Nghiên cứu thu nhận sinh khối nấm men rhodotorula trên môi trường lên men bán rắn, tạo chế phẩm thức ăn cho gia cầm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN ĐÌNH THỊNH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN SINH KHỐI
NẤM MEN RHODOTORULA TRÊN MÔI
TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN, TẠO CHẾ
PHẨM THỨC ĂN CHO GIA CẦM
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM & ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 7 NĂM 2008


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

Cán bộ chấm nhận xét 1:

GS. TS. DƯƠNG THANH LIÊM

Cán bộ chấm nhận xét 2:

TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Ngày 20 tháng 08 năm 2008



ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------------

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
---oOo---

Tp. HCM, ngày 30 tháng 06 năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên:

NGUYỄN ĐÌNH THỊNH

Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh:

28/05/1982

Nơi sinh : Tp. HCM

Chun ngành:

CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM & ĐỒ UỐNG

Khóa (Năm trúng tuyển): K2006
1. TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN
RHODOTORULA TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN, TẠO CHẾ
PHẨM THỨC ĂN CHO GIA CẦM”
2. NHIỆM VỤ LUẬN VĂN
Trên cơ sở giống nấm men Rhodotorula đã được phân lập từ lá lúa lấy tại
huyện Tân An, Long An; nghiên cứu tạo bột canh trường giàu beta-carotene và
enzyme phatase để sử dụng làm chế phẩm thức ăn cho gia cầm giúp hấp thu tốt
photpho và các chất dinh dưỡng. Nhiệm vụ cụ thể:
¾ Tối ưu các điều kiện ni cấy nấm men Rhodotorula trên mơi trường bán rắn.
¾ Khảo sát sự thay đổi các thành phần theo thời gian ni cấy.
¾ Tạo chế phẩm bột màu từ canh trường ni cấy bán rắn.
¾ Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên chuột.
3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

21/01/2008

4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM:

30/06/2008

5. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

PGS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

PGS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO


-1Lời mở đầu

LỜI MỞ ĐẦU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển, kéo theo sự phát triển của các ngành khoa học
kỹ thuật. Công nghệ sinh học đã và đang trở thành một trong những ngành được
quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Cơng nghệ sinh
học phát triển nhanh chóng tương tự ngành công nghệ thông tin, đang tạo ra một
cuộc cách mạng sinh học trong các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm,
làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, vật liệu mới, năng
lượng khai khoáng và bảo vệ môi trường.
Việc tận dụng các phế phẩm và những nguồn nguyên liệu rẻ tiền để tạo ra
những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ơ nhiễm môi trường, mang lại
hiệu quả kinh tế cho xã hội.
Vitamin A có vai trị rất quan trọng trong đời sống con người và vật nuôi.
Nguồn nguyên liệu thực vật và vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào
sắc tố carotenoid nói chung và tiền vitamin A nói riêng.
Enzyme phytase, một loại enzyme rất cần thiết trong việc hấp thu dưỡng chất
và P cũng có mặt nhiều trong thực vật và vi sinh vật.
Các vật nuôi như tôm, cá, gà, heo,… trong thức ăn cũng rất cần bổ sung
carotenoid thiên nhiên cũng như enzyme phytase. Chúng cần cho sự phát triển, tăng

trọng, tăng hệ miễn dịch chống lại nhiều bệnh tật, cho lượng thịt, trứng, sữa cao hơn
và chất lượng hơn.
Nhiều cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã xác định
các lồi nấm men đỏ thuộc giống Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp
carotenoid cũng như enzyme phytase nên chúng được dùng làm đối tượng để sản
xuất carotenoid tự nhiên từ vi sinh vật.
Từ các vấn đề đã được đề cập như trên, Đề tài “Nghiên cứu thu nhận sinh
khối nấm men Rhodotorula trên môi trường lên men bán rắn, tạo chế phẩm
CBHD: PGS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH


-2Lời mở đầu

thức ăn cho gia cầm” được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng việc
ni cấy nấm men Rhodotorula trên môi trường tấm gạo dùng trong chăn nuôi để
tạo ra chế phẩm thức ăn giàu giá trị dinh dưỡng và đặc biệt là có thêm sắc tố betacarotene (carotenoid) và enzyme phytase rất cần thiết cho sự phát triển vật ni
cũng như góp phần giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường. Đề tài được thực hiện với
mong muốn góp phần vào sự đa dạng hóa các sản phẩm thức ăn dùng trong chăn
nuôi, nâng cao giá trị dinh dưỡng, cải thiện nâng suất và chất lượng của vật ni và
gia cầm.
MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Trên cơ sở giống nấm men Rhodotorula, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên
môi trường bán rắn sử dụng các phụ phẩm và phế liệu của các nhà máy nông nghiệp
và thực phẩm như tấm gạo, bã đậu nành,…để tạo ra chế phẩm dạng bột từ canh
trường ni cấy trên mà có thể được sử dụng trực tiếp hoặc làm cơ sở để tạo các sản
phẩm thức ăn cho gia cầm và vật nuôi nhằm mục đích tăng cường dưỡng chất,
phịng ngừa bệnh thiếu vitamin A cũng như tăng khả năng hấp thu P trong cơ thể
của gia cầm và vật nuôi.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi nghiên cứu những vấn đề sau:
¾ Tối ưu các điều kiện ni cấy nấm men Rhodotorula trên mơi trường
bán rắn.
¾ Khảo sát sự thay đổi các thành phần theo thời gian nuôi cấy.
¾ Tạo chế phẩm bột màu từ canh trường ni cấy bán rắn.
¾ Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên chuột.

