Tìm hiểu công nghệ sản xuất của một số chế phẩm từ thịt hàu và ứng dụng của chúng trong công nghệ thực phẩm

MỤC LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................2
1.1 Tổng quan về ngun liệu hàu...............................................................................2
1.1.1 Ngun liệu hàu................................................................................................2
1.1.2 Tìm hiểu đặc tính sinh học của hàu..................................................................3
1.1.3 Tìm hiểu tình hình ni hàu ở Việt Nam và thế giới.........................................4
a. Tìm hiểu tình hình ni hàu trong nước...........................................................4
b. Tìm hiểu tình hình ni hàu trên thế giới.........................................................7
1.2 Tìm hiểu các nghiên cứu và ứng dụng về protease trong nước và trên thế giới...9

1.2.1 Tìm hiểu các nghiên cứu về protease trong nước và trên thế giới.......................9
1.2.2 Tìm hiểu các ứng dụng của protease...................................................................13
1.3

Tìm hiểu về các chế phẩm dịch thủy phân từ thịt hàu và các yếu tố ảnh hưởng đến

quá trình thủy phân..............................................................................................16
1.3.1 Giới thiệu về chế phẩm dịch thủy phân............................................................16
1.3.2 Tìm hiểu bản chất cơ chế của quá trình thủy phân............................................16
1.3.3 Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân..................................16
CHƯƠNG 2: TÌM HIỂU CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM TỪ THỊT
HÀU............................................................................................................................ 22
2.1 Tìm hiểu thành phần khối lượng của ngun liệu hàu...........................................22
2.2 Tìm hiểu thành phần hóa học của ngun liệu hàu................................................23
2.3 Tìm hiểu các chất phịng thối cho quá trình thủy phân thịt hàu.............................30
2.4 Tìm hiểu quá trình thủy phân thịt hàu bằng enzyme FD........................................32
2.4.1 Tìm hiểu nguồn thu nhận enzyme Allzyme FD..................................................32

2.4.2 Tìm hiểu ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme Allzyme FD..........................33


2.4.3 Tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme tới quá trình thủy phân............................34
2.4.4 Tìm hiểu ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân.........................................35
2.4.5 Tìm hiểu ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân................................36
2.5 Tìm hiểu chế độ cơ đặc thích hợp cho dịch thuy phân từ thịt hàu..........................37
2.6 Tìm hiểu chế độ thanh trùng thích hợp cho dịch thuy phân từ thịt hàu..................39
2.7 Tìm hiểu quy trình cơng nghệ sản xuất dịch thủy phân từ thịt hàu........................41
CHƯƠNG 3: TÌM HIỂU ỨNG DỤNG CỦA CÁC CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC TỪ THỊT
HÀU TRONG CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM.............................................................44
3.1 Tìm hiểu ứng dụng của các chế phẩm từ thịt hàu trong nước................................45
3.2 Tìm hiểu ứng dụng của các chế phẩm từ thịt hàu trên thế giới..............................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
Kí hiệu viết tắt

Diễn giải

CPT

Chế phẩm thô

CPE

Chế phẩm enzyme

DC

Dịch chiết

ES

Phức hợp enzyme-cơ chất

E/S

Tỷ lệ enzyme/cơ chất

NTS

Nitơ tổng số

NNH3

Nitơ đạm thối

Naa

Đạm acid amin


Bản
g
1

Nội dung

Trang

Diện tích và sản lượng hàu thương phẩm ni ở đầm Lăng Cô

4

2

Sản lượng hàu Cgigas ở Trung Quốc

7

3

Sản lượng hàu Cgigas ở Nhật Bản

8

4

Sản lượng hàu Cgigas ở Hàn Quốc

8

5

Sản lượng hàu Cgigas ở Pháp

9

8

Thành phần hóa học của hàu khu vực Khánh Hịa theo kích cỡ ngun
liệu
Hàm lượng các acid béo (% tổng các acid béo) theo kích thước của hàu
(chiều dài vỏ)
Thành phần sinh hóa của nhuyễn thể 2 vỏ và thủy sản khác

9

Hàm lượng vitamin trong một số nhuyễn thể 2 vỏ và thủy sản khác

25

10

Hàm lượng khoáng trong một số nhuyễn thể 2 vỏ và thủy sản khác

26

6
7

12

Hàm lượng Testosteron và Carotenoid tổng số trong thịt một số lồi
động vật thân mềm
Thành phần hóa học của thịt hàu

13

Hàm lượng các acid amin trong thịt hàu

11

14
15
16

Ảnh hưởng của thời gian đến sự thay đổi trạng thái cảm quan của các
mẫu thủy phân thịt hàu
Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến trạng thái cảm quan trong
q trình cơ đặc
Kết quả kiểm tra vi sinh vật chế độ thanh trùng

DANH MỤC CÁC BẢNG

23
24
25

26
28
29
36
37
39

DANH MỤC CÁC HÌNH
Bảng

Nội dung

Trang

1

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme Allzyme FD

33

2

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi hàm lượng
ẩm theo thời gian của các mẫu cô đặc dịch thủy phân
thịt hàu

38


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây với sự phát triển mạnh của ngành chế biến thuỷ sản
thì việc khai thác và sử dụng nguồn lợi sinh vật biển đang được xem là một hướng
chiến lược quan trọng để phát triển nền kinh tế biển. Ngoài các đối tượng truyền
thống như cá, tôm đã được quan tâm từ trước đến nay thì việc nghiên cứu và sử dụng
các sản phẩm từ động vật thân mềm cũng đang được các nhà khoa học chú ý đến.

