Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên

1
đại học quốc gia hà nội
trờng đại học khoa học tự nhiên
------------------------
Nguyễn Trung Quân
Tạo mô hình tiểu đờng trên chuột nhắt trắng
và thử tác dụng hạ đờng huyết một số
chế phẩm tự nhiên
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
Luận văn thạc sĩ khoa học
Ngời hớng dẫn khoa học: Ts. Hoàng Thị Mỹ Nhung
Hà Nội - 2009
Lời cảm ơn
Trớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS
Hoàng Thị Mỹ Nhung Bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh, Khoa Sinh Học
đã tận tình hớng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các
phơng pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban đốc Viện Y học cổ truyền
Quân đội, TS. Nguyễn Thị Tuyết Nga và tập thể khoa Nghiên cứu Thực
nghiệm, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trờng Đại học Khoa học
Tự nhiên, Khoa Sinh học đặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Tế Bào
Mô Phôi và Lý Sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời
gian qua.
Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi lời cảm ơn đến những
ngời thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập vừa qua.
Hà Nội, tháng 12 năm 2009
Tác giả
Nguyễn Trung Quân

Những chữ viết tắt
2
ACTH Adrenocorticotropic hormone
ADN Acid deoxyribonucleic
Anti - GAD Glutamic acid decarboxylase antibodies
Tế bào beta- đảo tụy Langerhans
CDC Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Mỹ)
CNT Chuột nhắt trắng
Cv Coefficient of variation
(Hệ số biến thiên)
ĐTĐ Đái tháo đờng
FDA Food and Drug Administration
ICA Islet cells antibodies
IDM International Diabetes Mellitus
LD
50
Lethal dose 50%
(Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)
MLH Lipid Mobilising Hormon
NOD Non-Obese Diabetic
STH Somatotropic Hormon
STZ Streptozocin (Streptozotocin)
WHO World Health Organization
(Tổ chức Y tế Thế giới)
Mục lục
3
Lời cảm ơn
Những chữ viết tắt
Mục lục

Trang
Mở đầu 1
Chơng 1- Tổng quan............. 3
1.1.
Tổng quan về bệnh ĐTĐ. ........................
3
1.1.1.
Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam ...
3
1.1.2.
Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ.....................................................
4
1.1.3.
Sinh lý bệnh ĐTĐ . ...............................
6
1.1.4.
Thuốc điều trị.. . ......................
10
1.2.
Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm . .....................
12
1.2.1.
Khái lợc về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm ...
12
1.2.2.
Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1.. ........................
13
1.2.3.
Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 ... .
16

1.2.4.
Mô hình ĐTĐ typ 2 .. ...................
19
1.3.
Cây Bông ổi (Lantana camara L) ...
19
1.3.1.
Đặc điểm hình thái và phân bố......... .. ...........................
19
1.3.2.
Thành phần hóa học . ..............................................
21
1.3.3.
Công dụng và tác dụng duợc lý .
22
Chơng 2- Đối tợng, Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 24
2.1.
Đối tợng ......
24
2.2.
Vật liệu, hóa chất ..........................................................
24
2.3.
Phơng pháp nghiên cứu ...........
25
2.3.1.
Thử gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ và Alloxan trên CNT........
25
2.3.2.
Phơng pháp thu dịch chiết từ cây Bông ổi ..................................

27
2.3.3.
Phơng pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi ..
27
2.3.4.
Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình th-
ờng ............................
28
2.3.5.
Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên CNT bình thờng của dịch
chiết Bông ổi ..
29
2.3.6.
Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ

30
2.3.7.
Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ
và chế độ giàu dinh dỡng .
31
2.3.8.
Phơng pháp định lợng glucose huyết
32
4
2.3.9.
Phơng pháp xử lý số liệu
33
Chơng 3- Kết quả và thảo luận............. 35
3.1.
Gây mô hình ĐTĐ typ 1

35
3.1.1.
Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan
35
3.1.2.
Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ .
38
3.2.
Thu dịch chiết nghiên cứu và thử độc tính cấp của dịch chiết cây
Bông ổi .
40
3.2.1. Thu dịch chiết Bông ổi . 40
3.2.2. Thử độc tính cấp dịch chiết cây Bông ổi 41
3.3. Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên CNT 43
3.3.1. Sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết Bông ổi 43
3.3.2.
Thử tác dụng dung nạp glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên
CNT bình thờng .
46
3.3.3.
Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô
hình ĐTĐ typ 1 đợc gây bằng STZ .
49
3.3.4.
Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô
hình ĐTĐ typ 2 đợc gây bằng STZ và chế độ ăn .. .
51
Kết luận ...................................................................... 54
Tài liệu tham khảo................................................................................. 55
Mở đầu