CBHD: PGS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH


NGHIÊN CỨU THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN
RHODOTORULA TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN,
TẠO CHẾ PHẨM THỨC ĂN CHO GIA CẦM

TĨM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là tối ưu các thơng số trong q trình ni cấy
bán rắn nấm men Rhodotorula. Bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm của Box
và Hunter, chúng tơi đã thành cơng khi tìm ra các thơng số tối ưu của q trình:
Nồng độ khống (µg/100g cơ chất): N = 3500; P = 1000; S = 700
Và các thông số ban đầu pH = 5,5; độ ẩm = 60% và mật độ cấy giống
= 7,265x107 CFU/g cơ chất.
Sau q trình tối ưu, chúng tơi tiến hành sấy toàn bộ canh trường ở nhiệt độ
40 – 450C trong khoảng 24 giờ và đi nghiền, chúng tôi thu được chế phẩm bột canh
trường nấm men Rhodotorula có độ ẩm 12,63% với các thành phần (% chất khô)
như sau:
™ Protein

: 22,08%;

™ Lipit

: 38,25%;

™ Tinh bột

: 8,75%;

™ Xơ tổng

: 13,46%;

™ Tro tổng

: 4,27%;

™ Hoạt tính phytase

: 87,00 UI/g chế phẩm khơ;

™ Và beta-carotene

: 181,22 µg/g chế phẩm khơ.

Chế phẩm canh trường được thử trực tiếp trên chuột. Khi so sánh giữa hai
loại thức ăn, kết quả khảo sát về khả năng tăng trọng, hàm lượng hemoglobin, số tế
bào hồng cầu và bạch cầu, hàm lượng canxi và photpho của chuột; cho thấy thức ăn
bổ sung chế phẩm bột canh trường có sự tương đồng hoặc tốt hơn so với thức ăn

kiểm chứng của Viện Pasteur. Đặc biệt là sự tăng lên có ý nghĩa của hàm lượng P
trong xương cho thấy khả năng hấp thu tốt P của thức ăn có bổ sung chế phẩm, nổi
bật lên hiệu quả của hoạt tính enzyme phytase khi làm tăng sự hấp thụ P cũng như
các dưỡng chất khác trong cơ thể chuột thử nghiệm.


RESEARCH ON COLLECTING BIOMASS OF THE RHODOTORULA
YEAST FROM THE CULTURE OF STATE-SOLID FERMENTATION,
PRODUCING THE POWDERED FEEDS (THE βCR POWDER)

ABSTRACT
The purpose of this research is to optimize parameters in the culture of the
solid-state fermentation of the Rhodotorula yeast. Using Box and Hunter
experimental design, we have succeeded in finding the optimal parameters:
Mineral contents (µg/100g substances): N: 3500; P: 1000; S: 700.
And initial parameters: pH: 5.5; the culture’s moisture: 60%; the yeast
density: 7.625x107 CFU/g substances.
After drying at 40 – 450C in about 24 hours and grinding, we have produced
the powdered feeds (the β – carotene riched powder: βCR powder) with moisture of
12.63% and the ingredients (% dried powder) as follow:
™ Total protein

: 22.08%;

™ Total lipid

: 38.25%;

™ Starch

: 8.75%;

™ Total fiber

: 13.46%;

™ Total ash

: 4.27;

™ Phytase activity

: 87.00 UI/g dried powder;

™ And beta-carotene

: 181.22 µg/g dried powder.

The βCR powder is created from the culture of solid-state fermentation of the
Rhodotorula yeast has been directly tested on lab mice. When comparing 2 kinds of
feeds, there is a similarity between the feeds with 50% of the βCR powder and the
controlling feeds of Pasteur Institute in gain weighting, hemoglobin content,
erythrocyte and leucocyte counts, calcium and phosphorus contents. Especially, the
increase of phosphorus content in mice’s bone significantly showed the good
potential absorption of phosphorus when using the feeds with 50% of the βCR
powder. This is the effect of phytase activity in enhancing potential absorption of
phosphorus and other nutrients in lab mice.

