Thu nhận enzyme invertase từ saccharomyces cerevisiae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


BÙI SƠN LÂM

ĐỀ TÀI

THU NHẬN ENZYME INVERTASE TỪ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE

GVHD
CHUYÊN NGÀNH

: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ
ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2007


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Lê Thị Phú

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN
VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM,
ngày……..tháng……..năm……….


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP-TỰ DO-HẠNH PHÚC

Tp. HCM, ngày……tháng…..năm 2007

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên: Bùi Sơn Lâm
Ngày, tháng, năm sinh: 26-12-1980
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống
I.

Phái: Nam
Nơi sinh: Tp. BMT
MSHV: 01105263

TÊN ĐỀ TÀI:

“Thu nhận enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae”
II.

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát quá trình tự phân của nấm men bia để thu nhận enzyme
invertase trong trường hợp có bổ sung và khơng bổ sung enzyme hỗ
trợ cho q trình tự phân.
- Khảo sát các quá trình tinh sạch chế phẩm enzyme thơ thu được sau
q trình tự phân.
- Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme sạch
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS Nguyễn Đức Lượng
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MÔN
QL CHUYÊN NGÀNH

PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua
Ngày …….tháng ……. năm 2007
TRƯỞNG PHÒNG ĐT-SĐH
TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn các thầy các cô
trong bộ môn Công nghệ thực phẩm trường Đại học
Bách Khoa đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em
hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt em xin cảm ơn sự hướng dẫn tận tình
của thầy Nguyễn Đức Lượng xuyên suốt trong quá trình

thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp và người
thân luôn luôn động viên và giúp đỡ vượt qua những
lúc khó khăn để làm tốt luận văn.
Tp.HCM, tháng 12 năm 2007
Bùi Sơn Lâm


TĨM TẮT
Ngồi amylase và glucose-isomerase, invertase là một enzyme quan
trọng được sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất dịch syrup, bánh
kẹo và kỹ thuật phân tích. Do enzyme hoạt động ở điều kiện ơn hịa, cho sản
phẩm thủy phân có chất lượng cao. Nấm men bia thuộc lồi Saccharomyces
cerevisiae, chứa enzyme invertase, thường chủ yếu tập trung trong lớp
không gian chu chất của tế bào. Lượng bã nấm men bia từ các nhà máy thải
ra hàng năm ngày càng tăng và nguồn nguyên liệu dồi dào này được tận
dụng để thu nhận enzyme invertase.
Nghiên cứu trong quá trình tự phân, khi sử dụng chế phẩm 𝛽glucanase (Viscozyme) của hãng Novozyme giúp cho việc phá vỡ màng tế
bào nhanh hơn và hoạt tính invertase thu được gấp 1.84 lần so với khơng bổ
sung. Tìm được các thơng số của quá trình là hàm lượng Viscozyme bổ
sung là 2% (so với chất khô nấm men), pH 5,5 ở nhiệt độ 500C. Sử dụng
các phương pháp kết tủa enzyme bằng muối anmonium sulfate, ethanol,
propanol-2 kết hợp phương pháp sắc ký trao đổi ion để tinh sạch enzyme.
Kết quả cho thấy phương pháp kết tủa bằng Ethanol sau đó chạy sắc ký trao
đổi ion (với DEAE-Sephadex) cho kết quả tốt nhất với hiệu suất thu hồi
enzyme là 70,47% và độ tinh sạch 66,29%. Chế phẩm enzyme invertase
sạch thu được có các đặc tính sau: Km=40,927 và Vm=0.997 đồng thời tìm
được pH thích hợp là 5,5 ở nhiệt độ 550C.