Bên cạnh các đối tượng thuỷ sản có giá trị xuất khẩu, hàu được đánh giá là
lồi hải sản có giá trị xuất khẩu cao, nhiều người ưa chuộng vì thịt hàu ngon, thơm,
bổ dưỡng và có giá trị dinh dưỡng cao. Đặc biệt, hàu được coi là thực phẩm thuốc có
khả năng phịng và chữa trị một số bệnh. Hiện nay, hàu trở thành đối tượng hấp dẫn
của ngành nuôi trồng và chế biến thuỷ sản ở nước ta. Chính ví vậy, tơi đã chọn đề tài
“Tìm hiểu cơng nghệ sản xuất của một số chế phẩm từ thịt hàu và ứng dụng của
chúng trong công nghệ thực phẩm”.

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU HÀU
1.1.1 Nguyên liệu hàu:
Hàu nguyên liệu được chọn thuỷ phân là hàu Crassostrea lugubris được
người dân ven biển gọi là hàu sữa. Đây là loài hàu đại diện cho khu vực miền Trung
phân bố dọc từ Thừa Thiên Huế - Đà Nẵng – Bình Định – Phú Yên – Khánh Hoà.
Hàu sữa Crassostrea lugubris hệ thống phân loại thuộc:
Ngành: Mollusca
Lớp: Bivalvia
Bộ: Ostreoide
Họ: Ostreidae
Giống: Crassostrea
Loài: Crassostrea lugubris
Tên tiếng việt: Miền bắc gọi là hầu

Miền Nam gọi là hàu, hào.
Tên tiếng anh: Oyster
Ở khu vực miền Trung, hàu Crassostrea lugubris có sản lượng ni chiếm
ưu thế và có giá trị dinh dưỡng cao. Trước đây, hàu Crassostrea lugubris cũng
được nuôi nhiều ở đầm Nha Phu – Khánh Hòa nhưng trong những năm gần đây sản
lượng nuôi ngày càng giảm. Tại thời điểm từ tháng 5–12/2007, nguyên liệu hàu
Crassostrea lugubris tại Nha Trang rất khan hiếm. Vì vậy trong quá trình làm luận
văn, nguyên liệu hàu được chọn là hàu Crassostrea lugubris, thu mua từ đầm Ô
Loan – Phú Yên. Đây là nơi có phong trào ni hàu và cho sản lượng lớn.

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.2 Tìm hiểu đặc tính sinh học của hàu.
Hàu là loài động vật thân mềm 2 mảnh vỏ, có kích thước lớn, vỏ dày, chắc
chắn. Mảnh vỏ trái lớn và dính liền với vật bám, hõm sâu vào và chứa toàn bộ phần
thân mềm, mảnh vỏ phải nhỏ, phẳng như nắp đậy. Hàu phân bố rộng trên toàn thế
giới nhưng đa số tập trung ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Mặc dù hàu có khả
năng thích nghi tốt với điều kiện ni nhưng nghề nuôi hàu chỉ phát triển ở một vài
quốc gia vùng nhiệt đới. Sản lượng hàu thu được chủ yếu khai thác từ tự nhiên. Các
loại hàu hiện nay đang được ni và khai thác gồm 3 nhóm chính: Ostrea,
Crassostrea, Saccotrea, trong đó sản lượng hàu chủ yếu thu từ nhóm Crassostrea
[37], [43]
Tốc độ sinh trưởng của hàu phụ thuộc rất lớn vào yếu tố nhiệt độ. Ở vùng
nhiệt đới nhiệt độ ấm áp nên tốc độ sinh trưởng của hàu nhanh và diễn ra quanh năm
(ví dụ hàu Crassostrea paraibanensis có thể đạt chiều cao 15cm trong một năm) . Ở

vùng ơn đới q trình sinh trưởng chỉ diễn ra vào mùa xuân – hè, mùa thu – đông
hàu gần như khơng sinh trưởng. Ngồi yếu tố nhiệt độ thì sự sinh trưởng của hàu còn
phụ thuộc vào mật độ, vào lồi và vùng phân bố do điều kiện mơi trường nước của
từng vùng khác nhau và do đặc tính riêng của mỗi loài [37].
Mùa vụ sinh sản của hàu xảy ra quanh năm nhưng tập trung chủ yếu vào tháng
4-6. Tác nhân chính kích thích đến q trình sinh sản của hàu là nhiệt độ, nồng độ
muối và thức ăn có trong mơi trường [37].
Thức ăn chính của hàu gồm vi khuẩn, vi sinh vật nhỏ, tảo hoặc trùng roi có
kích thước nhỏ. Phương thức bắt mồi của chúng là thụ động theo hình thức lọc. Cũng
như các lồi khác, hàu bắt mồi trong q trình hơ hấp nhờ vào cấu tạo đặc biệt của
mang [37]
Hàu có khả năng tự bảo vệ nhờ vào vỏ, khi gặp kẻ thù chúng khép vỏ lại. Kẻ
thù chính của hàu là một số loài sao biển và thân mềm chân bụng. Đặc biệt chúng
cịn có khả năng chống lại các dị vật (cát, sỏi…), khi dị vật rơi vào cơ thể màng áo sẽ
tiết ra chất xà cừ bao quanh lấy dị vật [37],[43].
SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.3 Tìm hiểu tình hình ni hàu ở Việt Nam và trên thế giới theo Nguyễn

Chính (1996), Lê Lan Hương (2006), Lê Hoài Hương (2006), Võ Hải Thi (2006), Hà
Lê Thị Lộc (2001), Nguyễn Thị Kim Bích (2001).
a. Tình hình ni hàu ở Việt Nam.
Vào thời kỳ hưng thịnh sản lượng sò, nghêu, hàu… của Việt Nam ước tính
khoảng 150-200 nghìn tấn/ năm. Nghề ni hàu đã phát triển mạnh ở cả 3 vùng đất
nước.

