Thu nhận enzyme phytase từ aspergillus ficuum, thử nghiệm, phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-----------------

QUÁCH CẨM HỒNG

THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ
ASPERGILLUS FICUUM, THỬ NGHIỆM
PHÂN GIẢI NGUỒN NGUYÊN LIỆU LÀM
THỨC ĂN GIA SÚC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2007


LỜI CẢM ƠN

Trân trọng biết ơn:
Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa
Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học
Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học
Đã truyền đạt cho tôi những nền tảng tri thức vững chắc trong suốt thời
gian học tập tại trường.
Để có được kết quả luận án này, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu
sắc nhất đến:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

Đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để
tôi hoàn thành tốt luận án của mình.
Cô tuyến, bạn Sanh và các cô chú, anh chị tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã
nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này.
Chị Ái, anh Duy, bạn Long và em Hiền thuộc phòng vi sinh Viện Sinh
học Nhiệt đới đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện
luận án này.
Xin chân thành cảm ơn các Anh Chị và các Bạn lớp Cao học K2005, các
bạn bè đồng nghiệp Khoa Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn
thành tốt luận án này.
Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã luôn yêu thương
và luôn ủng hộ con tiếp bước trên con đường học vấn của mình.


TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài nghiên cứu thu nhận enzyme phytase từ Aspergillus ficuum, thử
nghiệm phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc dựa trên cơ sở sử
dụng nguồn cơ chất cảm ứng là cám ngô để thu nhận enzyme phytase rồi sau đó
thử nghiệm phân giải nguồn phế phụ phẩm rẻ tiền sẵn có - cám ngô, cám mì, cám
gạo. Đề tài đã được tiến hành nghiên cứu với những nội dung sau:
- Về môi trường nuôi cấy đã tiến hành lựa chọn được môi trường với thành
phần thích hợp cho hoạt độ enzyme phytase cao.
- Về qui trình thu nhận, đã tiến hành khảo sát các thông số của quá trình
nuôi cấy – thời gian lên men, nhiệt độ lên men, phổ pH hoạt động, khả năng chịu
nhiệt của phytase từ chủng Aspergillus ficuum.
- Về tinh sạch, đã tiến hành khảo sát các phương pháp tủa – cồn,
ammonium sulfate, polyethylene glycol 6000; tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc
gel trên biogel P100; phân tách hệ enzyme phytase bằng phương pháp điện di
trên gel SDS – PAGE.

- Về sản phẩm, đã nghiên cứu về hoạt độ, hàm lượng prôtêin, thử nghiệm
phân giải phytase trên nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc, tạo chế phẩm
enzyme phytase dạng lỏng và bột.
Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng cám ngô như nguồn cơ chất để
thu nhận enzyme phytase. Chế phẩm enzyme dạng lỏng, bột có hoạt độ tương
đương với các sản phẩm cùng loại trên thị trường. Qui trình sản xuất enzyme
phytase không quá phức tạp nên kết quả nghiên cứu rất khả thi và có thể đưa vào
triển khai sản xuất và kinh doanh.


SUMMARY

This studying subject to receive enzyme phytase from Aspergillus ficumm,
test the splitting of material source used for livestock food which is based on use
of inducted substrate source, corn bran, to receive enzyme phytase, then
continue testing the splitting of available cheap waste material source such as
bran of corn, manioc, rice, etc… The study was proceeded as follows:
- Nutrient medium was chosen to be the one with components well-suited to
hight activity of enzyme phytase.
- Receving procedure was carried on testing parameters of nutrient
medium, fermentation time and temperature, acting pH spetrum, heat-proof
capacity of phytase from Aspergillus ficuum.
- Purity was undergone to confirm examining the methods of alcolhol
precipitation, ammonium sulfate, polyethylene glycol 6000, purifying enzyme by
gel chromatography on biogel P100, separating enzyme phytase system by
method of gel SDS-PAGE electrophoresis.
- Products was carried on studying activity, protein content, testing phytase
zymolysis on material source to produce livestock food, liquid and flour
prepation.
Studying results prove corn bran to be able to be used as the sustrate

source to receive enzyme. Liquid and flour enzyme preparation with activity
equivalent to the same market products. Procedure to manufacture enzyme
phytase is not complex, therefore it is very realizable and able to be put into
processing and trading.