ABSTRACT
Besides amylase and glucose-isomerase, invertase is an important
enzyme which is most popular used in syrup and confectionery industry,
and analysis technology because of its mild medium environment and
giving high quality hydrolytic products. Yeast, Saccharomyces cerevisiae,
contains invertase which focuses mainly in yeast periplasm. The yeast cells
quantity is discharged from factories increase yearly and this profuse raw
material is salvaged to receive invertase.
Researching

in

self-metabolism,

when

using

ß-glucanase

(Viscozyme) of Novozyme company the breaking cell process is faster and
obtaining invertase activity is 1.84 times than the process without ßglucanase . The parameters we get through this process: the additional
Viscozyme is 2% (against with yeast mass), pH 5.5 at 500C. We use
ammonium sulfate, ethanol and propanol-2 to precipitate invertase and
combine with ion-exchange chromatography to purify enzyme. The enzyme
precipitating method by Ethanol then using ion-exchange chromatography
(with DEAE-Sephadex) gives the best result with enzyme recovered
productivity is 70.47% and the purity 66.29%. The obtaining purifying
enzyme has the characteristics as below: Km= 40.927 and Vm= 0.997
optimal pH is 5.5 at 550C.

TĨM TẮT LÝ LỊCH
I. LÝ LỊCH TRÍCH NGANG:
Họ và tên: Bùi Sơn Lâm

Phái: Nam

Ngày tháng năm sinh: 26/12/1980

Tại: Tp. Buôn Ma Thuột

Nguyên quán: Trung Lộc, Can Lộc, Hà Tĩnh
Địa chỉ: 9C Hồng Diệu, Tp. Bn Ma Thuột
Dân tộc: Kinh

Tơn giáo: Khơng

II. Q TRÌNH ĐÀO TẠO
TRUNG HỌC:
Chế độ học: Chính qui

Thời gian học: từ 1995 đến 1998

Nơi học: Trường PTTH Buôn Ma Thuột, Tp. Bn Ma Thuột
ĐẠI HỌC:
Chế độ học: Chính qui

Thời gian học: từ 1998 đến 2003

Nơi học: Trường Đại Học Kỹ Thuật Đà Nẵng
Ngành học: Công nghệ thực phẩm
Ngày và nơi bảo vệ luận án tốt nghiệp: năm 2003 tại trường Đại học Kỹ
Thuật Đà Nẵng.
Người hướng dẫn: GS.TSKH Lê Văn Hoàng
TRÊN ĐẠI HỌC:
Cao học từ năm 2005 đến 2007 tại Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM
Tên luận án: Thu nhận enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae
Ngày và nơi bảo vệ: 01/2008 tại trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM
Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


Trang 1

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. 4
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. 6
Phần I: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 8
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................. 9
Phần II: TỔNG QUAN ................................................................................ 10
2.1. Nguồn thu nhận enzyme Invertase ...................................................... 11
2.1.1. Thu nhận enzyme invertase từ thực vật bậc cao............................ 11
2.1.2. Thu nhận enzyme invertase từ vi sinh vật ..................................... 11
2.2. Nấm men .............................................................................................. 12
2.2.1. Hình thái nấm men......................................................................... 12
2.2.2. Cấu tạo của tế bào nấm men .......................................................... 13
2.2.2.1. Thành tế bào ........................................................................... 13
2.2.2.2. Lớp không gian chu chất ........................................................ 13
2.2.2.3. Màng tế bào chất ................................................................... 14
2.2.2.4. Tế bào chất ............................................................................. 14

2.2.2.5. Nhân tế bào ............................................................................ 14
2.2.2.6. Không bào .............................................................................. 15
2.2.2.7. Volutin .................................................................................... 15
2.2.2.8. Ty thể ...................................................................................... 15
2.2.2.9. Ribosome ................................................................................ 16
2.3. Enzyme invertase ................................................................................. 16
2.3.1. Khái niệm ...................................................................................... 16
2.3.2. Đặc điểm Enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae .......... 18
2.3.2. Ứng dụng của enzyme invertase................................................... 20
2.3.2.1. Sản xuất đường nghịch đảo ................................................... 20
2.3.2.2. Sản xuất mứt kẹo .................................................................... 21
2.4. Quá trình thu nhận enzyme invertase .................................................. 23
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 2

2.4.1. Rửa nấm men và thu sinh khối nấm men ..................................... 24
2.4.2. Phá vỡ tế bào ................................................................................. 24
2.4.2.1. Các phương pháp cơ học ....................................................... 24
2.4.2.2. Các phương pháp phi cơ học ................................................. 26
2.4.2.3. Quá trình tự phân ................................................................... 26
2.4.3. Tinh sạch enzyme ......................................................................... 27
2.4.3.1. Phương pháp kết tủa .............................................................. 27
2.4.3.2. Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration) .................................. 28
2.4.3.3. Phương pháp sắc ký ............................................................... 29
2.5. Tình hình số lượng bã nấm men ở một số nhà máy bia ...................... 31
Phần III: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................... 32

