Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu hy thiêm Herba Siegesbeckia

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ac
y,
V

NU

KHOA Y DƢỢC

Ph

ar

m

LÝ THỊ HẢI YẾN

M

ed

ici

ne

an

d

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU

CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM
(Herba Siegesbeckiae)

Co

py

rig
ht

©

Sc

ho

ol

of

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ac
y,
V

NU

KHOA Y DƢỢC

m

LÝ THỊ HẢI YẾN

ici

ne

an

d

Ph

ar

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU
CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM
(Herba Siegesbeckiae)

M

Khóa: QH.2012.Y

ed

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

of

Ngƣời hƣớng dẫn:

ho

ol

ThS Nguyễn Thị Phƣơng
TS Nguyễn Thị Thanh Bình

Sc

1.
2.

Nơi thực hiện:

Co

py

rig
ht

©

Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn – Viện dƣợc liệu

Hà Nội – 2017

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN

NU

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn
Thị Phƣơng và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, chu
đáo, ln động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời

ac
y,
V

gian thực hiện khóa luận.

m

Em xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu cùng tập thể cán bộ
phịng Hố phân tích - tiêu chuẩn đã tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập tham gia
nghiên cứu học hỏi tại Viện.

Ph

ar

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập.

an

d

Trong suốt quá trình làm khóa luận và nghiên cứu tại Viện, em đã cố gắng nỗ
lực hết sức mình để hồn thành bản khóa luận này. Tuy nhiên, do kiến thức còn hạn

ne

hẹp và thời gian có hạn nên đề tài của em khơng tránh khỏi thiếu sót. Rất mong nhận
đƣợc sự góp ý của các thầy cơ để khóa luận của em đƣợc hồn thiện hơn.

Co

py

rig
ht

©

Sc

ho

ol

of

M

ed

ici

Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành
công trong công việc cũng nhƣ trong cuộc sống.

Hà Nội, tháng 06 năm 2017
Sinh Viên
Lý Thị Hải Yến


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................. 1

NU

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 2

ac
y,
V

1.1 Vị trí phân loại của cây hy thiêm .............................................................................. 2
1.2 Đặc điểm thực vật của cây hy thiêm ......................................................................... 2

1.2.1 Phân bố, sinh thái ................................................................................................... 3

ar

m

1.2.2 Thu hái và chế biến ................................................................................................ 3

Ph

1.3 Thành phần hóa học .................................................................................................. 4
1.3.1 Các diterpen ........................................................................................................... 4

an

d

1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen ..................................................................................... 4

ne

1.3.3 Các dẫn chất của geranylnerol ............................................................................... 6

ici

1.3.4 Các flavonoid ......................................................................................................... 6

ed

1.3.5 Các steroid .............................................................................................................. 7

M

1.3.6 Một số hợp chất khác ............................................................................................. 7

of

1.4 Tác dụng dƣợc lý. ...................................................................................................... 7

ol

1.4.1.1 Tác dụng chống viêm .......................................................................................... 7

ho

1.4.1.2 Tác dụng chống oxi hóa ...................................................................................... 7

Sc

1.4.1.3 Tác dụng ức chế miễn dịch ................................................................................. 8
1.4.1.4 Tác dụng chống dị ứng ........................................................................................ 8

rig
ht

©

1.4.1.5 Độc với tế bào u sắc tố ........................................................................................ 8
1.4.1.6 Tác dụng trên chuyển hóa lipid ........................................................................... 8

py

1.4.1.7 Tác dụng kháng khuẩn ........................................................................................ 8

Co

1.4.1.8 Tác dụng điều trị gout ......................................................................................... 9
1.4.1.9 Tác dụng khác ..................................................................................................... 9
1.5 Tính vị, cơng năng, cơng dụng .................................................................................. 9


1.5.1 Tính vị, cơng năng .................................................................................................. 9
1.5.2 Cơng dụng .............................................................................................................. 9

NU

1.6 Tổng quan về darutosid ........................................................................................... 10

ac
y,
V

1.6.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hố .................................................................. 10
1.6.2 Tác dụng của darutosid ........................................................................................ 11
1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm.......... 11

ar

m

1.7 Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao .................. 12

Ph

1.7.1 Vài nét về phƣơng pháp TLC áp dụng trong nghiên cứu định tính ..................... 12
1.7.2 Vài nét về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................... 13

an

d

1.7.2.1 Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC ................................................................. 13

ne

1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu năng cao ........................................................... 14
1.7.2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC ........................................................ 15

ed

ici

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17

M

2.1 Nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................... 17

of

2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu .......................................................................................... 17
2.2.1 Thiết bị ................................................................................................................. 17

ho

ol

2.2.2 Dụng cụ ................................................................................................................ 18