MỤC LỤC
Trang
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng biểu, hình vẽ

MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 2
1.1.

Sơ lược quá trình nghiên cứu enzyme phytase ............................................2

1.2.

Axít phytic....................................................................................................8
1.2.1. Cấu trúc hóa học ............................................................................ 10
1.2.2. Chức năng sinh lý .......................................................................... 12
1.2.3. Tác động kháng dưỡng của axít phytic .......................................... 13

1.3.

Enzyme phytase........................................................................................ 14
1.3.1. Định nghóa...................................................................................... 14
1.3.2. Phân loại và danh pháp .................................................................. 14

1.3.3. Cơ chế thủy phân của enzyme phytase.......................................... 17
1.3.4. Nguồn thu nhận .............................................................................. 20
1.3.4.1. Phytase từ thực vật ............................................................ 20
1.3.4.2. Phytase từ động vật........................................................... 20
1.3.4.3. Phytase từ vi sinh vật ........................................................ 21
1.3.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của phytase ......................................... 22
1.3.5.1. Nhiệt độ ............................................................................ 22
1.3.5.2. pH ..................................................................................... 23
1.3.5.3. Tác động cơ chất ............................................................... 26

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


1.3.5.4. Khả năng chịu nhiệt .......................................................... 27
1.3.6. Các yếu tố vật lý ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase
.................................................................................................................. 28
1.3.6.1. Các yếu tố vật lý ............................................................... 28
1.3.6.2. Các yếu tố dinh dưỡng ...................................................... 29
1.4.

Các ứng dụng của enzyme phytase........................................................... 32
1.4.1. Trong công nghiệp thức ăn gia súc ................................................ 32
1.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm........................................................ 33
1.4.3. Trong tổng hợp myo-inositol phosphate ........................................ 34
1.4.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy .............................................. 35
1.4.5. Các ứng dụng khác ......................................................................... 35

1.5.

Sơ lược về nấm mốc Aspergillus ficuum ................................................... 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.................................................38
2.1.

Vật liệu ..................................................................................................... 38
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 38
2.1.2. Các thiết bị chính ........................................................................... 38
2.1.3. Nguyên liệu sử dụng làm cơ chất ................................................... 38
2.1.4. Môi trường nuôi cấy nấm mốc ....................................................... 38
2.1.5. Hóa chất dùng xác định hàm lượng prôtêin ................................... 39
2.1.6. Hóa chất dùng xác định hoạt độ ..................................................... 39
2.1.7. Các hóa chất dùng trong định lượng đường tổng số bằng phản ứng
màu ........................................................................................................... 40
2.1.8. Các hóa chất dùng chạy điện di ..................................................... 40
2.1.9. Hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel ................................................ 41
2.1.10. Các hóa chất dùng xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt độ

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


phytase..................................................................................................... 42
2.1.11. Các hóa chất dùng trong bảo quản enzyme phytase ................... 42
2.2.

Phương pháp ............................................................................................. 43
2.2.1. Qui trình thu nhận enzyme phytase ............................................... 44

2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái Aspergillus ficuum....................... 45
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy Aspergillus ficuum sinh tổng hợp
enzyme phytase ........................................................................................ 45
2.2.4. Phương pháp chiết dung dịch enzyme từ canh trường nuôi cấy
nấm mốc.................................................................................................... 45
2.2.5. Xác định hoạt độ theo phương pháp của Murphy và Riley............ 46
2.2.6. Xác định hàm lượng prôtêin theo phương pháp Bradford.............. 48
2.2.7. Phương pháp xác định đường tổng số bằng phản ứng màu ............ 50
2.2.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm ............................................. 51
2.2.9. Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp
phytase hoạt độ cao .................................................................................. 52
2.2.10. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ phytase từ
chủng A. ficuum......................................................................................... 53
2.2.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase từ
chủng A. ficuum......................................................................................... 53
2.2.12. Phổ pH hoạt động của phytase từ chủng A. ficuum...................... 53
2.2.13. Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A. ficuum.................. 53
2.2.14. Phương pháp tủa enzyme phytase ............................................... 54
2.2.14.1. Phương pháp tủa bằng ethanol .................................... 54
2.2.14.2. Phương pháp tủa bằng ammonium sulfate (NH4)2SO4
..................................................................................................... 54
2.2.14.3. Phương pháp tủa bằng polyethylenglycol (PEG) 6000

