Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

Bộ giáo dục và đào tạo
Trường Đại học bách khoa Hà nội
------------------------------

Luận văn thạc sỹ khoa học
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào
và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn
Nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ngành: Công nghệ sinh học

Quách vũ quỳnh hương

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Thị ánh Hồng

Hà Nội 2006.


1

MụC LụC
Mở Đầu ...............................................................................................................
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................
2. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................
3. Mục đích của đề tài .............................................................................. 3
4. nội dung nghiên cứu ............................................................................ 3
Chương I: Tổng quan ............................................................................... 4
I.1. Giới thiệu chung về cây sắn .............................................................. 4
I.1.1. Vị trí, phân loại và nguồn gốc .............................................................. 4
I.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................ 5
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cây sắn ....................... 5

1.1.4. Độc tố trong củ và lá sắn ..................................................................... 6
1.1.5. Sản xuất, tiêu thụ sắn trên Thế giới và Việt Nam ................................. 6
I.1.5.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới ...................... 6
I.1.5.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ë ViÖt Nam ....................... 7
I.2. Mét sè BÖnh do nÊm gây hại trên sắn .............................................. 9
1.2.1. Bệnh do nấm gây hại trên củ sắn ngoài đồng ruộng ............................ 9
1.2.2. Bệnh do nấm gây hại trên củ sau khi thu hoạch .................................. 9
1.2.3. Bệnh do nấm gây hại trên thân cây sắn ............................................. 10
1.2.4. Bệnh do nấm gây ra trên lá sắn ......................................................... 10
I.3. Phương pháp nhân giống cây sắn ................................................... 10
1.3.1. Nh©n gièng trun thång ................................................................... 10
I.3.2. Nh©n gièng trong ®iỊu kiƯn in vitro .................................................... 10
I.4. kü tht chun gen ở thực vật ....................................................... 12
I.4.1. Tái sinh cây trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật - cơ sở thành công của
chuyển gen ................................................................................................... 12
I.4.1.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật .................... 12
I.4.1.2. Vai trò của hệ thống tái sinh trong kỹ thuật chuyển gen ....... 14
I.4.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuÈn Agrobacterium .. 15
I.4.2.1. C¬ chÕ .................................................................................. 15
I.4.2.2. Vect¬ ................................................................................... 17
I.4.2.3. Gen chỉ thị và gen chọn lọc .................................................. 19
I.4.3. Giới thiệu sơ lược về enzym thủy phân kháng nấm ......................... 20
I.4.4. Một số thành tựu về cây chuyển gen ................................................ 22
I.4.5. Những yếu tố tích cực và hạn chế của cây trồng biến đổi gen ........ 23
I.4.6. Một số nghiên cứu chuyển gen vào cây sắn ..................................... 24

18T

18 T

18T

1 8T

18T

18T

18T

18 T

18T

1 8T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

Quách Vũ Quỳnh Hương


2

I.4.7. Kü tht PCR - øng dơng kiĨm tra sù biĨu hiƯn cđa gen chun ... 26
Ch­¬ng II: VËt liƯu, nội dung và phương pháp nghiên
cứu . .................................................................................................................. 28
II.1 Vật liƯu Nghiªn cøu ........................................................................ 28
II.1.1. Thùc vËt ........................................................................................... 28
II.1.2. Chđng vi khuẩn và vectơ biến nạp .................................................. 29
II.1.3. Hoá chất và thiết bị .......................................................................... 29
II.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 29
I.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh của cây sắn ........................................... 29
II.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy. ....................................................................... 29
II.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy. ....................................................................... 30

II.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy. ............................................................... 30
II.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp giữa BAP và NAA đến
khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. ................................. 30
II.2.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí lấy mẫu đến khả năng phát
sinh hình thái mô nuôi cấy. .............................................................. 30
II.2.1.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các môi trường đến khả
năng tạo chồi của mô nuôi cấy. ........................................................ 30
II.2.1.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo cây hoµn
chØnh. ............................................................................................... 30
II.2.2. ThÝ nghiƯm trong vµ sau chun gen vào cây sắn. ......................... 30
II.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến khả năng
sống và ............................................................................................. 30
II.2.2.2. Nuôi cấy tái sinh cây sắn chuyển gen ................................. 30
II.2.3. Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển .................................. 30
II.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 30
II.3.1. Các loại môi trường ......................................................................... 30
II.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ....................................................... 31
II.3.3. Phương pháp vào mẫu .................................................................... 31
II.3.4. Chuẩn bị mẫu ở nội dung xây dựng hệ thống tái sinh của cây sắn
...................................................................................................................... 31
II.3.5. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................. 31
II.3.6. Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển. ................................. 33
II.3.7. Phương pháp tách chiết DNA ......................................................... 33
II.3.8. Phương pháp PCR ........................................................................... 34
Chương III: Kết quả và thảo luận ............................................... 40
Kết quả và thảo luận ............................................................................ 40
18T

18T

18T

18 T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18 T

18 T

Quách Vũ Quỳnh Hương


3

A. Các thí nghiệm nghiên cứu xây dựng hệ thống tái
sinh cho cây sắn ...................................................................................... 40
III.1. ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy ................................................................................................... 41
III.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy .............................................................................. 44
III.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy. ............................................................................. 46
III.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp giữa BAP và NAA đến khả
năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. ........................................... 48
III.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí lấy mẫu đến khả năng phát sinh
hình thái mô nuôi cấy. ............................................................................ 50
III.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các môi trường đến khả năng
tạo chồi của mô nuôi cấy. ....................................................................... 52
III.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo cây hoàn
chỉnh ....................................................................................................... 55
III.8. Những kết quả đà đạt được trong giai đoạn xây dựng hoàn thiện
hệ thống tái sinh cho cây sắn ................................................................. 56
B. Các nghiên cứu vào cây sắn hoàn thiện quá trình
chuyển gen. ................................................................................................ 59
III.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng
sống và tái sinh của mô lá cây sắn. ........................................................ 59
III.10. Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chun ............................ 65
III.11. KÕt qu¶ kiĨm tra PCR ............................................................... 6 7

Chương IV: Kết luận và đề nghị ................................................... 69
IV.1. Kết luận ......................................................................................... 69
IV.2. Đề nghị ..........................................................................................7 0

