Khảo sát phương pháp cố định nấm men saccharomyces cerevisiae 28 trên chất mang cellulose vi khuẩn và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN AN HUY

KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH
NẤM MEN SACCHAROMYCES
CEREVISIAE 28 TRÊN CHẤT MANG
CELLULOSE VI KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH : 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2008


i

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 1: ..........................................................................................
......................................................................................................................................

......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 2: ..........................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày …. tháng … năm 2008


ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Tp. HCM, ngày

----------------

tháng 8 năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: NGUYỄN AN HUY

Giới tính : Nam

Ngày, tháng, năm sinh : 19-10-1982

Nơi sinh : TP. Hồ Chí Minh

Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học
Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006
1- TÊN ĐỀ TÀI: “KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH NẤM MEN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 28 TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE VI
KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG”
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
¾

Khảo sát các đặc tính sinh học của chủng Saccharomyces cerevisiae 28.

¾

Tạo chế phẩm men giống cố định từ chất mang Bacterial Cellulose (BC) và

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 28.
¾

Khảo sát mật độ tế bào nấm men cố định trên BC trong q trình cố định.

¾

Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm nấm men cố định.

¾

Ứng dụng chế phẩm nấm men để lên men rượu chanh dây, so sánh động học

lên men của chế phẩm so với tế bào tự do, đánh giá hiệu quả sử dụng của chế phẩm.
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/02/2008
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/06/2008
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH


iii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô và bạn bè đã hướng
dẫn, giúp đỡ và động viên để tơi hồn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương đã định hướng, giúp đỡ và
hướng dẫn tôi trong suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô ở bộ môn Công nghệ Sinh học đã
giúp đỡ và ln ln tạo điều kiện thuận lợi trong q trình tiến hành thực nghiệm
để tơi hồn thành luận văn này.
Xin cảm ơn sự giúp đỡ, ủng hộ và động viên của các bạn trong lớp

CHCNSH06.
Và cuối cùng tôi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Cha-Mẹ-gia đình tơi đã ln quan
tâm, ủng hộ và giúp sức trong suốt thời gian tôi làm luận văn tốt nghiệp.
Tp.HCM, ngày 10 tháng 8 năm 2008
Nguyễn An Huy


iv

TÓM TẮT
Tạo chế phẩm men giống cố định từ chất mang Bacterial Cellulose (BC) và
chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 28 đề tài thu được kết quả sau:
-

BC là chất mang phù hợp trong cố định tế bào nấm men. Chất mang BC có
ưu điểm hơn các chất mang khác trong kĩ thuật cố định tế bào nấm men: rẻ
tiền, cấu trúc bền, có khả năng tái sử dụng nhiều lần.

-

Chế phẩm S. cerevisiae 28 cố định trên BC bằng phương pháp bẫy hấp phụ ở
chế độ lắc 200 vòng/ phút trong thời gian 48 giờ đạt được mật độ tế bào
7,44×106 tb/ cm3. Sau thời gian sấy 20 giờ ở 400C mật độ tế bào đạt được
4,46×106 tb/ cm3 bằng 60% so với ban đầu.

-

Chế phẩm nấm men cố định bảo quản ở 40C sau 7 tuần có mật độ tế bào nấm
men 3,5×106 tb/ cm3 giảm 21,5%.

-

Khi ứng dụng lên men rượu chanh dây, chế phẩm nấm men cố định có khả
năng tái sử dụng 7 lần.


v

ABSTRACT
After creating immobilized yeast cell product from Bacterial Cellulose (BC) and
Saccharomyces cerevisiae 28, the results were given as following:
-

The suitable carrier in immobilized cell technology is BC. The advantages of
BC carrier to other carriers are having cheap material, having steady
structure, being able to recycle many times.

-

The product made from S. cerevisiae 28, which is immobilized in BC by
trap– absorption method in 200 rpm/ minute shake condition and 48 hours,
had 7.44×106 cells/ cm3 cell density. Immobilized yeast cell product dried in
20 hours at 400C had cell survivor density of 4.46×106 cells/ cm3 (60% of
cell density before dried).

-

Immobilized yeast cell product stored at 40C in 7 weeks had 3.5×106 cells/
cm3 cell density, decreased 21.5% from beginning.

