Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và bảo quản hạt nhân tạo in vitro cây lan gấm (anoectochilus lylei rolfe ex downie)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

CHẾ VĂN DŨNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ
BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM
(Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

CHẾ VĂN DŨNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ
BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM
(Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành:

Công nghệ Sinh học

Mã ngành:

8420201

Mã học viên

58CH258

Quyết định giao đề tài:

321/QĐ-ĐHNT ngày 27/3/2018

Quyết định thành lập hội đồng:

1140/QĐ-ĐHNT ngày 10/9/2019

Ngày bảo vệ:

27/9/2019

Người hướng dẫn khoa học:
TS. PHAN XUÂN HUYÊN
TS. PHẠM THI MINH THU
Chủ tịch Hội Đồng:
PGS. TS. NGUYỄN VĂN DUY
Phịng Đào tạo Sau Đại học:

KHÁNH HỊA - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng mọi kết quả của luận văn: “Nghiên cứu khả năng tái
sinh chồi và bảo quản hạt nhân tạo in vitro cây lan gấm (Anoectochilus lylei
Rolfe ex Downie)” là cơng trình nghiên cứu của bản thân tơi tại Phịng Cơng nghệ

thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, dưới sự hướng dẫn của TS. Phan
Xuân Huyên và TS. Phạm Thị Minh Thu, và chưa từng được cơng bố trong bất cứ
cơng trình khoa học nào khác cho đến thời điểm này.
Đà Lạt, tháng 10 năm 2019
Tác giả

Chế Văn Dũng

iii


LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học
Nha Trang; Khoa sau Đại học – Trường Đại học Nha Trang; Lãnh đạo và Giảng viên
của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang đã quan
tâm giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu thực nghiệm và tạo mọi điều kiện
cho tôi được hồn thành khóa học này và rất tự hào được học thạc sỹ ngành Công
nghệ Sinh học tại Đại học Nha Trang.
Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học
Tây Ngun; Phịng Cơng nghệ thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
đã tạo mọi điều kiện cho tôi được nghiên cứu thực nghiệm tại phịng thí nghiệm ni
cấy mơ thực vật để hoàn thành kết quả của luận văn; đặc biệt cho tơi xin trân trọng
bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Phan Xuân Huyên và TS. Phạm Thị Minh Thu đã
tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện đề cương, thực hiện các
nội dung thực nghiệm để hoàn thành bản luận văn.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời trân trọng cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm đề tài cấp
tỉnh, với tên đề tài: “Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống Lan gấm
(Anoectochilus spp.) trên địa bàn tỉnh Đắk Lắk” đã tạo mọi điều kiện về kinh phí, hóa
chất và các thiết bị khác liên quan đến quá trình nghiên cứu thực nghiệm tại Viện
Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên giúp tôi hồn thành luận văn.

Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất cả bạn bè, động
nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Đà Lạt, tháng 10 năm 2019
Tác giả

Chế Văn Dũng

iv


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ iii
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. iv
MỤC LỤC .....................................................................................................................v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH..................................................................................................... ix
TRÍCH YẾU CỦA LUẬN VĂN ...................................................................................x
LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................3
1.1. Giới thiệu về hạt nhân tạo.......................................................................................3
1.1.1. Tổng quan về hạt nhân tạo...................................................................................3
1.1.2. Sự nảy mầm của hạt nhân tạo ..............................................................................5
1.1.3. Ứng dụng của hạt nhân tạo ..................................................................................6
1.1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của hạt nhân tạo ..............................9
1.2. Giới thiệu về cây lan gấm .....................................................................................14
1.2.1. Vị trí phân loại ...................................................................................................14
1.2.2. Nguồn gốc và phân bố .......................................................................................14
1.2.3. Đặc điểm hình thái.............................................................................................15

1.2.4. Đặc điểm sinh thái .............................................................................................16
1.3. Cơng dụng trong y dược của cây lan gấm ............................................................16
1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây lan gấm trên thế giới ................................19
1.5. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây lan gấm trong nước ..................................21
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................22
2.1. Vật liệu..................................................................................................................22

v


2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................22
2.2.1. Môi trường thực hiện thí nghiệm.......................................................................22
2.2.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm ....................................................................25
2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu cần nghiên cứu...........................................32
2.3. Xử lý số liệu..........................................................................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................34
3.1. Ảnh hưởng của giá thể đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo...............................34
3.2. Ảnh hưởng của môi trường rắn có bổ sung các chất điều hồ sinh trưởng thực vật
đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo ...........................................................................36
3.2.1. Ảnh hưởng của Benzyl Adenin .........................................................................36
3.2.2. Ảnh hưởng của Kinetin......................................................................................39
3.2.3. Ảnh hưởng của Thidiazuron ..............................................................................42
3.3. Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo ...............44
3.4. Ảnh hưởng của môi trường đến sự bảo quản hạt nhân tạo trong điều kiện tối, 40C .... 47
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................51
4.1. Kết luận.................................................................................................................51
4.2. Kiến nghị...............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................52

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABA

: Abscisic acid

BA

: 6-Benzyl Adenin

BAP/BA

: Benzyl adenine purin

CCC

: Cycocel

IAA

: Indole-3-acetic acid

IBA

: Indole-3-butyric acid

ISSP

: Inter simple sequence repeat

½ MS

: Mơi trường MS mà các thành phần giảm đi một nửa

MS

: Môi trường Murashige và Skoog, 1962

NAA

: Acid α-naphtaleneacetic

PLB

: Protocorm-like-body

RADP

: Random amplified DNA polymorphism

TDZ

: Thidiazuron

tRNA

: Transport RNA (ARN vận chuyển)

vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Số liệu pha chế môi trường nuôi cấy...........................................................23
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của giá thể đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo. ....................27
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của Benzyl Adenin đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo........28
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo....................29
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của Thidiazuron đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo. ...........30
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo......31
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của môi trường đến sự bảo quản hạt nhân tạo. ........................32
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của giá thể đến sự tái sinh chồi ................................................34
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của Benzyl Adenin đến sự tái sinh chồi...................................36
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tái sinh chồi ...............................................39
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Thidiazuron đến sự tái sinh chồi .......................................42
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến sự tái sinh chồi .................................45
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường đến sự bảo quản hạt nhân tạo. ........................47