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


..................................................................................................... 55
2.2.14.4. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme sau tủa

..................................................................................................... 56
2.2.15. Phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamid
.................................................................................................................. 57
2.2.16. Phương pháp sắc ký lọc gel (rây phân tử) ................................... 59
2.2.17. Phương pháp sấy phun enzyme phytase...................................... 62

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................64
3.1.

Kết quả quan sát hình thái ........................................................................ 64

3.2.

Định lượng đường tổng số bằng phản ứng màu ........................................ 65

3.3.

Khảo sát thành phần môi trường cho sinh tổng hợp phytase hoạt độ cao

............................................................................................................................. 66
3.4.

Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp phytase

hoạt độ cao .......................................................................................................... 71
3.5.

Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ phytase từ chủng

A. ficuum .............................................................................................................. 72

3.6.

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase từ chủng

A. ficuum .............................................................................................................. 74
3.7.

Phổ pH hoạt động của phytase từ chủng A. ficuum ................................... 75

3.8.

Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A. ficuum ............................... 77

3.9.

Khảo sát các phương pháp tủa enzyme phytase ....................................... 78

3.10. Thử nghiệm phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc ................ 82
3.11. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel trên Biogel P-100........................ 83
3.12. Phân tách hệ enzyme phytase bằng phương pháp điện di trên gel
SDS-PAGE .......................................................................................................... 86

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


3.13. Thử nghiệm bảo quản enzyme dạng lỏng, bột.......................................... 89
3.13.1. Thử nghiệm bảo quản phytase dạng lỏng.................................... 89
3.13.2. Thử nghiệm bảo quản phytase dạng bột ..................................... 95

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................99
4.1.

Kết luận .................................................................................................... 99

4.2.

Đề nghị .................................................................................................. 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hoàng


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A.ficuum

Aspergillus ficuum

HAP

Histidine axít phytase

Hđph

Hoạt độ enzyme phytase

HđR

Hoạt độ riêng enzyme phytase

Hđs

Hoạt độ riêng của dung dịch enzyme sau khi qua lọc gel

Hđt

Hoạt độ riêng của dung dịch enzyme trước khi qua lọc gel

IP6 hay InsP6

Myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate

OD0

Mật độ quang của thử không

ODT

Mật độ quang của thử thật

∆ OD

Hiệu số giữa mật độ quang của thử thật và thử không

PEG

Polyethylenglycol

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TĂGS

Thức ăn gia súc

TB

Trung bình

TN

Thí nghiệm

UI

Đơn vị hoạt độ (tính theo đơn vị quốc tế)

∑ UI

Tổng đơn vị hoạt độ (tính theo đơn vị quốc tế)

∑C

Tổng hàm lượng prôtêin của dung dịch enzyme sau khi
qua lọc gel

∑H

Tổng hoạt độ enzyme sau khi qua lọc gel

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Các công ty sản xuất chế phẩm phytase vi sinh
Bảng 1.2: Hàm lượng phospho tổng, phytate của các loại hạt dùng trong chế biến
thức ăn gia súc
Bảng 1.3: Cơ chế thủy phân của enzyme phytase
Bảng 1.4: Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu của các loại phytase
Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn phospho
Bảng 2.2: Xây dựng đường chuẩn albumin
Bảng 2.3. Xây dựng đường chuẩn saccharose
Bảng 2.4: Lượng ammonium sulfate bổ sung theo độ bão hòa
Bảng 2.5: Lượng PEG bổ sung
Bảng 3.1: Hàm lượng đường trong rỉ đường
Bảng 3.2: Mức thí nghiệm của các yếu tố
Bảng 3.3: Bảng ma trận thực nghiệm và kết quả
Bảng 3.4: Bảng kết quả tối ưu theo phương pháp leo dốc
Bảng 3.5: Hoạt độ tổng của enzyme phytase trong dịch nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau
Bảng 3.6: Hoạt độ riêng của enzyme phytase trong dịch nuôi cấy trên các môi