Sc

2.2.3 Hóa chất................................................................................................................ 18
2.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 18

©

2. 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu Hy thiêm ................................................... 18

rig
ht

2. 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm bằng TLC ......................................... 19

py

2. 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm bằng HPLC ............. 19

Co

2. 3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid bằng HPLC.................................. 19

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 19
2.4.1 Phƣơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử..................................................... 19


2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm............................................................. 19
2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm .............................. 19

NU

2.4.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc darutosid ............................................................ 21

ac
y,
V

2.4.4 Phƣơng pháp định tính dƣợc liệu hy thiêm bằng TLC ......................................... 21
2.4.5 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm bằng phƣơng
pháp HPLC ..................................................................................................................... 21

m

2.4.6 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid bằng HPLC................................... 22

Ph

ar

2.4.6.1 Tính chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................................ 22
2.4.6.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ................................ 22

an

d

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ......................................................................... 25
3.1 Chiết xuất và phân lập ............................................................................................. 25

ne

3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ Hy thiêm ................................................................. 25

ici

3.1.2 Phân lập ................................................................................................................ 26

ed

3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học của HT1 ..................................................................... 27

M

3.1.4 Xác định độ tinh khiết của darutosid ................................................................... 30

ol

of

3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính chất darutosid bằng phƣơng pháp sắc kí lớp
mỏng (TLC).................................................................................................................... 30

Sc

ho

3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng chất darutosid bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) .................................................................................................... 32

©

3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký ..................................................................................... 32

rig
ht

3.3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh .............................................................................................. 32
3.3.1.2 Chọn bƣớc sóng phân tích ................................................................................. 32

py

3.3.1.3 Khảo sát dung mơi pha động ............................................................................ 32

Co

3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu. .............................................................................. 34
3.4 Thẩm định phƣơng pháp ......................................................................................... 37
3.4.1 Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................. 37


3.4.2 Tính chọn lọc ........................................................................................................ 39
3.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). ................... 39

NU

3.4.4 Xây dựng đƣờng chuẩn và xác định khoảng tuyến tính. ...................................... 40

ac
y,
V

3.4.5 Thẩm định độ lặp lại............................................................................................. 41
3.4.7 Thẩm định độ thu hồi. .......................................................................................... 43
3.5 Bàn luận................................................................................................................... 44

ar

m

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 46

Ph

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................

Co

py

rig
ht

©

Sc

ho

ol

of

M

ed

ici

ne

an

d

PHỤ LỤC...........................................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Butanol

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

DMC

Dichloromethane

EtOAC

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

Hex

Hexan

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquyd Chromatography)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation)

M

Khối lƣợng phân tử ( MaSKĐ)

MS

Phổ khối (MaSKĐ Spectroscopy)

NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition)

ac
y,
V
m
ar
Ph

d
an

ne

ici

ed

M

of

ol

ho

Sc

©

rig
ht

Hệ số lƣu
Sắc ký lớp mỏng

TLC

Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV

Phổ tử ngoại (Ultra violet)

Co

SKLM

py

Rf

NU

But


DANH MỤC BẢNG

NU

Trang
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất HT1 và darutosid

ac
y,
V

theo tài liệu tham khảo.

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chƣơng trình gradient

ar

m

Bảng 3.3: Các thơng số khảo sát chƣơng trình gradient

Ph

Bảng 3.4: Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu

d

Bảng 3.5: Khảo sát thời gian chiết mẫu

an

Bảng 3.6: Khảo sát số lần chiết mẫu

33
34
35
36
37
38

Bảng 3.8: Kết quả xác định LOD và LOQ

40

ed

ici

ne

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống

M

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

40
42

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

43

ho

ol

of

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

Co

py

rig
ht

©

Sc

Bảng 3.12: Hàm lƣợng darutosid trong 3 mẫu dƣợc liệu hy thiêm

44


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

ac
y,
V

Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae)

NU

Trang
2

Hình 1.2: Một số ent- pimaran và ent- kauran phân lập từ S. orientalis

4

Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquyterpen lacton

5

ar

m

nhóm germancranlid phân lập từ S. orientalis

6

Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo của một số dẫn chất geranylnerol

6

an

d

Ph

Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquyterpen lacton
nhóm melampolid

ne

Hình 1.6: Công thức cấu tạo 2 flavonoid phân lập từ S. orientalis

ici

Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo của darutosid

ed

Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm

M

Hình 3.1: Sắc ký đồ darutosid phân lập đƣợc

of

Hình 3.2: Sắc ký đồ của 4 hệ dung mơi

ol

Hình 3.3 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient

7
10
17
30
31
34
38

Hình 3.4: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thêm chuẩn

39

Hình 3.5: Đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy tuyến tính của
darutosid