Tiểu đờng (đái tháo đờng) là một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyển
hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lợng cũng nh chi phí
điều trị trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới.
Dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 đã và đang trở thành
hiện thực Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa. Theo
WHO, năm 2025, sẽ có 300-330 triệu ngời mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5,4% dân
số toàn cầu, trong đó ĐTĐ type 2 chiếm 85-95%. Với tốc độ phát triển nhanh chóng
(tăng 170%), bệnh ĐTĐ ở các quốc gia đang phát triển sẽ trở thành đại dịch. ở
5
Mỹ, theo thông báo của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CDC, bệnh ĐTĐ tăng 14%
trong 2 năm (2003-2005) và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở Mỹ.
[1,5,17]
Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số ngời mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh
chóng. Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 thông báo tỷ lệ mắc bệnh trong cả
nớc là 2,7%. Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đờng
ở Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2%-4,99%) cùng với các nớc trong khu vực
nh Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia. [1]
Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã đợc
các tập đoàn, các công ty dợc phẩm nghiên cứu và phát triển nh sulfonylurea, các
biguanid, thiazolidindion. Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là
giải pháp tối u đối với quốc gia đang phát triển nh Việt Nam, lý do đa ra là giá thành
điều trị cao, thuốc tổng hợp có phản ứng phụ với tác dụng không mong muốn. Thuốc
có nguồn gốc thảo dợc đang đợc các nớc quan tâm và phát triển với u điểm là nguồn
dợc liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ dễ đợc cộng đồng chấp
nhận, đặc biệt là các nớc kém phát triển và đang phát triển. [11,12,17]
Để đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc có nguồn gốc thảo dợc thì
cần phải có những nghiên cứu đánh giá tác dụng dợc lý. Những nghiên cứu này
nhằm sàng lọc đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc trớc khi đa vào thử
nghiệm lâm sàng. Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng
nhằm đáp ứng những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của Bộ Y tế

Việt Nam và WHO. Đã có một số các mô hình ĐTĐ đợc áp dụng ở Việt Nam,
tuy nhiên vẫn cần có sự bổ xung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phơng
pháp đánh giá tác dụng hạ đờng huyết của thuốc thảo dợc.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài Tạo mô hình tiểu đ-
ờng trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đờng huyết một số chế phẩm tự
nhiên với các nội dụng chính:
- Xây dựng mô hình tiểu đờng (ĐTĐ) trên chuột nhắt trắng.
6
- Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi (Lantana
camara L. ) trên chuột nhắt trắng.
Chơng 1 Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan về bệnh ĐTĐ
Bệnh ĐTĐ, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), là một hội chứng có đặc tính
biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn
insulin hoặc vì có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin.
[1,39,50]
Các chuyên gia thuộc ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ Hoa Kỳ lại
đa ra định nghĩa về ĐTĐ nh sau: là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là
tăng glucose máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin; khiếm khuyết trong hoạt
động của insulin; hoặc cả hai. Tăng glucose máu mạn tính thờng kết hợp với sự hủy
7
hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt
là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu.[1,26]
1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam
* Trên thế giới:
ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế
giới. Điều đáng lo ngại là ĐTĐ tăng nhanh chóng ở các nớc đang phát triển. Theo
thông báo của IDM: năm 1994 cả thế giới có 110 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ; đến
năm 2000 con số này là 151 triệu ngời, dự báo đến năm 2010 con số này sẽ là 221
triệu ngời. [1,42]

Bảng 1. Số liệu thông báo về tỷ lệ mắc ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [1]
Nớc
Dân số
(triệu)
Số ca TĐ
(triệu)
Tỷ lệ %
Typ 1
(triệu)
Typ 2 (triệu)
Thái Lan 62 4,0 6,7 0,046 1,8
Mỹ 250 10 4,0 0,75 9,0
ấn Độ
1200 38 4,0 0,176 38
Hồng Kông 6,0 0,24 4,0 0,007 0,23
Pakistan 160 4,6 3,0 0,4 4,2
Đài Loan 20 0,424 2,1 0,004 0,04
Trung Quốc 1300 24 2,0 1,2 23
Indonesia 210 2,7 1,3 0,009-0,036 1,8-3,6
WHO dự tính đến năm 2025 sẽ có 300-330 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ chiếm
5,4% dân số toàn cầu, còn theo Quỹ ĐTĐ thế giới (WDF) sẽ khoảng 300-339 triệu.
Trong đó ở các nớc phát triển tăng 42%; các nớc đang phát triển tăng 170%. Theo
CDC, ở Mỹ bệnh ĐTĐ tăng 14% trong 2 năm, từ 18,2 triệu ngời mắc bệnh ĐTĐ
năm 2003 đến 20,8 triệu ngời năm 2005.[42]
Số liệu thống kê của WHO cho thấy ĐTĐ typ 2 chiếm 85-95% tổng số ngời
mắc bệnh ĐTĐ. Nghiên cứu sàng lọc ở Nhật Bản và Trung Quốc cho thấy, tỷ lệ
ĐTĐ typ 2: ĐTĐ typ 1 ở lứa tuổi học sinh trung học là 4:1.[1,50]
* ở Việt Nam
Kết quả điều tra quốc gia năm 2002-2003 về tình hình ĐTĐ [1] cho thấy:
- Tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 2,7%, trong đó ĐTĐ ở nữ là 3,7%, ở nam là 3,3%.