- Miền Bắc, nghề nuôi hàu bắt đầu từ những năm 1960 và được ni tại n
Hưng- Quảng Ninh, khu vực này có 5-6 lồi hàu có thể phát triển ni như hàu sú,
hàu cồn, hàu trắng…Đến năm 1962 tổng diện tích bãi nuôi lên 300 bãi, tổng sản
lượng nuôi hàu hàng năm đạt khoảng 300 tấn hàu thương phẩm.
- Miền Trung, điều kiện sinh thái rất phù hợp cho hàu sinh trưởng và phát
triển. Riêng đầm Lăng Cô- Thừa Thiên Huế đã phát triển rầm rộ từ năm 1997 đến
nay. Diện tích nuôi và sản lượng hàu được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 1: Diện tích và sản lượng hàu thương phẩm ni ở đầm Lăng Cơ
Chỉ tiêu

Diện tích (m2)

Sản lượng (kg)

Năm 1997

100

160

Năm 1998

1.350

2.400

Năm 1999

7.000

98.000

Năm 2000

20.513

32.490

Năm 2001

129.749

171.285

Nguồn: Hà Lê Thị Lộc, Nguyễn Thị Kim Bích (2001)

- Tại Bình Định đầu tháng 4-2006, Ban quản lý khu sinh thái Cồn Chim- Đầm

Thị Nại tập huấn kỹ thuật, hỗ trợ con giống cho 9 hộ dân ở khu vực này nuôi khảo
nghiệm 0,7 ha hàu thương phẩm. Trong q trình ni cho thấy, mơi trường nước ở
khu vực này phù hợp với điều kiện sinh trưởng và phát triển của hàu. Hiện nay,
người dân đã thu hoạch xong diện tích hàu ni khảo nghiệm với sản lượng gần 14
triệu tấn, giá hơn 5000đồng/kg.

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Phú Yên cũng là tỉnh có tiềm năng nuôi hàu lớn đặc biệt là hàu Crassostrea

lugubris. Việc nuôi hàu không chỉ thực hiện ở những vùng có sự phân bố tự nhiên
mà cịn có khả năng mở rộng ra nhiều địa phương có biển bằng việc di dời giống. Ở
những đầm chưa phát triển nguồn lợi hàu, nếu di giống và phát triển nuôi cọc, nuôi
khay, ni giàn sau một thời gian sẽ hình thành bãi hàu tự nhiên. Chính bãi giống
này là nơi ẩn nấp an tồn, thu hút được các đàn tơm, cá mẹ về sinh sản tạo thêm
nguồn lợi cho các đầm, vịnh. Hiện nay, bà con Phú Yên đang phát triển nuôi hàu
mạnh ở các đầm Ơ Loan, Cù Mơng…[42].
- Nha Trang cũng được coi là địa điểm có nghề ni hàu phát triển. Với đề tài

cấp Viện khoa học-công nghệ Việt Nam về “Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng
nghệ phát triển nguồn lợi hàu phục vụ cho việc phát triển đa dạng sinh học, cho môi
trường và tạo nguồn hàng xuất khẩu ổn định” là đề tài cấp Viện Khoa học - Công
nghệ Việt Nam, được thực hiện trong 2 năm (2003 - 2005) do Phó Giáo sư, Tiến sĩ
Khoa học Nguyễn Tác An, Viện trưởng Viện Hải dương học Nha Trang làm chủ
nhiệm với sự cộng tác của 25 cán bộ khoa học của Viện Hải dương học, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Khoa học thể dục thể thao, Bệnh viện Y học cổ truyền Trung
ương và một số người dân của thơn Ngọc Diêm, xã Ninh Ích, huyện Ninh Hịa, tỉnh
Khánh Hịa.
Nhóm nghiên cứu đã ni hàu thực nghiệm tại đầm Nha Phu. Cơng trình tập
trung nghiên cứu quy trình cơng nghệ phát triển lồi hàu Crassostrea lugubris (dân
gian vẫn gọi là hàu sữa). Kỹ sư Cao Văn Nguyện, cán bộ Trạm thực nghiệm của Viện
Hải dương học, thư ký đề tài cho biết: “Đây là loài hàu đại diện cho khu vực miền
Trung, phân bố dọc Thừa Thiên Huế - Đà Nẵng - Bình Định - Phú n - Khánh Hịa.
Hàu Crassostrea lugubris thương phẩm ni từ 8 tháng đến 1 năm có kích thước vỏ
hàu khoảng 8 - 10cm, nặng từ 50 - 56g/con”. Các nhà khoa học cũng đã xây dựng
thành cơng quy trình chế biến bột hàu Crassostrea lugubris ở quy mơ phịng thí
nghiệm bằng kỹ thuật enzyme thủy phân. Theo quy trình thủy phân này, cứ 8kg thịt

hàu tươi đông lạnh, thu được 0,55kg chế phẩm bột hàu thủy phân.