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc một hạt nhân tạo điển hình............................................................. 4
Hình 1.2. Cơ chế quá trình tự vỡ của hạt nhân tạo ....................................................... 6
Hình 1.3. Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie ......................................................... 14
Hình 2.1. Tạo vật liệu hạt nhân tạo đốt thân cây lan gấm .......................................... 22
Hình 2.2. Hạt nhân tạo mang chồi ngủ đốt thân cây lan gấm hồn chỉnh .................. 25
Hình 3.1. Ảnh hưởng của giá thể đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo........................... 35
Hình 3.2. Ảnh hưởng của Benzyl Adenin đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo............ 39
Hình 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo.............................. 42
Hình 3.4. Ảnh hưởng của Thidiazuron lên sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo ................. 44

Hình 3.5. Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến sự tái sinh chồi của hạt nhân tạo ..... 47
Hình 3.6. Ảnh hưởng của mơi trường đến sự bảo quản hạt nhân tạo trong điều kiện tối
4OC sau 6 tháng........................................................................................................... 49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của môi trường đến sự bảo quản hạt nhân tạo trong điều kiện tối
4OC sau 12 tháng......................................................................................................... 49
Hình 3.8. Sự sinh trưởng chồi của hạt nhân tạo khi chuyển từ điều kiện bảo quản
trong tối, 4OC ra điều kiện cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC. ...... 50

ix


TRÍCH YẾU CỦA LUẬN VĂN
Lan gấm là một lồi dược liệu q vì cơng dụng của một số hợp chất trong lồi
lan gấm có thể hỗ trợ điều trị ung thư, chữa bệnh đái tháo đường, làm giảm mỡ trong
máu, bảo vệ gan…, vì là lồi dược liệu q nên có giá trị kinh tế cao. Do vậy cây lan
gấm trong tự nhiên bị khai thác một cách triệt để qua hoạt động thu hái nhiều để bán
làm thuốc, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng cao nếu khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu.
Vì vậy, việc bảo tồn nguồn gen quí của lan gấm là vấn đề cấp thiết bằng biện pháp tạo
hạt nhân tạo. Đề tài này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng tái sinh chồi và bảo
quản hạt nhân tạo in vitro cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie).
Phương pháp được sử dụng là tạo các hạt nhân tạo từ đốt thân mang chồi ngủ
tách từ cây lan gấm nuôi cấy in vitro và khảo sát khả năng nẩy mầm của hạt trên các
môi trường khác nhau cũng như khả năng bảo quản của hạt trong điều kiện tối, nhiệt
độ mát.
Kết quả cho thấy khả năng tái sinh chồi của hạt nhân tạo cây lan gấm tốt nhất
trên: giá thể agar không bổ sung dinh dưỡng; hoặc mơi trường MS rắn có bổ sung 1,0
mg/l BA; hoặc môi trường nước. Sử dụng môi trường nước với điều kiện tối, 4C có
thể bảo quản hạt nhân tạo tới 12 tháng với tỉ lệ nảy mầm là 100%.
Nghiên cứu này cung cấp các kết quả đầu tiên tại Việt Nam về mơi trường
thích hợp cho việc bảo quản và tái sinh chồi hạt nhân tạo lan gấm (Anoectochilus lylei

Rolfe ex Downie), tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo; góp phần bảo tồn, bảo
quản nguồn gen dược liệu quý in vitro và phát triển cây lan gấm, dễ dàng và thuận tiện
trong việc vận chuyển, trao đổi giống quốc tế, làm nguồn nguyên liệu chiếu xạ gây đột
biến tạo giống mới.
Từ khóa: cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie), tái sinh chồi,
bảo quản hạt nhân tạo, in vitro, BA, agar, môi trường lỏng.

x


LỜI MỞ ĐẦU
Lan gấm là một cây dược quí, theo Đơng y, lan gấm có vị ngọt, hơi chát, tính
mát, có tác dụng chữa thần kinh suy nhược, ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy
thận; chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt, viêm khí
quản, viêm gan mãn tính, an thần, nhuận phế (mát phổi) và tăng cường sức khỏe, làm
khí huyết lưu thơng, bảo vệ gan, phịng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư, bệnh tiểu
đường, béo phì, điều trị bệnh tim mạch, chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, kháng
viêm,... (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Tất Lợi, 2013; Lin và cộng
sự, 2000; Du và cộng sự, 2000, 2001; Wang và cộng sự, 2002; Shih và cộng sự, 2005;
Wu, 2007; Zhang và cộng sự, 2007) và có giá trị kinh tế cao (theo khảo sát cây lan
gấm loài Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie trên thị trường hiện nay nói chung và
trên địa bàn TP. Đà Lạt nói riêng có giá trị từ 1.200.000đ – 1.500.000đ). Chính vì
những giá trị trên mà hiện nay cây lan gấm trong tự nhiên bị khai thác một cách triệt
để, dẫn đến cây lan gấm có nguy cơ tuyệt chủng cao và đã đưa vào sánh đỏ cần phải
bảo vệ (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006; Sách đỏ Việt Nam - Phần thực vật,
2007). Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen dược liệu
quý lan gấm là vấn đề rất cần thiết.
Ở Việt Nam có khoảng 12 lồi, nhưng chỉ có một số lồi được quan tâm và
nghiên cứu nhiều do nó có giá trị làm dược liệu, đó là lồi Anoectochilus lylei Rolfe
ex Downie và lồi Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Ở Việt Nam hiện còn

nhiều người chưa biết đến cây lan gấm, nhưng trên thế giới, y học cổ truyền ngàn
năm và các nghiên cứu y học hiện đại ghi nhận lan gấm là vua của các loài thảo dược,
do tác dụng dược lý đa dạng của nó. Ở nước ta và trên thế giới hiện nay đã có nhiều
cơng bố nghiên cứu về nhân giống in vitro thành công cây lan gấm (Nguyễn Quang
Thạch và Phí Thị Cẩm Miện, 2012; Đỗ Mạnh Cường và cộng sự, 2015; Trần Thị
Hồng Thúy và cộng sự, 2015; Phùng Văn Phê và cộng sự, 2010; Trương Thị Bích
Phượng và Phan Ngọc Khoa, 2013; Phan Xuân Bình Minh và cộng sự, 2015; Phan
Xuân Huyên và cộng sự, 2016; Ho và cộng sự, 1987; Tai, 1987; Chow và cộng sự,
1982; Shiau và cộng sự, 2002; Ket, 2003; Ket và cộng sự, 2004; Yoon và cộng sự,
2007; Du và cộng sự, 2008; Wu, 2010). Về nghiên cứu nuôi trồng cây lan gấm trên
đất ở thế giới đã có nhiều cơng bố (Gangaprasad và cộng sự, 2000; Shiau và cộng sự,
2001; Shiau và cộng sự, 2002; Chang và cộng sự, 2007; Cheng và Chang, 2009). Ở
nước ta cũng đã có cơng bố nghiên cứu nuôi trồng cây lan gấm nhưng chưa nhiều
1