18T

18 T

18T

18 T

18T

18 T

18T

18 T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18T

1 8T

18T

18 T

18T

18 T

18T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

1 8T

18T

18T

18T

18T

18T

18T

18 T

18T

18T

18T

Qu¸ch Vị Quúnh H­¬ng


1

Mở Đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực đứng hàng thứ 6 trên
thế giới có nguồn gốc nhiệt đới ở châu Mỹ La tinh và đà được trồng cách đây
khoảng 5000 năm [26]. Là cây lương thực hàng đầu ở các nước có khí hậu
nhiệt đới ẩm, cây sắn được trồng trên 89 nước với diện tích 14,8 triệu ha năm
2001 [28]. Đến thế kỷ 19, sắn được trồng ở Việt Nam [6] và là cây lương thực
đứng thứ tư sau lúa, ngô và khoai lang.
Hiện nay, sắn nhanh chóng được chuyển đổi vai trò từ cây lương thực
truyền thống thành cây cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp chế biến như
sản xt tinh bét, ®å ng, n­íc chÊm, mú chÝnh, cån... Sắn còn là nguyên
liệu quan trọng phục vụ chăn nuôi, lá sắn tươi là nguồn protein quan trọng
phục vụ tốt cho nghề nuôi tằm, thân sắn có thể tận dụng làm nguyên liệu trồng
nấm, mộc nhĩ ...
ở Việt Nam, sắn được trồng ở cả 7 vùng sản xuất nông nghiệp. Theo thống
kê năm 2001, vùng có diện tích trồng sắn lớn nhất là Đông Nam bộ (57.800
ha), vùng Đông Bắc (48.100 ha) và ít nhất là vùng Đồng bằng sông Cửu Long
(5.500 ha). Về năng suất, vùng Đông Nam bộ (16,8 tấn/ha), vùng Đồng bằng
sông Hồng (10,4 tấn/ha) và thấp nhất là vùng Bắc Trung bộ (7,1 tấn/ha)[13].
Sắn cũng là cây trồng bị nhiều loại nấm bệnh khác nhau gây hại, làm ảnh
hưởng không nhỏ đến sinh trưởng và phát triển của cây cũng như năng suất,
chất lượng của củ. Có gần 250 loại bệnh nấm của sắn trong đó có khoảng 10
loại bệnh có ảnh hưởng lớn đến giá trị kinh tế của cây sắn [5]. Bệnh nấm gây
hại trên củ sắn khi còn ở ngoài đồng ruộng có thể gây hại nặng ở một số địa
phương thậm chí có nơi không thu hoạch được. Điển hình ở đây là các loài
nấm Phytophthora, nấm Rosellinia necatrik... Bệnh nấm gây hại trên thân cây

Quách Vũ Quỳnh Hương

2

sắn, trên lá sắn và trên củ sắn sau khi thu hoạch cũng ảnh hưởng không nhỏ
tới chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế của cây sắn. Sử dụng thuốc bảo vệ
thực vật có thể hạn chế được phần nào ảnh hưởng của nấm bệnh đến cây sắn
chứ không cho tác dụng triệt để như mong muốn.
Chuyển gen là một công cụ hữu ích, bổ sung hiệu quả cho phương pháp
chọn tạo giống truyền thống và có thể mở rộng các nguồn gen có lợi sang các
giống khác. Để chuyển gen vào thực vật phương pháp thông dụng nhất là
chuyển gen nhờ Agrobacterium và chuyển gen bằng súng bắn gen [3]. Chuyển
gen hữu ích vào thực vật cho phép tăng cường những tính trạng mong muốn
mà vẫn giữ nguyên được những đặc tính của giống, tránh được những khó
khăn mà phương pháp chọn tạo giống truyền thống gặp phải.
Đối với cây sắn, chuyển gen có thể cải tiến năng suất, tăng cường chất
lượng củ, kháng sâu bệnh và sản sinh ra các hợp chất mới làm tăng giá trị của
sản phẩm. Để có thể tạo ra những cây chuyển gen một cách ổn định, cần xây
dựng một hệ thống nuôi cấy in vitro cho phép có thể tái sinh cây. Các gen
được chuyển cần có biểu hiện trực tiếp ở những cây chuyển gen đầu tiên và có
thể di truyền một cách ổn định cho các thế hệ sau. Sắn là cây sinh sản vô tính,
vì thế các cây được chuyển gen đầu tiên và đà ổn định về mặt di truyền có thể
sử dụng cho các chương trình chọn tạo giống.
Tạo phôi vô tính là phương pháp chung nhất để tái sinh sắn và chỉ giới hạn
ở mô phân sinh và mô phôi của các mẫu cấy như lá mầm hoặc trụ phôi từ phôi
hợp tử [70][73][50][60][44][56]. Ngoài ra việc phát sinh chồi thông qua phát
sinh cơ quan từ các tế bào tại mép cắt hoặc gần mép cắt của các mẫu rất thích
hợp cho việc chuyển gen nhờ Agrobacterium [46][57]. Xuất phát từ những cơ
sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
" Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu

chuyển gen kháng nấm và cây sắn nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens"

Quách Vũ Quỳnh Hương


3

2. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- ứng dụng tiến bộ của công nghệ sinh học hiện đại vào công tác chọn tạo
giống nhằm tạo ra các dòng sắn mang gen hữu ích mong muốn (kháng nấm).
- Đề tài cung cấp thông tin, số liệu làm cơ sở khoa học đóng góp cho việc
nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển các gen kháng nấm vào cây sắn nhờ
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nói riêng và là tài liệu tham khảo cho
học tập và các nghiên cứu chuyển gen khác nói chung.
- Thành công của đề tài tạo tiền đề cho việc chọn tạo ra những dòng sắn kháng
bệnh, chất lượng cao, năng suất tốt, hiệu quả kinh tế phục vụ cho nhu cầu sản
xuất nông nghiệp và công nghiệp.
3. Mục đích của đề tài

- Nghiên cứu quy trình chuyển gen kháng nấm chitinase-glucanase vào cây
sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm thu được cây sắn có gen
chuyển.
- Xây dựng quy trình tái sinh cây sắn chuyển gen trong in vitro.
4. nội dung nghiên cứu

ã Chuyển được gen kháng nấm vào cây sắn thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
ã Xác định được thành phần môi trường tối ưu cho khả năng tái sinh chồi cao
sau chuyển gen.

ã Tái sinh được cây sắn chuyển gen thành cây hoàn chỉnh.
ã Kiểm tra sự có mặt của gen được chuyển.

Quách Vũ Quỳnh H­¬ng


4

Chương I
Tổng quan
I.1. Giới thiệu chung về cây sắn

I.1.1. Vị trí, phân loại và nguồn gốc
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc giới thực vật (Phyta), ngành
thực vật hạt kín (Angrospermae), lớp hai lá mầm (Dicotyledonece), bộ thầu
dầu (Euphorbiales), họ thầu dầu (Euphorbiacae), chi Manihot [19].
Sắn có nguồn gốc từ Đông bắc Braxin nhưng cũng có tài liệu đà chứng
minh chúng còn có xuất xứ từ Bolivia và Mehico [34].
Thế kỷ 17, cây sắn du nhập vào châu á. Đến thế kỷ 19, sắn được đưa vào
miền nam Việt Nam [7] và trở thành cây lương thực quan trọng thứ tư của
Việt nam. Tới nay cây sắn đà được phân bố trên một diện rộng, chủ yếu là
những nước tập trung trong khoảng từ 30 vĩ Bắc đến 30 vĩ Nam.
Có nhiều giống sắn khác nhau. Dựa vào màu sắc của cây, vỏ củ và hàm
lượng glucozit độc thì có thể chia sắn ra làm 3 loại chính:
ã Sắn đắng (sắn vỏ trắng): có hàm lượng glucozit độc cao nhất trong các
loại sắn. Hàm lượng HCN trung bình trong củ là 15-30 mg/100g [1]. Có vỏ gỗ
màu nâu nhạt, vỏ thịt trắng, cuống lá tím, thân cây thấp, đốt ngắn, không ăn
tươi được.
ã Sắn ngọt (sắn vỏ đỏ): có hàm lượng glucozit độc thấp, hàm lượng HCN
chung trong củ khoảng 4 - 5mg/100g [1]. Thân cây có màu xanh nhạt, đốt dài,