41

rig
ht

©

Sc

ho

Hình 3.3: Khảo sát tính phù hợp của hệ thống

25

Sơ đồ 3.2: Tóm tắt quy trình phân lập darutosid trong cao ethyl acetat từ

27

py

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao hy thiêm

Co

dƣợc liệu hy thiêm


ĐẶT VẤN ĐỀ

ac
y,
V

NU

Hy thiêm có tên khoa học là Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ cúc
(Asteraceae). Cây cịn có tên gọi khác là cỏ đĩ, chó đẻ hoa vàng. Lồi cây của châu Á
và châu Đại Dƣơng. Ở nƣớc ta, hy thiêm mọc hoang nhiều ở nhiều tỉnh phía Bắc từ
Cao Bằng tới Nghệ An và các tỉnh Tây Nguyên. Ngƣời ta thƣờng sử dụng phần trên
mặt đất cây hy thiêm phơi khô hoặc sấy khô để làm dƣơc liệu. Theo y học cổ truyền,

m

hy thiêm có vị cay, đắng; tính mát; có tác dụng bổ huyết, hoạt huyết, trừ thấp, giảm
đau, lợi gân xƣơng… [5]. Cây đƣợc dùng để dùng trị phong thấp, tê bại nửa ngƣời, đau

ar

nhức xƣơng khớp, kinh nguyệt không đều, mụn nhọt lở ngứa, rắn căn, ong đốt [5].

Ph

Trong y học Trung Quốc, hy thiêm đƣợc dùng phối hợp với các cây thuốc khác để điều
trị ung thƣ và chảy máu não kèm theo chứng liệt. Ở Ấn Độ, hy thiêm đƣợc coi là có tác

an

d

dụng chữa các vết hoại thƣ và đau nhức [8].

ed

ici

ne

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hy thiêm (Siegesbeckia orientalis)
cho thấy lồi này có các nhóm chất nhƣ: diterpen (darugetinol, darutosid, ent-12α,16epoxy-2β,15α,19 trihydroxypimar-8-ene…), các dẫn chất nhóm sesquyterpen lacton
nhóm germacranolid nhƣ (orientin, orientalid…), nhóm melampolid; các flavonoid
(nhƣ 3,7-dimethylquercetin, rutin); các steroid (β -sitosterol, stigmasterol…); dẫn chất

M

của geranyl nerol; thymohydroquynon dimethyl ether; acid cafeic… [5]

Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm.

rig
ht

-

©

Sc

ho

ol

of

Hiện nay, ở nƣớc ta hy thiêm đã và đang đƣợc sử dụng rất nhiều để làm thuốc
trong y học cổ truyền. Vị thuốc hy thiêm đã đƣợc đƣa vào DĐVN IV, tuy nhiên chƣa
có chỉ tiêu định tính, định lƣợng hợp chất trong cây và phần định tính chƣa có chất đối
chiếu. Do vậy, để nâng cao giá trị sử dụng và nâng cấp tiêu chuẩn dƣợc liệu hy thiêm,
đề tài “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu hy thiêm (Herba Siegesbeckia)” đã
đƣợc thực hiện với các mục tiêu:

Co

py

- Định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm bằng phƣơng pháp sắc ký
lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

NU

1.1 Vị trí phân loại của cây hy thiêm
Siegesbeckia orientalis L. có vị trí phân loại nhƣ sau trong giới thực vật [9]:

ac
y,
V

Nghành Ngọc lan (Manoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliosida)

Bộ Cúc (Asteraceae)

m

Phân Lớp Cúc (Asteridae)

Ph

ar

Họ Cúc (Asteraceae)
Chi Siegesbeckia

ne

an

d

1.2 Đặc điểm thực vật của cây hy thiêm

Cây hy thiêm có tên khoa học là Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ Cúc
(Asteraceae) (Hình 1.1) [1-3].

Co

py

rig
ht

©

Sc

ho

ol

of

M

ed

ici

Tên khác: Cỏ đĩ, chó đẻ hoa vàng [1-3].

Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae)

2


chia 2 thùy ở phía cuống, 3 gân chính mảnh, mặt dƣới có lơng [8].

NU

Cây thảo, sống hằng năm, cao 30 – 90 cm, phân nhiều cành nằm ngang, có
lơng. Lá mọc đối, hình tam giác hay hình quả trám, dài 4 – 10 cm, rộng 3 – 6 cm,
cuống ngắn, phiến lá men theo cuống, đầu nhọn, mép có răng cƣa khơng đều và đơi khi

ac
y,
V

Cụm hoa có cuống dài 1 – 2 cm, mảnh, có lơng, là một đầu có đƣờng kính 6 – 7
cm; 5 lá bắc ngồi to, hình thìa, có lơng dính, lá bắc trong hình trái xoan ngƣợc, đầu
cụt, hoa màu vàng; 5 cái ngồi là hoa cái hình lƣỡi, những hoa khác lƣỡng tính, hình

ar

m

ống, khơng có mào lơng; tràng có lƣỡi ngắn, chia 3 thùy, ống có lơng, nhị 5, có tàu
nhọn rất ngắn [8].