-

Utilizing this immobilized yeast cell product to ferment passion fruit alcohol,
immobilized yeast cell product can be recycled up to 7 times.


vi

MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH........................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG..............................................................................................x
LỜI MỞ ĐẦU.......................................................................................................xi
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................1
1.1.

Đại cương về lên men rượu ......................................................................1

1.1.1. Lên men rượu ....................................................................................1
1.1.2. Cơ chế hoá sinh học của lên men rượu .............................................2
1.1.3. Cấu tạo, thành phần hoá học, dinh dưỡng nấm men .........................4
1.1.4. Nguyên liệu chanh dây sử dụng lên men rượu................................10
1.2.

Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật...........................................13

1.2.1. Chất mang .......................................................................................13
1.2.2. Cấu tạo, đặc tính của Bacterial Cellulose (BC) - chất mang sử dụng
trong đề tài ...................................................................................14
1.3.

Quá trình tạo chế phẩm men giống bằng cố định nấm men trên BC .....18

1.3.1. Các phương pháp cố định................................................................18
1.3.2. Ưu nhược điểm của nấm men cố định so với nấm men tự do ........21
1.4.

Những nghiên cứu về nấm men cố định trong lên men rượu.................22

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..24
2.1.

Vật liệu, hoá chất ....................................................................................24

2.2.

Nội dung nghiên cứu ..............................................................................25

2.3.

Các phương pháp phân tích ....................................................................33


vii

2.3.1. Phương pháp vi sinh........................................................................33
2.3.2. Phương pháp hoá sinh .....................................................................36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.......................................................38
3.1.

Khảo sát các đặc tính sinh học của chủng Sacharomyces cerevisae 28.38

3.1.1. Quan sát hình thái tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 28.38
3.1.2. Đường cong sinh trưởng của nấm men ...........................................39
3.2.

Quá trình tạo chế phẩm men giống bằng cố định nấm men trên BC .....42

3.2.1. Khảo sát mật độ tế bào trong thời gian cố định ..............................42
3.2.2. Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm ...........................................44
3.3.

Ứng dụng lên men rượu chanh dây ........................................................45

3.3.1. Khảo sát nguyên liệu .......................................................................45
3.3.2. Lên men rượu chanh dây.................................................................46
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................56
PHỤ LỤC.............................................................................................................59


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Quy trình đường phân ..................................................................................3
Hình 1.2 Quy trình biến đổi glucose thành ethanol ....................................................3
Hình 1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae...........................................................6
Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn ............8
Hình 1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn ............8
Hình 1.6 Trái chanh dây............................................................................................11

Hình 1.7 Màng bacterial cellulose ............................................................................14
Hình 1.8 Tế bào cellulose vi khuẩn(a) và thực vật(b)...............................................15
Hình 1.9 Quá trình tổng hợp BC ...............................................................................18
Hình 3.1 Tiêu bản nhuộm xanh methylen của nấm men ..........................................38
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc nấm men trên thạch đĩa..............................................39
Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn giữa OD và sinh khối khơ (SKK) của S. cerevisiae 28
...................................................................................................................................40
Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn giữa OD và mật độ tế bào của S. cerevisiae 28.........40
Hình 3.5 Đồ thị đường cong sinh trưởng, pH, 0Bx của S. cerevisiae 28 ..................41
Hình 3.6 Đồ thị so sánh mật độ tế bào S. cerevisiae 28 cố định trên BC ở các chế độ
lắc 120, 160, 200 vòng/ phút.....................................................................................43
Hình 3.7 Biến thiên mật độ tế bào theo thời gian .....................................................44
Hình 3.8 Đồ thị động học quá trình lên men sử dụng tế bào tự do...........................46
Hình 3.9 Đồ thị động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần 1, lần 2, lần 3,
lần 4 ...........................................................................................................................48
Hình 3.10 Đồ thị động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần 5, lần 6, lần 7,
lần 8 ...........................................................................................................................49


