SEMINAR PHÁT TRIỂN và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP UPLC – MSMS TRONG PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI FOTAGLIPTIN và HAI CHẤT CHUYỂN hóa của nó TRONG HUYẾT TƯƠNG và nước TIỂU

PHÁT TRIỂN VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG
PHÁP
UPLC – MS/MS TRONG PHÁT HIỆN
ĐỒNG THỜI FOTAGLIPTIN VÀ HAI CHẤT
CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG HUYẾT
TƯƠNG VÀ NƯỚC TIỂU
Tác giả: Zhenlei Wang, Ji Jiang, Pei Hu & Qian Zhao

10.4155/bio-2016-0243


Nội dung thuyết trình


1. TỔNG QUAN


1. TỔNG QUAN
1.1. Fotagliptin
• Fotagliptin là thuốc mới dùng điều trị đái
tháo đường týp II
• Thuộc nhóm chất ức chế dipeptidyl
peptidase IV (DPP-4)
• Đang được phát triển lâm sàng bởi Trùng
Khánh Fhol Pharma

C 17 H 19 FN 6 O


1. TỔNG QUAN
1.2. Chất chuyển hóa của fotagliptin

• Hai chất chuyển hóa chính là M1 và
M2-1
• Nồng độ của hai chất chuyển hóa
trong huyết tương lớn hơn nồng độ
của fotagliptin ở chuột và chó
• Cần định lượng 2 chất chuyển hóa
chính để biết rõ hơn dược động học
cũng như đặc tính bài tiết của
fotagliptin
Sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để định lượng
fotagliptin và 2 chất chuyển hóa chính của nó trong huyết
tương và nước tiểu


2. THÍ NGHIỆM


2. THÍ NGHIỆM
2.1. Vật liệu và thuốc thử
Vật liệu – Hóa chất

Nguồn cung cấp

Chất chuẩn bao gồm: fotagliptin, 2 chất
chuyển hóa M1 và M2-1, chất nội chuẩn

Cơng ty Dược Shenzhen
Salubris (Trung Quốc)

Acetonitril và metanol loại HPLC

Honeywell Burdick &
Jackson (Mỹ)

Acid formic và acid trifluoroacetic

Sigma Aldrich (Mỹ)

Dung dịch amoniac và amoni acetat

Sinopharm (Trung Quốc)

Nước khử ion

Hệ thống Millipore’s Milli-Q
(Mỹ)

Huyết tương và nước tiểu người khơng
chứa thuốc

6 tình nguyện viên khỏe
mạnh khơng dùng thuốc
trong 2 tuần


2. THÍ NGHIỆM
2.2. Thiết bị
• Các mẫu được phân tích trên hệ thống
UPLC-MS/MS
• Hệ thống Acquity UPLC-MS/MS (Waters Co.,

MA, USA) bao gồm:
- Bộ lấy mẫu tự động
- Lò cột
- Hệ thống quản lí dung mơi 2 dịng
- Dữ liệu có được trên máy khối phổ 3 tứ cực
API 5500 (Applied Biosystems, CA, USA)
- Phần mềm phân tích v1.4.2


2. THÍ NGHIỆM
2.3. Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ


2. THÍ NGHIỆM
2.3. Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
• Q trình rửa giải:


2. THÍ NGHIỆM
2.3. Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
• Các thơng số nguồn / khí được tối ưu hóa như sau:
Thơng số

Giá trị

Màn chắn khí

35 psi

Khí va chạm

8 psi

Điện áp phun ion

5000 V

Nhiệt độ

600°C

Khí nguồn ion 1

40 psi

Khí nguồn ion 2

60 psi


2. THÍ NGHIỆM
2.3. Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
• Cấu trúc hóa học của fotagliptin (A), IS
(B), M1 (C) và M2-1 (D).
• Fotagliptin (A) m/z 343.3 → 217.1;
• Chất nội chuẩn (B) m/z 347,4 → 221,0;
• M1 (C) m/z 344.2 → 193.1;
• M2-1(D) m/z 359.3 → 133.9.