8
- Xét theo khu vực thì vùng đô thị và khu công nghiệp có tỷ lệ mắc ĐTĐ là
4,4% trong khi ở vùng núi cao tỷ lệ này là 2,1%.
- Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở nhóm đối tợng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30-64
chiếm tỷ lệ cao 10,5%. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8%.
Theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đờng quốc tế và WHO, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ
của Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2-4,99%) cùng với các nớc trong khu vực
nh Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia thấp hơn so với các nớc khu vực 3 (5%-7,99%)
nh Nhật Bản, Hàn Quốc, Singapore. [1]
1.1.2. Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ
a) Chẩn đoán:
Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ, đợc Hiệp hội ĐTĐ Mỹ kiến nghị năm 1997
và đợc nhóm các chuyên gia về bệnh ĐTĐ của WHO công nhận vào năm 1998,
tuyên bố áp dụng vào năm 1999 với 3 tiêu chí:
(1) Có các triệu chứng của ĐTĐ lâm sàng; mức glucose huyết tơng ở thời
điểm bất kì 11,1mmol/l (200mg/dl).
(2) Mức glucose huyết tơng lúc đói 7,0mmol/l (126mg/dl)
(3) Mức glucose huyết tơng 11,1mmol/l (200mg/dl) ở thời điểm 2 giờ sau
nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đờng uống 75 gam đờng (loại anhydrous) hoặc
82,5 gam đờng (loại monohydrat). [1,18]
Bảng 2. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ theo IDM năm 2005. [1]
Đặc điểm ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 2
Khởi phát Rầm rộ, kết hợp nhiều
triệu chứng
Chậm, thờng không có triệu chứng
Biểu hiện lâm
sàng
- Sút cân nhanh chóng
- Đái nhiều
- Uống nhiều nớc

- Thể trạng béo
- Tiền sử gia đình có ngời mắc bệnh
đái tháo đờng typ 2.
- Đặc tính dân tộc , có tỷ lệ mắc
bệnh cao.
- Chứng gai đen (Acanthosis
nigricans)
- Hội chứng buồng trứng đa nang
Nhiễm ceton Dơng tính Thờng không có
C-peptid Thấp/mất Bình thờng hoặc tăng
9
Kháng thể - ICA dơng tính
- Anti-GAD dơng tính
- ICA âm tính
- Anti-GAD âm tính
Điều trị - Bắt buộc dùng insulin - Thay đổi lối sống
- Dùng các thuốc hạ glucose máu
bằng đờng uống.
- Dùng insulin
Kết hợp với
bệnh tự miễn
khác
Có Không
b) Phân loại:
* ĐTĐ typ 1
Phân loại theo hình thái miễn dịch
- Typ 1a: Chiếm 80%, thể này có các loại tự kháng thể kháng tế bào đảo tụy
thoáng qua ngay từ lúc khởi đầu của bệnh. Loại này ít khi kết hợp với một bệnh tự
miễn dịch nào khác, thờng có các typ HLA B15, HLA DR4. Thờng xảy ra sau
khi bị nhiễm virus gây phá hủy tế bào .

- Typ 1b: Các kháng thể kháng tế bào đảo tụy dai dẳng với hàm lợng cao. Th-
ờng kết hợp với các rối loạn miễn dịch khác nh bệnh lý tuyến giáp; bệnh tuyến vỏ
thợng thận; giảm chức năng tuyến sinh dục; thiếu máu ác tính. Đa số ngời bệnh là
nữ giới có typ HLA- B8 và HLA- DR3.
Phân loại theo diễn biến lâm sàng
- ĐTĐ typ 1 thể không phụ thuộc insulin (thoáng qua)
- ĐTĐ phụ thuộc insulin.
* ĐTĐ typ 2
- Những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin
ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy chức năng của của tế bào , dẫn tới rối loạn bài tiết
insulin.
* ĐTĐ typ 1 không qua trung gian miễn dịch
Đây là những trờng hợp ĐTĐ thiếu insulin nhng không có bằng chứng tự
miễn. Thể bệnh này có yếu tố di truyền rất rõ. Đặc điểm lâm sàng là có những đợt
thiếu insulin xen lẫn những giai đoạn bình thờng. [1]
1.1.3. Sinh lý bệnh ĐTĐ
10
a). Điều hòa cân bằng glucose máu
Trong điều kiện sinh lý bình thờng, glucose máu khoảng 5,6 mmol/l (100mg/
dl). Khi cơ thể sử dụng nhiều glucid (lao động nặng, hng phấn thần kinh, sốt, )
glucose máu có thể lên tới 6,7 8,3 mmol/l (120 150 mg/dl). Trong trạng thái
ngủ nghỉ glucose máu có thể giảm tới 4,5 mmol/l (80mg/dl).
Nếu vợt quá 8,9 mmol/L (160mg/dl) thì glucose bị đào thải qua thận, nếu
giảm xuống dới 3,3 mmol/L (60mg/dl) thì các tế bào thiếu năng lợng, có thể dẫn tới
hôn mê.
Bằng cơ chế điều hòa, cơ thể ngời bình thờng đợc duy trì lợng glucose máu
trong khoảng 4,5 6,7 mmol/l (80-120mg/dl). Cơ chế điều hòa đợc kiểm soát bởi
hệ nội tiết và hệ thần kinh [18].
* Vai trò điều hòa của hệ nội tiết
Một số nội tiết tố có tác dụng lên enzym chuyển hóa glucid qua đó tác động đến sự