3.1. Mục đích .............................................................................................. 33
3.2. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................. 33
3.3. Nguyên liệu ......................................................................................... 34
3.3.1. Nấm men ....................................................................................... 34
3.3.2. Đường ........................................................................................... 34
3.3.3. Enzyme ......................................................................................... 34
3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 35
3.4.1. Khảo sát một số phương pháp phá vỡ màng tế bào ...................... 35
3.4.2. Quá trình tinh sạch enzyme invertase ........................................... 35
3.5. Các phương pháp phân tích ................................................................. 36
3.5.1. Xác định hàm lượng chất khơ nấm men ....................................... 36
3.5.2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS (acid 3,5DinitroSalicylic) ..................................................................................... 37
3.5.3. Xác định protein bằng phương pháp so màu Lowry .................... 37
3.5.4. Xác định hoạt tính invertase ......................................................... 38
3.6. Xử lý số liệu thực nghiệm .................................................................... 40
Phần IV :KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 41
4.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp tự phân ........................................... 42
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 3

4.1.1. Khảo sát tỷ lệ sinh khối nấm men/ dung môi ............................... 42
4.1.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH ..................................................... 44
4.2. Phương pháp tự phân có bổ sung enzyme ........................................... 46
4.2.1. Xác định hàm lượng chế phẩm Viscozyme bổ sung .................... 47
4.2.2. Xác định pH ban đầu của dịch nấm men có bổ sung Viscozyme 48
4.2.3. Xác định nhiệt độ ban đầu của của nấm men ............................... 49

4.3.1. Phương pháp kết tủa enzyme ........................................................ 51
4.3.1.1. Kết tủa bằng muối ammonium sulfate, (NH4)2SO4 ................ 51
4.3.1.2. Kết tủa bằng dung môi Ethanol ............................................. 52
4.3.1.3. Kết tủa bằng dung môi propanol-2 ........................................ 54
4.3.2. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion ........... 55
4.4. Khảo sát một số tính chất của chế phẩm enzyme ................................ 60
4.4.1. Xác định nhiệt độ thích hợp của chế phẩm .................................. 60
4.4.2. Xác định pH thích hợp của chế phẩm ........................................... 62
4.4.3. Khảo sát động học của chế phẩm invertase .................................. 63
Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................... 67
5.1. Kết luận ............................................................................................... 68
5.2. Đề nghị ................................................................................................ 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 69

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 4

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần acid amin của enzyme invertase nội và ngoại ............ 18
Bảng 2.2. Một số phương pháp cố định enzyme invertase ............................. 21
Bảng 2.3. Quá trình tách bằng màng lọc ......................................................... 28
Bảng 2.4. Các loại gel dùng trong lọc gel ....................................................... 28
Bảng 2.5. Các loại nhựa trao đổi ion ............................................................... 29
Bảng 2.6. Số lượng bã nấm men ở một số nhà máy bia điển hình ở
Việt Nam ......................................................................................... 30
Bảng 4.1. Hoạt tính enzyme invertase theo tỷ lệ nấm men/dung môi ............ 42

Bảng 4.2. Hoạt tính của enzyme invertase theo nhiệt độ tự phân................... 43
Bảng 4.3. Hoạt tính enzyme invertase theo pH của dung dịch ....................... 45
Bảng 4.4. Hoạt tính enzyme invertase theo thời gian tự phân ........................ 45
Hình 4.5. Hàm lượng Viscozyme bổ sung ảnh hưởng đến hoạt tính
Invertase .......................................................................................... 47
Bảng 4.6. Hoạt tính enzyme invertase theo pH của dung dịch ....................... 48
Bảng 4.7. Hoạt tính enzyme invertase theo nhiệt độ của q trình
tự phân............................................................................................. 49
Bảng 4.8 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme invertase khi
kết tủa với muối ammonium sulfate ............................................... 52
Bảng 4.9 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme khi kết tủa bằng
Ethanol ............................................................................................ 53
Bảng 4.10. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme khi kết tủa bằng
Propanol-2 ....................................................................................... 54
Bảng 4.11. Hiệu quả tinh sạch enzyme invertase bằng sắc ký trao
đổi ion ............................................................................................. 58
Bảng 4.12. Hiệu quả tinh sạch enzyme invertase bằng sắc ký trao đổi
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 5

