Nghiên cứu tống hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib combretastatin TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-------------

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG
UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1.PGS. TS. Ngơ Quốc Anh
2. PGS.TS. Vũ Đình Hồng

HÀ NỘI - 2020


Cơng trình được hồn thành tại
Phịng Nghiên cứu phát triển dƣợc phẩm
Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Ngô Quốc Anh
PGS. TS. Vũ Đình Hồng

Phản biện 1:...................................................................................................

Phản biện 2:...................................................................................................
Phản biện 3:...................................................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước tại Học Viện
Khoa học và Cơng nghệ
Vào hồi

Có thể tìm thấy luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một
cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mơ khác bằng
cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nhiều vị trí khác
nhau (di căn). Theo thống kê của tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm
2018 hiện cả nước có hơn 300.000 người sống chung với ung thư, có 164.671
ca mới, 114.871 người tử vong do bệnh này. Tồn cầu hiện có khoảng 23 triệu
người mắc, trong đó mỗi năm có hơn 14 triệu người mắc mới và 8 triệu 2 trăm
nghìn người tử vong. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp Việt Nam nằm trong 50
nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư.
Việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị ung thư lại ít tác dụng phụ là một
trong những hướng luôn được giới khoa học quan tâm. Trong số các phương
pháp điều trị hiện nay, hóa trị liệu là một phương pháp điều trị ung thư sử dụng
một hoặc nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào. Một trong các loại thuốc
chống ung thư, được sử dụng ngày nay trong hóa trị liệu, tác động đến chu kỳ tế

bào để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và sau đó gây ra sự chết tế bào
theo chương trình (apoptosis).
Các hướng dẫn điều trị triển vọng thường khuyến nghị kết hợp nhiều loại
thuốc chống ung thư hoạt động trên nhiều cơ chế khác nhau. Ngày nay, nghiên
cứu khám phá ra các loại thuốc nhắm vào nhiều mục tiêu đang được chú ý, với
mong muốn kết hợp các mục tiêu phân tử khác nhau trên duy nhất một tác nhân
hóa học. Những ưu điểm của phân tử lai so với sự kết hợp của nhiều loại thuốc
có thể cải thiện các hạn chế về kỹ thuật, phản ứng phụ và sự kháng thuốc của
một mục tiêu riêng lẻ [1]. Một trong những nhóm chất chống ung thư quan
trọng nhất là các phân tử liên kết tubulin. Mặc dù một số loại thuốc nhắm mục


2

tiêu vi ống đã được sử dụng trong lâm sàng, nhưng vẫn cần tìm kiếm các tác
nhân mới có thể khắc phục những hạn chế về sự kháng thuốc và các tác dụng
phụ không mong muốn của các liệu pháp hiện tại [3].
2. Mục tiêu của luận án
1. Thiết kế được cấu trúc các hợp chất lai coxib - combretastatin
2. Tổng hợp được các hợp chất lai coxib - combretastatin
3. Sàng lọc được các hoạt tính kháng ung và kháng viêm của các hợp chất lai
4. Xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các hợp chất lai
5. Tiến hành docking phân tử hợp chất lai coxib - combretastatin với hai đích
tác dụng COX2 và tubulin
3. Những nội dung nghiên cứu chủ yếu của luận án
- Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất dị vòng lai hóa combretastatin và celecoxib
- Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất dị vòng 4 aza- podophyllotoxin
- Xác định cấu trúc các hợp chất tổng hợp được
- Sàng lọc hoạt tính các chất tổng hợp được
- Nghiên cứu sâu hơn về mặt cơ chế tác dụng và tác động lên chu kỳ tế bào của

một số chất mới tiêu biểu
- Nghiên cứu và khẳng định tương quan mơ hình cấu trúc lai hóa về mặt hóa
học cũng như sinh học lớp chất mục tiêu.

