Sự biến đổi sinh hóa trong quá trình lên men dịch thủy phân cá bởi tetragenococcus halophilus CH6 2 và CH8 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------***--------

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

SỰ BIẾN ĐỔI SINH HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
DỊCH THỦY PHÂN CÁ BỞI TETRAGENOCOCCUS
HALOPHILUS CH6-2 VÀ CH8-2

LUẬN VĂN TÁC GIẢ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------***--------

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

SỰ BIẾN ĐỔI SINH HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
DỊCH THỦY PHÂN CÁ BỞI TETRAGENOCOCCUS
HALOPHILUS CH6-2 VÀ CH8-2

LUẬN VĂN TÁC GIẢ KỸ THUẬT
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS LÊ THANH HÀ

Hà Nội - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Học viên: Nguyễn Thị Thanh Tâm
Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Người hướng dẫn : PGS.TS. Lê Thanh Hà
Tên luận văn: “Sự biến đổi sinh hóa trong q trình lên men dịch thủy
phân cá bởi Tetragenococcus halophilus CH6-2 và CH8-2 ”.
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Lê Thanh Hà. Luận văn này khơng có sự trùng lặp với
các đề tài khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Tâm

i


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới:

PGS. TS. Lê Thanh Hà, Giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện
Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội,
người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để
tơi hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh
học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và
giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn.
Trong thời gian thực tập và làm việc tại phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học
- Viện Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, tôi đã nhận được sự quan tâm
giúp đỡ, sự chỉ bảo tận tình về chun mơn, kĩ thuật cùng sự động viên chân thành của
thầy cô và tập thể học viên, sinh viên thực tập tại phịng. Tơi xin chân thành cảm ơn sự
giúp đỡ q báu đó.
Cuối cùng tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo
điều kiện, quan tâm và góp ý cho tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và
hồn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Tâm

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................................ ii
MỤC LỤC...................................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT......................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................................ viii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC MẮM ........................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu............................................................................................................... 3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm ..................................................................... 4
1.1.3. Quá trình hình thành nước mắm........................................................................ 6
1.2. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT NƯỚC MẮM ....................................................... 9
1.2.1. Phương pháp truyền thống ................................................................................. 9
1.2.2. Phương pháp cải tiến ......................................................................................... 11
1.2.3. Tình hình nghiên cứu nước mắm hiện nay ở nước ta..................................... 12
1.3. CHỦNG KHỞI ĐỘNG ......................................................................................... 15
1.3.1. Vi khuẩn Lactic .................................................................................................. 15
1.3.2. Tetragenococcus .................................................................................................. 16
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 18
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 18
2.2. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG .......................................................... 19
2.2.1 . Thiết bị ............................................................................................................... 19

iii


2.2.2. Hóa chất .............................................................................................................. 20
2.2.3. Mơi trường .......................................................................................................... 20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 21

2.3.1. Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu của chủng Tetragenococcus
halophilus CH8-2 .......................................................................................................... 21
2.3.2. Ứng dụng chủng Tetragenococcus halophilus CH6-2 và CH8-2 trong lên
men dịch thủy phân cá ................................................................................................. 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 33
3.1. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CHỦNG TETRAGENOCOCCUS
HALOPHILUS CH8-2. .................................................................................................. 33
3.1.1. Ảnh hưởng của pH môi trường......................................................................... 33
3.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ .................................................................... 34
3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối ........................................................................... 35
3.1.4. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường dinh dưỡng ......................................... 36
3.1.5. Đường cong sinh trưởng và xác định thời gian thu sinh khối ...................... 37
3.2. ĐỘNG HỌC TRONG LÊN MEN DỊCH THỦY PHÂN CÁ BỔ SUNG
CHỦNG KHỞI ĐỘNG TETRAGENOCOCCUS HALOPHILUS

CH6-2 và

CH8-2............................................................................................................................. 39
3.2.1. Sự thay đổi pH trong quá trình lên men .......................................................... 39
3.2.2. Sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men.................................... 40
3.2.3. Sự thay đổi hàm lượng α - amio acid................................................................ 41
3.2.4. Axit amin tự do trong dung dịch sau lên men ................................................. 42
3.2.5. Sự thay đổi của các hợp chất bay hơi ............................................................... 43
3.2.6. Đánh giá cảm quan dịch lên men thời điểm 180 ngày .................................... 44

iv


1. KẾT LUẬN ............................................................................................................... 46
2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 46

PHỤ LỤC ...................................................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 48

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC

VIẾT TẮT

OD

Độ đo quang

LAB

Vi khuẩn lactic

CH6-2

Tetragenococcus halophilus CH6-2

CH8-2

Tetragenococcus halophilus CH8-2

CFU (Colony forming unit)

Đơn vị khuẩn lạc

VSV

Vi sinh vật

K1, K2

Mơi trường Khống 1, Khoáng 2

E

Enzyme

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Nước mắm cá cơm ......................................................................................3
Hình 2.1. Môi trường khảo sát pH trước và sau nuôi chủng CH8-2 .........................22
Hình 2.2. Mơi trường khảo sát nồng độ muối trước và sau ni chủng CH8-2 .......23
Hình 2.3. Mơi trường khảo sát MRS, K1, K2 trước và sau nuôi chủng CH8-2 .......24
Hình 2.4. Đường chuẩn Ninhydrin ở bước sóng 570nm...........................................28
Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH mơi trường đến sự sinh trưởng của chủng
T.halophilus CH8-2 ...................................................................................................33
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng CH8-2 ................34
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng T.halophilus
CH8-2 ........................................................................................................................35
Hình 3.4. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của chủng T.
halophilus CH8-2 ......................................................................................................37
Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của chủng T. halophilus CH8-2 ........................38