trường khác nhau
Bảng 3.7: Hoạt độ tổng phytase trong canh trường nuôi cấy A. ficuum theo thời
gian nuôi cấy.
Bảng 3.8: Hoạt độ riêng phytase trong canh trường nuôi cấy A. ficuum theo thời
gian nuôi cấy.

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase của chủng A. ficuum
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase của chủng A. ficuum
Bảng 3.11: Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A. ficuum
Bảng 3.12: Kết tủa phytase bằng cồn
Bảng 3.13: Kết tủa phytase bằng ammonium sulfate
Bảng 3.14: Kết tủa phytase bằng polyethylene glycol 6000
Bảng 3.15: Lượng phosphat phóng thích khi phân giải nguồn nguyên liệu làm
thức ăn gia súc
Bảng 3.16: Hoạt độ riêng phytase, hàm lượng prôtêin sau sắc ký
Bảng 3.17: Giá trị Rf và Log (trọng lượng phân tử) của những prôtêin trong thang
chuẩn
Bảng 3.18: Kết quả theo dõi biến đổi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm
enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 28-30oC)
Bảng 3.19: Kết quả theo dõi biến đổi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm
enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 5-6oC)
Bảng 3.20: Kết quả theo dõi biến đổi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm
enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản -5oC)
Bảng 3.21: Hiệu suất thu hồi enzyme sau khi sấy
Bảng 3.22: Kết quả theo dõi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme

phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 28-30oC)
Bảng 3.23: Kết quả theo dõi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme
phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 5-6oC)

Luận văn thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Một số chế phẩm phytase dạng bột và lỏng trên thị trường
Hình 1.2: Cấu trúc của axít phytic (myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate)
Hình 1.3: Phức phytate trong tự nhiên
Hình 1.4: Axít phytic tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo phức
hợp với kim loại
Hình 1.5: Phản ứng thủy phân phytase
Hình 1.6: Cấu trúc không gian 3 chiều của Alkaline phytase và HAP
Hình 1.7: Cây phát sinh chủng loài của hai loại Histidine axít phytase và Alkaline phytase
Hình 1.8: Sơ đồ thủy phân histidine axít phosphatases (HAPs) và alkaline
phytase
Hình 1.9 : Khẩu phần của lợn được bổ sung enzyme phytase
Hình 1.10 : Khẩu phần của gà được bổ sung enzyme phytase
Hình 1.11: Tảo phát triển do sự dư thừa phospho trong nước
Hình 1.12: Tảo phát triển gây sự thiếu oxy trong nước làm cá chết
Hình 1.13: Đặc điểm hình thái Aspergillus ficuum
Hình 2.1. Qui trình thu nhận enzyme phytase
Hình 2.2: Bộ điện di prôtêin Cole - Parmer
Hình 2.3: Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio - Rad
Hình 2.4: Máy sấy phun Mini- Spray Dryer, Model ADL 31,Yamoto, Nhật

Hình 3.1: Hình thái Aspergillus ficuum trên môi trường thạch đóa
Hình 3.2: Khuẩn ty và đính bào tử của Aspergillus ficuum quan sát qua kính hiển
vi quang học vật kính 40X

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


Hình 3.3: Khả năng tổng hợp phytase trên các môi trường khác nhau
Hình 3.4: Sự biến đổi hoạt độ phytase trong canh trường nuôi cấy A. ficuum theo
thời gian
Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase của chủng A. ficuum
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase của chủng A. ficuum
Hình 3.7: Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A. ficuum
Hình 3.8: Hiệu suất thu hồi enzyme khi sử dụng các tác nhân tủa khác nhau
Hình 3.9: Lượng phosphate phóng thích khi phân giải nguồn nguyên liệu làm
thức ăn gia súc
Hình 3.10: Sơ đồ sắc ký Biogel – P100 tinh sạch enzyme phytase
Hình 3.11: Điện di prôtêin trên gel polycrylamid SDS-PAGE các dịch enzyme từ
môi trường nuôi cấy khác nhau
Hình 3.12: Điện di prôtêin trên gel polycrylamid SDS-PAGE của dịch enzyme
sau sắc ký
Hình 3.13: Biểu diễn sự tương quan giữa giá trị Rf và Log (trọng lượng phân tử)
của các prôtêin trong thang chuẩn