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
A. CAROTENOID
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM MEN RHODOTORULA........................ 3
1.1.1. Phân loại......................................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố........................................................................................................... 4
1.1.3. Hình thái, kích thước tế bào ........................................................................... 5
1.1.4. Đặc điểm sinh hóa.......................................................................................... 6
1.1.5. Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula ............................................. 7
1.1.5.1. Cấu tạo............................................................................................. 7
1.1.5.2. Sinh sản ............................................................................................ 9
1.1.6. Các nghiên cứu về nấm men Rhodotorula..................................................... 9
1.2. PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN ........................................................11
1.2.1. Đặc điểm của phương pháp lên men bán rắn............................................... 12
1.2.2 Ảnh hưởng của mơi trường ni cấy đến q trình lên men bán rắn ........... 12
1.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ............................................................ 12
1.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon........................................................ 14
1.2.2.3. Vai trò của các muối....................................................................... 15
1.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn (Solid State
Fermentation: SSF) ................................................................................................ 15
1.2.3.1. Độ ẩm và hoạt độ nước aw ............................................................. 16
1.2.3.2. pH ban đầu .................................................................................... 16
1.2.3.3. Nhiệt độ và sự truyền nhiệt ............................................................ 16
1.2.3.4. Ảnh hưởng của môi trường khơng khí ........................................... 17
1.2.3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng................................................................ 17
1.3.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp lên men bán rắn so với lên men
dịch thể ................................................................................................................... 17
1.3.4.1. Ưu điểm.......................................................................................... 17

1.3.4.2. Nhược điểm .................................................................................... 18
1.4. CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP SẮC TỐ CAROTENOID Ở VI SINH VẬT .... 18
1.4.1. Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ................................................... 18
1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ....................................................... 19
B. ß-CAROTENE
1.5. ß-CAROTENE VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA NÓ .................................... 22
1.5.1. Giới thiệu về ß-Carotene (tiền vitamin A) ................................................... 22
1.5.2. Tầm quan trọng của ß-Carotene đối với sức khỏe ....................................... 22
1.6. CƠ CHẾ MẤT MÀU CỦA CAROTENOID ................................................. 23
1.6.1. Đồng phân hóa ............................................................................................. 23
1.6.1.1.Đồng phân do nhiệt độ, ánh sáng ................................................... 23
1.6.1.2. Đồng phân epoxyt .......................................................................... 23
1.6.2. Biến đổi do enzyme...................................................................................... 23
1.6.2.1. Peroxidase làm giảm chất lượng carotenoid, theo con đường trực
tiếp và cả gián tiếp ................................................................................................. 24
1.6.2.2. Lipoperoxidase chỉ hoạt động khi có mặt acid béo khơng no bị oxy
hóa bởi lipoxidase .................................................................................................. 24
1.6.3. Biến đổi không do enzyme........................................................................... 24
1.6.3.1. Sự oxy hóa chất màu ...................................................................... 24
1.6.3.2. Sự nhiễm bẩn do ion kim loại......................................................... 25
C. ENZYME PHYTASE
1.7. ENZYM PHYTASE ....................................................................................... 26
1.7.1. Định nghĩa.................................................................................................... 26
1.7.2. Phân loại....................................................................................................... 27
1.7.3. Đặc điểm cấu tạo.......................................................................................... 27
1.7.4. Đặc điểm xúc tác.......................................................................................... 28
1.7.4.1. Trung tâm hoạt động ...................................................................... 28
1.7.4.2. Cơ chế hoạt động ........................................................................... 29
1.7.4.3. Sản phẩm cuối của sự thủy phân .................................................. 30

1.7.4.4. Sự đặc hiệu cơ chất ........................................................................ 30
1.7.5. Đặc điểm lý hóa .......................................................................................... 31
1.7.5.1.Nhiệt độ ........................................................................................... 31
1.7.5.2. pH................................................................................................... 32
1.7.5.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt tính của
phytase.................................................................................................................... 32
1.7.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật .............. 33
1.7.7. Vai trò của enzym phytase trong việc tiêu hóa phospho và các chất dinh
dưỡng khác ............................................................................................................. 34
1.8. ỨNG DỤNG CỦA PHYTASE ....................................................................... 35
1.8.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc................................................ 35
1.8.2. Trong thực phẩm .......................................................................................... 35
D. SINH LÝ CHUỘT VÀ SINH LÝ MÁU
1.9. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ CHUỘT NHẮT TRẮNG........................................... 36
1.9.1. Khái quát về chuột nhắt trắng ...................................................................... 36
1.9.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển của chuột ............................................. 39
1.9.2.1. Nhiệt độ và độ ẩm .......................................................................... 39
1.9.2.2. Ánh sáng......................................................................................... 39
1.9.2.3. Sự thơng gió ................................................................................... 40
1.9.2.4. Tiếng ồn.......................................................................................... 40
1.9.3. Nhu cầu dinh dưỡng của chuột nhắt trắng ................................................... 40
1.10. SINH LÝ MÁU............................................................................................. 42
1.10.1. Huyết tương................................................................................................ 43
1.10.2. Hồng cầu .................................................................................................... 43
1.10.3. Hemoglobin................................................................................................ 44
1.10.4. Bạch cầu ..................................................................................................... 45
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU – GIỐNG VI SINH VẬT & MÔI TRƯỜNG ..................... 46