Hình 3.6. Sự thay đổi pH trong quá trình lên men ...................................................39
Hình 3.7. Kết quả khảo sát số tế bào tại các thời điểm lên men ...............................40
Hình 3.8. Kết quả khảo sát hàm lượng α- amino acid tại các thời điểm lên men .....41
Hình 3.9. Biểu đồ phân tích acid amin tự do (mg/L) trong dịch lên men .................42
Hình 3.10. Đánh giá cảm quan ..................................................................................44

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân hạng nước mắm [1]......................................................................................... 4
Bảng 2.1. Đặc điểm chủng ....................................................................................................... 18
Bảng 2.2. Thành phần mơi trường MRS, Khống 1, Khống 2 [13] ............................ 20
Bảng 2.3. Chế độ rửa giải trong sắc ký HPLC .................................................................... 29
Bảng 3.1. Thành phần các hợp chất dễ bay hơi .................................................................. 43
Bảng 3.2.. Kết quả phân tích acid amin tự do (mg/L) trong dịch lên men sau 180
ngày ................................................................................................................................................ 47

viii


MỞ ĐẦU
Nước mắm là một loại nước chấm quen thuộc được ưa chuộng nhất ở nước ta
và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày. Nước mắm có giá trị dinh dưỡng cao,
hấp dẫn người ăn bởi hương vị đậm đà, đặc trưng mà không loại sản phẩm nào có thể
thay thế được.
Theo hãng nghiên cứu thị trường Euromonitor, thị trường nước mắm ước tính
có giá trị khoảng 4.5 tỷ USD và có mức tăng trưởng hàng năm khoảng 4.7% trong giai
đoạn từ 2016 đến 2021. Trong đó, thị trường nước mắm Việt Nam được định giá vào
khoảng 501 triệu USD, với sản lượng hơn 70.000 tấn nước mắm được sản xuất trong

năm 2015.
Nước mắm sản xuất theo phương pháp cổ truyền ở Việt Nam có mùi vị thơm
ngon đặc trưng. Tuy nhiên nó có nhược điểm là hàm lượng nitơ khơng cao, chu kì sản
xuất q dài (từ 6 tháng đến 1 năm hoặc có thể lâu hơn). Vài chục năm gần đây có
nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước nhằm rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao
chất lượng, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của thị trường trong và ngoài nước. Nhưng
sản phẩm chế biến từ các phương pháp cải tiến này đã gặp trở ngại về hương vị vì sự
tạo thành hương vị của nước mắm chủ yếu là do vi sinh vật trong quá trình phân hủy cơ
chất tạo thành, mà để tạo hương thì cần thời gian dài.
Trong các nghiên cứu của Thái Lan và Hàn Quốc đã chứng minh vai trò quan
trọng của vi khuẩn lactic chịu mặn Tetragenococcus (chịu nồng độ muối 18-25%)
trong tạo hương nước mắm. Tetragenococcus là loài chủ yếu từ tháng thứ 4 lên men
trong nước mắm Hàn Quốc. Ngoài ra Tetragenococcus đã được chứng minh có trong
nước tương của Hàn Quốc, Nhật Bản và có vai trò quan trọng trong tạo hương.
Tetragenococcus còn sinh peptidase nên có thể thúc đẩy q trình thủy phân peptid
thành axit amin, vừa cải thiện vị vừa nâng cao giá trị dinh dưỡng của nước mắm.
Hiện nay ở Thái Lan, một nước có truyền thống sản xuất nước mắm đã có
hướng nghiên cứu cải thiện quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng việc bổ sung
các chủng vi khuẩn lactic chịu mặn Tetragenococcus halophilus. Kết quả nghiên cứu

1


cho thấy có thể rút ngắn thời gian lên men xuống còn 4-6 tháng, tăng hàm lượng nito
tổng và nito amin, giảm các amin không mong muốn như histamin, tryptamin,
putrescin với chất lượng cảm quan màu sắc, hương vị tương đương nước mắm truyền
thống.
Udomsil đã phân lập được các vi khuẩn lactic, xác định là Tetragenococcus
halophilus phát triển ở nồng độ 25% NaCl, và đóng vai trị quan trọng trong quá trình
hình thành hương bởi các hợp chất bay hơi [23]. Chính vì vậy việc sử dụng

Tetragenococcus halophilus làm chủng khởi động cho dịch thủy phân cá bằng enzyme,
có thể rút ngắn thời gian lên men, tăng độ đạm mà vẫn giữ được hương vị của nước
mắm truyền thống.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, nhằm mục tiêu tối ưu hóa các
các điều kiện lên men nước mắm, tôi quyết định chọn đề tài “ Sự biến đổi sinh hóa
trong q trình lên men dịch thủy phân cá bởi Tetragenococcus halophilus CH6-2
và CH8-2 ”
Đề tài gồm 2 nội dung chính:
Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu của chủng Tetragenococcus
halophilus CH8-2.
Ứng dụng chủng Tetragenococcus halophilus CH6-2 và CH8-2 trong lên men
dịch thủy phân cá, xác định các chỉ tiêu:
• pH
• Sự thay đổi các hợp chất bay hơi
• Khả năng tạo axit amin