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng

1

MỞ ĐẦU

Phospho là nguyên tố quan trọng cho sự sống, tham gia vào cấu tạo DNA,
RNA và cấu tạo tế bào, hay vận chuyển năng lượng tế bào thông qua ATP
(adenosine triphosphat). Phospho có nhiều trong các cây họ đậu và nó được dự
trữ ở dạng phytate hoặc axít phytic. Các động vật dạ dày đơn ngăn như gia cầm,
lợn và cá không thể hấp thụ phospho trong axít phytic vì chúng thiếu enzyme nội
sinh có khả năng thủy phân phytate. Bên cạnh đó axít này còn ngăn cản khả năng
kết hợp của các ion kim loại, prôtêin với các axít béo không no, dẫn tới làm giảm
khả năng tiêu hóa thức ăn của gia súc, gây hiệu ứng kháng dinh dưỡng.
Chính vì vậy đa số các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm có nguồn gốc từ
các loại đậu, ngô cần được bổ sung phytase, một enzyme có khả năng phân giải
axít phytic thành inositol và phospho vô cơ. Phytase được tìm thấy chủ yếu ở thực
vật, động vật, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, đặc biệt là chi Aspergillus vì chúng
có khả năng tổng hợp enzyme phytase cao và có thể chịu được pH thấp.
Nước ta là một nước nông nghiệp, ước tính mỗi năm sản lượng lúa đạt gần
34 triệu tấn kéo theo lượng phế phụ phẩm tăng lên. Với nguồn phế phụ phẩm
nông nghiệp dồi dào, rẻ tiền, sẵn có nên có ý nghóa cho việc thu nhận enzyme
phytase ở quy mô lớn để ứng dụng trong chăn nuôi.
Với những lợi ích nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “THU NHẬN
ENZYME PHYTASE TỪ ASPERGILLUS FICUUM, THỬ NGHIỆM PHÂN
GIẢI NGUỒN NGUYÊN LIỆU LÀM THỨC ĂN GIA SÚC”.

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng

2

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

SƠ LƯC QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE
¾ Nghiên cứu trong nước
Hiện nay rất ít nghiên cứu về enzyme phytase cũng như chưa có cơ sở

nào sản xuất và thương mại hóa chế phẩm enzyme phytase từ vi sinh vật mà
chủ yếu là nhập từ nước ngoài. Ở nước ta thì enzyme này đã được đưa vào sử
dụng từ những năm 90, có thể kể đến một số nghiên cứu về enzyme phytase
từ vi sinh vật như:
Năm 2003 Lê Thiên Minh và cộng sự đã phân lập được chủng
Aspergillus niger MP2 từ phân gà có khả năng tạo phytase trên nguồn phế phụ
phẩm nông nghiệp, sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm trên môi trường cám
ngô cho hoạt độ cao nhất là 2,45UI/ml, nhiệt độ lên men là 30oC, pH 5 và lên
men trong thời gian 7 ngày. [12]
Ngoài ra còn có tác giả Nguyễn Minh Hiệp - Trung tâm phát triển khoa
học và công nghệ trẻ, nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ
VSV ứng dụng bổ sung thức ăn gia súc (Đề tài nghiên cứu thẩm định thông tin
2004 ).
Năm 2005 tác giả Đỗ thị Huyền và cộng sự đã phân lập 27 chủng vi
khuẩn từ 226 mẫu đất và phân gia cầm có khả năng tổng hợp phytase và đã
định loại được 7 chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis có khả năng sinh phytase,
trong đó chủng B1 cho hoạt tính phytase cao nhất đạt 2850UI/lít; phân tích

trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom khẳng định chủng B1 là Bacillus subtilis
.[7]
Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