2. THÍ NGHIỆM
2.4. Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn và
các mẫu chuẩn kiểm tra
Pha chế

Dung dịch hiệu chuẩn

Mẫu chuẩn kiểm
tra

Dung dịch nội chuẩn

Dung dịch gốc

1 mg/ml trong acetonitrile

1 mg/ml trong nước –
acetonitrile (1:1)

Dung dịch đối
chiếu

Pha loãng trong nước – acetonitrile (1:1)

Pha loãng với nước acid formic (50:1)

Chuẩn bị mẫu Pha dung dịch đối chiếu trong mẫu dịch sinh học trắng
Pha loãng
Huyết
tương

Nồng
độ
Nước
tiểu

Huyết tương - 10
Nước tiểu - 50

Hệ số pha loãng = 50
0.200/0.200/0.200
-1000/160/1000 ng/ml

20.0/20.0/20.0
-20,000/10,000/10,000
ng/ml

0.500/0.500/0.500,
20.0/5.00/20.0,
8000/1200/8000 ng/ml
800/120/800 ng/ml
40.0/40.0/40.0,
800/400/400,
16,000/8000/8000
ng/ml

40,000/20,000/20,000
ng/ml


2. THÍ NGHIỆM

2.5. Chuẩn bị mẫu thử
Huyết tương


2. THÍ NGHIỆM
2.5. Chuẩn bị mẫu thử
Nước tiểu
 Pha lỗng trực tiếp
 Thêm 990 µL dung dịch nội chuẩn trong nước
tiểu vào 100 µL mẫu nước tiểu rồi đem trộn đều.
Sau đó đem hỗn hợp pha lỗng 100 lần bằng dung
môi acetonitrile-nước (1:9) bằng Tomtec Quadra 4


2. THÍ NGHIỆM
2.6. Thẩm định Phương pháp

• Theo hướng dẫn của FDA Hoa Kì, EMA và FDA
Trung Quốc:


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN
LUẬN


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phát triển Phương pháp
Tối ưu hóa phương pháp MS:
 Chế độ ion hóa dương với ESI phát hiện chất
phân tích tốt hơn.

 Acetonitril chọn làm dung môi pha động, nhiễu
nền thấp.
 Các thông số nguồn/khí và hợp chất cũng được
tối ưu hóa.


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phát triển Phương pháp


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phát triển Phương pháp
Phương pháp chuẩn bị mẫu:
 Mẫu huyết tương: phương
pháp chiết pha rắn được tiến
hành trên máy Tomtec Quadra 4
với SPE loại Oasis™ MCX (30
mg, 2 ml). Dung dịch rửa tối ưu
là metanol-nước (40:60) có hoặc
khơng có acid formic 2% và
metanol: dung dịch amoniac
(20:1) là dung dịch rửa giải cuối
cùng tốt nhất.
 Mẫu nước tiểu: pha loãng
trực tiếp 1000 lần .


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Thẩm định Phương pháp
Tính tuyến tính – Độ nhạy – Độ đặc hiệu

 Tính tuyến tính
 Hệ số tương quan: R > 0.99
 Khoảng tuyến tính:
• Huyết tương: 0.200/ 0.200/ 0.200 – 1000/ 160/ 1000 (ng/ml)
• Nước tiểu: 20.0/ 20.0/ 20.0 – 20,000/ 10,000/ 10,000 (ng/ml)
(tương ứng Fotagliptin/M1/M2-1)
 Nồng độ quan sát được dao động từ 85.0 – 115.0% nồng
độ lý thuyết
 Độ đặc hiệu
Khơng có hiệu ứng chồng – peak nhiễu đáng kể tại thời
gian lưu 1.91, 2.40, 1.12, 1.91 tương ứng của Fotagliptin,
M1, M2-1, IS.


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Thẩm định Phương pháp
Tính tuyến tính – Độ nhạy – Độ đặc hiệu
 Độ nhạy : Phân tích sắc ký đồ m/z đại diện
Mẫu trắng huyết tương (A) và LLOQ (B) của Fotagliptin


Mẫu trắng huyết tương (C) và LLOQ (D) của IS


Mẫu trắng huyết tương (E) và LLOQ (F) của M1


Mẫu trắng huyết tương (G) và LLOQ (H) của M2-1