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC MẮM
1.1.1. Giới thiệu
Nước mắm là một loại gia vị có giá trị dinh dưỡng cao không chỉ phổ biến tại
Việt Nam mà còn được ưa chuộng tại nhiều quốc gia châu Á như Malaysia, Hàn
quốc, Thái Lan,…. Nước mắm được tạo ra nhờ sự kết hợp giữa cá cùng với muối ở
tỷ lệ thường là 3:1 và lên men trong khoảng từ 12 – 18 tháng [25]. Mắm cá đang
muối được gọi là chượp. Khi chượp chín đem lọc hoặc đem nấu rồi lọc ta được
nước mắm. Mỗi nước có kiểu sản xuất khác nhau tạo ra sản phẩm có giá trị dinh
dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau mang hương vị đặc trưng cho từng quốc gia và
dân tộc.

Thái Lan là nước sản xuất nước mắm hàng đầu trên thị trường thế giới.
Ngành công nghiệp nước mắm ở Thái Lan đã được mở rộng từ quy mô trong nước
sang quy mô quốc tế trong 50 năm qua. Tại Việt Nam nghề làm mắm có từ lâu đời,
mang bản sắc của dân tộc. Nước mắm hấp dẫn mọi người bởi hương vị đậm đà và
giá trị dinh dưỡng cao.

Hình 1.1. Nước mắm cá cơm

3


Nước mắm được chế biến theo phương pháp truyền thống ở Việt Nam có
mùi vị thơm ngon đặc trưng nhưng độ đạm không cao, thời gian lên men kéo dài từ
12 – 18 tháng, năng suất không cao và không kinh tế. Vì vậy, những năm trở lại đây
nhiều nghiên cứu như bổ sung enzyme hoặc các axit, kiềm, giảm nồng độ muối hay
tăng nhiệt độ,… được thực hiện trong và ngoài nước nhằm rút ngắn thời gian lên
men nước mắm, tăng độ đạm nhưng các phương pháp này đều có nhược điểm, chi
phí cao và khơng tạo được hương vị như nước mắm truyền thống. Vì vậy, khơng
được ứng dụng trong sản xuất nước mắm thương mại.
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm
1.1.2.1. Chất đạm
Các chất đạm chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước
mắm. Đạm bao gồm 3 loại, trong đó đạm tổng số là tổng lượng nitơ có trong nước
mắm (g/L), quyết định phân hạng nước mắm; đạm amin là tổng lượng nitơ nằm
dưới dạng amin (g/L), quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm và đạm amon là
đạm thối, làm giảm chất lượng nước mắm. [1]
Mặt khác, trong nước mắm có chứa rất nhiều loại acid amin, đặc biệt là các
acid min không thay thế như: isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine,
threonine, tryptophan, valine và histidine. Tùy theo nguyên liệu cá mà tỉ lệ các loại
acid amin này khác nhau. Chính những thành phần trung gian này làm cho nước

mắm dễ bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật.
Bảng 1.1. Phân hạng nước mắm
Mức chất lượng
STT

Tên chỉ tiêu

Nước mắm
nguyên chất

1

Hàm lượng nitơ tổng số, tính bằng g/l,
khơng nhỏ hơn

2

Hàm lượng nitơ axit amin, tính bằng %
so với nitơ tồn phần, không nhỏ hơn

4

Nước mắm

10

10

35

35


3

Hàm lượng nitơ amơniac, tính bằng %
so với nitơ tồn phần, khơng lớn hơn

4

Hàm lượng muối, tính bằng g/l, trong
khoảng

30

30

245

200

(TCVN 5107 : 2018 NƯỚC MẮM)
1.1.2.2. Các hợp chất bay hơi
Các hợp chất bay hơi trong nước mắm rất phức tạp và quyết định hương vị
của nước mắm. Các hợp chất bay hơi được tạo ra từ quá trình thủy phân protein,
oxy hóa lipid nhờ hệ enzyme nội bào và enzyme trong vi khuẩn ruột cá. Các
aminopeptidase chuyển peptide, oligopeptide thành amino acid, các amino acid này
là tiền chất quan trọng của các chất sinh hương. Hàm lượng các chất bay hơi trong
nước mắm (mg/100g nước mắm), bao gồm: cacbonyl bay hơi 407 - 512
(formaldehyde), các acid bay hơi 404 - 533 (propionic), các amin bay hơi 9.5 - 11.3

(izopropylamin), các chất trung tính bay hơi 5.1 - 13.2 (acetaldehyde).
Theo kết quả nghiên cứu của Dougan và Howard (1975), hương nước mắm
được tạo nên từ 3 loại hương vị đặc biệt [9] :
• Hương thối của amoniac được hình thành từ sự tổng hợp của amoniac, các
amin và các hợp chất chứa nitơ.
• Hương phomat được hình thành từ các acid béo bay hơi có khối lượng
phân tử thấp và ketonemethyl.
• Hương thịt thì phức tạp hơn, được hình thành từ sự oxi hóa các cơ chất
nguyên liệu cá trong nước mắm và các ketoneacid.
Rossana R. Peralta và cộng sự (1996) đã báo cáo rằng: có khoảng 155 chất
bay hơi đã được xác định, trong đó bao gồm 14 acid, 36 hợp chất cacbonyl, 17 hợp
chất chứa nito, 10 hợp chất chứa lưu huỳnh,… Trong đó số lượng lớn các acid,
cacbonyl và các hợp chất chứa lưu huỳnh như dimethyl sulfide, dimethyl trisulfide
và 3-(methylthio) propanal cũng như nhiều hợp chất chứa nito là những thành phần
chính tạo nên mùi hương đặc trưng của nước mắm. [3]