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Chi phí đầu tư ni hàu khơng cao do giống có thể lấy hồn tồn trong tự
nhiên, thức ăn sẵn có trong tự nhiên, kỹ thuật ni cũng khá đơn giản. Bằng nhiều
phương pháp, các nhà khoa học thực hiện đề tài đã khẳng định: Thịt hàu ni ở đầm
Nha Phu có đầy đủ các acid amin khơng thay thế, trong đó 5 loại cần cho các chức
năng tiêu hóa, thần kinh, nội tiết, tạo mơ xương, phối hợp vận động… có hàm lượng
tương đương hoặc cao hơn thịt bào ngư, có 2 loại enzyme sinh tổng hợp các protein
có hoạt tính sinh dược học là Cyclosporin synthethase và HC-toxins ythethase có tác
dụng kháng nấm.
Riêng Cyclosporin cịn có tác dụng kháng miễn dịch mạnh, cần thiết cho việc
ghép tạng và có tác dụng hữu hiệu trong ngăn chặn các tổn thương não, chống viêm
khớp cấp tính, giảm đau… (theo Cao Văn Nguyện (2001), Nguyễn Tác An(2005),
Lâm Ngọc Trâm và cộng sự (1996), [40].
- Khu vực miềm Nam nuôi hàu mạnh nhất ở 2 địa điểm là Bà Rịa- Vũng Tàu

và Cần Giờ- TP Hồ Chí Minh. Vùng nước Long Sơn (Vũng Tàu) được mệnh danh là
mỏ hàu. Đây là vùng nước có điều kiện tự nhiên thuận lợi phù hợp cho việc vỗ béo
hàu Crassostrea lugubris lý tưởng sau thu hoạch. Theo ước tính chỉ riêng vùng nước
Long Sơn số cơng ty và hộ gia đình ni hàu đã lên đến hàng trăm. Năm 2003-2004
TS.Lê Minh Viễn - GĐ công ty nuôi trồng thuỷ sản và thương mại Viễn Thành đã
nghiên cứu thành công đề tài “Sản xuất hàu giống bám đơn bằng sinh sản nhân tạo
và nuôi hàu thương phẩm”. Phương pháp này cho ra những con hàu có thân hình

gọn, đẹp, sâu lịng, đồng kích cỡ, vỏ mọng, tỷ lệ thịt/ vỏ cao (25%) và mức hao hụt
khi khai thác hàu thương phẩm thấp (3-5%).
Hiện nay, công ty TNHH nuôi trồng thuỷ sản và thương mại Viễn Thành
đang xây dựng một trung tâm sản xuất giống theo công nghệ sinh sản nhân tạo với
đầy đủ trang thiết bị trên một khuôn viên rộng 2,3 ha tại vùng nước Long Sơn. Hy
vọng trong tương lai đây sẽ là địa điểm tin cậy để cung cấp giống hàu ni chất
lượng cao phục vụ cho phía Nam theo Nguyễn Tuấn Anh (2004),[37].

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Như vậy, chỉ có thể kết hợp chặt chẽ giữa bảo vệ và phát triển nguồn lợi tự
nhiên, phát triển khai thác và nuôi nhân tạo các lồi nhuyễn thể 2 mảnh chung và con
hàu nói riêng thì chúng ta mới có được nguồn sản phẩm lớn, tập trung và ổn định
phục vụ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu đang ngày một gia tăng.
b. Tìm hiểu tình hình ni hàu trên thế giới.

Trên thế giới, do hàu có giá trị kinh tế cao nên nhiều nước như Trung Quốc,
Nhật bản, Hàn Quốc, Canada, Mỹ… đã tiến hành nuôi và đạt sản lượng lớn.
- Trung Quốc: là nước có nghề ni hàu đã được phát triển hơn 2000 năm

trước đây và sản phẩm hàu luôn là hải sản truyền thống trong khẩu phần ăn của
người dân Trung Quốc. Đối tượng ni chủ yếu khoảng 17 lồi trong đó hàu
C.plicatula là đối tượng ni đầu tiên, tiếp theo là hàu C.rivularis, C.gigas (nhập từ
Nhật Bản). Sản lượng nuôi hàu luôn đúng đầu thế giới. Sau 10 năm nghề nuôi hàu ở
Trung Quốc phát triển như vũ bão và đạt tới sản lượng vượt qua mọi dự báo [38].

Bảng 2: Sản lượng hàu C.gigas ở Trung Quốc
Năm

Sản lượng hàu lớn T.B.D (1000 T)

1985

42

1990

503

1995

2.280

1996

2.285

1997

2.318

1998

2.833

1999

3.200
Nguồn: Trương Vân Phi (1962)

Hiện nay hàu là thực phẩm quan trọng của người Trung Quốc và rất được ưa
chuộng trên thị trường. Giá hàu nuôi Trung Quốc khá rẻ, trung bình chỉ có 0,9
USD/kg (cả vỏ).

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Nhật Bản : Nhật Bản không chỉ là quê hương của nghề nuôi hàu mà người

Nhật còn cống hiến cho nhân loại nhiều thành tựu và kinh nghiệm quý báu trong lĩnh
vực này. Người Nhật đã hồn thiện cơng nghệ sinh sản nhân tạo từ rất sớm và đưa
vào thực hành thành công kỹ thuật nuôi treo hiện nay được phổ biến khắp thế giới.
Điều đáng buồn là do nhiều nguyên nhân khác nhau, nghề nuôi hàu của Nhật Bản
vốn rất tiến bộ và hiện đại lại cứ sa sút dần theo năm tháng [39].