ix

Hình 3.11 Đồ thị so sánh hàm lượng đường tổng giữa lên men bằng nấm men tự do,
chế phẩm lần 1, lần 7, lần 8.....................................................................................51
Hình 3.12 Đồ thị so sánh độ rượu giữa lên men bằng nấm men tự do, chế phẩm lần
1, lần 7, lần 8. ...........................................................................................................52
Hình 3.13 BC trước cố định ......................................................................................53
Hình 3.14 Chế phẩm nấm men cố định sau 48 giờ ...................................................54
Hình 3.15 Chế phẩm nấm men cố định đạt độ ẩm 10% ...........................................54
Hình 1 Đường chuẩn glucose....................................................................................62

x

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Ảnh hưởng của một số axit tới nấm men.....................................................9
Bảng 1.2 Thành phần hoá học của chanh dây...........................................................12
Bảng 1 Giá trị đo OD theo mật độ tế bào..................................................................59
Bảng 2 Giá trị đo OD theo sinh khối khô .................................................................59
Bảng 3 Đồ thị đường cong sinh trưởng, pH, 0Bx của Saccharomyces cerevisiae 28
...................................................................................................................................59
Bảng 4 Biến thiên mật độ tế bào trong thời gian cố định .........................................60
Bảng 5 Động học quá trình lên men của tế bào tự do...............................................60
Bảng 6 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần nhất .............................60
Bảng 7 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần hai ...............................60
Bảng 8 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần ba.................................61
Bảng 9 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần tư .................................61
Bảng 10 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần năm ...........................61
Bảng 11 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần sáu .............................61
Bảng 12 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần bảy.............................61
Bảng 13 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần tám ..........................62
Bảng 14 Đường chuẩn glucose xây dựng bằng phương pháp DNS ........................62
Bảng 15 Giá trị hàm lượng đường tổng đo ở độ pha lỗng 220 lần của dịch lên men
trong q trình lên men .............................................................................................63


xi

LỜI MỞ ĐẦU
Rượu có nguồn gốc lịch sử lâu đời cách đây khoảng 7000 năm. Người ta cho
rằng rượu vang xuất hiện lần đầu ở các nước Ả rập vào khoảng thế kỉ 18 hoặc 19

trước Công Nguyên. Ngày nay rượu vang được phổ biến trên toàn thế giới, và là
thức uống quan trọng trong các dịp lễ tết. Công nghệ sản xuất rượu đem lại nguồn
lợi lớn về kinh tế. Rượu vang có nguuồn gốc từ quả nho nên có tên gọi là “Vin” hay
“Wine”. Ngày nay “rượu vang” được hiểu theo nghĩa rộng hơn là rượu lên men trực
tiếp từ nước quả [23].
Trong công nghệ sản xuất rượu vang truyền thống, quá trình lên men được thực
nhờ tế bào nấm men tự do. Tuy nhiên việc sử dụng nấm men tự do còn tồn tại nhiều
nhược điểm:
- Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp
- Sử dụng một lần nên làm giảm tính kinh tế nếu lên men ở qui mơ cơng nghiệp.
- Khó bảo quản, dễ thối hóa giống
- Khó tự động q trình lên men [11, 12, 24].
Do đó các nghiên cứu về nấm men cố định được thực hiện nhằm khắc phục
những nhược điểm trên. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, nấm men cố định có nhiều ưu
điểm hơn hẳn so với nấm men tự do:
- Tốc độ sử dụng cơ chất lớn, năng suất lên men cao, chất lượng sản phẩm đồng
đều, rút ngắn thời gian lên men.
- Tái sử dụng nấm men cố định nhiều lần, góp phần giảm chi phí sản xuất.
- Hoạt tính ổn định, tạo sản phẩm có chất lượng đồng đều [6, 11].
Từ những ưu điểm của nấm men cố định chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát
phương pháp cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae 28 trên chất mang
cellulose vi khuẩn và ứng dụng ”. Nội dung của đề tài gồm:
- Khảo sát các đặc tính sinh học của chủng Saccharomyces cerevisiae 28.


xii

- Tạo chế phẩm men giống cố định từ chất mang Bacterial Cellulose (BC) và
chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 28.
- Khảo sát mật độ tế bào nấm men cố định trên BC trong quá trình cố định.

- Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm nấm men cố định.
- Ứng dụng chế phẩm nấm men để lên men rượu chanh dây, so sánh động học
lên men của chế phẩm so với tế bào tự do, đánh giá hiệu quả sử dụng của chế phẩm.