5


Katsuya Fukami và cộng sự (2002) đã xác định các hợp chất bay hơi đặc biệt
trong nước mắm. Kết quả là có 4 hợp chất tạo nên mùi hương đặc trưng cho nước
mắm là 2 - methylpropanal, 2 - methylbutanal, 2 - ethylpridine và dimethyl
trisulfide. [12]
Mới đây nhất, Xu Wei và cộng sự, năm 2010, đã phân tích các hợp chất bay
hơi trong nước mắm có nồng độ muối thấp. Kết quả 91 hợp chất được tìm thấy, bao
gồm: 7 hợp chất axit, 5 hợp chất alcohol, 26 hợp chất carbon, 4 hợp chất ester, 18
hợp chất chứa nito, 14 hợp chất chứa furan, 5 hợp chất phenol và 7 hydrocarbon
khác [29]. Một số hợp chất tạo nên mùi hương đặc trưng của mắm, trong đó có 4
hợp chất như Katsuya Fukami đã đưa ra [11].
Từ những kết quả nghiên cứu về các hợp chất bay hơi trong nước mắm giúp

các nhà khoa học có những nghiên cứu, bổ sung các hợp chất gây hương, các
enzyme, các vi sinh vật có tác dụng hình thành các hợp chất bay hơi trong q trình
lên men nước mắm. Từ đó ứng dụng vào nâng cao hương nước mắm trong sản xuất
nước mắm ngắn ngày.
1.1.2.3. Các chất khác
Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250 - 280g/L và một số các chất khoáng như: S,
Ca, Mg, P, I, Br....
Các Vitamin như B1, B2, B12, PP. Thành phần và hàm lượng vitamin khác
nhau tùy vào từng loại cá, độ tươi, phương pháp chế biến.
1.1.3. Quá trình hình thành nước mắm
Ngun liệu chính để sản xuất nước mắm là cá và muối. Nước mắm được
hình thành do việc thay đổi các đặc tính vật lý, hóa học và vi sinh của dịch cá ở
nồng độ muối cao và nồng độ oxi thấp.
1.1.3.1. Cơ chế lên men nước mắm
Bản chất của quá trình lên men nước mắm là sự thủy phân protein cá thành
acid amin và peptid nhờ enzyme protease của vi sinh vật có trong ruột cá và hệ

6


enzyme nội bào. Quá trình này là một quá trình phức tạp vì tính đặc hiệu của
enzyme chỉ tác dụng lên một số chất đặc hiệu và một số kiểu liên kết nhất định.
Protease
Protein

E

polypeptid

E

peptid

acid amin

Song song với quá trình thủy phân protein cá thành acid amin và peptid bậc
thấp là quá trình hình thành hương, các hợp chất bay hơi, tạo mùi hương đặc trưng
cho nước mắm.
1.1.3.1. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến q trình lên men nước mắm
Cá là nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước mắm. Cá đóng vai trị quan
trọng, ảnh hưởng quyết định nhiều đến thành phần, chất lượng và giá thành của
nước mắm, vì thế lựa chọn loại cá để sản xuất hết sức quan trọng. Nước mắm chủ
yếu được sản xuất từ các loại cá biển nhỏ như: cá nục, cá tráp, cá liệt, cá tạp… là
những lồi cá có giá trị kinh tế thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng loại cá gì cho sản xuất
cịn phụ thuộc vào từng địa phương, mùa vụ khác nhau. Nên sử dụng loại cá gầy, có
hàm lượng lipit thấp (< 0.1%). Sử dụng các loại cá có kích thước nhỏ để giảm bớt
cơng đoạn xử lý nguyên liệu, đồng thời kích thước nhỏ diện tích bề mặt tiếp xúc
giữa muối và cá tăng lên, làm cho q trình thủy phân diễn ra nhanh chóng. Tuyệt
đối khơng dùng các loại cá có chứa độc tố để chế biến nước mắm. Khơng dùng các
loại cá có chứa tỉ lệ cơ thịt đỏ cao như cá ngừ, cá thu, cá sịng…vì trong thành phần
của cơ thịt đỏ có chứa nhiều acid amin histidin, đây là một tiền chất của histamin,
một amin có khả năng gây ngộ độc cao. Nếu sử dụng cá Cơm thì nước mắm thành
phẩm có hương vị thơm ngon đặc trưng hơn, nguồn nguyên liệu cá tạp thì nước
mắm thành phẩm có hương vị kém đặc trưng, do đó phải kéo rút qua chượp gây
hương để bổ sung hương vị. Sở dĩ nước mắm được làm từ cá cơm cho hương vị
thơm ngon hơn vì cá cơm là loài cá ăn nổi, hoạt động mạnh nên thành phần của cá ít
mỡ. Trong sản xuất khơng tạo lớp máng mỡ dày, do đó mùi vị ơi khét ít xảy ra. Cá
cơm nói riêng và cá tầng nổi nói chung có kích thước nhỏ hơn các loại cá khác nên