lá màu xanh thẫm, vỏ củ có màu nâu xẫm.
ã Sắn nghệ (sắn vỏ vàng): có hàm lượng glucozit độc cao hơn sắn vỏ đỏ.
Trung bình trong củ có 10mg/100g HCN [1]. Thân cây màu vàng nhạt hơi
xanh, vỏ củ màu vàng ngà, thịt sắn hơi vàng, năng suất thấp nên ít trồng.

Quách Vũ Quỳnh Hương


5

Hình 1.1. Cây sắn, hoa, quả và hạt sắn
I.1.2. Đặc điểm sinh học
Sắn là cây tiểu mộc, cao khoảng 1 - 4m, có phân nhánh hoặc không phân
nhánh tuỳ giống, lá khía thành nhiều thùy, rễ ngang phát triển thành cđ, tÝch
lịy tinh bét. Thêi gian sinh tr­ëng tõ 6 - 12 tháng, có nơi lên tới 18 tháng. Sắn
thường được trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới [7].
Vụ sắn thường bắt đầu vào cuối mùa khô. Thời gian sinh trưởng từ 10 - 12
tháng ở miền Bắc và 7 - 9 tháng ở miền Nam. Cây sắn chịu được đất chua nên
trồng được ở những vùng đồi đất xấu ở miền Bắc hay vùng đất phèn ở châu
thổ sông Cửu Long. Đất cát ven biển, đất phù sa cũ và mới cũng trồng được
sắn. Vùng núi cao không trồng được sắn vì sắn không chịu được rét.
I.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cây sắn
Thành phần các chất cấu tạo các bộ phận trên cây sắn rất khác nhau. (xem
bảng 1 - phụ lục 1). Củ sắn giàu tinh bột, nhiều nhiệt lượng và axit ascorbic
nh­ng cã nhiỊu gluxit khã tiªu, nghÌo protit, lipit, Ýt muối khoáng và ít
vitamin. Lá sắn có nhiều canxi, protit, vitamin A, B1, B2 và một số axit amin
không thay thế như lizin, triptophan cao hơn các bộ phận khác và thay đổi tùy
thuộc vào tuổi cây. Có thể dùng củ và ngọn sắn để ăn. Thành phần hoá học
giữa sắn vàng và sắn trắng cũng rất khác nhau (xem bảng 2 - phụ lục 1)
Sắn được dùng thay ngũ cốc làm thức ăn giàu năng lượng cho gia súc, gia

cầm. Củ sắn được sử dụng rộng rÃi ở nhiều nước, lá và thân cây ít được dùng

Quách Vũ Quỳnh H­¬ng


6

hơn. Một số nơi dùng thân lá sắn kết hợp trong cỏ khô để sử dụng hàm lượng
protit và chất xơ. Củ sắn thường được sử dụng dưới dạng sắn lát khô, sắn viên
hoặc bột, chế biến thức ăn tổng hợp. Cũng có thể sử dụng sắn tươi nhờ khả
năng dễ tiêu của tinh bột sắn nhưng cần chú ý đầy đủ đến tác động của HCN.
Giá trị dinh dưỡng của sắn đối với các loại gia súc, gia cầm được phân tích ở
châu Phi cho kết quả ở bảng 3 - phụ lục 1.
I.1.4. Độc tố trong củ và lá sắn
Bất kỳ loại sắn nào cũng đều có độc tố acid cyanic (HCN). HCN được phát
hiện có trong cây sắn từ năm 1904. Tùy từng loại sắn mà hàm lượng chất độc
này thay đổi và sự phân bố của nó cũng không đều trong các cơ quan trên
cùng một cây (bảng 4 phụ lục 1). Theo kết quả nghiên cứu của Nastey (1973),
các chất glucoside cyanogenic của sắn có thành phần chủ yếu là linamarin
(93%) và lotaustralin (7%). Những chÊt nµy chun thµnh HCN khi cã sù hiƯn
diƯn cđa linamatase (một loại enzym trong sắn).
I.1.5. Sản xuất, tiêu thụ sắn trên Thế giới và Việt Nam
I.1.5.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới
Theo số liệu thèng kª cđa FAO (1968) cã tíi 88 n­íc trªn thế giới trồng
sắn với năng suất bình quân năm 1968 là 8,7 tấn/ha, sản lượng trên 85 triệu
tấn [2].
Đến năm 2004, toàn thế giới có 89 nước trồng sắn đạt diện tích 18,51 triệu
ha, năng suất bình quân 10,94 tấn/ha, sản lượng 202,64 triệu tấn [29]. Diện
tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều hướng gia tăng trong
hơn 10 năm qua 1994-2004 (bảng 5 - phụ lục 1) trong đó có 22 nước đạt sản

lượng sắn hàng năm trên 1 triệu tấn. Châu Phi chiếm 53% sản lượng sắn thế
giới, tiếp theo là châu á 29%, châu Mỹ La tinh và vùng Caribê 17% (bảng 6 phụ lục 1).

Quách Vũ Quỳnh Hương


7

Châu á là một trong ba vùng trồng sắn quan träng cđa thÕ giíi. DiƯn tÝch
trång s¾n hiƯn cã 3,51 triệu ha, sản lượng 58,92 triệu tấn, đứng thứ hai sau
châu Phi, năng suất củ bình quân 16,76 tấn/ha. Nước dẫn đầu về sản lượng của
châu á là Thái Lan (20,40 triệu tấn) nhưng nước dẫn đầu về năng suất lại là
ấn Độ (27,91 tấn/ha), cao nhất trên toàn thế giới [29].