(Ket và cộng sự, 2004; Phan Xuân Huyên và cộng sự, 2016). Về nghiên cứu các hợp
chất trong cây lan gấm và tác dụng sinh học của của nó thì hiện nay trên thế giới đã
có nhiều nghiên cứu, ở nước ta đã có nghiên cứu cơng bố nhưng chưa nhiều (Du và
cộng sự, 2008; Wu, 2010; Hsieh và cộng sự, 2011; Hsiao và cộng sự, 2011; Hsiao và
cộng sự, 2013; Zhang và cộng sự, 2013; Lin và cộng sự, 2013; Panda và cộng sự,
2014; Rehman và cộng sự, 2015; Hsiao và cộng sự, 2016; Hsieh và cộng sự, 2016).
Về nghiên cứu thực phẩm bảo vệ sức khỏe trà lan gấm thì hiện nay trên thế giới đã có
hai sáng chế đã công bố như: trà lan gấm và trà lan gấm đen, nhưng ở nước ta thì
chưa có cơng bố nào. Về nghiên cứu hạt nhân tạo cây lan gấm thì hiện nay trên thế
giới và trong nước chưa có nghiên cứu nào cơng bố. Xuất phát từ những dẫn chứng
khoa học và ý nghĩa thực tiễn về y dược của cây lan gấm, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và bảo quản hạt nhân tạo in vitro cây lan
gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie)”.
Mục đích nghiên cứu

Đánh giá khả năng tái sinh chồi và bảo quản hạt nhân tạo in vitro cây lan gấm
(Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie).
Nội dung nghiên cứu
1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự tái sinh chồi từ hạt nhân tạo cây lan gấm.
2. Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường rắn có bổ sung chất điều hịa sinh
trưởng thuộc nhóm cytokinin (BA, Kinetin, TDZ) đến sự tái sinh chồi từ hạt nhân tạo
cây lan gấm.
3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lỏng đến sự tái sinh chồi từ hạt nhân tạo
cây lan gấm.
4. Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường (môi trường nước; mơi trường
½ MS lỏng; mơi trường MS lỏng; mơi trường MS rắn; môi trường MS rắn + 1mg/l
BA) đến sự bảo quản hạt nhân tạo cây lan gấm trong điều kiện tối, 4OC.
Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này cung cấp các kết quả đầu tiên tại Việt
Nam về mơi trường thích hợp cho việc bảo quản và tái sinh chồi hạt nhân tạo lan gấm
(Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie), tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu này góp phần bảo tồn, bảo quản nguồn gen dược
liệu quý in vitro và phát triển cây lan gấm, dễ dàng và thuận tiện trong việc vận chuyển,
trao đổi giống quốc tế, làm nguồn nguyên liệu chiếu xạ gây đột biến tạo giống mới.
2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về hạt nhân tạo
1.1.1. Tổng quan về hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo là một dạng hạt mơ phỏng hạt tự nhiên, có cấu trúc bao gồm một
phôi sinh dưỡng (mầm cây) được bọc trong một lớp vỏ hạt (thường làm bằng
alginate) có chứa nội nhũ (chất dinh dưỡng), có khả năng nảy mầm khi gieo và tồn tại
khi bảo quản (Hình 1.1).
Kỹ thuật hạt nhân tạo được nghiên cứu đầu tiên bởi Murashige (1978) và sau

đó phát triển thành cơng nhờ Redenbaugh và cộng sự (1987). Về cơ bản, hạt nhân tạo
giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phơi vơ tính được bọc bởi lớp vỏ bên ngoài bởi lớp
gel và có khả năng nẩy mầm như hạt tự nhiên, nhưng khác biệt là hạt nhân tạo khơng
có phơi nhũ. Kitto và Janick (1985) bọc hạt nhân tạo cà rốt bằng polyxyethylene đạt
tỷ lệ sống là 3%; Kersie MC và cộng sự (1988) đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ
linh lăng, 65% hạt biến đổi sau bước làm khô. Janick (1988) tạo hạt nhân tạo thành
công trên cây cần tây. Carman và cộng sự (năm 1988) tạo được hạt nhân tạo ở lúa mì.
Ban đầu mầm cây được sử dụng là phơi vơ tính. Nhưng ngày nay mầm cây có thể là
chồi đỉnh, đốt thân, mơ sẹo,… một số dạng đã được sử dụng như protocorm-like body
(PLB), vảy củ hoa lily, chồi ngọn và chồi ngủ cây đảng sâm,… (Dương Tấn Nhựt,
2011; Cao Đình Hùng và cộng sự, 2013; Phan Xuân Huyên và cộng sự, 2014; Huyen
và Hien, 2015; Trần Văn Thịnh và cộng sự, 2015).
Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hồn chỉnh từ
phơi vơ tính, đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo nhằm mục
đích vận chuyển, bảo quản, lưu trữ giống dễ dàng hơn. Trong điều kiện tối ưu thì hạt
nhân tạo sẽ nảy mầm khỏi lớp vỏ nhân tạo cịn khơng sẽ chuyển sang trạng thái
ngừng sinh trưởng cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi. Công nghệ hạt nhân tạo là
hướng nghiên cứu mới trong Công nghệ Sinh học và được nghiên cứu rộng rãi do hạt
giống tổng hợp được sử dụng trong bảo tồn và cung cấp các mô thực vật có tầm quan
trọng trong thương mại và kinh tế. Gần đây, các cây lai, cây trồng chuyển gen, cây
đột biến, các cây có giá trị kinh tế, thực vật quý hiếm, ngũ cốc, cây ăn trái và các loại
cây dược liệu đã được sử dụng cho các nghiên cứu tạo hạt nhân tạo (Reddy và cộng
sự, 2012).
3