Bảng 3: Sản lượng hàu C.gigas ở Nhật Bản
Năm

Sản lượng hàu (1000T)

1985
1990

260
250

1995

227

1996
1997

222
218

1998
1999

205
180
Nguồn: Tế Diệu Quốc (1962)

- Hàn Quốc: Trước đây Hàn Quốc là nước ni hàu lớn thứ nhì thế giới,

nhưng hiện nay chỉ đứng thứ ba do sản lượng đang bị giảm sút [39]
Bảng 4: Sản lượng hàu C.gigas ở Hàn Quốc
Năm

Sản lượng hàu lớn T.B.D (1000 T)

1985

1990

230
219

1995

191

1997
1998

200
175

1999

170
Nguồn:Lâm Truyền Kỳ (1962)

- Pháp : Pháp là quốc gia châu Âu, nhưng từ sớm đã nhập nội hàu lớn Thái

Bình Dương và ni rất thành công. Hiện nay họ đứng hàng thứ tư thế giới về sản
lượng hàu nuôi [39].
SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 5: Sản lượng hàu C.gigas ở Pháp
Năm

Sản lượng hàu (1000T)

1990

142

1995
1997

144
147

1998

143

1999

145

Nguồn: Trương Sĩ Kỳ (2001)

Các nước khác : Sau Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Pháp, các nước
ni hàu đó là: Mỹ (sản lượng 84000/1999), Đài Loan (sản lượng 20000/1999), Tây
Ban Nha (sản lượng 15000/1999) và Niu Dilan (sản lượng 13000/1999).
1.2; TÌM HIỂU CÁC NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VỀ PROTEASE
TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI Nguyễn Ngọc Bội (2004), Đặng Văn
Hợp (2000), Đỗ Văn Ninh (2004), Đỗ Minh Phụng (1997), Nguyễn Thị Mỹ
Trang (2004)
1.2.1 Tìm hiểu các nghiên cứu về protease trong nước và trên thế giới
Protease là nhóm enzyme xúc tác thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) trong
phân tử protein, polypeptid và các cơ chất tương tự theo cơ chế sau:
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-…-NH-CH-COOH + (n+1) H2O protease
R1 R2 Rn
H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH + … + H2N-CH-COOH
R1 R2 Rn

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trong các protease thì nhóm protease tiêu hoá được nghiên cứu sớm và nhiều
hơn cả. Nhưng ngay thế kỷ 18, nhà tự nhiên học Reomur đã phát hiện ra trong dạ dày
của chim có tác nhân xúc tác cho q trình thuỷ phân protein. Sau đó, vào năm 1836,
Schwann đã quan sát được hoạt động thuỷ phân protein của tác nhân có trong dịch vị và
30 năm sau người ta tách được enzyme thuỷ phân mà ngày nay gọi là pepsin theo
Nguyễn Ngọc Bội (2004), Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004).

Năm 1962, Danivevski đã tách được tripsin, amylase tuỵ tạng bằng phương pháp
hấp phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa lớn trong tách chiết, nghiên cứu các tính chất của
enzyme cũng như protein. Sau đó, hàng loạt enzyme protease đã được nghiên cứu, tách
dưới dạng chế phẩm như: papain được Wurtz tách ra năm 1879, bromelain được
Crassman, Ambros tách ra năm 1920… theo Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004).
Năm 1970, Kerry T. Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết
protease trung tính từ mơi trường ni cấy B.subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và
nhận thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca 2+ trong trung tâm hoạt động,
có pHopt = 6,5-7,5, t0opt =570C. Protease này bị ức chế bởi Cu 2+, Ni2+, Hg2+,Pb2+, Cd2+ ,
Fe2+ và khi có mặt ion Ca 2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH = 5.5-10 theo
Nguyễn Ngọc Bội (2004), Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004).
Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease trung
tính ở A.oryzae và nhận thấy rằng đó là một protease kiềm, trong cấu trúc có 3 cầu
disulfid nội phân tử. Enzyme này không bền sau 10 phút xử lý ở 75 0C, nhưng độ bền
của enzyme lại được phục hồi ở trên 75 0C cho đến 1000C. Đặc tính bền nhiệt này của
enzyme là do các liên kết disulfid trong enzyme quyết định.
Để tăng độ bền nhiệt của protease kiềm từ A.oryzae các nhà khoa học Nhật Bản
đã tiến hành gây đột biến ở chủng nấm mốc này để tạo ra một liên kết disulfid trong
phân tử protease. Kết quả là protease ban đầu của nấm mốc A.oryzae có nhiệt độ tối
thích ở 510C nhưng sau khi gây đột biến ở đoạn Cys 169 và Cys 200 thì enzyme này có
nhiệt độ tối thích ở 560C theo Đặng Văn Hợp (2000).