Ph

Quả bế, hình trứng, có 4 – 5 cạnh, trịn ở đỉnh, gốc thn dần, nhẵn, màu đen

d

[5].

an

Mùa ra hoa: tháng 4 – 5 đến tháng 8 – 9, mùa quả: tháng 6 – 10 [5].

ne

1.2.1 Phân bố, sinh thái

ici

Chi Siegesbeckia L. hiện có 2 lồi ở Việt Nam là hy thiêm và hy thiêm núi [8].

ol

of

M

ed

Hy thiêm phân bố ở vùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới: Trung Quốc,
Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Indonesia, Philippines, Australia. Ở Việt Nam, cây phân bố
chủ yếu ở vùng núi và trung du phía Bắc nhƣ Hà Giang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai,
Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Ngun, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hịa Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An [8].

Sc

ho

Cây ƣa sáng và ƣa ẩm, thƣờng mọc tập trung trên đất ẩm ở các bãi sông, ruộng
hoang, ruộng trồng ngô và ven đƣờng đi. Hằng năm cây con mọc từ hạt vào tháng 4 –

©

5. Cây sinh trƣởng nhanh và ra hoa ngay cuối mùa hè hoặc đầu mùa thu, sau lụi tàn vào
đầu mùa đông. Vỏ quả có lơng dính, dễ dàng phát tán nhờ con ngƣời và động vật [8].

rig
ht

1.2.2 Thu hái và chế biến

Co

py

Phần trên mặt đất của cây đƣợc thu hái vào tháng 4 – 6 lúc cây sắp ra hoa hoặc
mới có ít hoa. Cắt cây có nhiều lá, loại bỏ lá sâu, lấy phần ngọn dài khoảng 30 – 50 cm
đem phơi hay sấy khơ [3,5]. Dƣợc liệu cịn ngun lá khô không mọt, không vụn nát là
tốt [8].

3


1.3 Thành phần hóa học

1.3.1 Các diterpen

NU

Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây hy thiêm cho biết thành phần

©

Sc

ho

ol

of

M

ed

ici

ne

an

d

Ph

ar

m

ac
y,
V

hóa học chính của Siegesbeckia orientalis L. là các diterpen có cấu trúc ent-pimaran và
ent-kauran [5].

rig
ht

Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo một số ent- pimaran và ent- kauran phân lập từ S.
orientalis

py

1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen

Co

Hy thiêm cịn có các dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm germancranlid và nhóm
melampolid [5].

4


Dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm germancranlid

Năm 1991, C. Zdero cùng các cộng sự đã phân lập đƣợc 4 dẫn chất
sesquiterpen lacton nhóm germancranlid từ S. orientalis. Đến năm 2015, nhóm các
nhà khoa học Trung Quốc đã tách thêm đƣợc 10 dẫn chất cùng nhóm [19,24].

M

ed

ici

ne

an

d

Ph

ar

m

ac
y,
V

NU

1.4.1

ol

of

Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm
germancranlid phân lập từ S. orientalis
Dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm melampolid
4 dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm melampolid đƣợc phân lập bởi C. Zdero
cùng các cộng sự vào năm 1991 [27].

Co

py

rig
ht

©

Sc

ho

1.4.2

5


NU
ac

y,
V
m

Ph

melampolid

ar

Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm
1.3.3 Các dẫn chất của geranylnerol

rig
ht

©

Sc

ho

ol

of

M

ed

ici

ne

an

d

Một số dẫn chất của geranylnerol đƣợc tách ra từ cây hy thiêm [27].

Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo của một số dẫn chất geranylnerol

py

1.3.4 Các flavonoid

Co

Hai hợp chất flavonoid đƣợc phân lập từ S.orientalis đó là 3,7dimethylquercetin và rutin [5]

6


NU
ac
y,
V

Hình 1.6: Cơng thức cấu tạo của 2 flavonoid phân lập từ S. orientalis

m

1.3.5 Các steroid

ici

ne

an

d

Ph

ar

Các steroid đƣợc phân lập từ cây S. orientalis là β-sitoterol, stigmasterol,
stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranosid [5].