2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 46


2.1.1.1. Gạo tấm.......................................................................................... 46
2.2.1.2. Bã đậu nành ................................................................................... 46
2.1.2. Giống vi sinh vật và môi trường .................................................................. 47
2.1.2.1. Nguồn giống................................................................................... 47
2.1.2.2. Môi trường giữ giống nấm men ..................................................... 48
2.1.2.3. Môi trường hoạt hóa nấm men ...................................................... 48
2.1.2.4. Mơi trường ni cấy bán rắn ......................................................... 49
2.1.2.5. Môi trường khảo sát khả năng hình thành sinh khối nấm men ..... 49
2.1.2.6. Giống chuột nhắt trắng .................................................................. 49
2.1.2.7. Thức ăn cho chuột.......................................................................... 50
2.1.2.8. Hóa chất......................................................................................... 50
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 51
2.2.1. Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men ................................................................. 51
2.2.2. Thuyết minh quy trình ................................................................................. 52
2.2.2.1. Ngâm gạo ....................................................................................... 52
2.2.2.2. Hồ hóa............................................................................................ 52
2.2.2.3. Phân phối ....................................................................................... 52
2.2.2.4. Thanh trùng.................................................................................... 52
2.2.2.5. Cấy vi sinh vật................................................................................ 52
2.2.2.6. Nuôi cấy ......................................................................................... 52
2.2.2.7. Tạo chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula ................. 53
2.2.3. Các phương pháp phân tích.......................................................................... 53
2.2.3.1. Phương pháp xác định ẩm theo TCVN 4326:1986 ........................ 53
2.2.3.2. Phương pháp phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp
Kjeldahl theo TCVN 4328:2001............................................................................. 53
2.2.3.3. Phương pháp phân tích hàm lượng lipit thơ bằng phương pháp trích
ly theo TCVN 4331:2001........................................................................................ 54

2.2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:1986 ...... 54
2.2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng xơ theo TCVN 4329:1993....... 54


2.2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp kết
tủa bằng cồn và xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Miller (G.
Lorenz Miller, 1958) ............................................................................................... 55
2.2.3.7. Phương pháp xác định pH ............................................................. 55
2.2.3.8. Phương pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào nấm men
Rhodotorula theo Sato et al (1985)....................................................................... 55
2.2.3.9. Phương pháp xác định hàm lượng beta-carotene ......................... 55
2.2.3.10. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase........................ 56
2.2.4. Tối ưu các yếu tố trong quá trình sinh tổng hợp sinh khối nấm men
Rhodotorula sp.CBS10104..................................................................................... 56
2.2.4.1. Khảo sát chọn điểm ở tâm.............................................................. 56
2.2.4.2. Tối ưu các yếu tố khoáng ............................................................... 58
2.2.4.3. Tối ưu các yếu tố độ ẩm, pH và mật độ cấy giống ban đầu........... 59
2.2.5. Các test thử trên chuột.................................................................................. 61
2.2.5.1. Phương pháp đếm số lượng hồng cầu ........................................... 61
2.2.5.2. Phương pháp đếm số lượng bạch cầu............................................ 61
2.2.5.3. Xác định hàm lượng hemoglobin ................................................... 62
2.2.5.4. Bố trí thí nghiệm trên đàn chuột .................................................... 63
2.2.5.5. Phương pháp cho chuột ăn và xác định trọng lượng chuột........... 63
2.2.5.6. Phương pháp thu nhận chất thải từ lồng nuôi chuột ..................... 63
2.2.5.7. Phương pháp thu nhận xương chuột.............................................. 63
2.2.5.8. Phương pháp xác định hàm lượng Calcium .................................. 64
2.2.5.9. Phương pháp xác định hàm lượng P ............................................. 64
2.2.5.10. Phương pháp thu nhận máu......................................................... 64
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................ 64
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN

3.1. ĐƯỜNG CHUẨN SINH KHỐI NẤM MEN ................................................. 66
3.2. KHẢO SÁT SƠ BỘ CHỌN ĐIỂM Ở TÂM................................................... 66


3.3. TỐI ƯU CÁC NỒNG ĐỘ KHOÁNG THEO QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM
BOX VÀ HUNTER ............................................................................................... 68
3.3.1. Phương trình hồi qui .................................................................................... 69
3.3.2. Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui.................................... 70
3.3.3. Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui ................................................... 70
3.3.4. Kết luận và nhận xét..................................................................................... 71
3.3.4.1. Kết luận .......................................................................................... 71
3.3.4.2. Nhận xét ......................................................................................... 71
3.4. TỐI ƯU pH, ĐỘ ẨM VÀ MẬT ĐỘ CẤY GIỐNG THEO QUI HOẠCH THỰC
NGHIỆM BOX VÀ HUNTER .............................................................................. 71
3.4.1. Phương trình hồi qui ................................................................................... 72
3.4.2. Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui ................................... 73
3.4.3. Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui ................................................... 73
3.4.4. Kết luận và nhận xét..................................................................................... 74
3.4.4.1. Kết luận .......................................................................................... 74
3.4.4.2. Nhận xét ......................................................................................... 74
3.5. KHẢO SÁT THỜI GIAN SINH KHỐI CỰC ĐẠI ........................................ 75
3.6. KHẢO SÁT LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ (GLUCOSE) THEO THỜI GIAN..... 76
3.6.1. Đường chuẩn glucose................................................................................... 76
3.6.2. Sự thay đổi hàm lượng đường khử (glucose) theo thời gian ....................... 77
3.7. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM BỘT MÀU TỪ CANH TRƯỜNG
NUÔI CẤY BÁN RẮN NẤM MEN RHODOTORULA ....................................... 78
3.7.1. Độ ẩm ........................................................................................................... 78
3.7.2. Đạm tổng...................................................................................................... 79
3.7.3. Lipit tổng...................................................................................................... 79
3.7.4. Tinh bột ........................................................................................................ 79