ion sau khi đã xử lý bằng dung môi Ethanol và propanol-2 ........... 60
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm........................... 61
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm .................. 62
Bảng 4.15. Phương trình biểu diễn các mối quan giữa nồng độ cơ chất
theo thời gian phản ứng với các nồng độ cơ chất khác nhau .......... 64
Bảng 4.16. Các giá trị 1/[S] và 1/V tương ứng với mỗi nồng độ cơ chất ..... 656

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 6

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình thái và cấu tạo của tế nấm men .............................................. 11
Hình 2.2 Cấu tạo thành tế bào nấm men ........................................................ 12
Hình 2.3 Phản ứng thủy phân đường saccharose ........................................... 16
Hình 2.4 Sơ đồ thu nhận enzyme invertase ................................................... 22
Hình 2.5 Các phương pháp phá vỡ màng tế bào ............................................ 24
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................ 32
Hình 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối nấm men/dung mơi đến
hoạt tính invertase thu được ............................................................ 42
Hình 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả quá trình tự phân ................ 43
Hình 4.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính invertase trong q trình
tự phân............................................................................................. 44
Hình 4.4 Hoạt tính enzyme invertase theo thời gian tự phân ........................ 46
Hình 4.5 Hàm lượng Viscozyme bổ sung ảnh hưởng đến hoạt tính
invertase .......................................................................................... 47
Hình 4.6 pH ban đầu ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme Viscozyme ......................................................................... 49
Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme Viscozyme ......................................................................... 50
Hình 4.8 Giản đồ thu enzyme invertase trên cột Sephadex G100 ................. 56
Hình 4.9 Giản đồ thu invertase trên cột sắc ký trao đổi ion
DEAE-Sephadex A25 ..................................................................... 57

Hình 4.10 Giản đồ thu invertase trên cột DEAE-Sephadex sau khi tủa
với Ethanol .................................................................................... 58
Hình 4.11 Giản đồ thu invertase trên cột DEAE-Sephadex sau khi tủa
với Propanol-2............................................................................... 59
Hình 4.12 Sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm invertase ....... 61
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 7

Hình 4.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm invertase.......... 63
Hình 4.14 Hàm lượng đường bị thủy phân theo thời gian ở các nồng độ
cơ chất khác nhau.......................................................................... 64
Hình 4.15 Đường biểu diễn mối quan hệ giữa 1/[S] và 1/V.......................... 65

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 8

Phần I

MỞ ĐẦU

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 9

LỜI MỞ ĐẦU
Ở đâu có sự sống ở đó có enzyme, enzyme diatase được tách từ malt
bởi Payen và Persoz năm 1833 nhưng đến giữa thế kỷ 19 mới đưa vào sản
xuất theo qui mô công nghiệp. Từ đầu thế kỷ 21 đến nay, cùng với sự phát
triển của ngành công nghệ di truyền đã tạo ra các chủng vi sinh vật đột biến
có khả năng sinh tổng hợp cao, cộng thêm cải tiến kỹ thuật sử dụng enzyme
tạo nền tảng cho sự bùng phát ngành công nghệ enzyme, các chế phẩm
enzyme được ứng dụng ngày càng nhiều trong cơng nghệ thực phẩm, kỹ thuật
phân tích, y học, di truyền. Một xu hướng mới đang xuất hiện là sự xuất hiện
các máy móc cảm ứng (biosenssion), các đầu dị sinh học (biosensor) trong kỹ
thuật phân tích hay tin sinh học (bioinformatic).
Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzyme được ứng dụng rộng
rãi trong sản xuất rượu, bia, nước giải khát, bánh kẹo, chế biến rau quả, thịt,
cá… Trong đó thị trường đồ uống là một trong những thị trường tiềm năng,
hàm lượng các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất dịch syrup được tiêu
thụ ngày càng tăng. Ngoài amylase và glucose-isomerase, invertase là một
enzyme quan trọng và được sử dụng phổ biến trong công nghệ sản xuất dịch
syrup. Do enzyme hoạt động ở điều kiện ơn hịa, cho sản phẩm thủy phân có
chất lượng cao với hàm lượng tro thấp, dung dịch ít biến đổi màu và hàm
lượng hydroxy methyl furfural (HMF) thấp. Ngồi ra enzyme invertase cịn
được sử dụng trong sản xuất bánh kẹo và kỹ thuật phân tích.
Hiện nay, tại Việt Nam việc sử dụng enzyme trong thực phẩm đang
phát triển nhưng về chủng loại và số lượng cịn ít. Đồng thời, do hạn chế về
mặt kỹ thuật, tài chính nên khơng có nhà máy sản xuất chế phẩm enzyme nói
chung và enzyme invertase nói riêng ở qui mơ cơng nghiệp, do đó hầu hết