7

dễ thủy phân, hoạt tính enzyme protease trong thịt và ruột cá cao hơn các loại cá
khác nên quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn. Vì vậy, cùng một thời gian sản xuất
(6 – 12 tháng) thì ở các bể chượp có nguyên liệu là cá cơm, việc thủy phân diễn ra
triệt để hơn, khơng cịn mùi vị tanh ngái của cá.
Muối là nguyên liệu quan trọng thứ hai, do đó nguyên liệu muối cũng được
lựa chọn phù hợp. Muối có nhiều loại như muối mỏ, muối biển, muối giếng. Do đặc
điểm nước ta có bờ biển dài, khí hậu nhiệt đới gió mùa nên muối được sản xuất từ
nước biển là phương pháp phổ biến nhất. Thành phần hóa học của muối sẽ ảnh
hưởng tới chất lượng mùi vị của nước mắm. Cả muối biển và muối mỏ có natri
clorua (NaCl) là thành phần chính. Muối thường được sử dụng trong ngành nước
mắm là muối biển. Trong muối biển Thái Lan, natri clorua là 88.26 ± 2.79% trong
khi muối từ các nước khác có hàm lượng NaCl cao hơn (~ 97%) (Wilaipun, 1990)
[29].
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng để phát huy tác dụng tích cực của các loại
enzyme. Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng của các
enzyme sẽ tăng, nhưng nhiệt độ tăng cao quá sẽ ức chế enzyme và quá trình thuỷ
phân sẽ giảm. Vì enzyme mang bản chất là protein nên chúng không chịu được
nhiệt độ cao. Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định, do đó ta cần
tạo một nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh trưởng.
pH của mơi trường ảnh hưởng đến q trình lên men nước mắm, mỗi hệ enzyme
có pH tối thiểu khác nhau vì vậy phải tạo pH thích hợp cho enzyme hoạt động.
Tỷ lệ cá và muối là một yếu tố khác ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm. Ở
mỗi quốc gia khác nhau, tỷ lệ cá với muối thay đổi tùy thuộc vào loại cá và điều
kiện của mỗi địa phương. Nói chung, tỷ lệ cá và muối sẽ thay đổi tùy thuộc vào kích
cỡ cá được sử dụng trong sản xuất. Ở nồng độ muối khác nhau, hoạt động của vi
khuẩn và enzyme sẽ thay đổi dẫn đến thay đổi hương vị của nước mắm. Hàm lượng
muối giúp xác định các loại vi sinh vật có các hoạt tính enzyme khác nhau trong quá

8

trình lên men ở nồng độ muối cao. Các sản phẩm chuyển hóa khác nhau từ các vi
sinh vật khác nhau cũng ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm. [29]
Bảng 1. Điều kiện sản xuất nước mắm ở một số quốc gia [40]
STT
1

Quốc gia

Tên sản phẩm

Tỉ lệ cá : muối

Thời gian lên men

Nhật Bản

Shottsuru Uwoshoyu

5:1

6 tháng

2

Hàn Quốc

Jeot – kal

4:1

6 tháng

3

Việt Nam

Nước mắm

3:1 - 3:2

4 - 12 tháng

4

Thái Lan

Nam – pla

5:1

5 - 12 tháng

5

Malaysia

Budu

5:1 – 3:1

3 - 12 tháng

6

Philipin

Patis

3:1 – 4:1

3 - 12 tháng

1.2. Phương pháp sản xuất nước mắm
1.2.1. Phương pháp truyền thống
Phương pháp truyền thống là phương pháp lên men tự nhiên sử dụng hệ
enzyme sẵn có trong nội tạng cá và thịt cá cũng như hệ vi sinh vật tự nhiên sẵn có
trong cá và muối. Có hai phương pháp phổ biến là phương pháp đánh khuấy và
phương pháp gài nén.
1.2.1.1. Phương pháp đánh khuấy
Đánh khuấy là phương pháp sản xuất của huyện Cát Hải, Hải phòng. Phương
pháp này có đặc điểm là muối được cho nhiều lần vào cá, thêm nước lã, kết hợp với
đánh khuấy, tiếp nhiệt bằng cách phơi nắng cho đến khi chượp chín.
Việc cho muối nhiều lần lợi dụng được khả năng phân giải của enzym và vi
sinh vật tới mức độ cao, rút ngắn thời gian chế biến chượp. Đồng thời cho muối vào
nhiều lần tạo điều kiện đề phòng thối, tiêu diệt các vi khuẩn gây thối hỏng thông
thường và không kìm hãm quá nhiều khả năng hoạt động của enzym.
Việc cho thêm nước lã để làm loãng khối dịch cá, cung cấp một lượng vi
sinh vật đáng kể, tạo môi trường lỏng giúp cho vi sinh vật hoạt động được dễ dàng