3.7.5. Xơ tổng......................................................................................................... 79
3.7.6. Tro tổng ........................................................................................................ 79
3.7.7. Hoạt tính phytase.......................................................................................... 80


3.7.7.1. Đường chuẩn photpho.................................................................... 80
3.7.7.2. Hoạt tính phytase ........................................................................... 80
3.7.8. Hàm lượng beta-carotene ............................................................................. 81
3.7.8.1. Đường chuẩn beta-carotene........................................................... 81
3.7.8.2. Hàm lượng beta-carotene .............................................................. 81
3.8. CÁC KẾT QUẢ THỬ TRÊN CHUỘT KHI ĂN BẰNG THỨC ĂN CÓ BỔ
SUNG CHẾ PHẨM VÀ THỨC ĂN VIỆN PASTEUR......................................... 82
3.8.1. So sánh về sự tăng trọng .............................................................................. 82
3.8.2. So sánh về hemoglobin ................................................................................ 84
3.8.3. So sánh về số lượng hồng cầu...................................................................... 86
3.8.4. So sánh về số lượng bạch cầu ...................................................................... 88
3.8.5. So sánh về hàm lượng canxi trong xương.................................................... 90
3.8.6. So sánh hàm lượng P trong xương ............................................................... 92
3.8.7. So sánh hàm lượng P trong phân.................................................................. 94
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN ..................................................................................................... 97
4.1.1. Các thơng số tối ưu cho q trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula ............ 97
4.1.2. Khảo sát các thành phần theo thời gian ....................................................... 97
4.1.3. Chất lượng chế phẩm bột canh trường nuôi cấy nấm men Rhodororula..... 97
4.1.4. Các test thử trên chuột.................................................................................. 98
4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 100
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Ý nghĩa

βCR ..........................................Chế phẩm bột canh trường giàu beta-caroten
BS....................................................................................................... Bổ sung
CB..................................................................................................... Cân bằng
CFU........................................................Colony Forming Unit (số khuẩn lạc)
CK..................................................................................................... Chất khô
CP.................................................................................................... Chế phẩm
CT................................................................................................ Canh trường
ĐPL............................................................................................ Độ pha loãng
KL.................................................................................................... Khuẩn lạc
KHL............................................................................................... Khối lượng
KL TB.............................................................................Khuẩn lạc trung bình
HL.................................................................................................. Hàm lượng
HPLC......... High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng cao áp)
IU (UI).......................................................International Unit (đơn vị hoạt độ)
ppm.........................................................................................................10-6g/g
STT.................................................................................................... Số thứ tự
TA....................................................................................................... Thức ăn
TB.................................................................................................. Trung bình
TN................................................................................................. Thí nghiệm
TT.......................................................................................................... Thứ tự


MỤC LỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen trong môi trường đến sự phát triển và khả năng
tổng hợp chất béo của nấm men Rh. glutinis .....................................................................13

Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 trong môi trường đến sự phát triển và khả
năng tổng hợp chất béo của nấm men Rh. glutinis ............................................................14
Bảng 1.3. Một số đặc điểm sinh lý của chuột nhắt trắng...................................................37
Bảng 1.4. Khoảng nhu cầu dinh dưỡng của chuột nhắt trắng............................................40
Bảng 1.5. Số lượng hồng cầu ở một số động vật (triệu/mm3) ...........................................43
Bảng 1.6. Số lượng bạch cầu ở động vật (ngàn/mm3) .......................................................45
Bảng 2.1. Thành phần gạo tấm sử dụng.............................................................................46
Bảng 2.2. Thành phần bã đậu nành của Vinamilk .............................................................47
Bảng 2.3. Mức khảo sát của các yếu tố khống.................................................................57
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát .................................................................................57
Bảng 2.5. Mức biến thiên của các yếu tố khoáng ..............................................................58
Bảng 2.6. Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2 ba yếu tố N , P và S của
Box – Hunter......................................................................................................................59
Bảng 2.7. Mức biến thiên của các yếu tố khoáng ..............................................................60
Bảng 2.8. Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2 ba yếu tố pH, độ ẩm và
mật độ cấy giống của Box – Hunter ..................................................................................60
Bảng 3.1. Số khuẩn lạc theo độ đục OD............................................................................66
Bảng 3.2. Số CFU/g CT khô theo số liệu thực nghiệm chọn điểm ở tâm .........................67
Bảng 3.3. Số CFU/g CT khô theo số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng ..............................69
Bảng 3.4. Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng ......................69
Bảng 3.5. Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khống ...............69
Bảng 3.6. Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng ....................70
Bảng 3.7. Số CFU/g CT khô theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy
giống ban đầu.....................................................................................................................72
Bảng 3.8. Các hằng số bj theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống
ban đầu...............................................................................................................................72
Bảng 3.9. Các hệ số hồi qui tj theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy
giống ban đầu.....................................................................................................................73

