Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ nấm men pichia pastoris gs115

LÊ THỊ NGỌC SƯƠNG





N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
N


C
C
Ứ
Ứ
U
U

T
T
H
H
U
U


N
N
H
H
Ậ
Ậ
N
N


V
V
À
À


T
T
I
I
N
N

H
H


S
S
Ạ
Ạ
C
C
H
H


P
P
H
H
Y
Y
T
T
A
A
S
S
E
E

T
T
Á
Á
I
I


T
T
Ổ
Ổ


H
H
Ợ
Ợ
P
P


T
T
Ừ
Ừ

N
N
Ấ
Ấ
M
M


M
M
E
E
N
N


P
P
I
I
C
C
H
H
I
I
A
A

P
P
A
A
S
S
T
T
O
O
R
R
I
I
S
S


G
G
S
S
1
1
1
1
5
5

Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60 42 031



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH





Thành phố Hồ Chí Minh – 2009
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Hoàng Quốc Khánh,
trưởng Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa Học



LÊ THỊ NGỌC SƯƠNG

N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
N


C
C
Ứ
Ứ
U
U


T
T
H
H

U
U


N
N
H
H
Ậ
Ậ
N
N


V
V
À
À


T
T
I
I
N
N
H
H

S
S
Ạ
Ạ
C
C
H
H


P
P
H
H
Y
Y
T
T
A
A
S
S
E
E


T
T
Á
Á

I
I


T
T
Ổ
Ổ


H
H
Ợ
Ợ
P
P


T
T
Ừ
Ừ




N
N
Ấ
Ấ

M
M


M
M
E
E
N
N


P
P
I
I
C
C
H
H
I
I
A
A


P
P
A
A

S
S
T
T
O
O
R
R
I
I
S
S


G
G
S
S
1
1
1
1
5
5





Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 60 42 031



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH





Thành phố Hồ Chí Minh – 2009
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Hoàng Quốc Khánh,
trưởng Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa Học
và Công Nghệ Việt Nam, người đã đưa ra ý tưởng về đề tài này.Thầy luôn
quan tâm, hướng dẫn, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp em hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa
cũng như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự nhiên Tp.Hồ
Chí Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt
khóa học này.
Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, em Đào Thị Thu Hiền, cán bộ
nghiên cứu Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, đã quan tâm,

giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Em xin cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, phòng Các Chất Có Hoạt tính Sinh
học, cùng quý thầy cô ở Viện Sinh học Nhiệt đới, đã tận tính hướng dẫn và
giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn
quý thầy cô.
Cảm ơn các em Trinh, Vân, Phi, Linh, Lan cũng như các bạn cùng lớp
đã luôn gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ mình trong thời gian qua.
Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành cảm ơn
ông bà, cha mẹ hai bên đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, động viên,
giúp đở và tạo điều kiện để con có thể hoàn thành tốt luận văn cũng như
khóa học này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn ông xã, dù không phải lúc nào cũng ở gần
bên, nhưng anh luôn thương yêu, động viên, tạo mọi điều kiện để em hoàn
thành tốt luận văn cũng như khóa học này. Anh luôn là chỗ dựa vững chắc
cho em.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2009.
Xin chân thành cảm ơn
Lê Thị Ngọc Sương


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình và biểu đồ
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu 3
1.1 Acid phytic 4
1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4

1.1.2 Chức năng sinh lý của acid phytic 5
1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic
trong tự nhiên 6
1.1.4 Tác động kháng dưỡng của acid phytic 7
1.2 Enzym phytase và phytase của Aspergillus ficuum 7
1.2.1 Định nghĩa 7
1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase 8
1.2.3 Phân loại 9
1.2.3.1 Phân loại dựa trên nhóm phosphate đầu tiên bị
enzyme tác động 9
1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình
tự acid amin 9
1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase 10
1.2.4.1 Phytase từ động vật 10
1.2.4.2 Phytase từ thực vật 11
1.2.4.3 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật 12
1.2.5 Đặc tính sinh hóa 15
1.2.5.1 Nhiệt độ và độ pH tối ưu 15
1.2.5.2 Trọng lượng phân tử 16
1.2.5.3 Cơ chất 17
1.2.5.4 Thành phần amino acid của phyA và phyB
trong A. ficuum 18


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1.2.6 Đặc điểm xúc tác của enzym phytase 18
1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 20
1.2.7.1 Ion kim loại 20
1.2.7.2 Canxi và tỷ lệ Canxi/phospho 21