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu về protease vi sinh vật và nấm

mốc đã góp phần mở rộng quy mơ sản xuất và ứng dụng của các nhóm enzyme này
trong các lĩnh vực đời sống. Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm
trên thế giới ở các nước phát triển chủ yếu là Châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng
300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính khoảng 500 triệu USD theo
Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lâm Dũng (1993). Hàng năm trên thế giới có khoảng 600
tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật, trong đó khoảng 500 tấn từ vi khuẩn
và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có cơng nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên
tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo…Các
nước này đã đầu tư thích đáng cho cơng tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng protease
từ vi sinh vật. Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzyme nói chung và
protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ. Chính vì thế nhịp độ sản xuất
enzyme ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 515%.
Ở Việt Nam, có nhiều cơng trình cơng bố về việc nghiên cứu sử dụng protease,
các cơng trình cơng bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một
số đặc tính nghiên cứu của enzyme…Một số cơng trình nghiên cứu về protease ở Việt
Nam như sau:
- Nguyễn Lâm Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Truy (1964) đã nghiên cứu

sử dụng protease A.oryzae cho thấy có thể sử dụng enzyme này để rút ngắn thời (1967)
còn tiến hành trộn trực tiếp một số chủng nấm mốc Aspergillus có khả năng sản xuất
protease với cá và giữ ở 550C trong khoảng 1-3 ngày, kết quả nghiên cứu cho thấy cá bị
thuỷ phân nhanh hơn [3].
- Phạm Thị Trân Châu và các cộng sự (1987) đã nghiên cứu một số tính chất của

bromelain tách từ chồi dứa cho thấy trong chồi dứa có 2 protease và bromelain chồi dứa
có hoạt tính cực đại ở pH = 6,5; t 0opt = 600C. Tới năm 1997, Lê Thị Thanh Mai tiếp tục
nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain đã cho thấy có thể thu
nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp
siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton cũng như có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp
SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

lọc gelsephadex G-75 với hiệu suất cao [3].

- Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự và cộng sự (1991) đã dùng B.subtilis bổ sung vào
thuỷ phân cá. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,3% chế phẩm B.subtilis vào chượp, trong
điều kiện nhiệt độ 500C thì thời gian chế biến nước mắm rút ngắn còn 10 ngày và 30-35
ngày trong điều kiện tự nhiên mùa hè [3].
- Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự (1993) đã nghiên cứu và cho thấy có thể dùng
mơi trường ni cấy chứa protease của nấm mốc A.oryzae 29A để rút ngắn thời gian chế
biến nước mắm. Tuy nhiên nước mắm sản xuất theo phương pháp này chưa có mùi vị đặc
trưng và khâu lọc rút nước mắm cịn gặp khó khăn do hỗn hợp chượp đặc nhuyễn [10].
- Tác giả Đặng Văn Hợp (2000) công bố nghiên cứu về protease của A. oryzae A4

cho thấy có thể thu nhận protease từ mơi trường nuôi cấy A. oryzae A4 theo phương pháp
bề mặt và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật từ canh trường nuôi theo cách chiết rút
bằng nước cất rồi kết tủa bằng ammo niumsul phate. Enzyme thu được hoạt động tốt nhất
ở 500C, pH 6,5 và có thể ứng dụng để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. [10]
- Vũ ngọc Bội (2004) công bố các nghiên cứu về protease B.subtilis S5 cho thấy

có thể dùng nước cất để thu nhận protease với hoạt tính cao từ canh trường ni
B.subtilis S5 theo phương pháp nuôi cấy bán rắn và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật
bằng cách dùng ethanol để gây kết tủa. Protease thu được có nhiệt độ thích hợp là 55 0C
và pH thích hợp là 6,0. Protease này có thể sử dụng rất tốt trong thuỷ phân cơ thịt cá tạp
để sản xuất bột đạm thuỷ phân và thuỷ phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày
[3], [21].

- Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng cá

và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một hỗn
hợp gồm nhiều protese có nhiệt độ thích hợp từ 50-550C và hồn tồn có thể sử dụng
protease này trong thuỷ phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thuỷ phân ứng dụng trong
sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [18].

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 18


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các cơng trình nghiên cứu trên đã góp phần thúc đẩy lĩnh vực nghiên cứu về
protease ở nước ta phát triển. Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng protease ở nước ta còn
nhiều hạn chế như các chế phẩm enzyme được sản xuất với giá thành còn cao…Vì vậy,
cần tiếp tục nghiên cứu hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra một phương pháp ứng
dụng phù hợp với điều kiện sản xuất thực tế tại Việt Nam. Đặc biệt là cần tăng cường
nghiên cứu về protease từ vi sinh vật - một lĩnh vực cho phép hạ giá thành chế phẩm
enzyme.
1.2.2 Tìm hiểu ứng dụng của protease
 Protease là loại enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

công nghệ thực phẩm, chế biến thuỷ sản, y học…Hơn nữa, khi thuỷ
phân bằng protease thì có những ưu điểm sau:
- Tính đ ặc hiệu cao
- Điều kiện nhẹ nhàng (nhiệt độ thường)
- An toàn đối với người sử dụng.
Tuy nhiên, khi dùng protease để thuỷ phân thì mỗi enzyme u cầu có

những điều kiện hoạt động riêng. Hoạt lực của enzyme được xác định giá trị hoạt
động của nó.
 Những ứng dụng của protease:

+ Trong chế biến thuỷ sản: Từ lâu người ta đã nghiên cứu và biết được tác dụng
của protease tiêu hoá và enzyme khác có sẵn trong nguyên liệu có tác động đến
quá trình thuỷ phân cá trong cơng nghệ sản xuất nước mắm. Để tăng quá trình
thuỷ phân rút ngắn thời gian chế biến nước mắm người ta đã tiến hành tạo nhiệt
độ thích hợp cho protease hoạt động, làm giảm độ mặn ban đầu của khối cá cũng
như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease với cá bằng cách xay nhỏ cá.
Hơn nữa, người ta còn nghiên cứu bổ sung thêm protease từ ngoài vào để làm
tăng tốc độ, hiệu quả thuỷ phân protease cá.