phải nhập khẩu các chế phẩm enzyme với giá thành cao. Điều đó cho thấy
việc tìm hiểu, nghiên cứu và phát triển sản xuất enzyme tại Việt Nam là điều
cần thiết.
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 10

Phần II

TỔNG QUAN

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 11

2.1. Nguồn thu nhận enzyme Invertase
Enzyme invertase được thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật và thực vật bậc cao.
2.1.1. Thu nhận enzyme invertase từ thực vật bậc cao [12, 21, 34]
Invertase thu nhận từ thực vật bao gồm nhiều loại khác nhau được phân
chia theo tính chất hòa tan, pH tối ưu, điểm đẳng điện. Hai loại invertase tách
ra từ thực vật ở dạng hòa tan hoặc liên kết với thành tế bào. Invertase hòa tan
được chia thành invertase acid, invertase kiềm hoặc invertase trung hòa dựa
trên pH thủy phân tối ưu. Invertase acid (pH tối ưu từ 3,5÷5,0) liên quan đến
q trình trao đổi chất saccharose và được dự trữ trong các khơng bào thực

vật cịn non. Invertase kiềm (pH= 7,0÷8,0) có thể hiện diện trong tế bào chất
của mô trưởng thành và điều chỉnh mức hexose và saccharose trong tế bào
chất. Trong apoplast, một loại invertase ở thành tế bào có pHopt acid đóng một
vai trị quan trọng trong q trình làm chậm lại sự đồng hóa bằng cách duy trì
gradient nồng độ saccharose giữa mô sản xuất và mô tiêu thụ. Sự xuất hiện
của các dạng invertase có thể là thuận lợi cho quá trình sinh lý của thực vật,
nó được coi như là một phương tiện tối ưu hóa q trình trao đổi chất
saccharose, kiểm soát sự phân chia và dự trữ ở các tế bào khác nhau, ở các
pha phát triển khác nhau và ở các điều kiện sinh lý khác nhau.
Hoạt tính enzyme invertase được tìm thấy trong nhiều loại mơ thực vật
như: lúa mì, ngơ, lúa mạch, đậu, củ cải đường, cà rốt, nước ép xoài, hoa loa
kèn, rễ cây tre, lúa và khoai tây ngọt. Chúng tích lũy dưới dạng protein hóa
tan trong tế bào hoặc liên kết với thành tế bào.
2.1.2. Thu nhận enzyme invertase từ vi sinh vật [9, 19]
Invertase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các loài nấm men như
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida utilis,
Rhodotula glutinis, Shizosaccharomyces pome… và một số loài nấm mốc như
Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Atozobacter chroococcum…
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 12

Hiện nay thu nhận enzyme invertase trong qui mô cơng nghiệp chủ yếu
từ S.cerevisiae. Hoạt tính và loại enzyme invertase thu được từ S.cerevisiae
phụ thuộc vào chủng nấm men và điều kiện nuôi cấy.
2.2. Nấm men [1, 5, 26, 38]
Nấm men là sinh vật thuộc nhóm eucaryote, chúng có mặt hết sức rộng rãi

trong tự nhiên. Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein và
vitamin vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm.
2.2.1. Hình thái nấm men
Nấm men thường có cấu tạo đơn bào, hình dạng nấm men thay đổi theo
lồi, phụ thuộc vào tuổi và điều kiện ngoại cảnh. S.cerevisiae thường có dạng
hình trứng hay bầu dục. Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo
giống, loài, thường to hơn tế bào vi khuẩn. Các loài nấm đơn bào thường có
kích thước 3÷5 x 5÷10m.