1.2.7.3 Nồng độ cơ chất 21
1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
enzym phytase 21
1.2.8.1 Nguồn cacbon 21
1.2.8.2 Nguồn nitơ 22
1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng 22
1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho 23
1.2.9 Ứng dụng của enzym phytase 23
1.2.9.1 Ứng dụng trong nghiệp chế biến thức ăn gia
súc, gia cầm 23
1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 24
1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo-
inositol phosphate 25
1.2.10 Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 26
1.3 Nấm men Pichia pastoris 27
1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung 27
1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 28
1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P. pastoris 30
1.3.4 Sự tiết các protein ngoại lai 31
1.3.5 Biến đổi hậu dịch mã 32
1.3.6 Các chủng biểu hiện phổ biến 33
1.3.7 Các vector biểu hiện 34
1.3.8 Pichia pastoris GS115 đã biến nạp 35
Chương 2: Vật liệu & Phương pháp 38
2.1 Vật liệu 39
2.1.1 Nguyên vật liệu 39


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

2.1.2 Hóa Chất và môi trường 39
2.1.2.1 Hóa chất 39
2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy 41
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 42
2.2 Các phương pháp sử dụng 43
2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein: 43
2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính phytase 45
2.2.3 Phương pháp chạy điện di SDS-PAGE 48
2.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel 52
2.2.5 Phương pháp thẩm tích (Dialyse) để loại muối 54
2.2.6 Phương pháp xác định hằng số Michaelis (K
m
) 55
2.3 Phương pháp nghiên cứu: 58
2.3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase 58
2.3.2 Khảo sát các điệu kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi
cấy, lên men thu nhận phytase tái tổ hợp 59
2.3.2.1 Tỷ lệ giống 59
2.3.2.2 Thời gian nuôi cấy 60
2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy 60
2.3.2.4 Lượng methanol bổ sung trong quá trình
nuôi cấy 61
2.3.2.5 Nồng độ K
3
PO
4
bổ sung vào môi trường nuôi cấy 61
2.3.3 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa 62
2.3.4 Xác định hiệu quả của quá trình nuôi cấy 62
2.3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 63

2.3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 63
2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH 63
2.3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 64
2.3.5.4 Nhiệt độ tối ưu (t
opt
) của enzym phytase thu
nhận được 64


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
2.3.6 Tinh sạch enzym phytase thu được bằng phương pháp
sắc ký lọc gel 64
2.3.7 Điện di SDS-PAGE 65
2.3.8 Khảo sát các đặc tính của phytase thu được sau khi
qua sắc ký lọc gel 65
2.3.8.1 Khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian để
tìm ra giá trị K
m
(hằng số Michaelis) của
enzym 65
2.3.8.2 Xác định K
m
65
2.4 Tóm tắt qui trình thu nhận phytase tái tổ hợp 66
Chương 3: Kết quả & Biện luận 67
3.1 Kiểm tra khả năng sinh phytase của các giống 68
3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
thu nhận phyase 69
3.2.1 Khảo sát tỷ lệ giống cấy 69

3.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy 71
3.2.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy 73
3.2.4 Khảo sát lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ trong quá
trình nuôi cấy 75
3.2.5 Khảo sát nồng độ K
3
PO
4
bổ sung vào môi trường nuôi
cấy 77
3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt tính
phytase 80
3.4 Xác định hiệu quả nuôi cấy thu nhận phytase tái tổ hợp 82
3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 84
3.5.1 Khảo sát sự bền nhiệt của phytase tái tổ hợp 84
3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH 87
3.5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các ion kim loại 90
3.5.4 Xác định nhiệt độ tối ưu 92
3.6 Tinh sạch enzyme phytase thu nhận được 94


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
3.6.1 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp thu nhận
được, chưa qua loại muối 94
3.6.2 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp đã qua loại
muối 96
3.6.3 Xác định hiệu suất của quá trình sắc ký lọc gel 98
3.7 Điện di SDS-PAGE 100
3.8 Hằng số Michaelis (K

m
) 103
Chương 4: Kết luận & Đề nghị 107
4.1 Kết luận 108
4.1.1 Các điều kiện liên quan đến quá trình nuôi cấy 108
4.1.2 Tác nhân tủa 108
4.1.3 Hiệu quả thu nhận phytase tái tổ hợp 108
4.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 109
4.2 Đề nghị 109
TÀI LIỆU THAM KHẢO 111
Chương 5: Phụ lục




Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BMGY : Bufferred Glycerol-comlex Medium
BMMY : Bufferred Methanol-comlex Medium
CPE : Chế phẩm phytase tái tổ hợp thu nhận được
ĐC : Mẫu đối chứng
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid
HđC : Hoạt độ chung của phytase
HđR : Hoạt độ riêng của phytase
Hđmax : Hoạt độ tối đa
M : Trọng lượng phân tử
Phytase-PAI : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có
mang gen phyAI
Phytase-PB : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có

mang gen phyB
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide gel
electrophoresis
TCA : Tricloroacetic acid
TEMED : N,N,N
’
,N
’
-tetramethylene ethylene diamine
TK : Thử không
TT : Thử thật
YPD : Yeast extract Pepton Destrose
YNB : Yeast Nitrogene Base





DANH MỤC CÁC BẢNG


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Trang
Bảng 1.1: Các loại thức ăn có hoạt tính phytase trên 100 đơn vị /kg 11
Bảng 1.2: Đặc tính phytase được thu nhận từ các nguồn khác nhau 14
Bảng 1.3: Kích thước phân tử của phytase từ các nguồn khác nhau 17
Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch Albumin chuẩn để dựng đường
chuẩn Albumin 44

Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch photphate chuẩn 46
Bảng 2.3: Các bước thực hiện phản ứng enzyme 47
Bảng 3.1: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo tỷ lệ giống 69
Bảng 3.2: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo thời gian nuôi cấy 71
Bảng 3.3: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo môi trường nuôi cấy 73
Bảng 3.4: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo lượng methanol bổ sung
mỗi 24 giờ 76
Bảng 3.5: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB theo nồng độ K
3
PO
4
bổ sung
vào môi trường nuôi cấy 78
Bảng 3.6: Sự biến đổi hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ
riêng của phytase-PAI và phytase-PB theo các tác nhân tủa 81
Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất nuôi cấy của phytase-PAI và phytase-PB 84
Bảng 3.8: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PAI 85
Bảng 3.9: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PB 86
Bảng 3.10: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđmax của
phytase-PAI và phytase-PB theo sự đổi pH 88
Bảng 3.11: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđ đối
chứng của phytase-PAI tương ứng với các ion kim loại
khác nhau 90

Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Bảng 3.12: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđ đối
chứng của phytase-PB tương ứng với các ion kim loại 91
Bảng 3.13: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđmax của
phytase-PAI và phytase-PB tương ứng với các nhiệt độ
khác nhau của phản ứng 92
Bảng 3.14: Kết quả quá trình sắc ký lọc gel 99
Bảng 3.15: Chú thích các điện di đồ 102
Bảng 3.16: R
f
tương ứng với LgM

của các protein chuẩn 102
Bảng 3.17: Trọng lượng phân tử của phytase tái tổ hợp thu nhận được 103
Bảng 3.18: Sự biến đổi hoạt độ chung của phytase-PAI và phytase-PB
theo nồng độ cơ chất tương ứng với thời gian phản ứng
khác nhau 105
Bảng 3.19: Hoạt độ chung cao nhất của phytase theo nồng độ cơ
chất Na-phytate 106

Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của axit phytic 4
Hình 1.2: Phức phytate trong tự nhiên. 5
Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của phytase 19
Hình 1.4: Sự thủy phân acid phytic thành inositol và acid phosphoric
bằng phytase 20
Hình 1.5: Hình thái của nấm men Pichia pastoris 27
Hình 1.6: Biểu đồ chung cho vector biểu hiện của P. pastoris 31
Hình 2.1: Bộ điện di SDS-PAGE (Bio-Rad) 49
Hình 2.2: Hệ thống sắc ký lọc gel Biologic LP (Bio-Rad) 53
Hình 2.3: Đường cong của phương trình Michaelis Menten 56
Hình 2.4: Đường cong của phương trình Lineweaver Burk 57
Hình 3.1: Khảo sát khả năng sinh phytase của các giống
GS115/phyAI và GS115/phyB cấy trên môi trường MM-
canxi phytate. 68
Hình 3.2: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung của
phytase-PAI theo tỷ lệ giống khác nhau. 70
Hình 3.3: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PB theo tỷ lệ giống khác nhau. 70

Hình 3.4: Sự biến thiến hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI theo thời gian nuôi cấy. 72
Hình 3.5: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ của phytase-
PB theo thời gian nuôi cấy. 72
Hình 3.6: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB (dạng thô), trên môi trường
BMMY và môi trường nước chiết giá 74

Hình 3.7: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI và phytase-PB (dạng tủa), trên môi trường
BMMY và môi trường nước chiết giá 74


Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Hình 3.8: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung của
phytase-PAI theo lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ. 76
Hình 3.9: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PB, theo lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ. 77
Hình 3.10: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PAI, theo nồng độ K
3
PO
4
bổ sung vào môi trường 79
Hình 3.11: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của
phytase-PB, theo nồng độ K
3
PO
4

bổ sung vào môi trường 79

Hình 3.12: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ
riêng của phytase-PAI theo các tác nhân tủa khác nhau. 81
Hình 3.13: Sự biến thiên hoạt độ chung và hoạt độ riêng của
phytase-PB theo các tác nhân tủa khác nhau. 81
Hình 3.14: Kết tủa phytase-PAI và phytase-PB với các tác nhân tủa
khác nhau được hòa vào đệm Natri acetate 0,2M, pH 5,5 82
Hình 3.15: Chế phẩm phytase-PAI và phytase-PB thu được sau khi tủa
bằng cồn 96
o
83
Hình 3.16: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PAI 85
Hình 3.17: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PB 86
Hình 3.18: Sự biến thiên % hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và
phytase-PB theo sự đổi pH 89
Hình 3.19: Sự biến thiên % hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và
phytase-PB theo các nhiệt độ khác nhau của phản ứng 93
Hình 3.20: Sắc ký đồ của phytase-PAI 94
Hình 3.21: Sắc ký đồ của phytase-PB 95
Hình 3.22: Sắc ký đồ của enzyme phytase-PAI đã loại muối 96
Hình 3.23: Sắc ký đồ của enzyme phytase-PB đã loại muối 97
Hình 3.24: SDS-PAGE của phytase-PAI và phytase-PB 100
Hình 3.25: Đường chuẩn trọng lượng phân tử của các protein chuẩn 103
Hình 3.26: Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk của phytase-PAI 106
Hình 3.27: Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk của phytase-PB 107


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 1 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
MỞ ĐẦU
Photpho là nguyên tố quan trọng trong cơ thể sống. Nó là một chất dinh dưỡng
thiết yếu trong nhiều chu trình trao đổi chất. Photpho cùng với canxi cấu tạo nên
xương, răng, cùng với protein, lipid và glucid để tham gia cấu tạo tế bào đặc biệt là
màng tế bào. Photpho vô cơ ở dạng photphat (PO
4
)
3-
, đóng một vai trò quan trọng
trong các phân tử sinh học như ADN, ARN, trong đó nó tạo thành một phần trong
cấu trúc của các phân tử này. Các tế bào sống cũng sử dụng photphat để vận chuyển
năng lượng tế bào thông qua adenosine triphosphat (ATP). ATP còn là yếu tố quan
trọng trong sự photphat hóa, một dạng điều chỉnh quan trọng trong các tế bào.
Photpho cũng là một nhân tố khoáng chính cần cho gia súc, gia cầm. Nó tham gia
trong các photpholipid, là thành phần được các động vật dùng để làm cứng xương
của chúng.
Khoảng 50 – 80% tổng lượng photpho tự nhiên hiện diện trong thực vật, là
nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Nó ở dạng liên kết với các chất
khoáng, protein hình thành phức hợp không hòa tan. Khoảng 2/3 lượng photpho
tổng nằm trong các loại ngủ cốc, cây họ đậu, và hạt cây có dầu hiện diện như là
photphophytat và chỉ 1/3 lượng photphophytate được hấp thu và cân bằng được bài
tiết.
Nitơ và photpho được xem là có khả năng gây hại đến chất lượng đất và nước.
Lượng photphophytate có trong hạt ngũ cốc và các loại đậu hay hạt cây có dầu
không được các loài động vật hấp thu và đã thải ra ngoài môi trường qua phân của
chúng. Vì vậy đã gây nên sự ô nhiễm phytate cho môi trường đất và nước.
Phytase là một enzyme có khả năng phân giải phytate photpho để phóng thích
photpho vô cơ, cung cấp lượng photpho cho cơ thể động vật. Do đó nó cũng có tiềm
năng tác động để làm giảm sự ô nhiễm môi trường, bởi việc giảm sự bài tiết phytate

và nitơ trong phân. Vì vậy, giá trị thương mại hóa của phytase vi sinh vật được ứng
dụng để bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm được chú ý nhiều hơn trong
những năm gần đây. Tuy nhiên nguồn phytase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều
khuyết điểm như hoạt độ thấp, ít có khả năng chịu nhiệt,…. Do đó người ta đã bắt


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 2 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
đầu nghiên cứu để có thể thu nhận được nguồn phytase có hoạt độ cao hơn, có khả
năng chịu nhiệt, pH, và các đặc tính khác, đó là nguồn phytase tái tổ hợp. Trong
luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ
nấm men Pichia pastoris GS115 và xác định các đặc tính của enzyme này.