Hình 1.2. Những vùng trồng sắn chính của châu á
(Mỗi chấm tương ứng 10.000ha sắn năm 2003) Nguồn: Reinhardt Howeler 2004 [63]
Tiêu thụ sắn trên thế giới năm 2002 - 2003 ước đạt 5,9 triệu tấn. Thái Lan
là nước xuất khẩu sắn hàng đầu thế giới, kế đến là Việt Nam. Những nước
nhập khẩu chủ yếu là Trung Quốc, Cộng đồng châu Âu (EU), Nhật, Hàn
Quốc, Mỹ và Philippines (bảng 7 - phụ lục 1). Năm 2003 - 2004 tiêu thụ săn
tươi trên thế giới ước đạt 4,6 - 4,9 triệu tấn sản phẩm, tương đương 14,0 - 15,2
triệu tấn củ tươi. Tình hình xuất khẩu sắn trên thế giới năm 2003 - 2004 được
thể hiện ở bảng 8 - phụ lục 1.
Theo dự báo đến năm 2020, sản lượng sắn toàn thế giới ước đạt 275,1 triệu
tấn, trong đó sản xuất sắn ở các nước đang phát triển là 247,7 triệu tấn, các
nước phát triển đạt khoảng 0,4 triệu tấn. Tốc độ tăng trưởng về lượng tiêu thụ
sản phẩm sắn hàng năm giai đoạn 1993 - 2020 của châu Mỹ ước đạt 1,3%,
châu Phi là 2,44% và châu á là 0,84 - 0,96% (bảng 9 - phụ lục 1)[20].
I.1.5.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ở Việt Nam

Quách Vũ Quỳnh Hương


8

ở Việt Nam, sắn là cây lương thực có sản lượng đứng thứ hai sau lúa và
được coi là cây màu quan trọng thứ hai sau cây ngô. Sản xuất sắn trong nước
liên tục tăng trong giai đoạn 1960-1980, giảm sút trong giai đoạn 1980-1990
[6], ổn định và phát triển trong hơn 10 năm trở lại đây do chủ trương đẩy
mạnh sản xuất lúa, ngô đồng thời vẫn coi trọng các cây màu như sắn, khoai
lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển của Bộ Nông nghiệp và
phát triển nông thôn (bảng1.1).
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của Việt Nam
Chỉ tiêu
Diện tích
(1.000ha)

1976

1980

1985

1990 1993

1997

2001

2002

2003

2004

233,2

436,4

335,0 256,8 278,0

254,4

263,9

337

371,7 370,0

Năng suất
7,7
7,5
8,8
8,9
8,8
9,45 10,64 13,17 14,06 14,50
(Tấn/ha)
Sản lượng
(1.000tấn) 1795,6 3273,0 2948,0 2285,5 2446,4 2404,1 2807,9 4438,0 5226,1 5365,0
Nguån: Hoµng Kim, 1995[6], Tổng cục thống kê 2001[13] và FAOSTAT 2005[29].

Sắn được trồng ở hầu hết các tỉnh nhưng tập trung nhất là ở các vùng đồi
núi trung du, miền núi thấp Bắc Bộ, Đông Trường Sơn, Tây nguyên và Nam
Bộ... (bảng 10 - phụ lục 1).
Năm 2002, một số tỉnh miền Bắc như Yên Bái, Bắc Kạn, Phú Thọ, Sơn La,
Lào Cai, đà chuyển đổi cây sắn từ cây lương thực thực phẩm sang thành cây
công nghiệp [17].
Cây sắn đà bổ sung một cách đáng kể nguồn nguyên liệu cho công nghiệp
chế biến như sản xuất tinh bột, làm khô để xuất khẩu hoặc tự sơ chế phục vụ
cho sản xuất maltoza, cồn, các loại bún bánh. Sắn sử dụng làm thức ăn chăn
nuôi chiếm 60,9% tổng sản lượng sắn tiêu thụ ở Việt Nam, tinh bột sắn 16%,
sắn khô phục vụ cho xuất khẩu chiếm 4,9% và sắn lát khô trong các hộ gia
đình chiếm 6,0% [27]. Ngoài ra, Việt Nam còn tham gia xuất khẩu sắn và hiện
là nước xuất khẩu sắn thứ hai trên thế giới sau Thái Lan [29]. Tình hình chế

Quách Vũ Quỳnh Hương


9

biến sắn ở Việt Nam cũng phát triển mạnh, nhất là tại các tỉnh phía Nam
(bảng 11 - phụ lục 1).
I.2. Một số Bệnh do nấm gây hại trên sắn

I.2.1. Bệnh do nấm gây hại trên củ sắn ngoài đồng ruộng
Khi còn ở ngoài ruộng củ sắn dễ bị nhiều loại nấm xâm nhập và gây hại,
nhất là những vùng đất ẩm. Bệnh có thể gây hại nặng đến không thu hoạch
được đa phần là do thối củ. Trong số các loài nấm xâm nhập và gây hại trên củ
sắn ngoài đồng ruộng phải kể đến:
Các loài nấm Phytophthora. Thường gây ra những vết nâu và chết hoại trên

củ, trên cuống, trên rễ ở bất kỳ tuổi nào của cây sắn hoặc gây ra các vết bệnh
có hình dáng bất kỳ với màu nâu trên lá. Nấm xâm nhập vào củ và phân huỷ
phần bên trong của củ, từ đó tiết ra chất dịch bắt đầu từ những vết thối mềm.
Nấm Rosellinia necatrik. Thường xuất hiện trên các chân đất ẩm, giàu chất
hữu cơ. Ban đầu trên mặt củ sắn xuất hiện những đám sợi nấm màu trắng, sau
chuyển sang đen. Mô củ bị bệnh có màu nâu. Bóp mạnh củ sắn thì vết bệnh
tiết ra chất nước có mùi thối.
Nấm Rogidoporus lignosus. Tương đối phổ biến ở các vùng trồng sắn. Nấm
gây thối củ gọi là "thối trắng". Củ sắn bị bệnh có một lớp sợi nấm phủ lên trên
bề mặt màu trắng, sau chuyển sang màu kem rồi chuyển thành màu da cam.
Mô củ nhiễm bệnh bị khô và tiết ra mùi thối đặc trưng, bệnh là cho cây chết
dần. Những ổ nhiễm bệnh lan dần ra thành từng vệt trên ruộng sắn.
Nấm Corticium rolfsii là loài khá phổ biến, phân bố rộng, gây hại nhiều
loại cây trồng khác nhau. Nấm này có thể quan sát thấy trên hom, trên rễ và
trên củ sắn. Biểu hiên của bệnh này là xuất hiện những đám sợi nấm màu
trắng, chúng sẽ xâm nhập vào củ và gây thối củ.
I.2.2. Bệnh do nấm gây hại trên củ sau khi thu hoạch
Sau khi củ sắn được thu hoạch, một số loài nấm đà xâm nhập vào củ từ
ngoài ruộng vẫn tiếp tục phát triển và gây hại. Một số loài nấm xâm nhập vào

Quách Vũ Quỳnh Hương


10

củ thông qua các vết thương được tạo ra trên củ khi thu hoạch. Sự phối hợp
gây hại của 2 nhóm nấm này làm cho củ sắn bị huỷ hoại khá nhanh. Điển hình
ở đây phải kể đến các loài: Mucor mucedo, Rhizopus nigricans, Choanephora
cucurbitarum, Fusarium sp.
I.2.3. BÖnh do nÊm gây hại trên thân cây sắn