Hình 31: Mơ phỏng hợp chất lai coxib – combretastatin theo mục tiêu đặt ra


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan trình bày chung về các hợp chất kháng ung thư theo cơ chế ức
chế tubulin, sơ lược về cơ chế tubulin. Nhóm các hợp chất theo cơ chế tubulin
vẫn luôn là đề tài đáng được quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu thuốc chống
ung thư. Các hợp chất combretastatin có những hoạt tính sinh học phong phú đã
được ứng dụng trong điều trị một số căn bệnh ung thư, chúng được biết đến với
hoạt tính gây độc tế bào theo cơ chế ức chế trùng hợp tubulin tại vị trí colchicin
[2]. Cho đến nay những hợp chất điều trị ung thư theo cơ chế này vẫn đang
được ứng dụng rộng rãi và luôn là một hướng nghiên cứu nhận được nhiều sự
quan tâm.
- Tổng quan về các hợp chất combretastatin, thuộc lớp chất cis-stilben,
một nguồn phong phú của các hợp chất dẫn đường trong việc tìm kiếm các loại
thuốc mới, các hợp chất điển hình như resveratrol và combretastatin A-4
phosphat hiện đang được thử nghiệm để điều trị bệnh Alzheimer và ung thư
trên lâm sàng. Các stilben mới được phân lập gần đây đã cho thấy có nhiều hoạt
tính sinh học đa dạng, bao gồm tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống sốt rét,
gây độc tế bào, bảo vệ gan và chống viêm. Combretastatin A-4 (CA4) cũng
được xem là tác nhân gây độc tế bào tiềm năng do ức chế mạnh sự trùng hợp vi
ống bằng cách gắn vào điểm gắn kết của colchicin trên tubulin. CA-4 có độc
tính cao trên nhiều mơ hình tế bào ung thư, do vậy nó là một cấu trúc mục tiêu
hiện đang rất được quan tâm.

- Tổng quan về Pyrazol là các dị vịng có năm cạnh tạo thành một nhóm
các hợp chất đặc biệt hữu ích trong tổng hợp hữu cơ. Chúng là một trong những
nhóm hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất trong họ azol. Pyrazol được báo cáo
qua các tài liệu hiện có và SAR cho thấy, nó là cần thiết cho việc thiết kế các
chất ức chế chọn lọc COX2. Một trong các hợp chất quan trọng và thông dụng


4

nhất trong các hợp chát pyrazole được ứng dụng trong thương mại đó là
celecoxib, một chất được biết đến với hoạt tính kháng viêm mạnh, là thuốc ức
chế chọn lọc COX2 thông qua hoạt động của prostaglandin gây ra trong q
trình viêm và đau mà khơng tác dụng lên các prostaglandin COX1 có tác dụng
bảo vệ đường tiêu hóa. Hơn nữa Celecoxib ức chế cả sự tăng sinh trên mô hình
in vitro tế bào ung thư vú ở người như MCF7 và MDAMB-231. Một số nghiên
cứu chỉ ra rằng celecoxib và các hợp chất liên quan có thể gây ra sự bắt giữ chu
kỳ tế bào ở giai đoạn G0 /G1 dẫn đến tế bào chết theo chu trình apotosis, ức chế
sự phát triển của khối u và ngăn chặn sự hình thành mạch của khối u khi khơng
có sự hiện diện của COX2
Qua đó có thể thấy các hợp chất lai hóa combretastatin celecoxib là
những lớp chất đầy hứa hẹn vẫn còn mới về mặt phát triển cấu trúc cũng như
hoạt tính sinh học góp phần xây dựng chung cho những cơng trình nghiên cứu
mới tìm kiếm các loại thuốc kháng ung thư trong ngành hóa dược.