Bảng 3.10. Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy
giống ban đầu.....................................................................................................................73
Bảng 3.11. Số CFU/g canh trường khô theo ngày nuôi cấy ..............................................75
Bảng 3.12. OD đo theo nồng độ glucose ...........................................................................76
Bảng 3.13. Hàm lượng đường khử (glucose) theo thời gian .............................................77
Bảng 3.14. Độ ẩm của bột canh trường .............................................................................78
Bảng 3.15. Hàm lượng đạm tổng của bột canh trường......................................................79
Bảng 3.16. Hàm lượng lipit tổng của bột canh trường ......................................................79
Bảng 3.17. Hàm lượng tinh bột của bột canh trường.........................................................79
Bảng 3.18. Hàm lượng xô thô của bột canh trường...........................................................79
Bảng 3.19. Hàm lượng tro tổng của bột canh trường .......................................................80
Bảng 3.20. Nồng độ photpho theo độ đục OD...................................................................80
Bảng 3.21. Hoạt tính phytase của bột canh trường............................................................80
Bảng 3.22. Độ OD theo hàm lượng beta-carotene chuẩn ..................................................81
Bảng 3.23. Hàm lượng beta-carotene của bột canh trường ...............................................82
Bảng 3.24. Sự tăng trọng của chuột...................................................................................82
Bảng 3.25. OD của hemoblogin trong 2 lô chuột ..............................................................84
Bảng 3.26. Số lượng hồng cầu/mm3 máu của chuột..........................................................86
Bảng 3.27. Số lượng bạch cầu/mm3 máu của chuột ..........................................................88
Bảng 3.28. Thể tích chuẩn độ (ml) canxi trong xương chuột ............................................90
Bảng 3.29. Hàm lượng P (µg) có trong xương 0.1g xương ...............................................92
Bảng 3.30. Hàm lượng P (µg) có trong 1g phân................................................................94
Bảng 4.1. Thành phần của chế phẩm bột canh trường.......................................................98
Bảng 4.2. So sánh các chỉ tiêu trên chuột đối chứng và chuột ăn chế phẩm .....................98


MỤC LỤC HÌNH
Hình 1.1. Khuẩn lạc Rh. mucilaginosa và Khuẩn lạc Rh. Glutinis......................................5
Hình 1.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis.................................................................6
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp carotenoids ...............................................................20

Hình 1.4. Các giai đoạn của quá trình sinh tổng hợp carotenoids .....................................20
Hình 1.5. Các phản ứng dehydro hóa trong q trình sinh tổng hợp caroteniods .............21
Hình 1.6. Tổng hợp carotenoid có vịng từ lycopene.........................................................21
Hình 1.7. Beta-carotene trong khơng gian 3 chiều ............................................................22
Hình 1.8. Phản ứng phân giải phytat bởi enzym phytase ..................................................26
Hình 1.9. Sản phẩm phân giải phytat bởi enzym phytase..................................................26
Hình 1.10a. Cấu trúc phytase của E.coli (gồm hai tiểu phần) ...........................................28
Hình 1.10b. Cấu trúc phytase của A.niger (gồm một tiểu phần) .......................................28
Hình 1.11. Sự gắn acid phytic vào trung tâm hoạt động của phytase Bacillus..................29
Hình 2.1. Gạo tấm phụ phẩm.............................................................................................46
Hình 2.2. Bã đậu nành của cơng ty Vinamilk ....................................................................47
Hình 2.3. Chủng nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) .......................................48
Hình 2.4. Cấy chuyền giữ giống trên mơi trường thạch malt trong ống nghiệm...............48
Hình 2.5. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm ................................................................................51
Hình 3.1. Đường chuẩn sinh khối nấm men Rhodotorula.................................................66
Hình 3.2. Sinh tổng hợp sinh khối theo các nồng độ khống ............................................68
Hình 3.3. Q trình sinh tổng hợp sinh khối theo thời gian ..............................................75
Hình 3.4. Đường chuẩn glucose ........................................................................................76
Hình 3.5. Hàm lượng đường khử (glucose) thay đổi theo thời gian..................................77
Hình 3.6. Đường chuẩn nồng độ photpho..........................................................................80
Hình 3.7. Đường chuẩn beta-carotene ...............................................................................81
Hình 4.1. Chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula............................................98