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 19


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Còn trong sản xuất bột cá nếu sử dụng protease sẽ dễ dàng tách da thịt ra
khỏi xương, bột cá mịn hơn, hiệu quả kinh tế cao hơn theo Nguyễn Trọng Cẩn,
Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1990).[6], [21].
+ Trong công nghệ thực phẩm: Đây là lĩnh vực mà enzyme được sử
dụng rộng r ãi nhất.
Trong chế biến thịt, đậu: Người ta thường sử dụng protease thuỷ phân nhẹ
nhàng nguyên liệu để làm mềm, tăng nhanh q trình “chín” của thịt, đậu hoặc
thuỷ phân sâu sắc tạo thành các dạng dịch thuỷ phân hoặc bột đạm thuỷ phân
trước khi chế biến các sản phẩm nhằm tạo cho thịt, đậu có màu, mùi vị mới dễ
tiêu hoá. Dịch hoặc bột thịt, đậu thuỷ phân là loại bột dinh dưỡng cao cấp, dễ

hấp thụ, khơng có phần ức chế enzyme, có thể phối chế theo các công thức khác
nhau để chế biến thức ăn cho trẻ em, người già, người bị bệnh. Mặt khác, quá
trình này cũng tiết kiệm được năng lượng trong chế biến một cách đáng kể Đỗ
Văn Ninh (2004). [18]
- Trong chế biến phomat: Người ta sử dụng các protease khác nhau để làm đơng
tụ sữa, thu casein và thúc đẩy q trình chín của phomat. Nhờ protease mà
hương vị chất lượng phomat tăng lên, thời gian chế biến ngắn hơn, hiệu suất thu
hồi sản phẩm cao hơn theo Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) [21]
- Trong công nghiệp bia: Các protease được sử dụng để thuỷ phân protein
tạo sản phẩm tiền đề cho quá trình lên men tiếp theo, ảnh hưởng quyết định
đến độ trong, độ tạo bọt, độ bền của bọt, màu, mùi vị của sản phẩm theo Lê
Ngọc Tú, Lương Hữu Đồng (1975)[25].
- Trong sản xuất rượu: Protease được sử dụng là trong rượu, giảm bọt,
thúc đẩy quá trình lên men malolactic.
- Trong chế biến các loại ngũ cốc, làm bánh: Sử dụng protease để cải
thiện các đặc tính cơng nghệ, cải thiện độ chắc, tăng thể tích của bánh, giảm
thời gian nhào trộn bột.
- Trong chế biến trứng và các sản phẩm từ trứng: Làm chín trứng muối,
cải thiện vị, trạng thái tăng chất lượng bột trứng.
SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Các protease cũng được sử dụng để thuỷ phân protein trong phế liệu
của công nghệ thực phẩm(xương, nội tạng, máu động vật …), chuyển phần
protein của phế liệu thành dạng hoà tan, tách khỏi các thành phần khơng tan
hoặc hồ tan nhưng khác tỷ trọng, thu dịch đạm thuỷ phân hoặc bột giàu đạm
dùng làm thức ăn chăn nuôi hoặc thực phẩm.
+ Trong nông nghiệp: Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng
các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, tăng khả năng tiêu hoá
thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiến hành bằng cách thêm trực tiếp
protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng protease để xử lý sơ bộ thức ăn
theo Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến
(1990), Nguyễn Hữu Chấn (1983)[6], [7], [21].
+ Trong y học: Một số protein như trypsin, α chymotrypsin dùng để sản
xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hoá, bệnh nghẽn tim mạch, tiêu mủ ở các ổ
viêm, làm thông đường hô hấp, bệnh thiếu enzyme bẩm sinh…GS- TSKH.
Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp với Viện quân y 108 nghiên cứu sử dụng chế
phẩm protease có tên gọi “prozi mabo” để điều trị bỏng. Kết quả cho tháy giả
mạc rụng nhanh, vết bỏng nhanh khỏi theo Phạm Thị Trân Châu(1993),
Nguyễn Lâm Dũng (1993), Nguyễn Hữu Chấn (1983)[8], [21]
+ Trong công nghiệp phim ảnh: Protease dùng để thuỷ phân sơ bộ da
nguyên liệu, làm mềm da, dễ tẩy lông và tỷ lệ lông thu hồi tăng 20-30% so
với phương pháp tẩy lơng bằng hố học đồng thời làm tăng chất lượng của da
theo Đỗ Văn Ninh (2004)[18].
+ Trong cơng nghiệp sản xuất xà phịng, chất tẩy rửa và mỹ phẩm:
Protease được bổ sung vào xà phòng, kem đánh răng, bột giặt làm tăng
chất lượng tẩy sạch các vết bẩn có protein như vết máu, mủ trên quần áo bệnh
nhận, vải trong bệnh viện, quần áo bộ đội thời chiến, quần áo blu của công
nhân trong nhà máy thuỷ sản hoặc bổ sung vào kem dưỡng da, kem bơi mặt có

thể loại bỏ được lớp biểu bì chất làm mềm da theo Lê Ngọc Tú (1997)[25].