5

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất và dung môi

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.3. Tổng hợp các hợp chất lai coxib- combrestatin
2.3.1. Tổng hợp các dẫn chất este của chất lai este coxib - combretastatin

Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin
(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate
(1 mmol, 1 eq) (77), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH
khan; phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78).
Tổng hợp được 20 chất lai dang lai hóa dạng este của coxib - combretastatin là
các chất từ 79 đến 98.
2.3.2. Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3

Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin chứa nhóm CF3
(a) 100 (1.0 mmol), 99 etyl trifluoroacetat (1,2 eq) và NaH (2,5 eq) trong THF (5 mL), 6 h.
(b), EtOH (5 mL), axit (1.0 eq); arylhydrazin hydrochlorid 78 (1.0 mmol) được thêm liên
tiếp vào cặn và hồi lưu trong 6 giờ. Chất 102 được phân lập qua sắc ký cột.


6

2.3.3. Tổng hợp các dẫn chất axit của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin

Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép combretastatin và coxib dạng axit
(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1
mmol, 1 eq), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan;
phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78). Sản phẩm thu được sau phân lập qua sắc
ký cột được hịa tan trong hệ dung mơi THF/MeOH/H2O = 3:1:1, sau đó NaH

(1,2 eq) được thêm vào hỗn hợp. Thực hiện phản ứng trong 3h thu được chất lai
hóa dạng axit 103-122.
Tổng thành cơng 20 chất lai dang lai hóa dạng axit của combretastatin-coxib là
các chất từ 103-122
2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các hợp chất nghiên cứu
Các hợp chất đã tổng hợp được tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng ung thư vú
MCF7, ung thư đại tràng HT-29, ung thư biểu mô gan Hep-G2 và ức chế sản
sinh NO.


7

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Những ưu điểm của việc sử dụng một phân tử lai so với việc đồng thời
kết hợp nhiều loại thuốc riêng lẻ có thể cải thiện các hạn chế về phản ứng phụ
và sự kháng thuốc [107]. Tuy có hoạt tính nổi trội, nhưng combretastatin vẫn
cịn nhiều những tác dụng khơng mong muốn. Đây là lý do nhóm nghiên cứu
đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và
celecoxib, một chất kháng viêm theo cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn cho
các hợp chất lai mới với hy vọng tìm ra những chất mang các đặc điểm hoạt
tính sinh học lý thú như kháng ung thư và kháng viêm của chất gốc đồng thời
ít gây tác dụng phụ.
3.1. Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai
3.1.1. Thiết kế cấu trúc phân tử lai
Nghiên cứu đã áp dụng chiến lược lai ghép để lai hóa các nhóm dược lý
quan trọng của hai hợp chất gốc celecoxib và CA4 trong một phân tử duy nhất.
Vòng pyrazole được thay thế bởi 1,2-diphenyl của khung celecoxib như một
cấu trúc tương tự như cis-1,2-diphenylethylene trong CA4. Sự thay thế liên kết
đơi bằng vịng 5 đã được khẳng định về mặt hoạt tính gây độc tế bào và ức chế
tubulin [108]. Các hợp chất bị khóa dạng cấu hình cis này thể hiện một số lợi

ích như ngăn chặn q trình đồng phân hóa từ dạng cis thành trans, giúp tăng
độ đặc hiệu của hoạt chất này với các mục tiêu tế bào và cải thiện tiềm năng
điều trị của nó. Sự hiện diện của các nhóm trimethoxybenzene của CA4 cũng là
cần thiết cho hoạt tính độc tế bào [76]. Chúng tơi đặc biệt quan tâm đến việc
duy trì nhóm sulfonamid hoặc các đặc điểm liên quan đến celecoxib vì điều này
dường như dẫn đến việc bảo tồn được tính chọn lọc COX2 của chất lai thu được
[109]. Tác dụng ức chế COX2 nếu có sẽ góp phần vào tổng thể hoạt động
chống khối u của các phân tử lai mới.