Stigmasterol 3-O-β-Dglucopyranosid

M

1.3.6 Một số hợp chất khác

ed

Stigmasterol

ol

of

Thymohydroquynon dimethyl ether, acid cafeic… cũng đƣợc tìm thấy ở cây hy
thiêm [5].

ho

1.4 Tác dụng dƣợc lý.

Tác dụng chống viêm

Sc

1.4.1

©

Trên chuột cống trắng cho thấy cao lá hy thiêm có tác dụng ức chế khá mạnh
viêm cấp tính trên mơ hình gân phù bàn chân chuột và ức chế viêm mạn tính, gây teo

py

rig
ht

tuyến ức chuột cống non. Ngoại ra còn giảm tỷ lệ γ- globulin trong trong huyết thanh
khi phối hợp trong bài thuốc gồm hy ,thiêm, mộc qua, thiên niên kiện và ngƣu tất
[3,15].

Co

1.4.2

Tác dụng chống oxi hóa

Dịch chiết methanol và ethyl acetat của hy thiêm có tác dụng chống oxi hóa (đặc

biệt là dịch chiết methanol) [23]. Hy thiêm chống oxi hoá trên gốc tự do OH● và O2-● .

7


Trên anion O2-●, dịch chiết nƣớc có tác dụng mạnh, cịn trên OH● phân đoạn butanol có
hiệu quả cao. Đặc biệt, khi nghiên cứu sâu về cơ chế chống oxi hố trên O2-●, có tác giả

NU

cịn thấy, phân đoạn butanol chống oxi hố mạnh trên dịch treo mơ não đồng thể và
màng hồng cầu [15].

ac
y,
V

Ngoài ra, Boyle SP cùng các cộng sự (2000) và Uma Devi P (2006) đã chứng
minh đƣợc trong cây hy thiêm có chứa orientin, rutin… có tác dụng chống oxi hóa của
bởi cơ chế các làm sạch các gốc tự do nhƣ superpoxid hoặc tạo ra chelat với kim loại
Tác dụng ức chế miễn dịch

ar

1.4.3

m

màu… [22,23].

d

Ph

Dịch chiết ethanol hy thiêm làm giảm nồng độ IgG, IgG1, IgG2b và làm ức chế
miễn dịch khi tiến hành thực nghiệm ở in vivo và in vitro trên chuột nhắt trắng với liều
Tác dụng chống dị ứng

ne

1.4.4

an

thử nghiệm 0,25; 0,5 mg và 1,0 mg/ngày trong vòng 28 ngày [25].

ed

ici

Nhờ ức chế sản xuất IgE từ lympho B mà dịch chiết hy thiêm có tác dụng chống
dị ứng. Hơn nữa hy thiêm có hoạt tính kháng histamin và kháng acetylcholine thể hiện

ở tác dụng làm giảm biên độ co thắt cơ trơn ở ruột cô lập gây bởi histamin và
Độc với tế bào u sắc tố

of

1.4.5

M

acetycholin [12].

Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Sc

1.4.6

ho

ol

Kirenol và pubetalin đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat thể hiện độc tính
rất mạnh đối với dịng tế bào u sắc tố B16 ở chuột [27].

©

Nghiên cứu trên chuột thí nghiệm cho thấy hy thiêm làm tăng lipid máu. Điều
này đƣợc thể hiện bằng việc gây giảm ở cả 3 chỉ số: cholesterol máu, tỷ số β/α

py

rig
ht

lipoprotein máu và mức lipid tồn phần trong máu động vật thí nghiệm [8]. Thành
phần rutin trong hy thiêm đƣơc chứng minh là có tác dụng trên chuyển hóa lipid ở
chuột béo phì [20].

Co

1.4.7

Tác dụng kháng khuẩn

Rutin trong hy thiêm có hoạt tính kháng khuẩn (trên chủng vi khuẩn gram
dƣơng) và kháng nấm (nhƣng khơng có tác dụng trên nấm Candida albicans) [6].

8


Tác dụng điều trị gout

1.4.8

ac
y,
V

NU

Cao toàn phần hy thiêm với liều 600 mg/kg/ngày, liên tục trong 5 ngày có tác
dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm trên mơ
hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, tỷ lệ giảm so với lô gây tăng là 30,0% [9].
Trong số các cao phân đoạn chiết xuất từ cao toàn phần hy thiêm, phân đoạn n-

m

butanol thể hiện tác dụng hạ acid uric huyết thanh ƣu thế nhất trên mơ hình gây tăng
acid uric cấp ở cả chuột nhắt trắng và chuột cống trắng cũng nhƣ khả năng ức chế
xanthin oxidase in vitro [9].

ar

Phân đoạn n- butanol hy thiêm với liều 120 mg/kg/ngày uống liên tục trong 5

Tác dụng khác

an

1.4.9

d

Ph

tuần có khả năng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng trên mô hình
gây tăng acid uric mạn tính, tỷ lệ giảm so với lơ chứng bệnh là 27,4% [9].