Nội nhũ
Phơi
Vỏ hạt

Hình 1.1. Cấu trúc một hạt nhân tạo điển hình
Nguồn: />propagation/#.VLytih2VMsd
Các yếu tố tạo hạt nhân tạo:
- Tạo phơi vơ tính: Phơi vơ tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc nhân sinh
khối trực tiếp bằng hệ thống nuôi cấy phù hợp. Phôi soma được tạo thành từ mơ tế
bào, có cấu trúc lưỡng cực và khơng có mạch nối liền với mơ sẹo. Theo Sharp và
cộng sự (1980) giai đoạn trước khi hình thành tế bào soma gọi là tiền phơi, vì tế bào
tiền phơi có thể phân chia để hình thành tế bào phơi trực tiếp, gọi là phát sinh phơi
trực tiếp; tuy có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi của một số lồi (như cà rốt, đậu
ván,…) khơng cần các chất kích thích sinh trưởng nhưng cũng có nhiều tế bào lại cần
chất kích thích sinh trưởng để phân bào trước khi phát sinh tế bào phôi.
- Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate: Có nhiều vật liệu để tạo gel được sử dụng
làm vỏ bọc cho phơi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl
methyl cellulose, carrageenan, gelrite, guargum, sodium pectate, tragacanth gum,
dextran, xanthan gum,… những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào
môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc
ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất để tạo vỏ bọc cho phơi đó là sử dụng sodium alginate (Redenbaugh và cộng sự,
1993), sodium alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như
tính dính vừa phải, khơng gây độc cho phơi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp
sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải
để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi
những tổn thương bởi các tác nhân bên ngoài. Nguyên tắc chính trong q trình tạo
4


vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phơi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và
cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na+ có
trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng
nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ

của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo
liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất.
Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phơi vơ tính bằng sodium alginate cho thấy
có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, tuy nhiên vẫn cịn nhiều
vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao sodium alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị
mất đi khỏi vỏ bọc (Redenbaugh và cộng sự, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh
và cộng sự, 1993),… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ
giúp nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phơi vơ tính hơn, ngun nhân là do
than hoạt tính tăng cường khả năng hơ hấp của phôi, và giữ lại những chất dinh
dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc của phơi.
- Quy trình tạo hạt nhân tạo: Tất cả các vật liệu sử dụng trong quy trình tạo hạt
nhân tạo đều được khử trùng
Bước 1: Dùng dao cắt chồi (shootbud) có kích thước từ 2-3 mm từ cây nuôi
cấy in vitro.
Bước 2: Dùng pipette hay ống tiêm hút dung dịch sodium alginate rồi cho nhỏ
từng giọt rơi xuống.
Bước 3: Dùng kẹp gắp chồi hay phôi đưa vào trong giọt sodium alginate được
nhỏ xuống dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 15 phút.
Bước 4: Dùng pince gắp hạt cho vào nước cất vô trùng trong 5 phút để làm
sạch lượng CaCl2.2H2O cịn sót lại.
1.1.2. Sự nảy mầm của hạt nhân tạo
Do vỏ hạt được hình thành từ phản ứng giữa sodium alginate với ion Ca2+, nên
khi gieo hạt nhân tạo vào môi trường ẩm (môi trường tái sinh) q trình trao đổi điện
tích giữa vỏ hạt và mơi trường diễn ra (Hình 1.2). Các điện tích đơn hóa trị (K+,
Na+,…) trong mơi trường tái sinh sẽ tiếp xúc vỏ hạt, làm cho liên kết giữa alginate
với ion đa hóa trị trở nên lỏng lẻo, hạt ngày càng mềm và cuối cùng hạt vỡ ra.
5


Hình 1.2. Cơ chế quá trình tự vỡ của hạt nhân tạo

(Nguồn: Dương Tấn Nhựt, 2011)
1.1.3. Ứng dụng của hạt nhân tạo
Phổ biến nhất là sử dụng hạt nhân tạo để bảo tồn nguồn gene của những cây
trồng quý hiếm; bên cạnh đó hạt nhân tạo cịn dùng để trao đổi giống, sản suất giống
đại trà, dùng làm công cụ phân tích và nhiều ứng dụng khác.
1.1.3.1. Bảo quản nguồn gen thực vật
Bảo quản tại chỗ các mầm cây quý hiếm ở trong phịng thí nghiệm dưới dạng
các hạt nhân tạo là một phương thức hữu hiệu do hạt có kích thước nhỏ nên chiếm ít
khơng gian và giảm được chi phí bảo quản (gồm trang thiết bị, hóa chất, mơi trường
ni cấy, nhân cơng,…). Có 2 kiểu bảo quản như:
a) Bảo quản ngắn và trung hạn
Bảo quản ngắn hạn thường kéo dài một vài tuần, phù hợp với việc dự trữ mầm
cây để vận chuyển đến những nơi xa. Còn bảo quản trung hạn thường kéo dài một vài
tháng do có sử dụng mơi trường và điều kiện để mầm cây sinh trưởng chậm. Nhiệt độ
bảo quản phụ thuộc vào đối tượng cây trồng, nhưng hai mức nhiệt độ thường được sử
dụng để bảo quản hạt nhân tạo là 4OC (trong tủ lạnh) và 25OC (trong phịng thí
nghiệm), vì chúng có sẵn ở hầu hết các phịng thí nghiệm. Hạt nhân tạo sau khi bảo
quản sẽ được gieo để thu nhận sinh khối là chồi, cụm chồi hoặc cây con, rồi từ đó
được trồng hay nhân giống in vitro (Phan Xuân Huyên và cộng sự, 2014; Huyen và
Hien, 2015; Trần Văn Thịnh và cộng sự, 2015).
6


Tỷ lệ nảy mầm và khả năng tái sinh của hạt nhân tạo phụ thuộc vào loài cây và
điều kiện bảo quản. Chẳng hạn sau 60 ngày bảo quản ở 4OC trong mơ trường ½ MS
lỏng, tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo cây Phylianthus amarus là 47% (Singh và cộng
sự, 2006); Ray và Bhattacharya (2008) đã bảo quản hạt nhân tạo cây Rauvolfia
serpentinea ở 4OC trong mô trường MS lỏng, sau 14 tuần bảo quản có 68,5% hạt
sống sót; Tỉ lệ này đối với cây cúc Đóa vàng (Chrysanthemum morifolium) là 60%
sau 8 tuần bảo quản ở 4OC (Cao Đình Hùng và cộng sự, 2013); Matsumoto và cộng