Hình 2.1. Hình thái và cấu tạo của tế nấm men
Trong đó: Cw: thành tế bào; Cm: màng nguyên sinh chất; Cp: chất nguyên sinh;
D: thể Golgi; ER : mạng lưới nội chất, Li: các giọt mỡ; Mi: ty thể; N: nhân;
Nl: hạch nhân; Po: các giọt polyphosphat; Rb: Ribosome; V: không bào; Sc:
sẹo nảy chồi.
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 13

2.2.2. Cấu tạo của tế bào nấm men
2.2.2.1. Thành tế bào
Thành tế bào chiếm 15÷25% chất khơ của tế bào, dày 100÷200nm. Cấu
trúc chính của thành tế bào là polysaccharide (chiếm 80÷90%), chủ yếu là
glucan (hiện diện cả hai liên kết -1,6 và -1,3) và manan (gồm liên kết α -1,6
trong lõi với α -1,2 và α -1,3 cạnh chuỗi) với một tỷ lệ nhỏ chitin. Chitin là
một polimer của N-acetylglucosamine chỉ chiếm 2÷4% thành tế bào và chủ
yếu ở sẹo lồi, hàm lượng chitin trong các chủng loại nấm men cũng khác
nhau, ở chủng Candida albicans có hàm lượng chitin cao hơn nhưng ở một số

lồi khác thì khơng có sự hiện diện của chitin.

Hình 2.2: Cấu tạo thành tế bào nấm men
Ngồi ra thành tế bào cịn chứa các thành phần khác như: protein, lipid
và phosphat vô cơ
2.2.2.2. Lớp không gian chu chất
Lớp không gian chu chất có bề dày rất mảnh 35÷45A0, nằm ở khoảng
giữa thành tế bào và màng tế bào chất, chứa mannoprotein. Tại đây một số cơ
chất không thấm qua được màng tế bào chất sẽ bị thủy phân thành các chất có
phân tử lượng nhỏ hơn rồi vận chuyển vào bên trong tế bào chất. Enzyme
invertase thường ở lớp không gian này để thủy phân phân tử saccharose thành
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 14

glucose và fructose nhỏ hơn được vẩn chuyển qua màng tế bào chất vào bên
trong nội bào.
2.2.2.3. Màng tế bào chất
Màng tế bào chất dày khoảng 7nm với một vài chỗ lõm vào trong tế
bào chất. Cũng giống như các màng khác được cấu tạo bởi lớp lipid kép kết
hợp với protein. Thành phần lipid chứa chủ yếu là phosphatidycholine,
phosphatidyl-ethanolamine

và

một

lượng

nhỏ

phosphaditylinositol,

phosphadityl-serine, phosphaditylglycerol, sterol (ergosterol và zymosterol).
Màng protein nấm men có vai trò bảo vệ nguyên sinh chất, enzyme tổng hợp
thành tế bào, điều hòa vận chuyển một cách chọn lọc các chất dinh dưỡng từ
bên ngoài vào bên trong và bài tiết các thành phần có hại cho cơ thể từ bên
trong ra ngoài.
2.2.2.4. Tế bào chất
Tế bào chất của nấm men là một dung dịch keo, có tính acid (pH=5,5),
chứa các ion, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp và trung bình
hoặc những hợp chất cao phân tử hòa tan (như enzyme, factor, glycogen).
Những enzyme có mặt trong tế bào chất chủ yếu gồm các enzyme tham gia
chu trình đường phân, sinh tổng hợp acid béo, protein.
2.2.2.5. Nhân tế bào
Nhân tế bào là cơ quan hình cầu có nhân thùy, đường kính khoảng
1,5m. Nhân được bao bọc bởi màng nhân, lớp màng này cấu tạo từ 2 lớp có
chứa các lỗ nhỏ có đường kính 50÷100nm. Nhân đóng vai trị quan trọng
trong q trình phân chia tế bào, phân bào và tạo chồi. Đối lập với các
eukaryote khác, màng nhân của nấm men không bị hịa tan trong suốt q
trình phân bào.
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 15