3

Năm 2006 tác giả Đỗ thị Huyền và cộng sự đã nghiên cứu khả năng
sinh phytase của chủng Bacillus subtilis B1, sử dụng phương pháp nuôi cấy
chìm trên nguồn cacbon là cám gạo và nguồn nitơ là casein kết hợp với
NH4NO3. Tại nhiệt độ 37oC chủng Bacillus subtilis B1 cho hoạt độ phytase
cao nhất bằng 0,123UI/ml, pH thích hợp nhất cho sinh tổng hợp phytase là pH
6,5-7,0, thời gian lên men là 74 giờ. [8]
¾ Nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới enzyme phytase đã được nghiên cứu và đăng trên rất
nhiều tạp chí. Có thể liệt kê một số tác giả trong lịch sử nghiên cứu enzyme
này như:
Suzuki và cộng sự lần đầu tiên phát hiện enzyme phytase khi nghiên
cứu quá trình thủy phân ở cám gạo (1907), chính thức được thương mại hóa
trên thị trường Châu Âu vào năm 1993-1994 bởi Gist-Brocades (DSM) và bán
trên thị trường bởi BASF dưới tên thương mại là Natuphos. Natuphos chuyên
cung cấp các sản phẩm enzyme dạng bột, viên hay lỏng. Đến nay nhờ sự tiến
bộ của khoa học thì việc sản xuất phytase từ vi sinh (vi khuẩn, nấm men, nấm
mốc ) ứng dụng trong nhiều lónh vực như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
thức ăn gia súc, tổng hợp myo-inositol phosphate, giảm thiểu ô nhiễm môi
trường, ... đã trở nên phổ biến. Vào cuối thế kỷ 20, doanh số hàng năm của
phytase ước tính khoảng 500 triệu đôla. [23], [31]
Năm 1990 Gorcom và cộng sự đã phát hiện chủng Aspergillus ficuum

có khả năng tạo enzyme phytase có hoạt độ phytase cao hơn 50 lần so với
những chủng hoang dại được xem như một phát minh thời đó. [23]
Năm 1991 Gist-Brocades đã có những thành công trong sản xuất và
thương mại hóa các chế phẩm phytase đầu tiên được nuôi cấy thu nhận từ

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


4

những chủng nấm mốc đột biến thông qua những phương pháp đơn giản hoặc
việc sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp dùng vào mục đích hỗ trợ tiêu hóa. [23]
Năm 1993 tác giả Ullah và cộng sự đã hoàn tất việc giải mã trình tự
gen của Aspergillus ficuum. Prôtêin bao gồm 583 amino axít, có trọng lượng
phân tử là 64,245 KDa, 13 gốc được glycosyl, vùng hoạt động chứa trình tự
RHG. [43], [44]
Năm 1996 tác giả Wodzinski và Ullah đã đưa ra con số thống kê rằng
nếu dùng phytase để bổ sung vào thức ăn gia súc của tất cả vật nuôi ở Mỹ sẽ
giảm được 8,23×104 tấn phospho thải ra môi trường tương ứng với 168 triệu
USD mỗi năm. [19]
Năm 1999 tác giả Liu và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH và
khả năng chịu nhiệt của chủng Aspergillus ficuum. Hoạt độ của enzyme đo
được dựa vào tỷ lệ inositol và phospho phóng thích. Hoạt độ cao nhất của
enzyme phytase được tìm thấy ở pH = 5 và nhiệt độ thích hợp nhất cho sự
hoạt động của enzyme phytase là 50o C. Dưới điều kiện này Kcat là 96 s-1 và
tương ứng với Km để thủy phân axít phytic là 2,34 mM. Tuy nhiên khi nhiệt độ
tăng lên 58oC, các thông số Km = 3,28 mM, hoạt tính enzyme (Kcat = 33 s-1)
chỉ còn lại 34,6% [30]