sự (1995) báo cáo nghiên cứu tạo hạt nhân tạo và bảo quản hạt cây chuối, sau 1 tháng
bảo quản ở 25OC trong môi trường MS lỏng, trong điều kiện tối, kết quả cho thấy tỉ lệ
tái sinh chồi là 100%.
b) Bảo quản dài hạn
Theo Dương Tấn Nhựt (2011), bảo quản dài hạn hạt nhân tạo có thể kéo dài từ
một đến vài năm, chủ yếu bằng phương pháp lạnh đông. Có 2 phương pháp chính:
- Phương pháp tách nước vỏ bao hạt: nước được tách ra nhờ áp suất thẩm thấu
bằng cách ngâm hạt trong dung dịch sucrose 1M. Sau đó làm khơ hạt bằng khơng khí
khơ hay sử dụng dịng khí khơ thổi qua hạt. Phương pháp này có ưu điểm là dễ làm,
bảo vệ được chồi hoặc phôi bên trong, việc điều khiển quá trình khử nước khỏi hạt tốt
hơn, khả năng tái sinh sau bảo quản cao.
- Phương pháp thủy tinh hóa vỏ bao: ngâm hạt nhân tạo trong nitrogen lỏng
(-196OC) và bảo quản. Khi sử dụng, hạt được làm ấm bằng phương pháp giải đông
nhanh. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, tránh hiện tượng mất đỉnh sinh
trưởng và sự hình thành mơ sẹo nên khi hạt tái sinh sẽ bình thường và chắc chắn; quy
trình có tính ổn định cao (lặp đi và lặp lại nhiều lần).
1.1.3.2. Vận chuyển và trao đổi giống cây trồng
Với kích thước nhỏ bé (đường kính trung bình từ 4 – 7 mm) nên việc đóng gói
và vận chuyển hạt nhân tạo trở nên dễ dàng hơn so với cây ni cấy mơ (thường
chiếm thể tích lớn). Do hạt nhân tạo được bọc bởi một lớp vỏ bao alginate nên có thể
tránh được các tác động va chạm vật lý, ánh sáng, nhiệt độ,… trong quá trình vận
chuyển đi xa. Việc trao đổi và vận chuyển giống dưới dạng hạt nhân tạo giữa các
quốc gia sẽ thuận lợi vì tránh được sự kiểm dịch (thường rất chặt chẽ) do mầm cây và
hạt đều vô trùng. Sau khi vận chuyển xong, hạt nhân tạo dễ dàng được gieo trên môi
7


trường nảy mầm in vitro trong phịng ni cấy mơ thực vật để thu nhận mầm cây
dưới dạng chồi hoặc cây con để thực hiện các quá trình nghiên cứu, nhân giống,…
tiếp theo (Ravi và Anand, 2012).

1.1.3.3. Nhân giống
Trong việc sản xuất giống đại trà thì hạt nhân tạo ít được sử dụng so với các
phương pháp vi nhân giống khác do hạt nhân tạo cho tỉ lệ nhân giống thấp hơn. Tuy
nhiên, khả năng tái sinh chồi hoặc cây con từ hạt nhân tạo cũng được khảo sát đầy đủ
cả trong điều kiện in vitro và ex vitro. Trong điều kiện in vitro, hạt nhân tạo từ chồi
và chồi ngủ cây Acacia lai có tỉ lệ tái sinh từ 73,3% đến 100% sau 6 – 20 ngày gieo
(Andlib và cộng sự, 2011); Trên cây Khaya senegalensis, hạt nhân tạo sản xuất từ
chồi đỉnh có tỉ lệ nảy mầm từ 92 – 100% trên môi trường MS bổ sung 4,4 µM BA
(Hung và Trueman, 2011).
Đặc biệt trong điều kiện ex vitro, nếu tỉ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo cao sẽ mở
ra khả năng lớn trong vấn đề sản xuất giống có tính đồng nhất về di truyền (chủ yếu
là cây hoa và cây cảnh). Mukunthakumar và Mathur (1992) đã chứng minh hạt nhân
tạo cây tre (Dendrocalamus strictus) có thể nảy mầm khoảng 45% khi gieo trực tiếp
ra môi trường đất; Shingh và Chand (2010) đã tiến hành nghiên cứu phương pháp
gieo hạt nhân tạo cây Dalbergia sissoo trong điều kiện ex vitro trên giá thể than bùn
(peat moss) được khử trùng và làm ẩm bằng dung dịch ½ MS. Kết quả cho thấy,
trong trường hợp hạt không bảo quản có 22% số hạt nảy mầm và tái sinh, trong khi
hạt đã được bảo quản 30 ngày ở 4OC, khi gieo có 14,2% hạt nảy mầm.
1.1.3.4. Một số ứng dụng khác
Với kích thước nhỏ bé, cấu tạo đơn giản, dễ dàng tái sinh trên môi trường nuôi
cấy, hạt nhân tạo được sử dụng như là một công cụ trong các nghiên cứu để phân
tích, đánh giá cây trồng, như trong việc chiếu xạ để gây đột biến nhằm tạo ra các
giống cây trồng mới, năng suất và chất lượng hơn. Lê Ngọc Triệu và cộng sự (2011)
đã sản xuất hạt nhân tạo cây cúc Artfarm trắng (Chrysanthemum morifolium) từ mơ
phân sinh đỉnh sinh trưởng, sau đó tiến hành chiếu xạ với 3 tia là tia gamma, tia X,
chùm tia proton. Hạt nhân tạo sau khi chiếu xạ sẽ được gieo trên môi trường in vitro
để nảy mầm và tái sinh chồi. Kết quả đã tạo ra được 45 thể đột biến, trong đó đã chọn
ra được 12 thể đột biến có các đặc điểm hình thái ưu việt dùng làm nguyên liệu cho
công tác tạo giống mới.
8