cân bằng glucose huyết. Có hai nhóm nội tiết tố kiểm soát đối lập nhau:
- Insulin làm giảm glucose máu
- Tập hợp các nội tiết tố và các chất làm tăng glucose máu
Insulin:
Insulin do tế bào của đảo tụy Langerhans tiết ra có tác dụng làm giảm
glucose máu. Insulin là một protein gồm 51 acid amin, đợc chia thành 2 chuỗi alpha
(21 acid amin) và (gồm 30 acid amin), đợc nối với nhau bằng các cầu nối S S.
Thời gian bán hủy của insulin là 3- 5phút.
Trung bình mỗi ngày tụy tiết ra 40-50 đơn vị insulin (IU), để đảm bảo nồng
độ glucose trong máu đợc duy trì giới hạn từ 4,4-5,3 mmol/l (80-95 mg/dl). Nồng độ
insulin cơ bản trong huyết tơng cũng đảm bảo sự bài tiết glucose của gan với tỷ lệ
1,9-2,1mg/kg/phút. [1,18]
Bảng3 . Tóm tắt vai trò sinh lý của insulin
Tình trạng insulin cao (sau ăn) Tình trạng insulin thấp (lúc đói)
11
Gan
Thu nhận glucose
Tổng hợp glycogen
Tổng hợp lipid
Mất khả năng tạo thể ceton
Mất khả năng tổng hợp glycogen
Sản xuất glucose
Phân hủy glucogen
Mất khả năng tạo mỡ
Tổng hợp thể ceton
Phân hủy glycogen
Cơ
Thu nhận glucose
Oxy hóa glycose
Tổng hợp glycogen

Tổng hợp protein nền
Mất khả năng thu nhận glucose
Oxy hóa acid béo, thể ceton
Phân hủy glycogen
Phân hủy protein và tiết acid amin
Mô mỡ
Thu nhận glucose
Tổng hợp lipid
Thu nhận Triglycerid
Mất khả năng thu nhận glucose
Phân hủy lipid và bài tiết acid béo tự do
Mất khả năng nhận triglyceride
Hệ đối kháng với insulin:
Có tác dụng làm tăng glucose máu
- Adrenalin: kích thích tạo AMP vòng của tế bào đích, tăng hoạt hóa enzym
phosphorylase ở gan làm tăng thoái hóa glucogen tạo glucose.
- Glucagon: tác dụng tơng tự nh adrenalin nhng mạnh hơn và kéo dài hơn.
Glucagon còn kích thích phân hủy mỡ do enzym lipase đợc hoạt hóa bởi AMP
vòng.
- Glucocorticoid: ngăn cản glucose thấm vào tế bào (trừ tế bào não). Tăng
hoạt hóa G-6-phosphatase làm tăng giải phóng glucose ở gan vào máu. Tăng
tân tạo glucose từ protid.
- Thyroxin: tăng hấp thu đờng ở ruột, tăng phân hủy glycogen.
- STH: tăng thoái hóa glycogen bằng cách ức chế enzym hexokinase. STH
còn hoạt hóa insulinase.
- Insulinase và kháng thể chống insulin: trực tiếp phân hủy insulin.
12
Hình 1. Kiểm soát tiết insulin trong tế bào beta
* Vai trò của hệ thần kinh
Đến nay các nhà khoa học đã phát hiện đợc hai trung tâm (A và B) ở vùng dới

đồi tham gia điều hòa glucose huyết thông qua hormon:
- Trung tâm A: gồm những tế bào thần kinh, không có mặt của insulin vẫn thu
nhận đợc glucose từ máu. Trung tâm này đại diện cho các tế bào không cần insulin
vẫn thu nhận đợc glucose nh: tế bào não, gan, hồng cầu. Khi glucose máu giảm
xuống dới 4,5mmol/l thì trung tâm A bị kích thích làm tăng tiết glucagon, adrenalin,
ACTH, LMH để tăng tạo glucose đạt đợc nồng độ 5,6 mmol/l.
- Trung tâm B: Đại diện cho các tế bào còn lại của cơ thể, phải có insulin mới
thu nhận đợc glucose. Các tế bào loại này sử dụng đợc thể ceton nh là một nguồn
năng lợng bổ xung quan trọng. Khi thiếu insulin, trung tâm B sẽ huy động mọi cơ
chế nội tiết làm tăng glucose máu, đủ thấm vào tế bào nhờ sự chênh lệch lớn về
nồng độ glucose trong và ngoài tế bào. Tuy nhiên sự chênh lệch này phải đủ lớn
(tăng gấp 4 lần bình thờng) mới xảy ra sự khuếch tán. Nhng khi đó thì cũng có lợng
lớn glucose bị thận đào thải (gặp trong bệnh tiểu đờng thiếu hụt insulin). [18]
b). Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ
13
* Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 1
- Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc
vào điều kiện môi trờng. Các gen có liên quan là HLA-DR3, HLA-D4 và DQW-8,
còn gen kháng là HLA-DRW2, B7.[18]
Bệnh gặp ở 0,2-0,5% số ngời trong quần thể và chiếm 5-10% số ngời mắc bệnh tiểu
đờng.
Các giai đoạn trong ĐTĐ typ 1:
- Giai đoạn 1. Bản chất di truyền nhạy cảm gen
- Giai đoạn 2. Khởi phát quá trình tự miễn.
- Giai đoạn 3. Phát triển một loạt các kháng thể
- Giai đoạn 4. Tổn thơng chức năng tế bào đảo tụy
- Giai đoạn 5. Đái tháo đờng lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần nh hoàn
toàn tế bào đảo tụy. Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến
chứng. [1]
* Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 2

