấm men người ta phát hiện có hai vùng mang tính thẩm
thấu có chọn lọc đối với các chất khác nhau. Vỏ chứa các lỗ đường kính đến
3,6nm, qua đó nước và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào đi vào bên trong.
Các enzym được tách ra từ tế bào tập trung ở các lớp này, chúng thủy phân
các đường có phân tử lớn (maltose, saccharose) không có khả năng thẩm thấu
vào trong được. Nhờ đó các đường maltose, saccharose được đồng hóa.
Màng tế bào (membrane) là màng plasma rất mỏng, dày khoảng 8nm và
cũng gồm 3 lớp, được cấu tạo từ phức hợp lypoproteit, canxi và ribonucleoproteit.
Chức năng chủ yếu của màng là điều chỉnh vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế
bào.
Tế bào chất ( cytoplasma) là hệ thống keo, độ nhớt của nó phụ thuộc vào
thời kì sinh trưởng và các yếu tố sinh lý. Ở các tế bào non trẻ, độ nhớt của
cytoplasma nhỏ hơn ở tế bào già, đảm bảo cho việc vận chuyển sản phẩm trao
đổi chất được tốt hơn.

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 10


Luận văn thạc só

CBHD: TS. Trần Bích Lam

Valutin gồm các chất chứa nitơ, dẫn xuất của acid nucleic. Nó có quan hệ
tới sự sinh trưởng của nấm men và xuất hiện trong thời kì sinh trưởng, nảy chồi
hay tạo nang bào. Valutin nằm bên trong không bào, ở dạng hạt to (valutin nằm
yên) hoặc nhiều hạt nhỏ phân bố xung quanh mặt bên trong của không bào
(valutin hoạt động). Khi tiếp xúc với metylen xanh, valutin ở tế bào sống sẽ biến
thành màu đỏ, còn ở tế bào chết sẽ biến thành màu xanh nhưng bản thân nấm

men không đổi màu.
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân. Bên trong chứa đầy
nucleoplasma trong suốt và những sợi chỉ nhỏ dài gọi là chromosome
Nhân tế bào có hình tròn, đường kính từ 1:m đến 2:m. Nó bị ngăn cách
với xitoplasma bởi hai lớp màng. Các màng này thông với nhau qua các lỗ có
đường kính từ 30 đến 100nm. Qua đó sự liên hệ giữa nucleoplasma và xitoplasma
được thực hiện. Người ta cho rằng sự liên hệ này mang tính chọn lọc rất cao.
Nhiễm sắc thể (chromosome) cấu tạo từ protid và acid dezoxyribonucleic
(DNA). Ngoài hai chất vừa kể trên, chromosome còn chứa acid ribonucleic và
các enzym. Chromosome đóng vai trò quan trọng trong tế bào, thực hiện chức
năng di truyền và trao đổi chất, kiểm soát sự phân chia tế bào và tổng hợp protid,
lypoproteit và các quá trình sinh học khác, kể cả sự sinh sản. Quá trình nảy chồi
xảy ra cùng với việc tách nhân làm hai, khi tạo nang bào nhân sẽ tách thành
nhiều phần, tùy theo số nang bào tạo thành.
Ty thể (mitochondria) là những phần rất nhỏ bé nằm ở tế bào chất
xitoplasma, tựa các sợi có chiều rộng như nhau, từ 0,2 đến 0,5:m nhưng khác
nhau về chiều dài và có thể từ 0,4 – 1,0:m. Ty thể được cấu thành từ protit, acid
ribonucleic và các hợp chất photpho. Chúng còn chứa các enzym thủy phân
protit, chất béo và glucide. Chức năng chủ yếu của ty thể là ghép nối sự tổng hợp

HVTH: Trần Thị Mai Anh

Trang 11