1

CHƯƠNG 1.
1.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Đại cương về lên men rượu
1.1.1. Lên men rượu

Lý thuyết về lên men rượu đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ lâu. Năm
1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy, khi lên men đường
khơng chỉ biến thành rượu mà cịn tạo ra axit axetic. Năm 1810, Gaylussac nghiên
cứu và thấy rằng, cứ 45 phần khối lượng đường glucoza khi lên men sẽ tạo ra 23
phần alcol etylic và 22 phần khí cacbonic. Trên cơ sở đó ơng đưa ra phương trình
tổng quát về lên men rượu như sau:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + Q
Năm 1875, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra
khi có mặt của vi sinh vật. Nếu ngăn ngừa khơng cho vi sinh vật tiếp xúc với dịch
đường thì hiện tượng lên men sẽ khơng xảy ra. Ơng kết luận “Sự lên men rượu là
một q trình sinh học có liên hệ mật thiết tới hoạt động của tế bào nấm men”.
Dịch lên men gồm rất nhiều tế bào men riêng biệt, 1gam men ướt có độ ẩm
khoảng 70-75% chứa tới 14 tỉ tế bào, bề mặt mỗi tế bào chiếm 5.10-5 mm2. Như vậy
1 gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7.000 cm2. Nhờ có bề mặt này nên nấm
men hấp thụ đường và các chất dinh dưỡng rất nhanh. Cơ chế lên men rượu xảy ra

như sau: Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thu qua bề mặt tế bào rồi thẩm
thấu vào bên trong. Ở đó các enzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để
cuối cùng tạo sản phẩm chính là rượu và khí cacbonic. Hai chất này đều khuyếch
tán và tan vào môi trường xung quanh. Rượu do rất linh động nên hồ tan nhanh
vào trong dịch lên men, cịn khí cacbonic hồ tan kém và khuyếch tán chậm. Lúc
đầu hoà tan hoàn toàn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào nấm men và
lớn dần tới mức lực đẩy Archimedes lớn hơn khối lượng tế bào nấm men cộng bọt
khí, lúc đó tế bào cùng bọt khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ tan vỡ và


2

hợp thành tiếng rào rào. Bọt khí tan, tế bào nấm men lại chìm dần, tiếp xúc với dịch
đường để hấp thu và lên men rồi lại sản xuất ra rượu và khí cacbonic.
Nấm men có thể lên men trong dịch đường có nồng độ 25 đến 30%, nhưng
chậm. Nồng độ thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15 đến
18%. Nồng độ cao thì áp suất thẩm thấu lớn, do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả lên
men, lên men sẽ kéo dài, đường sót trong giấm chín sẽ tăng. Nếu lên men ở nồng độ
đường thấp dẫn đến không đủ cơ chất cho quá trình lên men nên hiệu quả lên men
thấp [8, 12].
1.1.2. Cơ chế hoá sinh học của lên men rượu
Phương trình tổng quát lên men rượu như sau
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + 28 Kcal
Gồm các giai đoạn
• Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân).
Phân tử đường glucose trải qua một loạt phản ứng phức tạp dưới xúc tác của một
loạt hệ thống enzym, phân tử glucose ban đầu được chuyển hố thành 2 phân tử axit
pyruvic.
• Giai đoạn 2
Acid pyruvic bị decacboxyl để tạo thành acetaldehyde.

• Giai đoạn 3
Acetaldehyde bị khử bởi NAD.H2 tạo thành ethanol [25].


3

Hình 1.1 Quy trình đường phân [25].

Hình 1.2 Quy trình biến đổi glucose thành ethanol [25].