Luận Văn Thạc Sĩ Trang 3 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh



C
C
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g

1
1
:
:




T
T
Ổ
Ổ
N
N
G
G


Q
Q
U
U
A
A
N
N


T
T

À
À
I
I


L
L
I
I
Ệ
Ệ
U
U







Luận Văn Thạc Sĩ Trang 4 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1.1 Acid phytic (phytin)
Acid phytic là dạng chính dự trữ photpho trong các loại hạt ngũ cốc, các loại
đậu, hạt cây có dầu. Nó đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý và cũng ảnh hưởng
đáng kể đến chức năng, đặc tính dinh dưỡng của các loại hạt ngũ cốc, các loại đậu
và hạt cây có dầu, do sự hình thành phức hợp với protein và các chất khoáng.[23]
Dạng đúng của acid phytic là myo-inositol 1,2,3,4,5,6

hexadihydrogenphosphate (IUPAC-IUB, 1977). Muối của acid phytic là phytate.
Chính xác hơn, phytate là dạng phức của Natri, Magiê, Canxi với acid phytic, tồn
tại như dạng gọng kìm trong các hạt ngũ cốc, các loại đậu và hạt cây có dầu.[31]
1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic
Cấu trúc của acid phytic được tìm ra bằng phương pháp phân tích X-
ray (Blank và cộng sự, 1971) và
31
P-NMR ( Johnson và Tate, 1969). Johnson
và Tate đề nghị rằng nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí đối xứng qua trục, còn
các nhóm photphat còn lại nằm ở vị trí bất đối xứng. Ngược lại, theo Blank và
cộng sự, (1971) thì kết luận rằng các nhóm photphat 1,3,4,5 và 6 nằm ở vị trí
đối xứng qua trục, còn nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí bất đối xứng. Đối với
dữ liệu của Costello và cộng sự, (1976) thì ủng hộ thông tin của Johnson và
Tate, (1969) đã đề nghị.
Axit phytic có công thức tổng quát của là C
6
H
8
O
24
P
6
, tồn tại ở hai dạng
cấu trúc lập thể khác nhau, cấu trúc đối xứng và bất đối xứng. [31]

Hình 1.1. Cấu trúc của axit phytic [51]


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 5 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Hình 1.2. Phức phytate trong tự nhiên. [49]
Axit phytic có ái lực mạnh với các cation đa hóa trị và các protein tích
điện dương vì nó tồn tại dưới dạng phân tử tích điện âm mạnh trong phổ pH
rộng. Chính vì vậy mà acid phytic liên kết với các ion Mg
2+
, Ca
2+
, protein tạo
thành dạng phytate trong tự nhiên.[45]

1.1.2 Chức năng sinh lý của acid phytic
Acid phytic có trong ngũ cốc, các loại đậu và hạt cây có dầu, có nhiều
vai trò về sinh lý và đảm nhiệm nhiều chức năng như:[23]
- Là nguồn dự trữ photpho.
- Là nguồn dự trữ năng lượng.
- Như một nguồn cation.
- Là nguồn myo-inositol
- Khởi đầu cho quá trình ngủ của hạt.
Ngoài ra, acid phytic có lẽ còn nắm giữ nhiều chức năng khác nữa mà
chưa được biết đến, trong hạt ở thực vật (Reddy và cộng sự, 1989). Vai trò của


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 6 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
acid phytic như một chất chống oxy hóa tự nhiên trong suốt quá trình ngủ của
hạt (được đề nghị bởi Graf và cộng sự, 1987). Đặc tính chống ôxy hóa của acid
phytic dựa vào sự giả định rằng acid phytic thực sự ngăn chặn sự hình thành

hydroxit sắt chuyển động từ rễ. Sự hiện diện của acid phytic được xem là có
tác động đến việc chống lại sự tăng trưởng của tế bào ung thư trong bệnh ung
thư biểu mô vú và ruột kết ở các loài động vật. (Dvorakova, 1998).
Những nghiên cứu ở cuối thập niên 80 và đầu những năm thập niên 90,
đã xác định inositol photphat giữ vai trò trung gian trong sự vận chuyển của
các chất khoáng vào trong tế bào. Vai trò của chúng đặc biệt là inositol 3-
photphat trong sự truyền tín hiệu và sự điều chỉnh chức năng của các tế bào
thực vật và động vật. Vấn đề này được nhiều nhà nghiên cứu chú ý đến.
(Wodzinski and Ullah,1996).[44]
1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic trong tự nhiên
Acid phytic được tìm thấy đầu tiên như là các muối của các ion dương
hóa trị 1 và 2 (như muối kali, magiê trong gạo và muối canxi, magiê trong đậu
nành, trong những vùng riêng rẽ của các loại hạt ngũ cốc, cây họ đậu). Nó tích
lũy trong các loại ngũ cốc, các loại đậu trong suốt quá trình chín của hạt, cùng
với các cơ chất dự trữ khác như tinh bột và chất béo. Trong các hạt ngũ cốc và
hạt đậu acid phytic tích lũy trong các hạt nhỏ alơron và các tinh thể hình cầu
tách biệt (Reddy và cộng sự, 1989).
Nội nhũ của phôi lúa mì và lúa thì hầu như không có phytate. Nó dường
như tập trung trong mầm và các lớp hạt alơron của các tế bào phôi.
Ferguson và Bollard, (1976) đã tìm ra rằng 99% phytat trong đậu là
nằm trong các lớp tế bào mầm.
Lượng phytate lớn nhất ở ngũ cốc được tìm thấy là ở ngô (0.33-2.22) và
ở các loại đậu là ở đậu dolique (5.92-9.15), (Reddy và cộng sự, 1989).