Năm 2000 enzyme phytase là một trong 60 enzyme được EU
(European Union) cho phép sử dụng như một chất phụ gia bổ sung vào thức ăn
gia súc và đã đem lại hiệu quả kinh tế cao. [19]
Năm 2001 tác giả Newkirk và cộng sự đã nghiên cứu vai trò của
phytase khi ủ với nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc nhằm cải thiện giá trị
năng lượng trao đổi (ME) của thức ăn gia súc. [34], [35]
Năm 2002 tác giả Sandberg và cộng sự đã nghiên cứu phytase có
nguồn gốc thực vật và vi sinh trong dinh dưỡng con người. [40]

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


5

Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ
gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme
phytase là những chủng nấm mốc tái tổ hợp (Bảng 1.1). Trung Quốc, Ấn Độ,
Thái Lan, Mỹ, Nhật, … là những quốc gia đi đầu trong lónh vực cung cấp các
enzyme hỗ trợ dinh dưỡng từ vi sinh vật hàng đầu trên thế giới. [23]

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hoàng


6

Bảng 1.1: Các công ty sản xuất chế phẩm phytase vi sinh [23]

STT

Công ty

Nước

1

AB Enzymes

Đức

2

Alko
Biotechnology

Phần
lan

3

Alltech

Mỹ

4

BASF

Đức

5

Biozyme

Mỹ

6

DSM

Mỹ

7

Fermic

8
9

Finnfeeds
International
Genencor
International

Mê hi
cô
Phần
lan

Mỹ

10

GRAS

Mỹ

11

Helm

Mỹ

12

Roal

Phần
lan

Novozymes

Đan
mạch

13

Luận văn Thạc só Khoa học

Nguồn phytase
Aspergillus
awamori
Aspergillus
oryzae
Aspergillus
niger
Aspergillus
niger
Aspergillus
oryzae
Peniphora lycii
Aspergillus
oryzae
Aspergillus
awamori
Penicillium
simplicissimum
Aspergillus
niger
Pichia pastoris
Aspergillus
awamori
Aspergillus
oryzae
Peniphora lycii

Chủng sản
xuất
Trichoderma

reesei
Aspergillus
oryzae
Aspergillus
niger
Aspergillus
niger
Aspergillus
oryzae
Aspergillus
oryzae
Aspergillus
oryzae
Trichoderma
reesei
Penicillium
funiculosum
Aspergillus
niger
Pichia
pastoris
Trichoderma
reesei
Aspergillus
oryzae
Peniphora
lycii

Tên thương
mại

Finse
SP, TP, SF
Allzyme
phytase
Natuphos
AMFERM
Bio-Feed
Phytase
Phyzyme
Avizyme
ROVABIO
Phytase
Helmzym-P
Finase
Ronozyme
hoặc
Roxazyme

HVTH: Quách Cẩm Hồng


7

(A)

(C)

(E)

Luận văn Thạc só Khoa học

(B)

(D)

(F)

HVTH: Quách Cẩm Hồng


8

Hình 1.1: Một số chế phẩm phytase dạng bột và lỏng trên thị trường:
(A). Chế phẩm phytase chứa trong túi nilon 2kg do công ty CBT Qingdao,
Trung Quốc sản xuất, (B). Chế phẩm nutri-phytase chứa trong thùng nhựa
10 kg do công ty Ultra Bio-Logics, Mỹ sản xuất, (C), (D), (E), (F). Chế phẩm
Ronozyme-P do hãng Novozymes, Đan Mạch sản xuất (C). Chế phẩm
enzyme chứa trong bao giấy 20 kg, (D). Chế phẩm enzyme chứa trong bao
1000kg, (E). Chế phẩm enzyme chứa trong thùng nhựa 200 kg, (F). Chế phẩm
enzyme chứa trong thùng 1000kg.

1.2.