Trong nhân có vùng chứa các thơng tin di truyền, xuất hiện trong suốt
quá trình phân bào và sửa chữa sai sót trong q trình sao chép, nằm trong
dịch nhân là DNA cùng với histone và non-histone trong chuỗi nhiễm sắc thể.
2.2.2.6. Khơng bào
Mỗi tế bào nấm men có một hoặc nhiều không bào. Không bào chứa
đầy dịch, bên ngoài được bao bọc bởi lớp màng lypoprotein gọi là màng
khơng bào. Hình dạng của màng khơng bào có thể thay đổi tùy theo độ tuổi và
trạng thái sinh lý của tế bào. Không bào là nơi chứa đựng các ezyme protease
tham gia vào quá trình tự phân.
Chức năng của khơng bào: chứa các enzyme tiêu hóa như
endopeptidase, aminopeptidase, carboxypeptidase, tích trữ các acid amin,
polyphosphate và các ion kim loại cần thiết, điều chỉnh sự thẩm thấu.
2.2.2.7. Volutin
Thường thấy trong khơng bào
Vai trị: là nơi chứa chất dự trữ dinh dưỡng của tế bào.
2.2.2.8. Ty thể
Là những bào quan rất nhỏ nằm trong tế bào chất, hình bầu dục, nhiều
rộng từ 0,2÷0,5m, chiều dài 0,4÷1m.
Ty thể được cấu tạo từ protein, acid ribonulcleic và các hợp chất phospho. Ty
thể gồm 3 lớp:
- Lớp màng ngoài: chứa các enzyme liên quan đến sự chuyển hóa lipid.
- Khoảng cách giữa các lớp nơi xảy ra các phản ứng tạo ATP.
- Lớp màng trong: chứa các NADH và những thành phần của chuỗi hô
hấp.

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học

Trang 16

Ngồi ra, mạng lưới ty thể cịn chứa các enzyme của q trình oxy hóa
acid béo, chu trình acid citric.
Chức năng: thực hiện phản ứng oxy hóa khử giải phóng điện tử, tham gia tổng
hợp ATP, tham gia giải phóng năng lượng từ ATP và chuyển chúng thành các
dạng năng lượng khác cung cấp cho tế nào
2.2.2.9. Ribosome
Ribosome của nấm men tồn tại hai loại:
- Loại 80S gồm hai tiểu thể 40S và 60S, tồn tại trong nguyên sinh chất.
- Loại 70S gồm hai tiểu thể 50S và 40S. Chúng liên kết với cấu trúc
màng và có khả năng tổng hợp mạnh.
Chức năng của ribosome là tham gia vào quá trình tổng hợp protein ở tế bào.
2.3. Enzyme invertase
2.3.1. Khái niệm [3, 7]
Invertase (ký hiệu là E.C.3.2.1.26) còn gọi là -fructofuranosidase,
sucrase hay saccharase là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp enzyme, chủ yếu sử dụng trong cơng nghiệp bánh kẹo. Nó
là một loại enzyme thủy phân, có tác dụng thủy phân đường saccharose thành
glucose và fructose, tránh sự kết tinh của đường trong sản phẩm thực phẩm,
sự đồng hóa cồn trong rượu pha.
Saccharose là một disaccharide không khử, được tạo bởi một phân tử
-D-glucose và -D-fructose bằng liên kết -1,4-glycoside. Saccharose dễ
dàng bị thủy phân dưới mơi trường acid hoặc có mặt của invertase, khi bị thủy
phân sẽ tạo thành hỗn hợp đường đơn, gọi là hỗn hợp đường nghịch đảo
(invert sugar) với tỷ lệ glucose và fructose là 1:1. Dung dịch saccharose ban
đầu có góc quay cực phải (+66,50), sau khi thủy phân có độ quay cực (-200)
do tạo thành D-glucose có D=+52,50 và D-fructose có D= -920.
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 17