Sinh bệnh học ĐTĐ typ 2 diễn tiến qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1. Nồng độ glucose máu vẫn ở mức bình thờng, nhng có hiện tợng kháng
insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thờng trong máu.
Giai đoạn 2. Tình trạng kháng insulin có xu hớng nặng dần và xuất hiện tăng
glucose huyết sau bữa ăn.
Giai đoạn 3. Sự kháng insulin không thay đổi, nhng bài tiết insulin suy giảm và gây
tăng glucose huyết lúc đói. Bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài.
14
Hình 2. Các giai đoạn tiến triển của ĐTĐ typ 2 [17]
Trong số các yếu tố môi trờng đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh thì béo
phì là yếu tố thờng đợc đề cập nhất. Béo phì làm gia tăng tình trạng kháng insulin.
Nhiều bằng chứng cho thấy kiểm soát tốt tình trạng tăng cân béo phì sẽ làm giảm
đáng kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát glucose huyết tốt. [1,17]
Tóm lại sự thiếu hụt trong bài tiết insulin và tình trạng kháng insulin là
nguyên nhân gây ĐTĐ typ 2 và béo phì là yếu tố thúc đẩy phát triển bệnh.
1.1.4. Thuốc điều trị ĐTĐ
Trớc sự phát triển nhanh chóng của bệnh ĐTĐ, nhu cầu thuốc điều trị là rất
lớn. Trên thị trờng hiện nay có nhiều loại thuốc khác nhau chủ yếu là các thuốc có
nguồn gốc tổng hợp và bán tổng hợp, dựa vào tác dụng và cơ chế có thể chia thành 3
nhóm sau đây:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn.
a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin
15
- Insulin điều hòa glucose huyết chủ yếu tại các mô đích là gan, cơ và mô mỡ.
Sau khi bài tiết, insulin đến các mô đích gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu là một
glycoprotein gồm hai đơn vị (nằm ngoài tế bào) và hai đơn vị (nằm trong tế bào)
đợc nối với nhau bằng cầu nối disulfid. Insulin gắn vào phần thụ thể , kích thích
tyrosin kinase của thụ thể trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng làm tăng tính

thấm màng tế bào với glucose, giúp glucose vận chuyển vào tế bào nhanh hơn. Sau
khi vào tế bào, glucose đợc phosphoryl hóa thành glucose- 6 phosphat (G6P); từ đó
G6P chuyển thành glycogen dự trữ hoặc tiếp tục bị oxy hóa để cung cấp năng lợng
cho cơ thể.
Các thuốc kích thích bài tiết insulin:
- Các nhóm sulfonylurea: gắn vào các thụ thể của nó ở các tế bào đảo tụy
làm chẹn kênh K, gây khử cực màng tế bào. Kênh Ca
2+
phụ thuộc điện thế mở ra cho
phép Ca
2+
vào trong tế bào. Nồng độ Ca
2+
trong tế bào tăng khởi động vận chuyển
các hạt chứa insulin đến bề mặt tế bào và giải phóng insulin ra ngoài. Trong nghiên
cứu này cũng sử dụng gliclazid (Diamicron) liều 19,2mg/kg chuột tơng đơng với liều
80mg dùng cho ngời làm thuốc đối chứng dơng. [6,11,13]
- Nhóm Nateglinid (Starlig): Trong cơ thể nateglinid gắn vào thụ thể đặc hiệu
(SUR 1) ở tế bào beta đảo tụy làm chẹn kệnh Ca
2+
, Ca
2+
từ ngoài vào trong tế bào
kích thích giải phóng insulin. [1,17]
b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin
- Các thuốc nhóm biguanid: ức chế tân tạo glucose tại gan, tăng tổng hợp
glycogen. Cải thiện khả năng hấp thu glucose ở các tế bào đích (tế bào cơ và tế bào
mỡ). Tác động trực tiếp lên các chất vận chuyển (GLUT1 và GLUT4) tăng khả năng
vận chuyển glucose vào tế bào.
- Các thuốc nhóm thiazolidinedion: thuốc cải thiện tình trạng kháng insulin,

tăng tổng hợp glycogen và giảm sản xuất glucose ở gan. Thiazolidindion là chất
đồng vận chọn lọc trên receptor gamma tăng sinh - hoạt hóa peroxisom nhân điều
hòa gen chuyển hóa lipid và glucid kiểm soát chuyển hóa tại mô đích (cơ, mỡ).
Thiazolidin đòi hỏi sự có mặt của insulin.
c) Thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn
16
Acarbose là thuốc ức chế enzym - glucosidase của tế bào niêm mạc ruột. Do
tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm lại quá trình hấp thu tinh
bột, dextrin và các disaccharid ở ruột non, tránh đợc tình trạng tăng glucose huyết
sau ăn. Ngoài ra thuốc còn ức chế cạnh tranh glucoamilase, sucrase.
* Nhóm thuốc thảo dợc:
- Nhiều thuốc tân dợc đợc sử dụng điều trị ĐTĐ có hiệu quả tốt tuy nhiên hầu
hết các thuốc đều có tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian
dài do vậy phát triển thuốc có nguồn gốc từ thảo dợc là điều tất yếu. Trong nớc có
nhiều nghiên cứu chứng minh đợc hiệu quả hạ glucose huyết trên thực nghiệm của
một số loại thảo dợc nh: quả chuối hột (Musa balbisiana) [15], hoa của cây Cơm
cháy tròn (Sambucus nigra ssp. canadensis (L.) R. Bolli)[4], quả Dứa dại
(Pandanus odoratissimus L.)[12], cây Dừa cạn (Catharanthus roseus)[14], Rễ cây
Chóc máu (Salacia cochinchinensis)[11], Bằng lăng nớc (Lagerstroemia speciosa
(L.) Pers.)[6,7], Thổ phục linh (Smilax glabrra) [17]v.v [10]
1.2. Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm
1.2.1. Khái lợc về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm
Mô hình động vật là mô hình mà ở đó động vật đợc gây bệnh hoặc tổn thơng
tơng tự nh trên ngời. Những điều kiện thử nghiệm này thờng đợc gọi là mô hình
bệnh lý trên động vật. Việc sử dụng các mô hình động vật cho phép các nhà nghiên
cứu thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng, để bảo đảm an toàn cho các nghiên cứu
lâm sàng.
Để có một mô hình phù hợp phản ánh một cách xác thực, các bệnh đợc mô
hình hóa phải tơng tự về nguyên nhân và cơ chế gây bệnh giống nh ở ngời. Mô hình
động vật thờng đợc sử dụng trong nghiên cứu y sinh học (nghiên cứu về cơ chế bệnh