Hạt nhân tạo cũng được sử dụng trong chuyển gen thực vật bằng các kỹ thuật
khác nhau như: kỹ thuật RAPD trong chuyển gen cây Ananas comosus sử dụng hạt
nhân tạo từ chồi (Gangopadhyay và cộng sự, 2005), cây Dioscorea bulbifera sử dụng
hạt nhân tạo từ chồi đỉnh (Narula và cộng sự, 2007); kỹ thuật ISSR trong nghiên cứu
chuyển gen cây Cannabis sativa bằng hạt nhân tạo (Lata và cộng sự, 2011); trong
nghiên cứu của Vdovitchenko và Kuzovkina (2011) đã sử dụng kỹ thuật chuyển gen
pRi T-DNA-transformed để thay đổi gen trong gốc rễ cây thuốc Scutellaria baicalensis.
1.1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của hạt nhân tạo
1.1.4.1. Mầm cây
Mầm cây là thành phần chính trong hạt, quyết định sự thành công của việc
nghiên cứu, ứng dụng hạt nhân tạo. Vật liệu sử dụng làm phôi hạt ban đầu được sử
dụng là phơ vơ tính vì nó có hình dạng cấu tạo và tính chất giống phơi hữu tính. Tuy
nhiên, trên thực tế, việc sử dụng phơi vơ tính để sản xuất hạt nhân tạo ở một số cây
như: địa lan, lan hồ điệp (Trần Thị Ngọc Lan và cộng sự, 2011), cây trầm hương
(Trần Văn Minh, 2005),… thì rất hiệu quả, nhưng ở đa số các lồi cây khác thường
khó thành cơng hơn so với chồi đỉnh, đốt thân, cụm chồi vì phơi vơ tính rất khó hình
thành, phân biệt và tách riêng từng phơi. Trong khi đó chồi đỉnh, đốt thân, cụm chồi
thường có sẵn và dễ dàng tạo ra trong phịng ni cấy mô thực vật.
Tùy theo mỗi loại cây, việc sử dụng mầm cây có ảnh hưởng tới sự tái sinh hạt
nhân tạo như trên cây Spartina alterniflora hạt nhân tạo từ chồi cây tốt hơn phơi vơ
tính, có 86% hạt từ chồi cây nảy mầm, trong khi chỉ có 6% hạt từ phơi vơ tính nảy
mầm sau 2 tuần gieo. Hạt từ chồi cây nảy chồi với chiều dài chồi là 6 cm và rễ dài 4
cm sau 10 ngày (Utomo và cộng sự, 2001).
Trên cùng một cây cũng có thể dùng nhiều loại vật liệu khác nhau để làm phôi
hạt như: cây Camellia japonica L., hạt nhân tạo sản xuất từ phơi vơ tính (Janeiro và
cộng sự, 1997) và hạt được sản xuất từ chồi đỉnh (Ballester và cộng sự, 1997); Cây
lúa Oriza sativa có rất nhiều vật liệu để làm phôi hạt nhân tạo như tế bào trần (Giri và
Reddy, 1994), mầm phôi (Roy và Mandal, 2008), phôi vô tính (Suprasanna và cộng

sự, 1996).
1.1.4.2. Mơi trường gieo hạt
Mơi trường gieo hạt là một trong những nhân tố quan trọng khi sử dụng hạt
nhân tạo. Có thể chia mơi trường gieo hạt thành hai nhóm chính là mơi trường trong
9


ống nghiệm (vơ trùng) và mơi trường ngồi ống nghiệm (không vô trùng). Hạt nhân
tạo thường sinh sống và nảy mầm dễ dàng ở môi trường trong ống nghiệm hơn so với
mơi trường ngồi ống nghiệm, vì mơi trường ngồi ống nghiệm luôn tồn tại hệ sinh
vật gây hại cho nội nhũ hạt (các vi khuẩn, nấm mốc,…). Vì vậy, trong khảo sát ảnh
hưởng của môi trường gieo hạt thường sử dụng môi trường trong ống nghiệm. Môi
trường này chứa các chất khoáng đa vi lượng, vitamin và chất điều hịa sinh trưởng
thực vật,… Mơi trường trong ống nghiệm gồm 2 loại: môi trường giúp hạt tái sinh
chồi và môi trường giúp hạt tái sinh cả chồi lẫn rễ (Phan Xuân Huyên và cộng sự,
2014; Huyen và Hien, 2015; Trân Văn Thịnh và cộng sự, 2015).
a) Môi trường vô trùng để hạt tái sinh chồi
Môi trường để tái sinh chồi chủ yếu là môi trường MS hoặc một số môi trường
khác (phụ thuộc vào loài cây) được bổ sung chất điều hịa sinh trưởng nhóm
cytokinin như BA, Kinetin, TDZ,… Nhóm cytokinin này có tác dụng lên sự phân
chia tế bào, kích thích hạt nảy mầm và gây nên sự hình thành chồi mầm,… Nồng độ
cytokinin/auxin cao trong môi trường rất thích hợp cho sự tạo chồi ở nhiều loại cây.
Tùy theo lồi cây, nồng độ chất điều hịa sinh trưởng mà hạt nhân tạo có tỉ lệ tái sinh
chồi cao hay thấp.
Việc nghiên cứu môi trường tái sinh chồi từ hạt nhân tạo rất quan trọng vì đây
là mơi trường để nhân giống, tái sinh hạt sau khi vận chuyển và bảo quản. Hạt nhân
tạo cây Stevia rebaudiana được cảm ứng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l
BA là tốt nhất (Nower, 2014); Nhiều chồi được tái sinh thành công từ hạt nhân tạo
cây Aristoclochia tagala được ni cấy trên mơi trường MS có bổ sung 3 µM BA và 0,5
µM kinetin (Remya và cộng sự, 2013); Đối với cây Mentha arvensis, hạt nhân tạo nảy

mầm trên mơi trường MS có chứa 2 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA với tỷ lệ 80%, số chồi cao
nhất đạt 9,87 chồi/ hạt, chiều cao chồi cao nhất là 6,27 cm (Islam và Bari, 2012).
b) Môi trường vô trùng để chồi tái sinh thành cây
Đây là môi trường giúp hạt nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh trong
điều kiện in vitro trước khi trồng ra ex vitro. Môi trường này chứa chủ yếu nhóm chất
điều hịa sinh trưởng là auxin (IBA, NAA, IAA,...). Nhóm chất auxin có phản ứng
chính lên sự kéo dài tế bào thơng qua tác động trực tiếp lên sự giãn nở vách tế bào,
kích thích hình thành rễ bất định,… Những hạt nhân tạo có phơi là phơi vơ tính hoặc
10