ne

Ngồi các tác dụng trên, dịch chiết phân đoạn ethyl acetat và n-butanol cây hy
thiêm đƣợc chứng mình cịn có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ cổ tử cung

ed

ici

hela in vitro [18]. Rutin có thể làm giãn mạch, hạ áp, hạ đƣờng huyết [20].

of

1.5.1 Tính vị, cơng năng

M

1.5 Tính vị, cơng năng, cơng dụng

ho

ol

Hy thiêm có vị cay đắng, tính mát, quy vào 2 kinh can và thận, có tác dụng khử
phong, trừ thấp, hoạt huyết, chỉ thống, lợi gân cốt [8].
1.5.2 Cơng dụng

©

Sc

Hy thiêm đƣợc dùng để điểu trị phong thấp, nhức xƣơng, yếu chân, bán thân bất

toại, gân cốt nhực lạnh, lƣng gối tê dại [5], khớp sƣng nóng đỏ và đau nhức, đau lƣng,
mỏi gối. mụn nhọt lở ngứa, kinh nguyệt không đều. Ngày dùng 8 – 16 g, dạng thuốc

py

rig
ht

sắc, cao mềm hoặc hoàn tán. Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác nhƣ gối
hạc, cỏ xƣớc, củ cốt khí. Cịn dùng giã đắp tại chỗ chữa nhọt độc, ong đốt, rắn cắn. cây
có tác dụng phụ gây nơn nếu dùng tƣơi, uống nhiều [8].

Co

Trong y học Trung Quốc, hy thiêm dùng phối hợp với cây thuốc khác để điều trị
ung thƣ và chảy máu não kèm theo chứng liệt. Dùng toàn cây dƣới dạng nƣớc sắc, liều
một lần là 10 g. Ở Ấn Độ, hy thiêm đƣợc coi là có tác dụng chữa các vết loét hoại tử và

9


NU

các chứng đau nhức. Nƣớc ép cây tƣơi đắp lên vết thƣơng, khi khơ tạo thành một lớp
phủ ngồi giống nhƣ véc ni. Cồn thuốc hy thiêm đƣợc dùng ngoài cùng với glycerin để
chữa bệnh herpes loang vòng và một số bệnh nhiễm ký sinh trùng. Hy thiêm đƣợc dùng

ac
y,
V

để chữa thấp khớp và cơn đau thận. Nó đƣợc coi là có tác dụng trợ tim, làm ra mồ hơi,
chống scorbut và tăng tiết nƣớc bọt. Còn đƣợc dùng làm thuốc trị giun sán. Cao nƣớc
hy thiêm có tác dụng độc đối với một số loại gián [8].

m

Ở Madagasca, hy thiêm đƣợc dùng với tác dụng gây liền sẹo ở bên ngoài và bên
trong cơ thể (đối với loét ống tiêu hóa) [8].

ar

Ở Nepal, dịch ép rễ để trị vết thƣơng [8].

d

Ph

Ở Nigeria, cao tồn cây có tác dụng kháng khuẩn trị tổn thƣơng da, bệnh phong,
giang mai, bệnh hoa liễu và nấm da, làm thuốc tẩy và chống nôn [8].

an

1.6 Tổng quan về darutosid

ho

ol

of

M

ed

ici

ne

1.6.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hố

Sc

Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo của darutosid

rig
ht

©

- Tên
IUPAC:
2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(2R,4aS,4bR,7S,10aS)-7-[(1R)-1,2dihydroxyethyl]-1,1,4a,7-tetramethyl-3,4,4b,5,6,9,10,10a-octahydro-2H-phenanthren- 2yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
Cơng thức phân tử của của darutosid: C26H44O8

-

Khối lƣợng phân tử: M= 484.62

-

Trạng thái vật lý: Bột màu trắng

-

Tan trong MeOH

Co

py

-

10


1.6.2 Tác dụng của darutosid

ac
y,
V

NU

Hy thiêm chứa hàm lƣợng lớn darutosid. Tại các hịn đảo Reunion và Mauritius,
nó đƣợc biết đến bởi đặc tính chữa bệnh lành vết thƣơng bên ngoài nhanh và làm dịu
viêm [22].
Darutosid là một diterpenoid đƣợc phân lập từ Siegesbeckia orientalis, đƣợc

m

chứng minh là có đặc tính chống viêm trong thí nghiệm in vivo (ức chế đƣờng
lipoxygenase trong tổng hợp prostaglandin, ức chế collage-nase, chống lại chứng phát
ban do tia cực tím) [22].