Một số loại nấm bệnh gây hại trên củ sắn nhưng có thể phát triển lên thân
cây làm đen các ống mạch dẫn gây rụng lá, khô ngọn. Nấm cũng có thể xuất
hiện trên những hom sắn để lưu trữ khi độ ẩm không khí cao, những thân cây
non gây bệnh mụn thán thư làm lá héo và rụng, ngọn bị khô đen lại.
Cũng có bệnh nấm chỉ xuất hiện và phát triển nhanh vào mùa mưa làm
thân lá bị vặn vẹo biến dạng, cuống và gân lá có vết lở loét, lóng thân nhỏ lại
và dài ra và nói chung đều gây ảnh hưởng đến năng suất cây bệnh.
I.2.4. Bệnh do nấm gây ra trên lá sắn
Một số loài nấm phổ biến ở các vùng trồng nấm gây hại trên lá sắn như
Cercospora henningsii, Phyllosticta sp. có thể gây rụng lá dẫn đến chết cây.
Ngoài ra, tuỳ vào đặc điểm và khí hậu từng vùng mà xuất hiện một số bệnh
nấm khác trên lá như bệnh rỉ sắt, bệnh phấn trắng, bệnh chấm đen, bệnh chấm
láng... có những bệnh chỉ xuất hiện ở vùng nóng, có những bệnh lại chỉ xuất
hiện ở những vùng mưa và ẩm.
I.3. Phương pháp nhân giống cây sắn

I.3.1. Nhân giống truyền thồng
Có thể nhân giống cây sắn bằng hom lá

theo phương pháp của

Kloppenburg và cộng sự (1972) [15], nhân nhanh bằng hom hai mắt theo
phương pháp của CIAT hay đơn giản chỉ bằng cách gieo hạt thông thường.
I.3.2. Nhân giống trong điều kiện in vitro
Sắn dễ bị nhiễm một số loại nấm bệnh, virus và sâu bọ theo con đường
hom giống. Vì thế phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh
đà được phát triển vào giữa những năm 1970. Cho đến nay việc tạo ra giống

Quách Vị Qnh H­¬ng

11

mới nhanh chóng bằng cải tiến bộ gen thông qua nuôi cấy mô và chuyển gen
đang rất được quan tâm.
Nuôi cấy mô phân sinh cây sắn được thực hiện đầu tiên năm 1974. Đỉnh
mô phân sinh được tách ra từ những cây trồng trong nhà kính và cấy vào môi
trường khoáng đa lượng và vi lượng MS, vitamin B5, 20g/l sucrose, tuy nhiên
những mô phân sinh nhỏ hơn 0,2mm thì không thể sống sót, phát triển thành
cây vì môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng. Lui (1975) đà kết hợp
thêm 0,1mg/l BA, 0,2mg/l NAA để kích thích sự hình thành rễ, mô sẹo và rễ
phụ ở một số loài. Cũng năm 1975, ở Costa-Rica, Moh đà sử dụng hạt phấn
đơn bội làm vật liệu nuôi cấy mô.
Nuôi cấy phôi soma xuất hiện muộn hơn và lần đầu tiên được mô tả bởi
Stamp và Henshaw (1982). Ban đầu tác giả sử dụng phôi hợp tử làm nguyên
liệu khởi đầu để tạo phôi, sau đó thuỳ lá (leaf lobe) của cây cũng được sử
dụng và cho kết quả tương tự như phôi hợp tử [69].
Việc nhân giống thông qua phôi soma chủ yếu được ứng dụng trong công
tác chuyển gen cây sắn. Theo các báo cáo, các loại mô được sử dụng trong
quá trình phát sinh phôi (mảnh mô sẹo phát sinh phôi hoặc lá mầm từ phôi
soma trưởng thành) để làm nguyên liệu cho việc chuyển gen, sau đó cũng
dùng chính chu trình tái sinh phôi này để tái sinh mô chuyển gen.
Tình hình nuôi cấy mô sắn ở Việt nam
Nghiên cứu về cây sắn ở nước ta được chú trọng từ khi Việt Nam hợp tác
với các tổ chức và mạng lưới nghiên cứu sắn châu á. Tuy nhiên những nghiên
cứu trong điều kiện in vitro còn ít, chủ yếu chỉ về kỹ thuật trồng trọt.
Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đà có những
nghiên cứu bước đầu về nuôi cấy in vitro cây sắn: Đoàn Thị Phương và Bùi
Trang Việt đà sử dụng mẫu lá 4 tuần tuổi in vitro nuôi cấy trên môi trường
MS + 1,2mg/l NAA, 0,15mg/l BA và 0,3mg/l GA 3 , sau 7-10 ngày đà thu được

R

R

mô sẹo. Tiếp tục nuôi cấy các mô sẹo để tạo chồi [4]. Phan Tường Lộc và

Quách Vũ Quỳnh Hương


12

Nguyễn Hữu Hổ (Viện Sinh học Nhiệt đới) đà sử dụng thuỳ lá non từ cây khử
trùng mẫu và chuyển vào môi trường MS + Vitamin B5 + 2àM/l casein + 0,5
mg/L CuSO4, tạo cụm phôi với môi trường MS + 6 - 8 mg/l 2,4D, thu được
85% tạo phôi sau 25 ngày nuôi cấy. Môi trường tái sinh được sư dơng lµ MS +
(0,5- 2mg/l) BAP vµ (0,1-1mg/l) IBA, thu được 6 chồi/mẫu cấy [14]. Các
nghiên cứu khác cũng cho thấy loại mô sử dụng và kiểu gen của giống ảnh
hưởng đến khả năng tạo callus, sinh phôi và tái sinh cây.
I.4. kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
Rosen và cs. 2003; Veluthambi và cs. 2003 đà nhận định: "Chuyển gen là
một phương pháp gây biến dị di truyền có định hướng ở cây". Về mặt nông
học, chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một trong những bước tiến khá dài
của công nghệ sinh học. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc rất lớn vào bản chất
cây trồng, đặc tính di truyền, phương pháp biến nạp cũng như tái sinh cây
chuyển gen. Mục đích chính của kỹ thuật chuyển gen là phải đạt hiệu quả
cao, áp dụng được với nhiều với đối tượng cây trồng mà theo đó các nhà
nghiên cứu công nghệ đà phát triển, xây dựng nhiều giải pháp cũng như kỹ
thuật chuyển gen khác nhau.
I.4.1. Tái sinh cây trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật - cơ sở thành công
của chuyển gen

I.4.1.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật
U

Tính toàn năng của tế bào .
U

Haberlandt (1902) ngay từ xa xưa đà quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một
cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại: mỗi tế bào riêng rẽ
đà phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả
cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn
năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp

Quách Vũ Quúnh H­¬ng


13

nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đà hoàn toàn chứng
minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào
riêng rẽ. [31].
Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là mét chÝnh thĨ thèng nhÊt bao gåm nhiỊu c¬
quan chøc năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt. Sau đó từ các tế bào phôi sinh này
chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô,
cơ quan có chức năng khác nhau [12], [31].

Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:

Khi tế bào đà phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng
không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết,
ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào sinh phôi và phân
chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào.
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một
số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới,
còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chương trình đà được mà hoá trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào
khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thì thường bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của
khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bàp thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô
tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào

Quách Vũ Quỳnh Hương


14

thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế
bào [12]. Tuỳ theo mục đích đặt ra như tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo rễ, tạo
phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà điều chỉnh môi
trường thích hợp là rất cần thiết.
I.4.1.2. Vai trò của hệ thống tái sinh trong kỹ thuật chuyển gen
Đối tượng thường được sử dụng để chuyển gen ở thực vật là: mô lá, mô cấy

là lát cắt đoạn thân, mẩu callus, hay những tế bào tách rời... Những vật liệu
này sau khi đà được biến nạp thành công, các tế bào đà dung nạp những gen
ngoại lai, phải tìm cách làm cho những tế bào này tái sinh được thành một cơ
thể hoàn chỉnh bằng cách đặt nó vào một môi trường tái sinh thích hợp. Nếu
tái sinh không thành công thì quá trình biến nạp trước đó sẽ trở nên vô nghĩa.
Chính vì vậy, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật đóng vai trò hết sức quan trọng, quyết định thành công hay thất bại của thí
nghiệm biến nạp. Bên cạnh đó, sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp
cũng là mục tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng [55].
Để tạo được giống mới nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả, phải đảm
bảo 4 yêu cầu: Hệ thống tái sinh thích hợp; Hệ thống vectơ thích hợp; Có các
gen thích hợp đà được nhân dòng và đà xác định được các đặc tính; Các phương
pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính và
đồng ruộng [41].
Bower và Birch (1992) đà chuyển nạp gen thành công vào cây mía
(Sacccharum officinarum L) bằng súng bắn gen. Arencibia và cộng sự, (1997)
cũng đà xây dựng quy trình chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng của cây bằng
xung điện. Tuy vậy, các tác giả cho rằng, chuyển gen trực tiếp thường qua giai
đoạn tế bào nhưng việc tái sinh các tế bào này gặp rất nhiều khó khăn để nhận
được một cây mang gen ngoại lai.
I.4.2. Phương ph¸p chun gen gi¸n tiÕp nhê vi khn Agrobacterium

Qu¸ch Vị Quúnh H­¬ng


15

Mặc dù có nhiều phương pháp để tạo ra cây chuyển gen nhưng chuyển gen
gián tiếp là phương pháp đơn giản nhất để sử dụng chuyển gen cho nhiều loại
cây trồng.

Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes là hai vi khuẩn gây bệnh khối
u và rễ tơ cho thực vật đà được biết và nghiên cứu từ lâu. Tuy nhiên, người ta
lại chú ý nghiên cứu và khai thác sử dụng khả năng của chúng ở một khía
cạnh khác đó là sử dụng như một vectơ mang các gen ngoại lai để chuyển vào
mô tế bào thực vật trong đó A. tumefaciens được sử dụng phổ biến hơn cả.
Dựa vào cơ chế chun gen cđa vi khn A.tumefaciens, ng­êi ta ®· dïng
chóng để chuyển các gen mong muốn trên cơ sở thiết kÕ l¹i hƯ thèng Ti-plasmid
cđa vi khn sao cho vÉn đảm bảo được chức năng chuyển gen nhưng không mang
các gen gây độc cho cây cũng như tạo ra các dạng vectơ mới để chuyển gen là
những vectơ liên hợp và vectơ nhị thể. Các hệ thống vectơ mới được tạo thành này
đều được dựa trên cơ sở cải tiến Ti-plasmid. Phần T-DNA của Ti-plasmid sẽ bị cắt
bỏ những gen gây u và gen tổng hợp opine, thay thế vào đấy là các gen mong
muốn kèm theo gen chỉ thị và gen khởi động.
I.4.2.1. Cơ chế
A. tumefaciens mang một plasmid sao chép độc lập với bộ gen vi khuẩn đó
là plasmid Ti có kích thước khoảng 200kb. Trên plasmid này có các vùng:
+ Vùng T-DNA: được giới hạn bằng các trình tự lặp và bảo tồn ở hai đầu gọi
là hai bờ trái và phải, có chứa các gen mà hóa cho auxin, cytokinin và opine.
Vùng này được đưa và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật khi vi khuẩn xâm
nhiễm, trong đó bờ phải là nơi cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA vào
genome thực vật.
+ Vùng gen vir: các gen vir giữ vai trò chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế
bào thực vật. Vùng vir có tới 25 gen được định vị trên Ti-plasmid bao gåm 6
operon A, B, C, D, E vµ G trong đó vir A, B, D và G liên quan đến quá trình
tạo ra độc tính còn vir C và E liên quan đến quá trình tạo thành khối u. Các

Quách Vị Qnh H­¬ng


16

operon B, C, D, E đều là cistron. Vir A luôn luôn biểu hiện còn vir C thể hiện
mạnh ở môi trường dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các
operon này nhìn chung liên quan đến sự có mặt của các hợp chất chứa phenol
như acetosyringone và -hydroxy acetosyringone được tiết ra từ các tổn
thương trên cơ thể thực vật. Một số chủng Agrobacterium còn có thêm vùng
vir F và phần lớn các chủng nopaline có thêm một gen tổng hợp zeatin tzs
định vị gần đó. Các gen vir hoạt động giúp T-DNA tách khỏi Ti-plasmid và
tạo điều kiện để đưa T-DNA xâm nhập sang tế vµo thùc vËt.
+ Vïng ori gióp cho sù sao chÐp của plasmid
+ Vùng gen dị hóa opine
Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật: là một quá trình khá phức
tạp với nhiều yếu tố tham gia hoạt động, xảy ra khi Agrobacterium tiếp xúc
với tế bào thực vật bị tổn thương. Khi đó tế bào thực vật bị tổn thương sẽ tiết
ra các hợp chất phenolic như acetosyringone, -hydroxy acetosyringone. Các
hợp chất phenolic dẫn dụ với vi khuẩn, giúp cho các Agrobacterium nhận ra tế
bào chủ thích hợp và gắn vào thành tế bào. Vi khuẩn sẽ bám vào những vị trí
đặc trưng trên bề mặt tế bào nhờ sự giúp đỡ của các gen vir nằm trên nhiễm
sắc thể gọi là gen chv (chromosome virulence). Bên cạnh đó, các hợp chất
phenolic còn là chất cảm ứng cho các gen vir hoạt động. Quá trình này diễn ra
trong điều kiện pH thấp và được tăng cường nhờ các opine và monosacaride.
Đầu tiên gen vir A được hoạt hóa, sản phẩm protein của nó hoạt động như một
chất thụ cảm hóa học, nhận biết sự có mặt của các phân tử như acetosyringone
và truyền thông tin này cho protein gen vir G thông qua cơ chế phosphoril
hóa. Vir G điều khiển quá trình dịch mà các gen vir B, C, D và E. Các phân tử
đường cũng tham gia hỗ trợ các phức hợp phenolic làm tăng cường biểu hiện
của các gen vir. Ti-plasmid (gọi là mạch T) chuyển từ vi khuẩn sang tế bào
thực vật (đầu 5 đi trước). Đoạn DNA mạch đơn còn lại trên Ti-plasmid sẽ làm
khuôn để tổng hợp nên mach DNA bổ trợ mới. Quá trình này diễn ra sau 12