Hình 2.3. Phản ứng thủy phân đường saccharose
Invertase có hoạt tính cao trong vùng pH 3,5÷5,5 và pH tối ưu 4,5 và
nhiệt độ tối ưu là 550C. Các giá trị tối ưu này có thể thay đổi tùy thuộc vào
nguồn thu nhận enzyme. Invertase bắt đầu vô hoạt ở nhiệt độ 650C và hồn
tồn bị vơ hoạt ở 800C.
Các kim loại nặng như chì, thủy ngân là những chất cực kỳ độc đối với
con người vì chúng ức chế enzyme. Chẳng hạn như: Pb có thể phản ứng gốc
sulfhydryl (-SH) trong protein, theo phản ứng:
Protein-SH + Pb++ + HS-protein  protein-S-Pb-S-protein + 2H+
Liên kết disulfit tạo thành cấu trúc bậc 3, cấu trúc này quyết định đến
hoạt tính của enzyme. Vì vậy sự phá hủy liên kết disulfit sẽ gây bất lợi cho
enzyme.
Ngoài ra ion Ag+ cũng tác động lên histidine trong phân tử invertase và
làm cho nó mất hoạt tính, ở nồng độ cao CuSO4 cũng kìm hãm invertase,
aniline được xem là một chất độc do dó cũng làm vô hoạt enzyme invertase.
Cuối cùng nồng độc cơ chất cao cũng có tác dụng kìm hãm enzyme.

Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học


Trang 18

2.3.2. Đặc điểm Enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae
[ 9, 10,14, 15, 16, 19, 20, 23, 27,30, 32, 35]
Enzyme thu được từ S.cerevisiae có hai loại chính, một loại enzyme gọi
là invertase ngoại (external invertase), có bản chất là một glycoprotein với
mức độ glycosyl hóa cao, chứa 50% là D-manose và 3% glucosamine, liên kết
với 18-20 asparagine và có khối lượng phân tử khoảng 270.000 dalton, nó giữ
vai trị quan trọng trong q trình chuyển hóa saccharose vì cơ chất này khơng
có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào chất. Enzyme này tồn tại ở khoảng
không gian giữa màng tế bào và màng tế bào chất (lớp không gian chu chất).
Một loại enzyme khác, gọi là invertase nội bào (internal invertase), khơng
chứa hoặc chứa rất ít nhóm carbonhydrat hay khơng glycosyl hóa và tồn tại
bên trong tế bào chất, nó có khối lượng phân tử khoảng 135.000 dalton. Mặc
dù chuỗi polypeptide cả hai enzyme này đều được sản xuất bởi cùng 1 gen
SUC2 nhưng được phiên mã từ các codon khác nhau nên có thêm hai acid
amin (cysteine và cystin) trên chuỗi acid amin của invertase ngoại. Cả hai
enzyme đều có Km với saccharose và raffinose gần giống nhau và pHopt cũng
giống nhau (3,5÷5,5) nhưng pH ổn định khác nhau. Một nghiên cứu khác sau
đó chỉ ra enzyme invertase ngoại bào sau khi loại bỏ cacbonhydrate bằng cách
xử lý với enzyme endoglucosaminidase H thì cho thấy invertase ngoại bào
được kết hợp từ hai đơn vị protein có trọng lượng khoảng 60.000 dalton [23] .
Sự tạo thành cả hai loại enzyme này đều được kiểm soát bởi sự ức chế
dị hóa trong q trình sao chép. Đối với nguồn enzyme invertase thu nhận từ
vi sinh vật thì các sản phẩm của quá trình thủy phân saccharose đều là các
chất ức chế enzyme, trong đó glucose đóng vai trị là chất ức chế không cạnh
tranh và fructose là tác nhân ức chế cạnh tranh.
Một nghiên cứu sự ảnh hưởng của cacbonhydrate lên enzyme invertase
ngoại bào trong q trình rã đơng, pH, và xử lý nhiệt cho thấy enzyme tự
nhiên ban đầu bền hơn enzyme đã loại bỏ cacbonhydrate khi rã đông, giảm
Học viên: Bùi Sơn Lâm

Luận văn cao học