Luận Văn Thạc Sĩ Trang 7 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
.1.4 Tác động kháng dưỡng của acid phytic
Acid phytic được xem là có tác động kháng dưỡng mạnh (Pallanf và
Rinbach, 1996). Tác động này dựa trên cấu trúc phân tử bất thường của acid
phytic.
Ở trường hợp sự thủy phân hoàn toàn, 6 nhóm photphat của acid phytic
sẽ mang tất cả 12 chất mang tích điện âm. Vì vậy acid phytic có khả năng gắn
các ion dương có hóa trị 1,2 và 3 hình thành các phức không tan (Reddy và
cộng sự, 1989). Sự hình thành các phức hợp giữa acid phytic và khoáng không
hòa tan trong vùng ruột đã làm ngăn chặn sự hấp thu khoáng (Davies, 1982).
Điều này làm giảm lợi ích sinh học của các chất khoáng cần thiết (Davies,
1982), như kẽm hiện diện như một nguyên tố dạng vết có lợi ích sinh học thì
hầu như bị ảnh hưởng bởi acid phytic. Rimbach và Pallauf, 1992 cho rằng việc
chia nhỏ sự bổ sung acid phytic có ảnh hưởng tiêu cực rõ ràng lên sự hấp thu
ion Zn
2+
và từ đó ảnh hưởng đến tỷ lệ tăng trưởng và phát triển của động vật,
thực vật.
Ngoài việc hình thành các phức hợp với protein và các chất khoáng,
acid phytic còn tương tác với các enzyme như trypsin, pepsin, α-amylase và ß-
galactosidase, kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzyme tiêu hóa quan
trọng này. Dẫn đến sự kém tiêu hóa, làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát
triển ở động vật. (Dehpande and Cheryan, (1984), Singh and Kricorian, (1982),
Inagawa và cộng sự, 1987).
1.2 Enzyme phytase và phytase của Aspergillus ficuum
1.2.1 Định nghĩa
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase; EC 3.1.3.8
và EC 3.1.3.26), được tìm thấy đầu tiên ở vi sinh vật và thực vật, là enzyme
xúc tác sự thủy phân các liên kết phosphoester của acid phytic (myo-inositol
hexakisphosphate), nguồn dự trữ chính của photpho trong các hạt ở thực vật,

để phóng thích photpho vô cơ.[24],[45].



Luận Văn Thạc Sĩ Trang 8 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase [45]
1903 – Posternak: mô tả về acid phytic.
1907 – Suzuki và cộng sự: mô tả và tách chiết phytase từ cám gạo.
1911 – Dox và Golden: tìm được phytase trong aspergilli.
1913 – Plimmer và Anderson: xác định được các phức hợp photpho hữu
cơ trong nguyên liệu thực vật.
1914 – Anderson: xác định được cấu trúc của acid phytic.
1959 – Casida: tìm ra được 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính
phytase.
1962-1971: Tổ chức Khoáng sản và hóa học quốc tế, bước đầu thử
nghiệm thương mại hóa phytase.
1967 – Ware và Shieh: nhận bằng phát minh về acid phytic.
1968 – Ware và Shieh: phân lập được hơn 2000 chủng có hoạt tính
phytase. Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 và A. ficuum và
đã thu nhận gen phyA và phyB có hiệu suất cao nhất so với các báo
cáo trước đó, trong chủng có biến đổi không phải do di truyền.
1971 – Nelson và cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A. niger
NRRL3135 đối với gà trong các bữa ăn thử nghiệm và có hàm
lượng nhất định.
1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của Trung tâm nghiên cứu phía
nam, bộ phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu cơ bản về
phytase.
1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả và xác định thành phần, trình tự amino

acid của gen phy A thu nhận từ A. niger NRRL 3135.
1990 – Simons và cộng sự: chứng minh hiệu quả của phytase đối với gà
và heo.
1993 – Ehrlich và cộng sự: tạo dòng gen phy B, mã hóa cho enzyme
acid phosphatase pH 6.0, từ A. niger NRRL 3135.