9


khiến protein cá nhanh chóng được phân giải, làm tăng tốc độ thủy phân của enzym.
Mặt khác nước lã cho vào làm độ loãng của khối chượp tăng, dễ dàng cho việc đánh
khuấy, nhiệt độ của khối dịch được phân phối đều, thịt cá mau nát. Lượng nước cho
thêm vào nên vừa phải, nếu ít q thì tác dụng thủy phân protein kém nhưng nếu
nhiều q thì khơng khống chế được quá trình thối rữa, đồng thời làm giảm độ đạm
trong nước mắm. Vì vậy, lượng nước cho vào cịn tùy thuộc đặc điểm của nguyên
liệu, thường từ 20-30% so với cá.
Phơi nắng và đánh khuấy nhằm mục đích hấp thu nhiệt tạo điều kiện cho hệ
enzyme hoạt động mạnh, tốc độ phân giải nhanh, chượp mau chín. Ngồi ra việc
đánh khuấy là tác dụng cơ học làm cho thịt cá nhanh rã, làm tăng diện tích tiếp xúc
với enzyme, nhiệt phân bố đều từ trên xuống, làm cho muối nhanh tan và đều khắp
chượp.
Ưu điểm: thời gian chế biến ngắn
Nhược điểm: độ đạm không cao, lượng hao hụt nhiều, phải theo dõi thường
xuyên, mùi vị của nước mắm không thơm ngon đậm đà như phương pháp gài nén
rút nỏ, tỉ lệ đạm thối trong nước mắm cao, công nhân thao tác khơng có kinh
nghiệm rất dễ hỏng chượp hoặc chượp chất lượng kém.
1.2.1.2. Phương pháp gài nén
Theo phương pháp này, protein cá được thủy phân do vi sinh vật trong cá,
không cho nước lã và không đánh khuấy. Đặc điểm của phương pháp này là muối
được cho vào cá một lần ngay từ đầu theo tỉ lệ khoảng 1:3, trộn đều rồi cho vào
thùng (tốt nhất là thùng gỗ), rải thêm lớp muối khoảng 3-5 cm trên mặt để giữ nhiệt
và tránh ruồi nhặng, gài nẹp, đè đá bên trên để nén, tiếp nhiệt tự nhiên và kéo rút,
đảo nước bổi đến khi chượp chín hồn tồn. Khi đã cho đủ muối thì thân cá đã
ngấm đủ muối, nát đều và chìm xuống, khơng cịn hiện tượng trương và nổi lên nữa.
Nhờ nén chặt, nhiệt độ trong cá làm cho vi sinh vật hoạt động tốt hơn, hình thành

các khí NH3, CO2, H2S… làm cá trương lên, thịt cá bị xẻ nát nhưng da cá vẫn còn
nguyên.. Sau khi rút nước bổi, thể tích chượp giảm đáng kể, cá chìm xuống, nước

10


nổi lên có màu vàng trong và có mùi hương đặc trưng, khơng cịn mùi tanh của cá.
Màu sắc của nước mắm chuyển từ vàng nhạt sang vàng đậm, nước mắm trong.
Ưu điểm: chất lượng nước mắm thơm ngon hơn, đạm thối ít hơn, màu sắc và
mùi vị nước mắm tốt hơn.
Nhược điểm: thời gian chế biến rất dài.
1.2.2. Phương pháp cải tiến
Quá trình lên men nước mắm truyền thống kéo dài trong thời gian 1 năm. Do
vậy cải tiến quá trình lên men bằng cách như giảm lượng muối, bổ sung enzyme,
axit, kiềm…đều đã được sử dụng để rút ngắn thời gian lên men nước mắm.
1.2.2.1. Phương pháp hóa học:
Cơ chế của phương pháp này là sử dụng các hóa chất như HCl, NaOH ,
H2SO4, Na2CO3 để thủy phân protein thịt cá thành acid amin.
Ưu điểm: rút ngắn thời gian sản xuất, màu sắc đẹp, đạm thối ít, tổn hao acid
amin thấp.
Nhược điểm: mùi vị không được đặc trưng, cịn tồn đọng độc tố trong sản
phẩm do q trình chế biến sử dụng hóa chất ở nhiệt độ cao và thời gian dài.
1.2.2.2. Phương pháp enzyme:
Cơ chế của phương pháp này là sử dụng enzyme protease từ bên ngoài đưa
vào để tăng quá trình thủy phân protein thịt cá thành acid amin nhằm rút ngắn thời
gian sản xuất nước mắm, sau đó đem lọc và điều chỉnh chất lượng cho đạt yêu cầu
trước khi ra thành phẩm. Tuy nhiên, mỗi loại enzyme tách chiết từ các nguồn khác
nhau có hoạt tính thuỷ phân (phân cắt) protein khác nhau, điều kiện phản ứng khác
nhau (pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu…), tính chịu mặn khác nhau, hoạt động khác nhau
(phân cắt đến polypeptide hay phân cắt đến tận axit amin). Thông thường enzyme

này được tách chiết từ chủng nấm mốc Asp.Oryaze.
Ưu điểm: ít độc hại, thời gian ngắn, lượng mắm cốt nhiều.
Nhược điểm: thời gian lên men ngắn nên chưa đáp ứng được mùi vị đặc
trưng của nước mắm, để cải thiện người ta cho chạy qua chượp tốt để lấy hương vị
nước mắm, chi phí sản xuất cao.