4

1.1.3. Cấu tạo, thành phần hoá học, dinh dưỡng nấm
men
1.1.3.1.

Cấu tạo của tế bào nấm men

Tế bào nấm men có cấu tạo rất phức tạp. Người ta chia thành hai phần chính: vỏ
tế bào và phần trong của nội bào (vỏ và protoplasma).
Vỏ tế bào là một thành mỏng, trong suốt và có tính đàn hồi, có nhiệm vụ bảo vệ
tế bào khỏi tác động bên ngoài, đồng thời điều chỉnh mức độ thẩm thấu chất dinh
dưỡng và thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất.
Vỏ tế bào được cấu tạo chủ yếu từ polysaccarit kiểu hemixenluloza gồm glucan
và manan. Ngồi ra thành vỏ tế bào cịn chứa một lượng rất nhỏ chất béo, protit,
chất khoáng và xitin. Thành tế bào gồm ba lớp: lớp ngoài là màng nhẵn dày 10 đến
30 nm gồm chủ yếu lypoprotein. Lớp tiếp theo chứa phức hợp manan protein dày
100 nm. Lớp trong cùng có thể là chất keo hoặc sợi li ti dày từ 10 đến 250 nm, cấu
tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucoza và khoảng 6% hexoamin.

Vỏ tế bào được phát hiện có hai vùng mang tính thẩm thấu có chọn lọc đối với
các chất khác nhau. Vỏ tế bào chứa các lỗ có đường kính đến 3,6 nm, qua đó nước
và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào được đi vào bên trong.
Các enzym được tách ra từ tế bào tập trung ở các lớp này, chúng phân ly các
đường có phân tử lớn (maltoza, saccaroza) khơng có khả năng thẩm thấu vào trong
được. Nhờ đó các đường maltoza, saccaroza được đồng hoá.
Vỏ trong của tế bào là màng plasma rất mỏng, dày khoảng 8nm và cũng gồm ba
lớp, được cấu tạo từ phức hợp lypoprotein, canxi và ribonucleoprotein. Chức năng
chủ yếu của màng là điều chỉnh vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào.
Xitoplasma là hệ thống keo, độ nhớt của nó phụ thuộc vào thời kì sinh trưởng và
các yếu tố sinh lý. Ở các tế bào non trẻ, độ nhớt của xitoplasma nhỏ hơn ở tế bào
già, bảo đảm cho việc vận chuyển sản phẩm trao đổi chất được tốt hơn.


5

Nhân tế bào: tế bào nấm men đã có nhân thật, nhân thường có dạng hình bầu dục
hay hình cầu. Nhân được bao bọc bởi một lớp màng, bên trong là lớp dịch nhân và
có trong đó một thể rắn gọi là hạch nhân.
Không bào: chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng
hypoproteit gọi là màng không bào. Không bào là nơi chứa đựng các proteaza.
Ty thể: tham gia như là một nhà máy cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động.
Riboxom: tham gia mọi quá trình tổng hợp các hợp chất trong cơ thể.
Valutin gồm các chất chứa nitơ, dẫn xuất của axit nucleic. Nó có quan hệ tới sinh
trưởng của nấm men và xuất hiện trong thời kỳ sinh trưởng, nẩy chồi hay tạo nang
bào. Vaulutin nằm bên trong không bào, ở dạng hạt to (valutin nằm yên) hoặc nhiều
hạt nhỏ phân bố xung quanh mặt bên trong của không bào (valutin hoạt động). Khi
tiếp xúc với xanh metylen, valutin ở tế bào sống sẽ biến thành màu đỏ, còn ở tế bào
chết sẽ biến thành màu xanh nhưng bản thân nấm men không đổi màu.
Nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất ở 27-33oC. pH tối ưu 4,5-5,5. Tốc độ tăng trưởng,

sinh sản nhanh. Ở tế bào nấm men có một loại plasmid được gọi là “2µm plasmid”,
quan trọng trong thao tác chuyển gen [5, 8, 11, 19, 21].
1.1.3.2.

Thành phần hoá học và dinh dưỡng của nấm men

Thành phần hóa học và dinh dưỡng nấm men phụ thuộc chủng giống, môi
trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy. Men ép chứa trung bình 75%
nước và 25% chất khơ. Các chất khô của nấm men bao gồm các thành phần sau:
Protid 30 – 50%, (trung bình 40%).
Gluxit 24 – 40%, (trung bình 30%).
Chất béo 2 – 5%, (trung bình 4%).
Chất khống 5 – 11%, (trung bình 9%).
Gluxit của nấm men chủ yếu là glucogen (C6H10O5)n đây là chất dự trữ của tế
bào. Trong môi trường dư đường, lượng glucogen tăng đáng kể. Trong giai đoạn