Quách Vũ Quỳnh Hương


17

giờ kể từ khi vi khuẩn nhận biết được acetosyringone. Gen vir D mà hóa một
loại endonuclease cắt ở vị trí đặc biệt. Sự phân tích bắt đầu khi enzym này
hoạt động và cắt một đoạn ranh giới bên phải tại base thứ 3 hoặc thứ 4 tính từ
trái sang. Đầu 5 của mạch T được protein vir D2 gắn vào. Các prtein này bảo
vệ T-DNA khỏi sự tấn công của các enzym trong suốt quá trình vận chuyển.
Ngoài ra, protein vir D2 còn có chức năng nhận biết tế bào thực vật. Cuối
cùng, một vài sản phẩm của gen vir B kết hợp với màng và định vị tại đó. Cấu
trúc màng tế bào thực vật bị thay đổi trong suốt quá trình phức hợp TDNA/protein chui qua.
Sau khi đà qua màng tế bào, đoạn mạch T đi vào nhân và kết hợp với DNA
trong nhân của tế bào vật chủ ở những vị trí ngẫu nhiên, tại đó các gen trên TDNA bắt đầu hoạt động nhờ sự điều khiển của các gen trong nhân tế bào chủ.
Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật có nhiều nét tương đồng với
quá trình tiếp hợp của vi khuẩn. Quá trình chuyển T-DNA cần cấu trúc phức
protein - DNA sản sinh từ Agrobacterium dưới sự tác động của các phức hợp
chứa phenol tiết ra từ các tổn thương của tế bào thực vật.
I.4.2.2. Vectơ
Plasmid trong Agrobacterium là công cụ tham gia trực tiếp và có vai trò
cực kỳ quan trọng trong việc đưa gen lạ vào tế bào thực vật. Do đó từ plasmid
Ti hoang dại, người ta đà cố gắng cải tiến sao cho plasmid này hoạt động hiệu
quả nhất [8]. Có 2 loại vectơ chính Agrobacterium sử dụng trong chuyển gen
gián tiếp.
+ Vectơ liên hợp (cointegrating):
Đầu tiên các gen giữ chức năng tạo khối u trên thực vật trong plasmid bị
loại bỏ đi, sau đó gắn thêm vào các gen chọn lọc, gen chỉ thị, các promoter
cần thiết cho gen mục tiêu và các promoter giúp cho plasmid nhân lên được
trong tế bào E.coli và Agrobacterium. Cụ thể như sau:

Quách Vũ Quỳnh Hương


18

Vùng polylinker có nhiều vị trí cắt giới hạn cho phép chèn vào các gen
đích mong muốn đưa vào thực vật và vùng bờ trái, bờ phải của plasmid được
bao bọc bởi 24 cặp bazơ lặp lại. Gen chọn lọc chứa các gen kháng kháng sinh
hoặc thuốc diệt cỏ... dùng dể chọn lọc các cá thể đà được chuyển gen. Gen
kháng kháng sinh nằm ngoài vùng T-DNA giúp chọn lọc các tế bào vi khuẩn
có mang plasmid.
+ Vectơ nhị nguyên (đồng nhập):
Vectơ này nhỏ hơn vectơ liên hợp, có ưu điểm cho plasmid tồn tại lâu hơn
trong tế bào E.coli và Agrobacterium. Hệ thống này gồm 1 cặp plasmid có khả
năng tự sao chép trong E.coli và Agrobacterium vì trên plasmid có điểm khởi
đầu sao chép ori.
Đầu tiên là một plasmid Ti hoang dại có mang gen vir nhưng không cã
vïng T-DNA - helper plasmid. Plasmid thø 2 lµ plasmid Ti, trên đó các gen
auxA, auxB và cyt trong vùng T-DNA của plasmid hoang dại đà bị lấy đi, sau
đó chèn thêm vùng để gắn gen mục tiêu với nhiều vi trí cắt giới hạn. Các gen
chọn lọc thực vật chuyển gen như gen kháng kanamycin, hygromycin cũng
được đưa vào vùng T-DNA. Những gen kháng này có nguồn gốc từ vi khuẩn
nhưng nó được biến thành các gen kháng của thực vật bằng cách gắn thêm
đoạn gen tín hiệu của thực vật như các promoter hay những đoạn được
polyadenin hóa để các gen này được biểu hiện. Vectơ này còn được chèn thêm
những gen cần thiết cho mục tiêu của thí nghiệm biến nạp trong đoạn T-DNA
như các gen chỉ thị GFP, GUS... Các gen nằm trong vùng T-DNA được sắp
xếp hợp lý nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển và biểu hiện
trong cây. Gen mục tiêu thường nằm ở gần bờ phải, nơi quá trình chèn vào gen

genome thực vật là trung thực nhất. Ngược lại các gen đánh dấu (marker) lại
được sắp xếp gần bờ trái. Vùng trung tâm của T-DNA là một promoter kép
được tạo dòng theo hướng ngược nhau giúp giảm ảnh hưởng của các DNA
xung quanh trong bộ gen thực vật lên sự biểu hiện của gen mục tiêu.

Quách Vũ Quỳnh Hương


19

I.4.2.3. Gen chỉ thị và gen chọn lọc
Tất cả các vectơ đều phải có ít nhất một gen chỉ thị hoặc chọn lọc để giúp
ta quan sát và chọn lọc những cây chuyển gen thành công. Các gen chon lọc
này thường mà hóa cho một enzym có khả năng khử độc tính của chất chọn
lọc như kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ trong quá trình chuyển hóa. Các gen
này còn dùng để phân tích bộ gen cây chuyển gen nhằm xác định việc đoạn
DNA đưa vào có hiệu quả hay không. Các gen này thường được kiểm soát
bởi các yếu tố điều hòa lấy từ virus như promoter 35S của cauliflower mosaic
virus (CaMV) hay promoter vµ terminator cđa gen tỉng hợp nopaline (nos).
Gen đánh dấu có thể thiếu mất đi phần promoter, mục đích là để nhận ra các
đoạn DNA đà được chèn vào trong.
NptII là gen chọn lọc được sử dụng phổ biến nhất, sản phẩm của gen là
enzym neomycin phosphotransferase (NPT), nó tự động phosphoryl hoá và bất
hoạt các kháng sinh kanamycin, neomycine trong tế bào thực vật [23][35].
Ngoài ra còn có các gen khác của vi khuẩn như CAT (Chloramphenicol
acetytransferase)