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 9 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1993 – Pen và cộng sự: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa
cho phytase, vào trong tobacco.
1994 – Ullah và cộng sự: tạo dòng gen, từ A. niger NRRL 3135, mã hóa
cho enzyme acid phosphatase pH 6.0.
1993 – Beudeker và Pen: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa
cho phytase, vào trong Canoda (Brassica napus).
1.2.3 Phân loại
1.2.3.1 Phân loại dựa trên nhóm phosphate đầu tiên bị enzyme tác
động
Tổ chức Sinh hóa và Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB), tổ
chức định danh sinh hóa (JCBN) đã phân loại phytase thành hai loại với
mã số phân loại là EC 3.1.3.8 và EC 3.1.3.26. [30]
- EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên theo hệ
thống là myo-inositol hexakisphosphat-3-phosphohydrolase, là enzyme
thủy phân liên kết ester tại vị trí số 3 của myo-inositol hexakisphosphate
thành D-myo-Ins-1,2,4,5,6-pentakisphosphate và orthophosphate.[30]
Phytase của Aspergillus ficuum thuộc nhóm enzyme này [40].
- EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên theo hệ
thống là myo-inositol hexakisphosphate-6-phosphohydrolase là enzyme
thủy phân liên kết ester tại vị trí số 6 của myo-inositol hexakisphosphate

thành D-myo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphate và orthophosphate. Các
liên kết ester còn lại trong cơ chất được thủy phân ở các tỷ lệ khác
nhau.[30]
1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin
Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin thì enzyme
phytase được chia thành hai lớp:[32]
- Histidine acid phytase – HAP (phytaseA, phytaseB,
phytaseC).
- Alkaline phytase (PhytaseD).


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 10 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Tất cả các thành viên của nhóm HAPs đều có trung tâm hoạt
động là RHGXRXP.
1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase
1.2.4.1 Phytase từ động vật
Phytase trong mô động vật được phát hiện đầu tiên ở gan và
máu bê (McCollum và Hart, 1908). Tuy nhiên, việc nghiên cứu sâu hơn
để tìm phytase trong máu động vật hữu nhũ thì không thành công.
Phytase được tìm thấy trong máu của động vật có xương sống bậc thấp
hơn như chim, bò sát, cá và rùa biển (Rapoport và cộng sự, 1941). Năm
1937, Patwardhan là người đầu tiên ghi nhận có sự thủy giải phytate
trong ruột chuột. Hoạt động của phytase cũng được quan sát ở ruột heo,
cừu và bò (Spitzer và Phillips, 1972). Động vật nhai lại có khả năng tiêu
hóa phytate hoàn toàn nhờ hệ vi sinh vật có trong ruột, Photphate vô cơ
giải phóng ra sẽ được vi sinh vật và cả động vật chủ sử dụng.[22]
Phytase được tìm thấy có nhiều ở động vật có dạ dày đơn
(Bitar và Reinhold, 1972; Copper và Gowing, 1983, Yang và cộng sự,

1991, Chi và cộng sự, 1999). Tuy nhiên, phytase trong đường ruột là
phytase nội bào nên không đóng vai trò quan trọng đối với sự tiêu hóa
phytate trong thức ăn ở các loài động vật này (Williams và Taylor,
1985). Phytase trong ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với
phytase trong ruột chuột. Ruột non người bình thường có khả năng tạo
ra một lượng nhỏ phytase (Igbal và cộng sự, 1994) nên không có vai trò
quan trọng trong sự tiêu hóa phytate. Nhưng đó là yếu tố quan trọng
trong sự thủy giải phytate (Frolich, 1990) [43]
Craxon và cộng sự (1997) đã tạo dòng và biểu hiện multiple
inositol polyphosphate phosphatase (MIPP) gan chuột có hoạt tính
phytase. mRNA của MIPP có trong tất cả các mô được nghiên cứu ở
chuột nhưng biểu hiện mạnh nhất là ở cật và gan. Một enzyme giống
phytase cũng được tìm thấy ở Paramecium (Freund và cộng sự, 1992).