sinh, hoặc trong chẩn đoán, điều trị hoặc phát triển các thuốc nghiên cứu mới).
Các mô hình bệnh lý trên động vật có thể có bản chất tự nhiên hoặc đợc gây
ra bằng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học. Ví dụ nh:
- Dùng metrazol (pentylenetetrazol) trong mô hình bệnh động kinh.
- Làm tắc động mạch não giữa để gây mô hình bệnh đột quỵ.
- Tiêm virus hoặc vi khuẩn gây mô hình nhiễm khuẩn hoặc các bệnh cúm.
17
- Sử dụng các tia ion phóng xạ để gây khối u.
- Chọn lọc di truyền chuột NOD gây mô hình ĐTĐ đờng.
- Cắt buồng trứng để gây bệnh loãng xơng.
- Dùng Plasmodium yoelii gây mô hình bệnh sốt rét.
Việc nghiên cứu và ứng dụng các mô hình bệnh lý trên các loài động vật (khỉ,
chó, mèo, thỏ, chuột cống, chuột nhắt trắng ) đã trở nên phổ biến đặc biệt là trong
nghiên cứu y dợc học. [20,48]
Một số các lĩnh vực khác cũng sử dụng mô hình động vật cho các nghiên cứu
của mình nh tâm lý học, xã hội học quan sát hành vi động vật (mô hình hành vi).
Hiện nay các nhà nghiên cứu đã phát triển rất nhiều các phơng pháp khác
nhau trên cùng một loại mô hình bệnh nhằm tìm ra các mô hình phù hợp nhất và gần
nhất với các trờng hợp bệnh lý trên ngời.
1.2.2. Mô hình ĐTĐ typ 1
ĐTĐ typ 1 là do sự tổn thơng tế bào beta đảo tụy (do tự miễn) các mô hình
ĐTĐ cũng đợc phát triển dựa trên nguyên tắc trên. Mô hình ĐTĐ typ 1 đợc xây
dựng bằng nhiều con đờng nhng cơ bản có 2 phơng pháp phổ biến:
* Gây ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất:
Alloxan:
- Chuột cống (40-200mg/kg theo đờng tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng).
- Chuột nhắt (50-200mg/kg theo đờng tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng).
- Thỏ (100-150 mg/kg tiêm màng bụng).
- Chó (50-75 mg/kg tiêm màng bụng). [45]
Streptozocin:

- Chuột cống (35-65mg/kg tiêm màng bụng hoặc tĩnh mạch).
- Chuột nhắt (100- 200mg/kg tiêm màng bụng hoặc tĩnh mạch).
- Chuột Hamster (50 mg/kg tiêm màng bụng).
- Chó (20-30 mg/kg tiêm tĩnh mạch). [45]
* Gây ĐTĐ typ 1 bằng phơng pháp lai tạo và chọn lọc giống
Có 5 mô hình trên động vật đợc gây ĐTĐ typ 1 bằng phơng pháp lai tạo và
chọn lọc giống:
18
- Chuột nhắt NOD (nonobese diabetic).
- Chuột cống BB (Bio-Breeding)
- Chuột cống LETL (Long Evans Tokushima Lean)
- Chuột cống KDP (Komeda diabetes Prone)
- Chuột cống LEW-iddm (Lew- insulin dependent diabetes mellitus). [20,
22,29,32,45]
Trong khuôn khổ cho phép của luận văn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu gây
mô hình bệnh ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất (alloxan và streptozocin).
a) Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1
Streptozocin còn có tên khác là Streptozotocin, N-(Methylnitrosocarbamoyl) -
- D - glucosamine.
* Tính chất vật lý & hóa học:
- STZ gồm hai chuỗi và stereoisomers. Tinh thể màu hơi vàng, trắng
đục, hòa tan trong nớc, ketone, cồn thấp độ, ít tan trong dung môi hữu cơ phân cực,
không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực. Chất tinh khiết dễ hút ẩm không
khí và nhạy cảm với ánh sáng. STZ phân hủy thành diazomethane trong dung dịch
kiềm ở 0
0
C.
- Công thức mạch thẳng: C
8
H