kháng

chloramphenicol

[35],

HPT

(hygromycin

phosphatransferase) kháng hygromycin (Vanden Elzen và cs, 1985) và PAT
(phosphophinothricine acetyltransferase) kháng thuốc trừ cỏ phosphinotricine
cũng được sử dơng rÊt phỉ biÕn hiƯn nay.
Gen chØ thÞ gióp nhËn biết tế bào hoặc thể chuyển gen vì nó tạo ra các sản
phẩm có thể nhận biết dễ dạng. Các gen CAT và -glucuronide của E.coli
(GUS) được dùng làm gen chỉ thị những tế bào đà biến đổi chứa gen ngoại lai
ổn định [43]. Tương tự, gen LUX của đom đóm và gen vibrio harveyi cũng
được sử dụng làm gen chỉ thị vì gen này mà hoá enzyme luciferase phát tia
sáng cũng rất dễ phát hiện.
Thông thường, khi thiết kế các gen chuyển vào thực vật, để cho quá trình
nhận biết hay thanh lọc sau này được thuận lợi người ta thường thiết kế các
vectơ mang một số gen bao gồm: gen mong muốn (gen kháng sâu, gen kháng

Quách Vũ Quúnh H­¬ng


20

thuốc trừ cỏ, gen kháng etylen, gen sinh tổng hợp protein...), gen chỉ thị (gen
GUS, gen phát huỳnh quang...), gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh...).
Có thể nêu ra đây một số ví dụ như chuyển gen CryIAc kháng sâu vào một
số giống cải bắp (Brassica oleracea var capitata) nhờ chủng vi khuẩn
Agrobacterium - GV 2260 mang vectơ nhị hợp pART27 chøa gen chän läc

NPT II (neomycin phosphat transferasa) kh¸ng kanamycin và gen CryIAc mÃ
hoá protein tinh thể kháng sâu tại Viện Di truyền Nông nghiệp [2], trong
chuyển gen kháng hygromycin, gen GUS và gen kháng bệnh bạc lá Xa-21 vào
lúa bằng phương pháp bắn gen, Viện Sinh học Nhiệt ®íi TPHCM ®· lÊy DNA
cđa 2 plasmid p35H chøa gen marker (hph) và 1 plasmid chứa gen quan tâm
(gen GUS hc Xa-21) [18] hay chđng A.tumefaciens EHA 105 chøa plasmid
ITB mang gen cryIA(c), gen bar vµ gen GUS A...
I.4.3. Giíi thiệu sơ lược về enzym thủy phân kháng nấm
Chitin và -1,3-glucan là các polysaccaride cấu thành chủ yếu của thành tế
bào nhiều loại nấm. Sự vững chắc về mặt cơ häc cđa thµnh tÕ bµo nÊm phơ
thc vµo chitin (mét loại -1,4-polyme của N-acetylglucosamine). Việc xử lý
hệ sợi của nấm với chitinase dẫn đến các tế bào bị phá vỡ tại đỉnh sinh trưởng
của sợi nấm [51]. Những enzym hay dùng nhất là endochitinase và -1,3endoglucanase đều thuộc nhóm các protein liên quan đến sự phát sinh bệnh
xuất hiện tự nhiên của cây, được cho là ức chế sinh trưởng của nấm, khi chúng
tích tụ lại thì có những phản ứng bảo vệ của cây trồng liên quan đến khả năng
hủy hoại thành tế bào nấm. Những gen này có nguồn gốc từ đậu đỗ, đại mạch,
cỏ ba lá hay từ lúa và đà được chuyển vào cây thuốc lá.
Bốn loại (I-IV) endochitinase trong đó có ba loại chính (I-III) và -1,3endoglucanase đà được mô tả. Các loại hydrolase I đà được định khu trong
các không bào của cây và đà chứng tỏ là có ảnh hưởng ức chế mạnh lên sự

Quách Vũ Quỳnh Hương


21

sinh tr­ëng cña nÊm in vitro. Sù øc chÕ sÏ rõ ràng hơn nhiều khi ứng dụng hỗn
hợp hai kiểu hydrolase, cho thấy các protein hoạt động hợp lực [8].
Chitinase (enzym tổng hợp chitin) nói chung được tìm thấy ở mức thấp
hoặc mức cơ bản trong cây khỏe mạnh. Sự biểu hiện của nó tăng lên khi
nguồn bệnh tấn công. Do kết quả của sự tương tác giữa vật chủ vµ ngn bƯnh

phơ thc nhiỊu vµo tÝnh nhanh chãng vµ cường độ của sự hoạt hóa phản ứng
bảo vệ. Broglie và cộng sự đà kết hợp gen CH 5B endochitinase ở cây họ đậu,
mà hóa một protein loại I với ®o¹n promoter cđa gen CaMV 35S dÉn ®Õn sù
biĨu hiƯn về cấu trúc cao trong sự đa dạng của các kiểu tế bào.
Nhóm J.Ryals tại CIBA, Research Triangle Park (USA) đà thông báo về sự
bảo vệ của các cây thuốc lá chuyển gen chống lại các nguồn bệnh nấm đủ loại
như là kết quả của sự biểu hiện ở mức cao các protein kết hợp với tính kháng
được nội hấp (synsetic acquired resistance-SAR) trong các cây này. Đa số các
protein SAR này thuộc nhóm các protein PR. Sự tích luỹ mRNA của chúng
không chỉ trong các lá sơ cấp bị nhiễm bệnh mà còn trong các lá thứ cấp
không bị nhiễm. Mục đích của nghiên cứu này là bảo vệ trên một phạm vi
rộng chống lại các nguồn bệnh bằng việc kết hợp sản xuất quá mức các
protein SAR trong các cây chuyển gen.
Các protein bất hoạt riboxom từ thực vật (RIPs) đà cho các khả năng khác
tiến gần đến thử nghiệm để hạn chế một cách đặc hiệu quá trình trao đổi chất
của nấm. Các enzym này hạn chế việc tổng hợp protein trong các tế bào đích
nhờ sự phân tách N-glycosidic của RNA 28 S. Có hai dạng RIP: một dạng là
protein chuỗi đơn, một dạng protein bao gồm hai chuỗi, một chuỗi tạo ra
galactose - một dạng lectin đặc trưng có thể gắn với bề mặt tế bào. RIPs nằm
trong số các độc tố tự nhiên hiệu lực mạnh, được biết đến nhiều nhất trong số
này là ricin. RIPs không cản trở chức năng của bản thân các ribosome
nhưng lại gây ra các hoạt động ức chế khác nhau về phía các ribosome của các
loài có họ hàng xa, kể cả các riboxom nấm. Kiểu RIP I được tinh chế từ lúa

Quách Vũ Quỳnh Hương