AXÍT PHYTIC
Axít phytic (myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate, phytate hay còn

gọi là IP6) được biết đến như thành phần dự trữ phospho, inositol và nhiều loại
khoáng chất ở thực vật. Axít phytic chiếm 1-5% trọng lượng trong các loại ngũ
cốc, phấn hoa, hạt chứa dầu, quả hạch và chiếm 50 đến 80% lượng phospho tổng
trong các loại hạt. Trong thức ăn vật nuôi thì 1/3 phospho hiện diện ở dạng

phospho vô cơ tiêu hóa được trong khi 2/3 dạng phospho hữu cơ hiện diện ở dạng
phytin. Phytin là hỗn hợp muối canxi – magiê của axít phytic. [23], [38], [45]

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


9

Bảng 1.2: Hàm lượng phospho tổng, phytate của các loại hạt dùng trong
chế biến thức ăn gia súc (Tyagi và cs., 1998). [23], [46]
Hàm lượng

Hàm lượng

% phytate đối

phospho tổng (%)

phytate (%)

với phospho tổng

Bắp

0,39

0,25

64

Gạo

0,15

0,09

60

Lúa mì

0,44

0,27

61

Lúa miến

0,30

0,22

73

Lúa mạch

0,33

0,20

61

Đậu phộng

0,60

0,46

77

Đậu nành

0,88

0,56

64

Hạt bông

0,93

0,78

82

Hướng dương

0,90

0,45

51

Loại hạt

Trong tự nhiên, axít phytic tồn tại chủ yếu ở dạng muối phytate dưới dạng
phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+ và Fe2+,...
Phytate chứa 14-28% phospho, 12-20% canxi, 1-2% kẽm và sắt. [28], [35]
Hàm lượng và vị trí axít phytic trong các loại hạt khác nhau. Trong hạt gạo
và lúa mì axít phytic hầu như không có trong phần nội nhũ mà tập trung trong
lớp mộng. Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83-2,22%) và
trong các loại đậu (5,92-9,15%) (Reddy và cs., 1989). [46]

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hoàng


10

1.2.1

Cấu trúc hóa học
Axít phytic có công thức hóa học là C6H18O24P6 tồn tại ở hai dạng

lập thể khác nhau là cấu trúc đối xứng và bất đối xứng (Hình 1.2) [23],
[31]

Hình 1.2: Cấu trúc của axít phytic (myo-inositol hexakis dihydrogen
phosphate) [31]

Axít phytic có ái lực mạnh với các cation đa hóa trị và các prôtêin
tích điện dương vì nó tồn tại dưới dạng phân tử tích điện âm mạnh trong
phổ pH rộng. [28], [41]

Hình 1.3: Phức phytate trong tự nhiên

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng


11

Axít phytic có thể tồn tại ở dạng không liên kết với kim loại hoặc
tạo phức với kim loại tùy thuộc vào pH của dung dịch và nồng độ cation
kim loại (Hình 1.3). Tại pH axít dạng không liên kết với kim loại. Tại pH
trung tính, nhóm phosphat tăng ái lực với các cation kim loại khác nhau
hình thành phức với những cation này, thường là Mg2+ và Ca2+ (Cheryan
1980; Maenz và cs. 1999). [28], [35]
Trong phức hợp kim loại–axít phytic, Ca2+ (0,99Ao) và Sr2+ (1,12Ao)
là các cation kim loại hoá trị hai có bán kính ion rộng, liên kết với hai
anionoxy của hai nhóm phosphat kề nhau của axít phytic tạo cấu trúc
bidentate (Martin và Evans, 1986). Tuy nhiên, Mg2+ (0,65Ao),
Fe2+(0,74Ao), và Zn2+ (0,71Ao) được xem như các cation kim loại có bán
kính nhỏ lại liên kết tạo cấu trúc monodentate với hai nguyên tử oxy từ
hai nhóm phosphat của axít phytic (Hình 1.4). [35]

O

O

M

M
HO

P

HO

OH

O

O

OH

P

O
O

O
P

P

P
O

O

O

O

O

O

P

O

O

HO

HO

pH kiềm và các ion kim loại

O

O

O

M
HO

O
P

O

O

O

OH

O

O
P

O

O

O

HO
P

O
P

P

O
HO
HO

M
O

pH axit

OH

O

M

O
O

P

O
M

O

O

Axít phytic

Phức axít phytic-kim loại

Hình 1.4: Axít phytic tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo
phức hợp với kim loại [35]

Luận văn Thạc só Khoa học

HVTH: Quách Cẩm Hồng