15
N
3
O
7
- Trọng lợng phân tử: 265,22 g/mol
- Thời gian bán hủy: 5- 15 phút
Hình 3. Cấu trúc hóa học của streptozocin
19
* Lịch sử phát triển
Streptozocin là một kháng sinh đợc phân lập vào cuối thập niên 50 của Thế kỉ
20. Thuốc đợc các nhà nghiên cứu công ty Dợc Upjohn (một công ty của Pfizer) ở
Michigan phát hiện từ một chủng nấm sợi Streptomyces achromogenes có trong
mẫu đất lấy ở bang Kansas (Mỹ). Upjohn đăng kí phát minh và bản quyền vào tháng
8 năm 1958 và đợc trao giấy chứng nhận số U.S. Patent 3.027.300 tháng 3 năm
1962.
Giữa thập niên 60 (TK20) các nhà khoa học đã phát hiện ra tính độc chọn lọc
của STZ đối với các tế bào beta đảo tụy, trong khi các tế bào này lại điều tiết nồng
độ glucose huyết bằng cách tiết ra các hormon insulin. Đây là một gợi ý sử dụng
thuốc để gây mô hình ĐTĐ typ 1, và điều trị ung th tụy. Năm 1982, FDA đã trao
giấy phép lu hành thuốc điều trị ung th tế bào đảo tụy dới tên thơng mại là Zanosar.
[35]
Hình 4. Streptozocin của hãng Sigma
* Tác dụng:
- STZ chủ yếu đợc sử dụng trong điều trị ung th tế bào đảo tụy di căn. STZ
cũng hiệu quả trong điều trị u ác tính tế bào a bạc.
- STZ đợc ứng dụng để gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm
nhằm nghiên cứu các thuốc, chế phẩm điều trị bệnh ĐTĐ.
- STZ cũng đợc nghiên cứu làm thuốc kháng sinh nhng không đợc dùng cho
mục đích thơng mại.

* Cơ chế hoạt động của STZ:
20
- Khi đợc hấp thụ vào các tế bào beta, STZ đợc phân cắt thành glucose và một
nửa còn lại là methylnitrosourea. Vì có tính alkyl hóa nên tác động tới các đại phân
tử sinh học (ADN) dẫn tới phá hủy tế bào beta. Đích hớng tới là các ADN ty thể, qua
đó tác động đến các chức năng tín hiệu quá trình trao đổi chất trong ty thể của tế bào
beta, điều này cũng giải thích STZ có khả năng ức chế tiết insulin.
- Tính chọn lọc của STZ với tế bào beta: STZ là chất đồng đẳng nitrosourea
trong đó N- methyl-N-nitrosourea đợc liên kết với C-2 của hexose. Nitrosoure tan
trong lipid nên đợc hấp thụ dễ dàng vào mô qua màng sinh chất, kết quả của việc
thay thế hexose là STZ ít tan trong lipid. STZ đợc tích lũy chọn lọc trong tế bào beta
đảo tụy qua kênh vận chuyển glucose GLUT2 ái lực thấp nằm trong màng sinh chất.
Do vậy những tế bào không biểu hiện kênh vận chuyển glucose sẽ kháng với STZ.
Quan sát này cũng giải thích độc tính của STZ lớn hơn so với N-methy-N-
nitrosourea trong các tế bào xuất hiện kênh vận chuyển GLUT2 kể cả khi 2 chất này
đều alkyl hóa ADN tơng tự nhau.
- Tính độc của STZ đối với tế bào beta: tính độc của STZ phụ thuộc vào hoạt
tính alkyl hóa ADN của nhóm methylnitrosourea, đặc biệt là vị trí O
6
của guanine.
Sự vận chuyển của các nhóm methyl từ STZ tới các phân tử ADN gây nên tổn thơng
kéo theo một loạt chuỗi sự kiện khác kết quả là dẫn tới bẻ gãy các phân tử ADN. Sự
glycosyl hóa protein có thể cũng đóng góp thêm một yếu tố tổn thơng. Trong nỗ lực
sửa chữa ADN , các enzym poly (ADP-ribose) polymerase bị kích thích quá mức
dẫn tới làm giảm dự trữ NAD
+
(sau đó là ATP). Sự suy kiệt trong dự trữ năng lợng
của tế bào góp phần làm tế bào beta bị phân hủy. [35]
21
Hình 5. Sơ đồ hoạt động của STZ [35]

- Tính độc của STZ còn đợc biểu hiện ở con đờng thứ 2 khi STZ tạo ra nitric
oxide (NO) làm tổn thơng ADN và ức chế chu trình Krebs. NO ức chế hoạt tính của
enzym aconitase, đồng thời tăng cờng loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ xung cơ
chất cho xanthine oxidase và tăng cờng sản xuất axit uric. Xanthine oxidase tiếp tục
xúc tác phản ứng tạo thành anion superoxyde (O
2
-
), hydrogen pereoxide (H
2
O
2
) và
gốc (OH
-
). Các dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species) này cũng tập trung phá
hủy ADN dẫn tới sự huy động các enzym sửa chữa ADN và mất NAD
+
,giảm dự trữ
ATP dẫn tới sự phá hủy tế bào beta. Cũng có nghiên cứu chứng minh đợc sự giảm
NAD
+
cũng dẫn tới sự ức chế sinh tổng hợp và tiết insulin ở tế bào beta. [35]
b) Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1
Alloxan còn có tên khác là Mesoxalylurea 5- Oxobarbituric acid.
* Tính chất vật lý & hóa học:
- Công thức mạch thẳng: C
4
H
2
N