6

đầu của lên men nồng độ đường còn cao, nên nấm men chứa nhiều glucogen. Khi
lượng đường giảm, nấm men sử dụng glucogen để duy trì sự sống.
Protid chứa trong nấm men thường khoảng 35 đến 40% và có đủ các axit amin
không thay thế. Ở nhiệt độ cao và bình thường dưới tác dụng của proteaza có sẵn
trong nấm men, protid sẽ biến thành pepton, peptid và axit amin.
Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất,
hàm lượng khoảng 2 đến 5% khối lượng chất khô. Ở nấm men gia súc, hàm lượng
chất béo có thể đạt 10 đến 20%. Trong nấm men còn chứa các chất tương tự chất
béo như lơxitin, sterin và ecgosterin.
Chất khoáng chiếm từ 5 đến 11% đóng vai trị quan trọng trong hoạt động của tế
bào nấm men đặc biệt là photpho. Photpho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có

trong thành phần của photphatit, nucleoproteit cũng như axit nucleic.
Để đảm bảo sự sống, nấm men cần các vitamin B1 có trong thành phần của
coenzym cacboxylaza. B2 có ở dạng photphoric, axit nicotin có trong cozymara
v.v...Biotin và axit paraminobenzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của
nấm men [4, 8].

Hình 1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae [29].


7

1.1.3.3.

Các yếu tố hoá học, lý học ảnh hưởng tới sự sinh trưởng,
phát triển và lên men

• Ảnh hưởng nhiệt độ
Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28-320C.
Nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế được phát triển của
tạp khuẩn. Sau 8 đến 10 giờ nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28-300C, tiếp đó cần làm
lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu.
Ở nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là bị nhiễm
lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 300C, men hoang dại phát triển nhanh hơn
Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35-380C chúng phát triển nhanh gấp 6
đến 8 lần [20, 22].
• Ảnh hưởng pH
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo etylic là 4,5-5. Đối với dịch
đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8-5,2 nhằm kết hợp giữ
cho amylaza tiếp tục chuyển hoá tinh bột và dextrin thành đường lên men được.
Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm

hiệu suất lên men.


8

Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn [8].

Hình 1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn [8].
• Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men
Nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng
trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những
tạp khuẩn mà cả nấm men.
Đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc sẽ kéo dài thời gian lên men. Nồng độ
dịch đường quá thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men.
Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16 đến


9

18% (tuỳ theo mức độ thuần khiết), tương đương 13-15% đường, để sau lên men
sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 đến 9,5%V [4, 8, 24].
• Ảnh hưởng của một số hoá chất và chất sát trùng
Bảng 1.1 Ảnh hưởng của một số axit tới nấm men
Nồng độ
Axit

Thời gian
làm tiêu

Làm ngừng sinh trưởng

Tiêu diệt men

%

Mol/l

%

Mol/l

Clohydric

0,14

0,038

0,72

0,195

0,46

Sufuric

0,39

0,039

1,30

0,132

2,04

Photphoric

0.30

0.031

2,00

0,204

1,28

Axetic

0,75

0,125

3,00

0,500

1,25

Lactic

0,90

0,100

3,00

0,333

1,27

diệt(giờ)

[8]
Trong điều kiện sản xuất người ta cần dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn
chế tạp khuẩn. Có thể dùng nhiều hố chất khác nhau như clorua vơi, formalin hay
fluosilicat natri, tuy nhiên hàm lượng những chất sát trùng phải trong giới hạn cho
phép, nếu vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng khơng tốt đến q trình lên men.
Trong dịch đường lên men ln chứa một lượng furfurol, melanoidin ít nhiều
ảnh hưởng tới nấm men.
Với nồng độ 0,002% thể tích dịch, furfurol ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng và
trạng thái sinh lý của dịch lên men khi chứa 4 đến 6 triệu tế bào trong 1 ml, nhưng
khi dịch lên men chứa 90 triệu tb/ml nồng độ furfurol 0,006% mới ảnh hưởng tới
sinh lý nấm men.


10

Caramelan không bị hấp thụ trên bề mặt nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ
làm nhiều tế bào chết [4,8].

1.1.3.4.