ar

Ngồi ra, darutosid cịn có tác dụng phục hồi vết thƣơng và tái tạo mô bằng cách

ne

an

d

Ph

sinh tổng hợp collagen. Đối với da bị rạn (tổn thƣơng bề mặt da do sự giãn nở bất
thƣờng của lớp hạ bì trong thời gian mang thai hoặc thay đổi cân nặng, làm cho chất
elastin trong các mơ liên kết có thể giảm hoặc mất) thì darutosid có khả năng tái cấu
trúc các vết rạn, tăng sinh collagen, giúp hồi phục da [22].
Một thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu quả chống căng da của một loại kem chứa

ed

ici

1.0 % darutosid trên 14 tình nguyện viên nữ (21- 42 tuổi) có vết rạn trên bụng, đùi,
hơng, ngực… Kết quả cho thấy nếu sử dụng kem mỗi ngày hai lần trong bốn tuần liên

M

tiếp thì 7 trong số 14 tình nguyện viên nhận thấy vết rạn đƣợc làm đầy, kích thƣớc thu
nhỏ dần đồng thời độ nhạy cảm giảm, cải thiện độ đàn hồi của da [22].

ho

ol

of

1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm
HPLC
1.6.3.1 Định tính

Sc

Hiện nay, chƣa có dƣợc điển nào quy định chuyên luận định tính darutosid trong
dƣợc liệu hy thiêm.

©

1.6.3.2 Định lƣợng

Co

py

rig
ht

Trên thế giới chƣa có dƣợc điển nào quy định chuyên luận định lƣợng darutosid
trong dƣợc liệu hy thiêm. Một số cơng trình nghiên cứu định lƣợng darutosid từ loài
này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp [16]:
-

Detector UV ở bƣớc sóng 210 nm, cột (4,6 x 250 mm), cỡ hạt 5 µm.

-

Tốc độ dịng: 1.0 mL/phút.
Pha động: nƣớc - acetonitril (1 : 9 v/v)

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10,0000 mg darutosid, hồ tan trong 10
mL methanol để thu đƣợc dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/mL, sau đó tiến hành pha
11


lỗng để đƣợc các dung dịch có nồng độ từ 1-20 µg/mL.

ac
y,
V

NU

- Dung dịch thử: Cân 10 mg cao khơ chiết từ methanol thơ, thêm 10mL
methanol sau đó ly tâm trong vịng 20 phút. Lấy phần dịch vào bình định mức 10 mL.
Lặp lại quy trình này 4 lần, kết hợp dịch lọc. Cuối cùng thu đƣợc dung dịch có nồng độ
1 mg/mL

1.7 Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

ar

m

1.7.1 Vài nét về phƣơng pháp TLC áp dụng trong nghiên cứu định tính
Ngun tắc:

Ph

-

ne

an

d

Q trình tách bằng TLC đƣợc thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thƣớc
đồng nhất đƣợc kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhơm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng
kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố,
hấp thụ, trao đổi ion... Pha động là những hệ dung môi tƣơng tự phƣơng pháp HPLC.

Rf =

of

M

ed

ici

Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất là hệ số lưu giữ Rf. Trị số
của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách
dịch chuyển của pha động:

ol

Trong đó:

ho

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).

Sc

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động ( đo trên cùng
đƣờng đi của vết, tính bằng cm).

©

Rf: Có giá trị giao động từ 0-1.
Pha tĩnh của TLC

rig
ht

-

Co

py

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thƣớc 10-30 µm đƣợc trải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vng. Pha tĩnh thơng
dụng nhất hay dùng là silica gel, ngồi ra cũng có thể sử dụng nhơm oxyd, cellulose,
polyamid hay các loại silica gel pha đảo.
-

Pha động:

Pha động của TLC phụ thuộc vào cơ chế sắc ký, để tăng cƣờng sức rửa giải thƣờng
kết hợp 2 hoặc nhiều dung môi với nhau. Nguyên lý chi tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2
12


pha. Dƣới đây là 1 số gợi ý chung nhất cho dung mơi pha động:

NU

 Dung mơi cần có độ tinh khiết cao.

ac
y,
V

 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2

– 0,8 đạt độ phân giải cực trị.
 Chất phân tích dạng ion hay phân cực đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân
cực nhƣ hỗn hợp n-butanol – nƣớc. Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào nƣớc sẽ làm

m

tăng độ tan của base hoặc acid tƣơng ứng.

ar

 Khi dùng silica gel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của

an

d

Ph

pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng. Nếu
thêm một ít dung mơi ít phân cực nhƣ ether ethylic vào dung môi không phân cực nhƣ
methylebnzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf .
Đánh giá kết quả.