11


1.2.2.3. Phương pháp vi sinh vật:
Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm ngắn ngày sẽ chuyển hóa những protein
phức tạp của nguyên liệu thành acid amin. Ngoài ra, vi sinh vật còn tạo mùi vị đặc
trưng cho từng sản phẩm nước mắm khác nhau.
Rất nhiều nghiên cứu về phân lập và ứng dụng vi khuẩn có khả năng chịu
mặn, sinh protease và sinh hương như Tetragenococcus. sp, Vigrilbacillus.sp. Hàm
lượng α-amino trong cá lên men tháng thứ tư có bổ sung Vigrilbacillus. sp cao hơn
mẫu đối chứng [30]. Tương tự Aquerreta, Astiasaran và Bello (2001) đã báo cáo
rằng proteinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis có thể làm tăng hàm lượng α-amino
trong 40 ngày lên men [32]. Những nghiên cứu trên cho thấy sử dụng vi khuẩn có
khả năng sinh proteinase như chủng khởi động có thể làm giảm thời gian lên men.
Ở Việt Nam chúng ta công nghệ sản xuất nước mắm cũng tương đối phát
triển. Phương pháp nghiên cứu bổ sung vi vinh vật ưa mặn sinh protease làm chủng
khởi động trong lên men nước mắm ngắn ngày là hướng nghiên cứu triển vọng,
thiết thực nhằm khắc phục tất cả nhược điểm của các phương pháp cũ.
1.2.3. Tình hình nghiên cứu nước mắm hiện nay ở nước ta
Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Trung tâm giáo dục thường xuyên và Đào
tạo cán bộ Quảng Ninh đã nghiên cứu và tìm tỷ lệ kết hợp thích hợp 2 loại enzyme
Alcalase và Flavourzyme trong việc bổ sung vào quá trình lên men nước mắm.
Nhóm nghiên cứu đã triển khai kiểm nghiệm tồn bộ quy trình sản xuất tại Cơng ty
CP Thuỷ sản Cái Rồng, với quy mô 120kg cá/lần chượp cá trên 3 loại cá, dựa theo

cơng thức có tỷ lệ 0.4% Alcalase + 0.6% Flavourzyme. Kết quả cho thấy, sau 8
tháng, nhóm nghiên cứu thu được nước mắm cốt có hàm lượng Nito tổng số đạt
28.7g/L đối với cá cơm, 28.14g/L đối với cá nục và 28.77g/L đối với cá trích. Trong
khi đó, mẫu đối chứng khơng bổ sung enzyme ở cùng thời điểm có hàm lượng Nito
tổng chỉ đạt lần lượt là 22.01g/L, 19.17g/L và 19.45g/L. Để sản phẩm có hương vị
thơm ngon và đậm đà hơn, các nhà nghiên cứu tiếp tục cải tiến hương vị bằng cách
ủ với bã chượp truyền thống trong thời gian từ 20 - 30 ngày. Sau đó, bã chượp thu

12


được đem chan với 300L nước muối 25%, ủ tiếp từ 1 - 2 tháng thì cho hương vị
nước mắm tương đương với hương vị truyền thống. [1]
Theo một nghiên cứu của Trường Đại học nông lâm TP.HCM, 5 chủng vi
khuẩn hiếu khí Bacillus sp. và 2 chủng kị khí Clostridium sp. được phân lập có khả
năng sinh protease, chịu được nồng độ muối cao, trong đó chủng Bacillus sp.1 và
Bacillus sp.4 là 2 chủng có khả năng thủy phân protein cao hơn các chủng khác. Từ
đó chọn 2 chủng này để bổ sung vào chượp mắm làm tác nhân thúc đẩy quá trình
thủy phân của chượp mắm tốt và chủng Clostridium sp.1, Clostridium sp.2 là chủng
có khả năng sinh hương nước mắm tốt hơn các chủng còn lại trên nguồn nguyên
liệu nấm. Từ đó chọn 2 chủng này làm tác nhân bổ sung vào chượp mắm làm tác
nhân thúc đẩy quá trình sinh hương nước mắm nhằm tạo sản phẩm nước mắm chay
có mùi thơm đặc trưng của nước mắm cá. [3]
Nguyễn Lân Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Duy (1964) đã sử dụng
protease từ nấm mốc Asp. Oryzae để rút ngắn thời gian sản xuất.
Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty (1967) đã phân lập và tuyển chọn chủng
nấm mốc thuộc giống Aspergillus có năng lực phân giải protein cá, nghiên cứu điều
kiện tốt nhất để sản xuất lớn các loại nấm mốc này trên môi trường đơn giản. Trộn
nấm mốc với cá để từ 1-3 ngày ở nhiệt độ 55oC, kết quả cho thấy bã và xương lắng
xuống, nước cốt ở trên trong, nhưng hương vị không bằng nước mắm cổ truyền.

Năm 1975, một nhóm cán bộ nghiên cứu của viện nghiên cứu Hải sản Hải
Phòng, đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm protease của vi khuẩn Bacillus
pumillus vào quá trình thủy phân cá, kết quả cho thấy: khi cho thêm protease ngoại
bào của Bacillus pumillus với tỉ lệ 1% (so với cá) thì tăng nhanh quá trình thủy phân
một cách rõ rệt ở 24 giờ đầu, dịch thủy phân thu được có màu cánh gián, vị ngọt,
mùi thơm nước mắm, khơng có mùi lạ, và hàm lượng đạm cao hơn mẫu đối chứng.
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Ngô Thị Mai, Nguyễn Thị Dự (1991)
dùng protease của vi khuẩn Bacillus subtilis bổ sung vào chượp cho thấy: với lượng
0,3% chế phẩm protease của B.subtilis bổ sung vào chượp, trong điều kiện ổn định