1 SỐ HÌNH ẢNH QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY RHODOTORULA .....PHỤ LỤC 4


-3Chương I: Tổng quan

CHƯƠNG I § TỔNG QUAN
A. NẤM MEN RHODOTORULA

Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít các loại nấm men có khả năng tổng
hợp một lượng lớn sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene,
torularhodin. Một số chủng đã được nghiên cứu về khả năng tạo sinh khối, tích lũy
carotenoid, chất béo đặc biệt là các acid béo khơng no có giá trị sinh học cao trên
các phế phụ phẩm chế biến nông sản thực phẩm.
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM MEN RHODOTORULA
1.1.1. Phân loại
Theo Mason (1973) và nhiều nhà nấm học khác như Cejp (1952) và
Chadelaud (1963) lớp nấm bất tồn khơng có lồi chi thực sự, đây là nhóm khơng
đồng nhất của nấm, vị trí phân loại của chúng chưa được xác định đầy đủ. Chỉ biết
Rhodotorula thuộc lớp nấm bất toàn và nhóm khơng sinh bào tử [14]. Tuy nhiên
theo hệ thống phân loại của Lodder và Kreger-Van_Rij (1952): Rhodotorula thuộc
họ Cryptococcaeae, họ này chia làm ba họ phụ (subfamily) là: Cryptococcoideae,
Trichosporpodeae và Rhodotorulaideae. Trong đó Rhodotorulaideae chỉ gồm một
giống duy nhất là Rhodorotorula. Cơ sở để xếp Rhodotorula vào một nhánh riêng là
sự hiện diện của sắc tố carotenoid có các màu từ vàng đến đỏ trong tế bào của nấm
men Rhodotorula và khơng có khả năng đồng hóa nguồn inositol trong khi inositol
đóng vai trị là nguồn cơ chất carbon duy nhất để nấm men phát triển [3], [23], [57].
Theo khóa phân loại của Lodder (1990) giống nấm men Rhodotorula có đặc
điểm sau [23]:
- Tế bào nẩy chồi, khơng có khuẩn ty giả.
- Vệt màu hồng hay vàng do sinh sắc tố carotenoid, khơng lên men.
- Khơng đồng hóa inositol.
- Khơng hình thành hợp chất loại tinh bột.

CBHD: PSG. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH

-4Chương I: Tổng quan

Dựa vào khóa phân loại của Harrison thì giống nấm men Rhodotorula gồm
34 lồi, trong đó phổ biến là ba loài: Rh. glutinis, Rh. minuta và Rh. mucilaginisa.
Harrison mô tả đặc điểm phân loại giống nấm men Rhodotorula. sp như sau [67]:
- Giới:

Nấm

- Ngành:

Basidiomycota

- Lớp:

Urediniomycetes

- Bộ:

Sporidiales

- Họ:

Sporidiobolaceae

- Giống:

Rhodotorula

Theo Kurtzman và Fell (2000) giống nấm men Rhodotorula gồm 45 lồi,

theo mơ tả các tác giả cho rằng lồi Rh. mucilaginosa trước đó có tên gọi là Rh.
rubra, lồi này sinh enzyme urease, khơng đồng hóa nitrate, khơng phát triển trên
cycloheximide hoặc ở nhiệt độ trên 400C và loài Rh.rubra thực ra chỉ là một dạng
riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. rubra ở một số tài liệu hiện nay khơng cịn
nữa và đã được thay bằng tên mới là Rh. mucilaginosa [75].
1.1.2. Phân bố [12], [24], [34], [38]
Như các loại nấm men khác, Rhodotorula thuộc cơ thể đơn bào. Chúng phân
bố rộng rãi ở khắp nơi và thực tế trên thế giới cũng như ở Việt Nam, người ta đã
tiến hành phân lập được Rhodotorula ở mọi nơi trên mặt đất và trong khơng khí.
Ở thực vật: nấm men Rhodotorula (Rh. glutinis, Rh. municlaginosa,…) là
giống thường sinh sống trên bề mặt lá cây. Nấm men có nhiều sắc tố trên bề mặt lá
và theo Dickinson chính các sắc tố từ vi sinh vật có khả năng bảo vệ bề mặt lá dưới
tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Cũng theo Dickinson (1976, 1982) nấm
men Rhodotorula thường cư trú trên các loại hoa, mật hoa do các loại hoa có hàm
lượng đường cao nên rất thích hợp cho sự sống của nấm men này.
Cho đến nay chưa có tài liệu nào nói về độc tố của nấm men Rhodotorula.
Tuy nhiên, đối với thực vật Rhodotorula glutinis thường gây ra bệnh đỏ ở táo, rượu
táo. Theo Thomas J. Burr loại nấm men Rh. glutinis thường sống trên táo (cùng với
Aureobasidium) gây ra màu nâu đỏ trên táo, chúng cũng sống trên đất vườn trồng.
CBHD: PSG. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH


-5Chương I: Tổng quan

Theo Wiles nấm men Rhodotorula cùng với các nấm men dại như
Hansenula, Candida, Torulopsis, Pichia và Brettanomyces là những nấm men
không mong muốn làm ảnh hưởng đến chất lượng bia. Carr và cộng sự (1979 –
1980) cho biết các nấm men phân lập từ hạt ca cao thu được từ quá trình lên men

hạt ca cao tươi có sự hiện diện của Rhodotorula sp. Khi khảo sát ảnh hưởng của các
yếu tố như: độ thống khí, pH, nồng độ ethanol, nồng độ cơ chất thích hợp cho quá
trình lên men ca cao, Carr cho rằng trong tự nhiên có nhiều nấm men có khả năng
lên men ca cao, trong số đó có Rhodotorula sp có khả năng lên men bán rắn.
Trong đất: giống nấm men Rhodotorula thường sống nhiều trong đất, đặc
biệt là đất bị nhiễm dầu hay ngay trong nguồn dầu mỏ, các hydrocarbon mạch dài.
Ngoài ra, chúng ta cũng có thể tìm thấy chúng trên da ẩm, xung quanh môi trường
sống như từ các thảm trải, vữa từ bồn tắm và bàn chải đánh răng.
1.1.3. Hình thái, kích thước tế bào
Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đơi
khi ghồ ghề, mịn và nhớt. Mép khuẩn lạc khơng có răng cưa. Khuẩn lạc có màu từ
kem, hồng đến đỏ san hơ cũng có khi có màu vàng và đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc
tùy thuộc vào mơi trường dinh dưỡng và nhiệt độ ni cấy. Quan sát dưới kính hiển
vi khơng thấy có sự hình thành sợi nấm, một số lồi có sinh sợi nấm giả nhưng rất
kém phát triển, khơng hình thành bào tử túi [3], [4], [18], [23], [42], [67].

Hình 1.1. Khuẩn lạc Rh. mucilaginosa và Khuẩn lạc Rh. glutinis [11]

CBHD: PSG. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH


-6Chương I: Tổng quan

Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện ni cấy.
Hình dạng của nó gồm: hình trứng, hình dài, elip, hình trịn cầu và hình gậy.
Rhodotorula có khuẩn lạc trơn, mềm, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ.
Tế bào nấm men Rhodotorula ở dạng đơn bào, quan sát dưới kính hiển vi có
dạng hình trịn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc hình gậy. Kích thước tế bào dao

động trong khoảng 2 – 5 μm chiều rộng; 2,5 – 10 μm chiều dài [4], [67].

Hình 1.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [11]

1.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hố sau:
- Khơng lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, α-D
glucoide, saccharose, trehalose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng
các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào. Vài nấm
men thuộc giống Rhodotorula có khả năng lên men sinh ra CO2 (khí gây ra hiện
tượng sủi bọt) và có hoạt tính polygalacturonase – enzyme có khả năng thủy phân
pectin (Vaughn et al., 1969; Vaughn et al., 1972) [58], [66], [67].
- Tạo ra ezyme urease.
- Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B).
- Không tạo thành hợp chất loại tinh bột.
- Khơng tạo ra acid acetic.
- Khơng đồng hố được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của
Rhodotorula khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida [23], [65].
- Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau.

CBHD: PSG. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH


-7Chương I: Tổng quan

- Không sinh enzyme alpha-amylase, amyloglusidase và enzyme thủy phân
xellulose [32], [46].
- Có chứa enzyme D-amino-acid oxidase (EC 1.4.3.3) [59], [70], [72].

- Có chứa các enzyme khử bão hịa (desaturase) đặc biệt có khả năng chuyển
hóa acid oleic (C 18:1) thành acid linolenic (C18:3) [71].
- Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid.
Nấm men Rhodotorula còn được gọi là vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid
(carotengensis). Các sắc tố carotenoid chính trong nấm men Rhodotorula là: βcarotene, torularhodin và torulene. Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng
sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau.
1.1.5. Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula [12]
1.1.5.1. Cấu tạo
Cho đến nay việc nghiên cứu cấu tạo của nấm men Rhodotorula vẫn chưa
được miêu tả một cách cụ thể nhưng đặc điểm chung về cấu tạo của Rhodotorula
cũng giống như những loại nấm men khác bao gồm các phần sau:

™ Thành tế bào:
Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan,
manan, protein, lipide và một số thành phần nhỏ như kitin.

• Manan:
Manan là hợp chất cao phân tử của D – manose, mỗi phân tử thường chứa
200 – 400 thành phần manose. Thường manan liên kết với protide theo tỷ lệ 2:1.
Manan thường có mối liên kết α – 1,6; α – 1,3; β – 1,6. Phân tử lượng của chúng
khoảng 5.104.

• Glucan:
Glucan là hợp chất cao phân tử của D – glucose. Đó là một polysaccharide
phân nhánh có liên kết β – 1,3 và β – 1,6. Cả hai thành phần này phân bố đều trên
thành tế bào.

CBHD: PSG. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

HVTH: NGUYỄN ĐÌNH THỊNH