chồi đỉnh sẽ được gieo trên môi trường này để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Một số
báo cáo liên quan đến vấn đề này như: nghiên cứu trên cây súp lơ (Brassica
oleraceae var), hạt giống nhân tạo đã được gieo trồng trong mơi trường bán rắn có
chứa 2 mg/l IBA đã cho kết quả tốt nhất về khả năng tồn tại giống nhân tạo (Rihan và
cộng sự, 2012); Hạt nhân tạo cây Stevia được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung 0,2 mg/l IAA cho số lượng rễ/cây tối đa. Trong khi, với IBA ở mức 1,0 và 2,0
mg/l cho chiều dài rễ/cây tốt nhất (Nower, 2014).
1.1.4.3. Giá thể gieo hạt
Để hạt nhân tạo tái sinh được thì ngồi các yếu tố về mơi trường, chất điều hịa
sinh trưởng,… thì giá thể cũng là yếu tố quan trọng. Yêu cầu quan trọng của giá thể là
phải tơi xốp, thống khí, dẫn nước, chất dinh dưỡng tốt và rẻ tiền, dễ kiếm. Các giá
thể này sẽ được làm sạch, cho vào bình ni cấy sau đó bổ sung mơi trường tái sinh
hạt và được khử trùng (ở 121OC, 1atm).
Có rất nhiều loại giá thể được sử dụng trong nghiên cứu tái sinh hạt nhân tạo,
theo Nguyễn Thị Thanh Hiền và cộng sự (2003) nghiên cứu nảy mầm của hạt nhân
tạo cây hoa địa lan trên giấy thấm, kết quả cho thấy tỉ lệ nảy mầm đạt 71%; Hạt nhân
tạo cây hoa lily từ vảy củ, alginate 3%, có khả năng tái sinh tốt trên giá thể cát bổ
sung môi trường lỏng có đường với 80% hạt sống sót và 6,7% hạt ra rễ (Dương Tấn
Nhựt và cộng sự, 2004); theo Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2007) đã báo cáo việc sử

dụng các loại giá thể agar, cầu giấy lọc, bông thấm để gieo hạt nhân tạo cây lan hồ điệp
(Phalaenopis amabilis), kết quả cho thấy giá thể bông thấm là tối ưu cho sự tái sinh hạt
nhân tạo từ protocorm-like body cây lan hồ điệp với tỷ lệ hạt sống sót là 87,3%.
1.1.4.4. Điều kiện bảo quản
Để lưu trữ và bảo quản hạt nhân tạo các nguồn gene quý hiếm hay giống của
các cây trồng có giá trị kinh tế cao thì các điều kiện về nhiệt độ bảo quản, thời gian
bảo quản, môi trường bảo quản,… đã được nghiên cứu và kết quả được đánh giá qua
các nội dung sau:
a) Nhiệt độ bảo quản
Nhiệt độ bảo quản là yếu tố chính quyết định đến sự thành cơng trong bảo
quản hạt nhân tạo. Tại hầu hết các phòng thí nghiệm, để bảo quản hạt nhân tạo, nhiệt
11


độ 4OC thường được sử dụng vì các phịng thí nghiệm có tủ lạnh cung cấp nhiệt độ
này. Ngồi ra, nhiệt độ phịng thí nghiệm (20 – 25OC) cũng được sử dụng để bảo
quản hạt nhân tạo. Một số nghiên cứu khác thì sử dụng nhiệt độ trong khoảng giữa
(12 – 18OC). Việc sử dụng loại nhiệt độ nào để bảo quản hạt nhân tạo phụ thuộc vào
từng loại cây và điều kiện thí nghiêm khác nhau. Hung và Trueman (2011) đã nghiên
cứu bảo quản hạt nhân tạo cây bạch đàn lai (Corymbia torelliana × C. citriodora) ở
nhiệt độ 25OC cho tỷ lệ sống sót từ 50 – 84%, cao hơn ở nhiệt độ 4OC có tỷ lệ sống
sót là 0 – 4%, sau 8 tuần bảo quản; Hạt nhân tạo cây Rhodiola kirilowii có tỷ lệ nảy
mầm đạt 100% sau 6 tuần bảo quản ở 4OC (Zych và cộng sự, 2005); Siong và cộng sự
(2012) dùng môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l NAA + 3 mg/l BA để bảo quản hạt nhân
tạo cây Brassica oleracea var ở 4OC, sau 7 ngày có 70% hạt nảy mầm và 30 ngày có
63,33% hạt nảy mầm.
b) Thời gian bảo quản
Việc khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản tới việc bảo quản hạt nhân tạo
rất có ý nghĩa. Nếu thời gian bảo quản hạt nhân tạo càng lâu (nhưng vẫn đảm bảo sự
tồn tại của hạt) thì sẽ có lợi thế lớn trong việc vận chuyển hạt đi xa, trong nhân giống

sẽ làm giảm số lần cấy chuyền. Thời gian bảo quản hạt nhân tạo được kéo dài hay
ngắn phụ thuộc vào lồi cây, vật liệu làm phơi, nhiệt độ bảo quản, mơi trường bảo
quản,… Nhưng nhìn chung, thời gian bảo quản hạt càng lâu thì tỉ lệ nảy mầm, tỉ lệ tái
sinh của hạt,… càng giảm chủ yếu do mầm cây bị stress.
Trên thế giới, nghiên cứu thời gian bảo quản hạt cũng đã được tiến hành ở một
số cây, điển hình là hạt nhân tạo cây hơng (Paulownia elongate) có tỉ lệ nảy mầm là
53% trước khi được bảo quản ở 4OC và tỉ lệ này giảm xuống 43,2 và 32,4%, sau khi
được bảo quản trong thời gian 30 và 60 ngày (Ipekci và Gozukirmizi, 2003); Đối với
hạt nhân tạo cây Oxalis triangularis – một loại cây cảnh khơng có hạt giống tự nhiên
– được bảo quản ở 4OC trong 7 ngày cho tỉ lệ hạt nảy mầm là 96,67% với 4,57
chồi/hạt. Kéo dài thời gian bảo quản đến 30 ngày thì tỉ lệ hạt nảy mầm giảm xuống
90% với 3,97 chồi/hạt (Taha và cộng sự, 2013).
c) Môi trường bảo quản
Hạt nhân tạo có thể được bảo quản trên các môi trường khiến cho mầm cây
tăng trưởng chậm, như mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng, hay môi
12


trường có các chất khống được giảm nồng độ, hay mơi trường chứa các chất ức chế
sinh trưởng. Cũng có thể dùng nước cất vô trùng, môi trường lỏng hoặc mơi trường
chỉ có agar để bảo quản hạt nhân tạo. Sử dụng môi trường bảo quản sẽ gây ngủ hoặc
hạn chế hô hấp của mầm cây nên hạn chế sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển hạt
nhân tạo.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu bảo quản lạnh hạt
nhân tạo bằng cách gây mất nước hạt nhân tạo và ngâm trong nitơ lỏng ở các lồi
như: lồi Dianthus caryophyllus thực hiện bảo quản phơi soma bằng cách gây mất
nước ngâm vào nitơ lỏng trong 5 giờ, tỉ lệ nảy mầm là 48% (Halmagyi và Lambardi,
2006); loài hoa cúc Morifolium tiến hành gây mất nước ngâm trong nitơ lỏng 3 giờ, tỉ
lệ nảy mầm 85% (Sakai và cộng sự, 2000); loài Gentiana spp. thực hiện thủy tinh hóa
trong thời gian 60 - 140 phút, tỉ lệ nảy mầm là 74% (Tanaka và cộng sự, 2004)...