8

Hình 3.1. Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp
chất lai combretastatin – coxib
3.1.2. Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai
Tác dụng gây độc tế bào của những hợp chất này chống lại ba dòng thế
bào ung thư ở người HT-29, Hep-G2, MCF-7 cũng như ức chế sản sinh NO
bằng cách kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) tế bào đại thực bào RAW 264.7.
Vai trò của NO trong khối u rất phức tạp, nó có vai trị kích thích hoặc ức chế
quá trình tế bào tùy thuộc vào điều kiện, vì vậy sự ức chế sản sinh NO khơng
liên quan trực tiếp đến độc tính tế bào. Nhưng NO thể hiện một loạt các đặc
tính dược lý có ích tương tự như prostaglandin trên hệ tim mạch bao gồm sự
giãn mạch, sự ức chế kết tập tiểu cầu và sự điều hòa các mảng bám của bạch
cầu vào thành mạch [110]. Hơn nữa, việc sử dụng celecoxib trong phòng chống
ung thư vú và các khối u ác tính đã bị hạn chế bởi các tác dụng phụ của nó, đặc
biệt là nguy cơ biến chứng của tim mạch liên quan chủ yếu đến khả năng giảm
sản sinh prostacyclin PGI2 [111]. Nhờ đó có thể thấy sự duy trì sản sinh NO
cùng với những đặc tính ức chế COX2 của celecoxib có thể giúp tránh nguy cơ
biến chứng tim mạch, do vậy một chiến lược nhằm thiết kế một loạt phân tử đa

9

đích bằng cách kết hợp ức chế chọn lọc COX2 với các hoạt động phụ thuộc
nitric oxide (NO) đã được triển khai [112-114].
Trong quá trình viêm nhiễm, các tế bào miễn dịch được kích hoạt như đại
thực bào tiết ra một số chất trung gian gây viêm như cytokine tiền viêm, oxit
nitric (NO) và prostaglandin E2 (PGE2). Hơn nữa, có một mối liên quan rõ ràng
giữa mức độ prostaglandin trong các khối u vú ở người với sự phát triển của di
căn và khả năng sống sót [115]. Prostaglandin E2 tồn tại với nồng độ cao trong
các khối u vú và ở những thể trạng ung thư di căn, khi thiếu thụ thể estrogen và
progesterone [116-117]. Do đó, khả năng ức chế sản xuất PGE2 có thể được
coi là một chiến lược tốt trong việc thiết kế các chất chống ung thư. Tuy nhiên,
các tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức PGE2 rất thấp theo báo cáo khác
[109]. Do đó, hiệu lực hoạt tính của các hợp chất lai đã được thử nghiệm đáp
ứng viêm gây ra bởi LPS thay bằng ức chế PGE2 trên MCF7 [118].
Do vậy, các dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và khả năng ức
chế sản sinh NO được lựa chọn là các cơng cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính
kháng viêm của lớp chất nghiên cứu. Và để xác định được cơ chế kháng viêm
và kháng ung thư của các chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2,
các phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, các phương pháp nghiên cứu hoạt
tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt
tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3, nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng
phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI. Sau cùng, các chất
đã được chọn lọc và nghiên cứu cơ chế sinh học sẽ được thử nghiệm tương tác
với các đích tác dụng tubulin và COX2 bằng phương pháp docking phân tử để
khẳng định độ chính xác hoạt tính sinh học của mơ hình in vitro.
3.2. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin

10

Phương pháp một bình phản ứng đã được áp dụng để điều chế các dẫn
chất etyl 1,4,5-triaryl-1H pyrazole-3-cacboxylat từ ethyl oxalyl chlorid, 1,2diarylethanon và ethyl oxalyl chlorid arylhydrazin hydrochlorid (Hình 2.1,
Hình 2.2, Hình 2.7, Hình 2.8) [109]. Phản ứng ngưng tụ Claisen giữa hai thành
phần 1,2-diarylethanon và ethyl oxalyl chloride với tác nhân kiềm sử dụng là
tert-BuOLi, thu được sản phẩm trung gian muối lithium của ethyl 2,4-dioxo3,4-diarylbutanoat, phản ứng được tiếp tục với arylhydrazin hydrochlorid thông
qua phản ứng Knorr được xúc tác bởi axit clohydric để tạo ra triarylpyrazole-3cacboxylat (hợp chất lai 79 đến 98) và (hợp chất lai 103 đến 122). Một chu
trình điều chế dạng dẫn chất của celecoxib cũng được áp dụng (Hình 2.4, Hình
2.5) 3,4,5-trimethoxyphenyl - 1,1,1-trifluoro-2,4-butanedion (43, 102) thu được
từ sự ngưng tụ Claisen giữa các dẫn xuất acetophenon và etyl trifluoroacetat sau
đó tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo
thành 3,4,5-trimethoxyphenyl, một chất có cấu trúc tương tự celecoxib.
Theo các quy trình phản ứng được mơ tả trong Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp
chất lai coxib - combretastatin –đã được tổng hợp thành công với hiệu suất từ
64 – 83% (Bảng 3.1) 02 hợp chất chứa nhóm CF3 với hiệu suất lần lượt là 95%.
78% (bảng 3.2). 20 hợp chất dạng axit của chất lai coxib - combretastatin với
hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); các chất được xác định cấu trúc bằng các
phương pháp tinh chế và phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D,
2D.
Trong số các hợp chất lai thu được, các chất 79 đến 98 và 102 đến 122 lần
đầu tiên được tổng hợp và chưa từng được công bố trước đây. Và 01 hợp chất
đã được công bố và cũng được dùng như một chất so sánh là celecoxib (43)
được biết đến với nhiều cơng trình nghiên cứu [78-79].
3.3. Hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin


11

3.3.1. Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin

Sàng lọc hoạt tính của 20 hợp chất lai hóa coxib - combretastatin dạng este
và 02 chất lai chứa nhóm CF3
Độc tính tế bào của 20 hợp chất lai hóa coxib dạng este và 02 hợp chất
chứa nhóm CF3 đã được đánh giá về tỷ lệ ức chế sự phát triển tế bào trên ba
dòng HT-29, Hep-G2 và MCF-7 bằng phương pháp được phát triển bởi Monks
và cộng sự [120]. Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3.4 theo hoạt tính giảm dần.
Các hoạt tính chống tăng sinh của celecoxib thể hiện trên các tế bào ung thư ở
người như ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep-G2) ung thư trực tràng (HT29) đã được công bố [121-123]. Trong phạm vi cơng trình nghiên cứu này 12
hợp chất lai hóa mới 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hiện độc
tính tế bào trên các dòng MCF-7 mạnh hơn celecoxib và năm hợp chất 102, 96,
81, 82, 94 có IC50 < 10 µM. Trong đó một số các hợp chất như 102, 96, 94, 93
và 97 cũng có độc tính Hep-G2 tương đương với chất gốc celecoxib (65). Hơn
nữa, 05 hợp chất lai 96, 94, 90, 97, 80 cho thấy khả năng chống lại tế bào HT29 mạnh hơn 3-6 lần so với chất gốc celecoxib và hợp chất 90 có IC50 10 µM.
Qua đó có thể khẳng định, sự hiện diện của các nhóm thế chứa nitơ, halogen tại
vị trí para- của cả hai vòng phenyl liền kề 96, 93, 91, 92, 97 góp phần làm tăng
độc tính tế bào. Hợp chất 102 mang đầy đủ các đặc điểm cấu trúc của khung
celecoxib và CA4 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào nổi trội với dòng MCF-7.
21 hợp chất và celecoxib (65) cũng được thử tác dụng ức chế oxit nitric (NO)
khi kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) trên đại thực bào RAW 264.7 [124].
Điều thú vị là, ngoại trừ các hợp chất 102 và 98 có hoạt tính kép mạnh nổi trội
đối với việc ức chế sản xuất NO cũng như hoạt động gây độc tế bào trên dòng
tế bào ung thư MCF-7, các hợp chất khác trong nhóm này thể hiện hoạt động ức