-

ne

 Vết chất cần phân tích trên bản mỏng khi soi đèn UV hoặc phun thuốc thử

ici

hiện màu phải đƣợc nhìn thấy rõ, tách rời với các vết tạp.

ed

 Trị số Rf phải nằm trong khoảng 0,2-0,8.

M

 So sánh trị số Rf của chất chuẩn với các chất trên mẫu phân tích.

of

1.7.2 Vài nét về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC
HPLC là một kỹ thuật phân tích trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di
chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến
ái lực tƣơng đối của chất này đối với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi

©

Sc

ho

ol

1.7.2.1

rig
ht

cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi
detector.

Co

py

Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và rây phân tử
(loại cỡ). Trong phạm vi khóa luận này, tơi xin trình bày cụ thể về kỹ thuật sắc ký phân bố.
1.7.2.2
Điều kiện sắc ký phân bố hiệu năng cao
- Pha tĩnh:
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm nhiều
thành phần. Đó là chất rắn xốp, có kích thƣớc nhỏ, đƣờng kính 3 – 10 µm, có độ phân cực
khác nhau. Pha tĩnh đƣợc cấu tạo từ các nhóm chức khác nhau ghép hóa học trên giá mang,
13


thƣờng là các hạt silica. Tùy theo bản chất pha tĩnh, ngƣời ta phân ra hai loại:

NU

 Sắc kí pha thuận: Pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực nhƣ triethylen
glycol; pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, toluen, isopropyl ether.

ac
y,

V

Trong sắc kí pha thuận, chất ít phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực
của pha động, thời gian lƣu giảm dần.

m

 Sắc kí pha đảo: pha tĩnh là các silica gel đã đƣợc alkyl hóa, ít phân cực.
Trong sắc ký pha đảo, các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực

ar

của pha động thời gian lƣu tăng lên.
Pha động trong HPLC:

Ph

-

Detector trong HPLC

ed

-

ici

ne

an

d

Pha động là dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc kí. Pha động có
thể là dung mơi hữu cơ, hoặc hỗn hợp dung mơi theo tỷ lệ nhất định. Trong sắc kí pha
thuận, pha động là các dung mơi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, benzen, chloroform…
Trong sắc kí pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực nhƣ: methanol,
acetonitril… hay hỗn hợp của chúng.

©

Sc

ho

ol

of

M

Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi đƣợc tách riêng và rửa giải
ra khỏi cột sắc kí. Một chất khi đi qua detector sẽcho tín hiệu đáp ứng khác biệt với nền
pha động, qua đó cho phép đánh giá, định tính, định lƣợng các thành phần trong mẫu phân
tích. Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của đối tƣợng chất cần phân tích, detector sẽ đƣợc lựa
chọn thích hợp để những chất này có đáp ứng với detector. Các loại detector thƣờng đƣợc
sử dụng trong HPLC bao gồm: detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS), detector hiện đại
thuộc loại này là detector mảng diod (DAD); detector huỳnh quang; detector độ dẫn,
detector khối phổ.
Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC

Nguyên tắc của các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC là nồng độ của chất tỷ lệ
với chiều cao và diện tích píc của chất đó thể hiện trên sắc ký đồ.

rig
ht

1.7.2.3

py

Có 4 phƣơng pháp định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký:
Phƣơng pháp chuẩn ngoại.

-

Phƣơng pháp chuẩn nội.

-

Phƣơng pháp thêm chuẩn.

-

Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.

Co
-

14

Khóa luận đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp chuẩn ngoại.
Phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả mẫu

NU

chuẩn và mẫu thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc
chiều cao) píc của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) píc của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc

ac
y,
V

nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử.

Có 2 phƣơng pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm.

m

Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử.

-

Ph

ar

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:
CX = CS

an

CS là nồng độ mẫu chuẩn

d

Trong đó: CX là nồng độ mẫu thử

ne

SX là diện tích của píc mẫu thử

ici

SKĐ là diện tích của píc mẫu chuẩn

ed

Chuẩn hóa nhiều điểm: cần tiến hành qua những bƣớc sau:

-

of

M

 Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp
ứng thu đƣợc là các diện tích (hoặc chiều cao) của píc ở mỗi điểm chuẩn.

ho

ol

 Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích píc (hoặc chiều cao) với
nồng độ của chất chuẩn.

Sc

 Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính tốn nồng độ của chất thử.

©

Có thể tính tốn dựa theo 2 cách:

rig
ht

- Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) píc của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ suy ra
đƣợc nồng độ của nó.

Co

py

- Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mơ tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều
cao) của píc với nồng độ của chất cần xác định.
Y = a + bCX
Trong đó: Y là diện tich píc
a là giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung
b là độ dốc của đƣờng chuẩn

15