Theo Trần Văn Minh (2005) đã nghiên cứu bảo quản hạt nhân tạo cây trầm
hương (Aquilaria crassna) bằng cách bổ sung topsin-M hoặc benzoate natri vào hỗn
hợp tạo màng hạt với nồng độ từ 5 – 20 mg/l. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 5 mg/l
topsin-M hay benzoate natri cho tỷ lệ hạt tái sinh cao tương ứng là 84 và 74%; Dương
Tấn Nhựt và cộng sự (2004) đã bảo quản hạt nhân tạo cây lily (Lilyum sp.) trong môi
trường lỏng hạt vẫn sống sót và có khả năng tái sinh mạnh khi chuyển sang môi
trường tái sinh sau 3 tháng bảo quản. (Daud và cộng sự, 2008; Geetha và cộng sự,
2009; Sarmah và cộng sự, 2010) đã chỉ ra rằng, trong q trình tạo hạt nhân tạo, nếu
sử dụng mơi trường MS và thêm sodium alginat 3% để bọc phôi soma và dùng
CaCl2.2H2O 100 mM để tạo ra phản ứng kết tủa với dung dịch nội nhủ cho ra hạt
nhân tạo hoàn chỉnh ở cây linh lăng. Hạt nhân tạo sau khi được tạo ra nếu được bảo
quản trong môi trường nước và trong điều kiện tối, 2OC - 4OC trong thời gian 250 –
400 ngày thì tỉ lệ nảy mầm vẫn có thể đạt từ 94% - 100%. Theo Ghosh và Sen (1994)
đã công bố nghiên cứu bảo quản hạt nhân tạo trên cây Asparagus cooperi Baker với
tỷ lệ 8,3% hạt nảy mầm sau 90 ngày ở 2OC; Bustam và cộng sự (2013) nghiên cứu
bảo quản hạt nhân tạo cây Dendrobium shavin White ở nhiệt độ 4OC và 10OC trong
thời gian 75 ngày, duy trì được tỉ lệ sống là 80 – 92%. Hạt nhân tạo cây Catharanthus
reseus L. sau 30 ngày bảo quản ở 4OC có 81% hạt nảy mầm và sau 10 tuần bảo quản
hạt vẫn duy trì được sức sống (Maqsood và cộng sự, 2012).
13


1.2. Giới thiệu về cây lan gấm
1.2.1. Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Angiospermae
Bộ: Asparagales
Họ: Orchidaceae
Chi:

Anoectochilus

Loài: Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie

Hình 1.3. Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie
1.2.2. Nguồn gốc và phân bố
Chi lan gấm (Anoectochilus) có khoảng 51 lồi thuộc họ lan (Orchidaceae).
Tất cả các loài trong chi lan gấm đều có nguồn gốc ngồi tự nhiên. Ở châu Á có
khoảng 40 lồi lan gấm phân bố rộng khắp ở Sri Lanka, Ấn Độ, Nhật Bản, Malaysia,
Indonesia, đảo Thái Bình Dương, Trung Quốc, Việt Nam,… Tại Trung Quốc có
khoảng 20 lồi. Theo Trần Cơng Khanh (2011) ở Việt Nam có khoảng 12 loài lan
gấm (Chrysobaphus roxburghii Wall; Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl;
Anoectochilus setaceus Lindl; Anoectochilus xanthophyllus Planch; Anoectochilus
setaceopictus; Orchis picta Reinw. ex

Lindl; Anoectochilus regalis Blume;

Anoectochilus latomaculatus Blume; Anoectochilus regalis H. Low ex C. Morren;
Anoectochilus

yungianus S.Y.

Hu;

Zeuxine
14

roxburghii (Wall.)

M.

Hiroe;


Anoectochilus roxburghii var. regalis (Blume); Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie).
Khu vực phân bố chủ yếu ở dưới tán rừng, ở độ cao lý tưởng từ 1.000 m so với mực
nước biển trở lên, ưa ánh sáng thấp, độ ẩm cao và phân bố tại các tỉnh như: Lào Cai,
Hà Giang, Yên Bái, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Quảng Trị, Tuyên Quang, Nghệ An, Hịa
Bình, Kon Tum, Gia Lai và Lâm Đồng (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2000;
Đỗ Tất Lợi, 2013). Trong đó lồi A. roxburghii và lồi A. Lylei được biết đến nhiều
do có giá trị dược liệu q và giá trị kinh tế cao. Hiện nay, loài Anoectochilus lylei
Rolfe ex Downie đang nghiên cứu phân bố nhiều tại huyện Lạc Dương tỉnh Lâm
Đồng; Kbang, Kon Hà Nừng tỉnh Gia Lai.
1.2.3. Đặc điểm hình thái
Lan gấm là cây thân thảo, mọc trên đất, thân rễ dài. Thân trên đất mọng nước,
mang các lá mọc xòe sát đất.
Đặc điểm thân rễ: Thân rễ nằm sát ngang mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bị dài.
Thân rễ thường dài và nhiều lóng, có màu trắng xanh, đơi khi có màu nâu đỏ, thường
nhẵn và khơng phủ lơng.
Đặc điểm thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất,
mang nhiều lóng, thường từ 2 – 8 lóng như thân rễ, các lóng có chiều dài khác nhau.
Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, khơng phủ lơng, thường có màu xanh trắng,
đơi khi có màu hồng nhạt.
Đặc điểm của rễ: Rễ được mọc ra từ các mắt đốt trên thân rễ, đơi khi rễ cũng
được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi
mắt đốt chỉ có một rễ, đơi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mắt đốt trên thân
rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tùy theo cá thể.
Đặc điểm của lá: Lá mọc cách xoắn quanh thân, xịe trên mặt đất. Lá hình
trứng, gân trịn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài 2 – 5 cm và rộng 2

– 4 cm. Lá có màu nâu đỏ hay màu xanh thẫm ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung.
Hệ gân lá mạng lưới lơng chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu
hồng ánh kim ở mặt trên và nổi lên rất rõ. Cuống lá nhẵn và có màu trắng xanh, đơi
khi hơi đỏ tía ở bẹ lá, bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Kích thước của lá thay đổi, các lá trên
cùng một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

15