2
O
4
.H
2
O
- Trọng lợng phân tử: 160,01 g/mol
22
- Tan trong nớc.
- Thời gian bán hủy: 1,5 phút.
Hình 6. Cấu trúc hóa học của alloxan
* Lịch sử phát triển:
Alloxan đợc Brugnatelli phân lập lần đầu tiên vào năm 1818. Nhng cho đến
năm 1838, Friedrich Wohler và Justus Liebig mới công bố trong nghiên cứu về bản
chất acid uric và những bổ xung về phân tích hóa học chi tiết các chất mới gồm có
alloxan, alloxantin, uramil, dialuric và murexide.
Năm 1943, Dunn, Sheehan và McLetchie (Trờng Đại học Glasgow) báo cáo
alloxan gây ra sự phá hủy tế bào đảo tụy ở thỏ. Mặc dù trớc đó đã có những phát
hiện về sự tăng glucose huyết khi sử dụng alloxan nhng không đợc công bố, và thiếu
những nghiên cứu kiểm chứng.
Rất nhiều các nghiên cứu sau này đã chứng minh alloxan là hợp chất thích
hợp gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm. Động vật đợc gây ĐTĐ bằng alloxan có
những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ lâm sàng trên ngời: sút cân, uống
nhiều nớc, đái nhiều, có đờng trong nớc tiểu, keton niệu, glucose máu và keton máu.
[21,26,35]
23
Hình 7. Alloxan của hãng Sigma
* Tác dụng:
- Alloxan đợc ứng dụng để gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm
nhằm nghiên cứu các thuốc, chế phẩm điều trị bệnh ĐTĐ.

*Cơ chế hoạt động:
Cấu tạo của alloxan gần giống với cấu tạo phân tử glucose do đó alloxan đợc
vận chuyển vào tế bào beta nhờ protein vận chuyển glucose GLUT2 (Glucose
transporter 2). Tại đó, alloxan gây ra hai tác động sinh lý:
Hình 8. Các phản ứng tạo ra các dạng oxy hoạt động gây độc tế bào A, alloxan;
AH

, gốc tự do alloxan; AH
2
, dialuric acid; GS

, gốc glutathione; GSSG, glutathione
bị oxy hóa; OH

, gốc tự do hydroxyl; O
-
, gốc superoxide. [35]
- ức chế chọn lọc tiết insulin thông qua ức chế đặc hiệu enzym glucokinase
(enzym nhạy cảm glucose của tế bào beta).
- Gây ra trạng thái tiểu đờng phụ thuộc insulin thông qua sự hình thành ROS
(reactive oxygen species), dạng oxy phản ứng trong chuỗi phản ứng khử. Khi có mặt
của các thiol nội bào đặc biệt là các glutathione, alloxan tạo ra các dạng oxy phản
ứng trong chuỗi phản ứng khử với sản phẩm khử của nó là acid dialuric. Acid này tự
24
oxy hóa tạo thành các gốc superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl. Những gốc
hydroxyl này gây nên sự phân hủy tế bào beta.[35]
1.2.3. Mô hình ĐTĐ typ 2
ĐTĐ typ 2 là sự rối loạn phức hợp liên quan đến các yếu tố di truyền, dịch tễ
học, sự phát triển và môi trờng của mỗi cá thể. Gây mô hình ĐTĐ typ2 thờng dựa
trên chế độ dinh dỡng, hóa chất và yếu tố di truyền (gen), kết quả làm tăng glucose

huyết và kháng insulin ở mô ngoại biên. [37]
a) Chế độ dinh dỡng kết hợp với hóa chất
Chuột đợc nuôi bằng chế độ dinh dỡng giàu lipid, glucid trong một thời gian
dài (khoảng 4 tuần- 8 tuần), sau đó đợc tiêm STZ liều thấp (25-60mg/kg). Các chuột
này có đặc điểm tăng glucose huyết không nhiều, đặc điểm nổi bật là sự tăng tiết
insulin và đợc gọi là chuột Fat/feed. Mục đích của phơng pháp này là tạo mô hình
thiếu hụt và kháng insulin, mô phỏng theo kiểu ĐTĐ typ 2 ở ngời. [36,37,41,45,46]
b) Hóa chất STZ kết hợp với Nicotinamide
Gần đây, một mô hình gây ĐTĐ typ 2 đợc phát triển bằng cách kết hợp giữa
STZ và nicotinamid điều trị trên chuột cống. Chuột cống đợc tiêm nicotinamid
(180-230mg/kg, tiêm màng bụng) 15-30 phút trớc khi tiêm STZ (50-65 mg/kg, tiêm
tĩnh mạch) tăng glucose máu ổn định và từ từ mà không có sự thay đổi về nồng độ
insulin máu. Do nicotinamide là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào bằng hoạt
tính dọn gốc tự do (STZ sinh ra gốc tự do) và hạn chế tổn thơng tế bào beta đảo tụy
trong ĐTĐ typ 2. [45]
c) Chọn lọc và lai tạo
Một số cá thể thuộc chủng chuột cống Wistar, chuột nhắt KK có biểu hiện
rối loạn dung nạp glucose và tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh trong tự
nhiên. Nhằm tạo ra các chủng chuột có biểu hiện tăng glucose huyết và kháng
insulin mạnh, các nhà nghiên cứu đã lai tạo giữa chuột nhắt chủng KK có rối loạn
dung nạp glucose với chuột béo bệu lông vàng, tạo ra con lai KK-Ay có glucose
huyết tăng cao và kháng insulin mạnh. [17, 21,23, 29]
Ngoài ra còn có chuột nhắt ob/ob(obese), db/db(diabetes), chuột cống ZDF
(Zucker diabetic fatty), chuột cống GK (Goto-kakiraki) [45]
25