13


ở 50oC, thời gian chế biến rút ngắn còn 10 ngày và 30-35 ngày trong điều kiện tiếp
nhiệt tự nhiên vào mùa hè. Dịch lọc sau khi thủy phân được đánh giá tốt về thành
phần hóa học và cảm quan. Tăng hiệu suất thu hồi đạm so với phương pháp cổ
truyền.
Nguyễn Trọng Cẩn và các cộng sự (1993) đã nghiên cứu ứng dụng bổ sung
canh trường nuôi cấy nấm mốc A.oryzae 29A vào chượp để rút ngắn thời gian chế
biến nước mắm. Kết quả cho biết, dùng 2,5%-3% canh trường nuôi cấy nấm mốc
A.oryzae 29A bổ sung vào chượp, ở điều kiện pH=6.5-6.8, nhiệt độ 35oC- 40oC, tỉ lệ
muối ban đầu là 6%, và cứ 3 ngày cho muối 1 lần với lượng 3% cho đến khi đủ
muối, kết hợp với đánh khuấy thì sau 15-20 ngày chượp đã ổn định, có thể đem lọc
và rút nước mắm. Tuy nhiên nước mắm chưa có mùi vị đặc trưng, khâu lọc rút nước
mắm cịn gặp nhiều khó khăn vì chượp tạo thành hỗn hợp đặc nhuyễn có độ nhớt
cao.
Trần Thị Luyến (1994) đã nghiên cứu bổ sung rỉ đường kết hợp với sục khí
và cho muối nhiều lần để rút ngắn thời gian chế biến chượp, nâng cao hiệu suất thu
hồi đạm trong sản xuất nước mắm.
Đặng Văn Hợp (2000) với cơng trình nghiên cứu Hồn thiện Cơng nghệ chiết

xuất protease từ A.Oyzae và ứng dụng vào sản xuất nước mắm thu được kết quả: khi
bổ sung 0,1% chế phẩm protease (so với cá), tỉ lệ muối ban đầu là 8% và cứ 3 ngày
thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi đủ tổng số là 25% muối. Nếu
thủy phân trong điều kiện tiếp nhiệt tự nhiên là phơi nắng thì thời gian thủy phân rút
ngắn cịn 1520 ngày, hiệu suất thu hồi đạm từ cá tăng 20% so với phương pháp cổ
truyền. Nếu tiếp nhiệt trong điều kiện ổn định là 52oC thì thời gian thủy phân chỉ
còn 7 ngày.
Vũ Ngọc Bội (2004) đã nghiên cứu kiểm nghiệm sử dụng protease B.subtilis
S5 trong chế biến nước mắm từ cá cơm cho kết quả là: Có thể sử dụng protease
B.subtilis S5 để rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá trong chế biến nước mắm từ cá

14


cơm, nước mắm cao đạm sản xuất bằng protease B.subtilis có hàm lượng và thành
phân acid amin cao hơn nước mắm cốt sản xuất theo phương pháp truyền thống.
Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết (2006) đã nghiên cứu đặc tính của
enzym protease từ A.Oryzae và ứng dụng vào quá trình lên men nước mắm đã kết
luận: hàm lượng enzym protease càng nhiều thì quá trình thủy phân càng mạnh mẽ
và hàm lượng acid amin càng cao.
1.3. Chủng khởi động
Từ những nghiên cứu đặc tính vi sinh vật, người ta có thể cải tiến sản phẩm
và q trình lên men bằng cách sử dụng các vi sinh vật với vai trò là chủng khởi
động. Mỗi chủng sẽ được chuẩn bị cho mỗi quá trình lên men thực phẩm khác nhau.
Chủng khởi động là các vi sinh vật sống và sự trao đổi chất của chúng có vai trị
hiệu quả trong quá trình lên men (Hammes, 1994). [23]
Miralles và cộng sự (1996) đã phân lập các chủng Staphylococcus từ các sản
phẩm lên men Tây Ban Nha đã chín (saichichon) có tiềm năng như chủng khởi
động quá trình lên men thịt [34]. Các chủng Staphylococcus đã được phân lập và
được xác định là S. xylosus và S. epidermidis. S. xylosus cho thấy hoạt tính

proteinase và lipase ngoại bào rất quan trọng đối với quá trình thủy phân protein và
sự phát triển hương vị.
Uchida et al. (2005) nghiên cứu tác động của nước tương koji và vi khuẩn
lactic trong lên men nước mắm từ cá chép nước ngọt. Việc bổ sung nước tương koji
(Aspergillus oryzaes) đã làm tăng đáng kể các thành phần hòa tan như axit hữu cơ
và các axit amin có vai trị trong tạo hương và vị của nước mắm. Vì vậy, koji
(khơng có vi khuẩn axit lactic) đã được sử dụng trong nước lên men nước mắm như
nguồn cung cấp Aspergillus oryzaes. [39]
1.3.1. Vi khuẩn Lactic
Vi khuẩn lactic (LAB) là tên gọi chung của những vi khuẩn sinh axit lactic
như là sản phẩm chính trong q trình chuyển hóa cacbonhydrat. Do đặc tính chung
này, chúng được xếp chung vào họ Lactobacteriaceace. Tất cả đều là những vi khuẩn
gram dương, khơng sinh bào tử, hầu hết khơng có khả năng di động. Thu nhận năng

15