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

Trang 22


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.3. TÌM HIỂU VỀ CÁC CHẾ PHẨM DỊCH THỦY PHÂN TỪ THỊT HÀU
VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN theo
Nguyễn Ngọc Bội (2004), Nguyễn Trọng Cẩn (1990), Nguyễn Thị Hiền (1990),
Đỗ Thị Giang (1990), Trần Thị Luyến (1990), Nguyễn Hữu Chấn (1983), Đỗ
Văn Ninh (2004).
1.3.1 Giới thiệu về chế phẩm dịch thủy phân.
Hàu là nguyên liệu giàu acid amin thích hợp cho việc sản xuất chế phẩm dịch
thuỷ phân từ hàu. Ngoài ra, trong hàu có nhiều vitamin, khống chất,… cho nên các
sản phẩm chế biến từ hàu được coi là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
Thực chất của q trình sản xuất dịch thuỷ phân từ hàu chính là quá trình thuỷ
phân protein để tạo ra các peptid và các acid amin dưới tác động của hệ enzyme
protein nội tại và enzyme protease bổ sung từ ngồi vào.
1.3.2 Tìm hiểu bản chất, cơ chế của quá trình thủy phân theo Đặng Văn
Hợp (2000) [10]
Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương trong hợp
chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác có sự tham gia của
nước trong phản ứng.
H2O H2N – CH – COOH

H2N – CH – CO – NH – CH –CO – NH –
protease R1 R2

R1 R2
Liên kết nhị dương

SVTH: LÝ MỸ HẠNH

+ H2N – CH – CO – NH –

(Acid amin) (Peptid)

(Protein)

Trang 23


Enzyme là chất xúc tác mang bản chất protein, enzyme có khả năng tương
tác lên các liên kết nhị dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử
cơ chất, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi có yếu tố nước
tham gia.
 Cơ sở lý thuyết về tác dụng của enzyme thủy phân vào liên kết nhị dương

Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) khơng có nhóm ngoại. Trong trung tâm hoạt
động của chúng có chứa gốc amino acid đặc hiệu. Đối với hydrolase thường chứa
hai nhóm chức.
Ví dụ: + Vịng imidazol của histidin
+ Nhóm hydroxyl (một số amino acid: serine, threonine)
Sự tương tác giữa hai nhóm đặc hiệu (-OH, - imidazol) đã hình thành tâm ái
nhân. Xung quanh trung tâm hoạt động của hydrolase còn chứa nhiều các amino
acid, vai trị của serine có chứa nhóm – OH có tác động rất lớn làm thay đổi trung
tâm hoạt động theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Do cấu trúc bậc
3 của phân tử protein-enzyme mà nhóm hydroxyl của serine và vịng imidazol của

histidin gần gũi nhau, tạo ra liên kết hydroxyl giữa gốc – OH của serine với nitơ bậc
3 của histidin. Nhờ quá trình đó mà nhóm hydroxyl xuất hiện tính chất ái nhân và có
thể tương tác được với liên kết nhị dương của cơ chất như sau:
OE

H+
N

Sự thủy phân của enzyme càng dễ dàng khi sự khuyết điện tử trong liên kết
nhị dương càng lớn, vì sự gắn tâm ái nhân của enzyme vào liên kết nhị dương càng
mạnh mẽ.
Sự khuyết điện tử có thể được tăng lên khi tăng tổng điện tích dương của hai
nguyên tử tạo thành liên kết hóa học hoặc chỉ tăng điện tích của một trong hai khi
cơ chất tương tác với enzyme.

Nếu trong hai phân tử cơ chất có nhiều liên kết giống nhau thì liên kết nào


nhị dương hơn cả sẽ bị phân ly thủy phân trước bởi enzyme (với điều kiện khơng
có án ngữ khơng gian và đặc hiệu lập thể của từng liên kết).
 Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase lên cơ chất bị thủy phân cũng tuân theo

cơ chế chung sau:
E - + S+

ES

P+E

Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất, ES là phức hợp enzyme và cơ chất, P sản

phẩm tạo thành.
Giai đoạn đầu có sự hình thành phức hợp trung gian ES, sự tạo thành phức
hợp này có thể theo hai kiểu sau:
- Kiểu cơ chế thứ nhất: Là kiểu hình thành đơn giản, tâm ái nhân (-) của

enzyme tương tác nhanh với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết
nhị dương. Sau khi tương tác sẽ làm thay đổi mật độ electron (e) và làm suy yếu
liên kết nhị dương tạo điều kiện cắt đứt liên kết. Các nhà nghiên cứu cho rằng kiểu
cơ chế này xảy ra khi tâm ái nhân của enzyme mạnh và sự khuyết điện tử của liên
kết nhị dương lớn theo Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn (1994).
- Kiểu cơ chế thứ hai: Lúc đầu các nguyên tử khuyết điện tử trong liên kết
nhị dương chưa thể đính trực tiếp vào tâm ái nhân của trung tâm hoạt động của
enzyme mà cơ chất gắn vào tâm ái nhân bằng một phản ứng hóa học nào đó giữa
tâm ái nhân ở trung tâm hoạt động enzyme với một nhóm hóa học ở vị trí liền kề
với liên kết nhị dương trong cơ chất. Dưới ảnh hưởng của trung tâm hoạt động của
enzyme sẽ dần dần làm tăng mức độ khuyết điện tử vốn đã tồn tại trước đó, bằng
cách tạo liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí gần gũi với liên kết nhị
dương. Nhờ vậy, làm cho sự phân bố điện tử trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo
chiều hướng cần thiết, khiến cho liên kết nhị dương được tăng cường và có thể
tương tác với các ái nhân của trung tâm hoạt động của enzyme và tiến hành làm
yếu liên kết, dẫn đến liên kết bị thủy phân khi có yếu tố nước tham gia theo Đặng
Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (1994).