Luận Văn Thạc Sĩ Trang 11 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1.2.4.2 Phytase từ thực vật
Phytase được tìm thấy trong cám lúa mì, các loại hạt, trong các
cơ quan dự trữ của thực vật như khoai tây, lá cây thuốc lá, trong cây bắp
(Huebel và Beck, 1996), gạo ( Hayakawa, 1989; Maugenest, 1999), lúa
mì (Nagai và Nakano Funahashi, 1962,1999), và cây đậu tương
(Hamada, 1996)… Những loại hạt có hoạt tính phytase cao là lúa mì,
cám lúa mì, lúa mạch, còn những loại hạt có hoạt tính phytase thấp là
bắp và hạt đậu đã xử lý nhiệt (Eeckout và cộng sự, 1994, Schroder và
cộng sự, 1996). Trong số 285 mẫu của 51 loại thức ăn mà Eeckout khảo
sát chỉ có 13 mẫu có hoạt tính phytase >100 U/kg; tất cả những mẫu
khác có rất ít hoặc không thấy có phytase.[44] (xem bảng 1.1)
Bảng 1.1 Các loại thức ăn có hoạt độ phytase trên 100 đơn vị /kg [44], [45].

Ngũ cốc Hoạt tính
phytase
(U/kg)
Phụ phẩm lúa mì Hoạt tính
phytase
(U/kg)
Lúa mạch 582 Cám 2957
Lúa mạch đen

5130 Cám ép viên 2573
Triticale 1688 Tấm 4381
Lúa mì 1193 Bột mì làm thức ăn gia súc

3305
Nhiệt độ tối ưu của phytase thực vật từ 45
o
C – 60
o
C
(Wodzinski và Ullah, 1996). Phytase thực vật bị bất hoạt một phần hay
hoàn toàn khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao (Ravindran và cộng sự, 1995).
Phillippy, (1999), cũng chứng minh rằng phytase lúa mì mất hoạt tính
đáng kể khi có mặt pepsin. Khả năng chịu nhiệt của phytase thực vật
không tốt và đây là trở ngại đầu tiên trong chế biến thức ăn cho gia súc,
gia cầm.

Luận Văn Thạc Sĩ Trang 12 Tổng quan tài liệu

HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
1.2.4.3 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật [23],[25],[28],[43]
Trong thiên nhiên phytase có thể được tìm thấy trong động
vật, thực vật, và vi sinh vật. Tuy nhiên, hầu hết công trình khoa học đều
làm trên phytase vi sinh vật, đặc biệt là có nguồn gốc từ nấm sợi như
Aspergillus ficuum (Gibson, 1987), A. fumigatus (Pasamontes, 1997)
hay Mucor piriformis (Howson và Davis, 1983), Rhizopus oligosporus
(Casey và Walsh, 2004), và Cladosporium species.
v Phytase nấm mốc nhìn chung được chú ý nhiều hơn do
năng suất cao, khả năng chịu acid trong thực phẩm (Kim và cộng sự,
1998). Shieh và Ware, (1968), đã phân lập hơn 2000 vi sinh vật từ đất
có khả năng sinh phytase. Hầu hết các vi sinh vật chỉ sản xuất phytase
nội bào, chỉ có 30 vi sinh vật sinh phytase ngoại bào, tất cả đều là nấm
sợi: 28 loài thuộc Aspergillus, 2 loài thuộc Penicillium và 1 loài thuộc
Mucor. Trong 28 loài thuộc giống Aspergllus, có tới 21 chủng là A.
niger. Trong khảo sát của Howson và Davis năm 1983, 84 nấm mốc
thuộc 25 loài có khả năng sinh enzyme phân hủy phytate ngoại bào,
Aspergillus ficuum NRRL 3135 có hoạt tính mạnh nhất. Nấm mốc chịu
nhiệt như Thermomyces lanuginosus và Sporotrichum thermophile sinh
phytase lần lượt ở 65
o
C và 45
o
C (Berka và cộng sự, (1998), Ghosh,
(1997).
v Phytase cũng được tìm thấy trong một số vi khuẩn như
Aerobacter aerogenes (Greaves và cộng sự, 1967), Pseudomonas sp.
(Irving và Cosgrove, 1971), Bacillus subtilis (Powar và Jagannathan,

1982), Klebsiella sp. (Shah và Parekh, 1990), B. subtilis (Shimizu,
1992), Escherichia coli (Greiner và cộng sự, 1993), Enterobacter sp. 4
(Yoon và cộng sự, 1996) và Bacillus sp. DS 11 (sau đó được xác định là
B. amyloliquefaciens) (Kim và cộng sự, 1998a). Trong đó, chỉ có giống
Bacillus và Enterobacter sản xuất phytase ngoại bào.