Các vi khuẩn có hại cho nấm men

Dịch đường lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men mà
còn cho các vi sinh vật khác. Các vi sinh vật nếu lẫn vào dịch đường, chúng sẽ biến
đường thành các sản phẩm khác và do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu. Trong
điều kiện lên men rượu, thường gặp nhất là các vi khuẩn sau đây:
Vi khuẩn latic: Đây là loại vi khuẩn yếm khí, có nhiệt độ tối ưu 37- 380C. Chúng
biến đường thành sản phẩm là axit lactic (chủ yếu), tạo một lượng đáng kể các chất
khác như alcol, axit axetic, cacbonic, diaxetyl, axetoin.
Vi khuẩn axetic: là vi khuẩn hiếu khí, khơng tạo bào tử, có nhiệt độ tối ưu
khoảng 20 - 350C. Chúng phát triển tốt trong canh trường có nồng độ alcol thấp,
oxy hóa alcol thành axit axetic. Vi khuẩn axetic thường phát triển trên bề mặt dịch
lên men để lâu ngày [4, 8].
1.1.4. Nguyên liệu chanh dây sử dụng lên men rượu
Tên khoa học: Passiflora edulis, Sims. thuộc họ Passifloraceae (họ Chùm Bao),
bộ Violales. Chi Passiflora hiện có 400 lồi, trong đó có khỏang 60 lồi cho trái ăn
được.
Tên thường gọi: Dây mát, Mát Mát, Chanh Dây/Chanh Sô-đa, trái MêLy.
Tiếng Anh: Passion fruit/ passion vine, purple granadilla.


11

Hình 1.6 Trái chanh dây [28].
• Đặc tính của chanh dây
Trái chanh dây chứa protein 1,2-2,4%, đường 5-8%, vitamin C 70 mg,
carotenoid (chủ yếu là beta-caroten), tinh dầu, muối khoáng, các acid amin như
leucin, valin, tyrosin, prolin, treonin, arginin, glycin, acid aspartic. Hạt có nhiều dầu

béo.
Thịt quả chanh dây chín có vị chua ngọt, màu vàng nhạt, thường được dùng dưới
dạng nước uống giải khát bằng cách bổ quả, lấy hết thịt bên trong, chà nhẹ rồi ép
lọc lấy dịch quả. Thêm đường trắng và nước sôi để nguội, khuấy đều để được một
cốc. Nước này có tác dụng bổ, mát, thanh nhiệt, tiêu khát, an thần, nhuận tràng, lợi
tiểu.
Có thể phối hợp với các loại quả khác như dứa, mãng cầu xiêm, sầu riêng... làm
thành nước sinh tố hỗn hợp cũng rất tốt. Ngoài ra, ngọn non chanh dây luộc ăn hoặc
lá nấu thành cao lỏng cũng có tác dụng an thần trị mất ngủ như cây lạc tiên thường
(Passiflora foetida L.) [27].


12

Bảng 1.2 Thành phần hoá học của chanh dây.
Thành phần

Đơn vị

dinh dưỡng

Trong

Thành phần

100g

dinh dưỡng

Đơn vị

Trong
100g

Khối lượng

(G)

100.00

Vitamin C

(mg)

20.00

Năng lượng

(kJ)

188.00

Vitamin E

(mg)

3.00

Năng lượng

(kcals)

44.91

B-Carotene Eq

(ug)

10.00

Protein

(g)

2.80

Total A Eq

(ug)

2.00

Hàm lượng béo

(g)

0.50

Sodium(Na)

(mg)

28.00

Potassium(Ka)

(mg)

350.00

tổng số
Carbohydrate

(g)

7.39

Magnesium(Mg)

(mg)

39.00

Nước

(g)

84.70

Calcium(Ca)

(mg)

16.00

Chất xơ

(g)

3.30

Phosphorus(P)

(mg)

54.00

Hàm lượng

(g)

7.39

Iron(Fe)

(mg)

1.10

Zinc (Zn)

(mg)

0.80

đường tổng
Thiamin

(mg)

0.03

Manganese(Mn)

(ug)

94.00

Riboflavin

(mg)

0.10

Copper (Cu)

(mg)

0.12

Niacin

(mg)

1.50

Glucose

(g)

2.90

Niacin từ

(mg)

0.40

Fructose

(g)

2.20

Sucrose

(g)

2.29

Tryptophan
Niacin Eq

(mg)

1.90
[28]