12

chế sản xuất NO yếu hơn , nhấn mạnh rằng chúng có thể có tính an tồn tốt hơn
trên hệ thống tim mạch so với celecoxib [110].
Bảng 3.4. Tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng este đối với
ba dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF7 và ức chế sản xuất NO

STT

Hợp
chất

R

R’

R’’

IC50 (µM)
Ức chế
xuất NO

sản HT-29

Hep-G2

MCF-7

3,4,5triOMe

4-NH2SO2

1.95±0.11

43.0 ± 6.0

39.96± 3.36

4.63± 0.59

H

4-F

4-NH2SO2

81.6 ± 10.6

18.7 ± 1.7

29.37± 1.90

7.97±0.51

81

H

H

4-CN

116.83±7.7

37.6±3.5

>254

8.20± 0.93

4

82

H

H

4-NO2

129.88±15.7

21.2±2.1

>242

9.67± 0.92

5

94

H

4-OH

4-NH2SO2

92.3 ± 7.2

18.8 ± 1.5

14.51±1.36

8.90± 0.79

6

93

H

4-Br

4-NH2SO2

73.7 ± 2.6

23.5 ± 1.8

35.48±2.85

19.27±0.27

7

91

H

4-Br

4-CN

116.01±13.6

32.6± 3.0

>211

20.16± 1.83

8

92

H

4-Br

4-NO2

91.58±7.8

153.2± 10

>203

21.30± 1.40

9

89

H

4-Br

4-OMe

21.01±4.3

39.6±2.9

>209

21.51± 1.48

10

90

H

4-Br

4-CF3

> 233

10.0±0.7

75.87±4.41

21.65± 1.86

11

97

H

4-Cl

4-NH2SO2

122.2 ± 9.7

14.1 ± 1

37.04±4.95

23.79± 3.11

12

85

4-OMe

4-OMe

4-CF3

134.10±15.7

107± 10

>201

29.80± 2.71

13

43

4-Me

4-NH2SO2

83.59 ± 5.0

58.4 ± 3.4

37.11±2.14

30.67±3.79

14

98

H

4,6diOMe

4-NH2SO2

4.41±0.17

136.0 ± 12

>197

39.93± 2.64

15

83

H

H

4-NH2SO2

> 233

100 ± 10

54.35±4.57

40.54±2.56

1

102

2

96

3


13

16

79

H

H

4-OMe

30.0±13.4

>251

21.43±1.93

43.19±4.86

17

87

4-OMe

4-OMe

4-NO2

148.85±8.4

>211

>211

48.81± 2.62

18

86

4-OMe

4-OMe

4-CN

76.42±9.4

110.3±7.0

>220

48.86± 3.13

19

84

4-OMe

4-OMe

4-OMe

67.06±3.7

160±15

>218

49.32± 1.72

20

80

H

H

4-CF3

59.52±5.5

17.3±2.0

63.17± 3.01

50.66± 4.46

21

88

4-OMe

4-OMe

4-NH2SO2

103.4 ±10.5

99.0±6.3

58.57± 4.70

68.43± 7.05

22

98

H

4,6-diOH

4-NH2SO2

> 208.5

173.9 ± 12

64.03± 5.75

83.60± 3.44

0.18± 0.04

0.44± 0.05

0.36± 0.04

8.39±0.31

L-NMMA
Ellipticine

Bảng 3.5. So sánh tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng axit
và dạng este đối với tế bào ung thư MCF-7 và ức chế sản xuất NO
IC50 (µM)
STT

R’

R

1

R’’

Este (NO)

Acid (NO)

Este
(MCF-7)

Acid (MCF7)

3,4,5-triOMe

4-NH2SO2

1.95±0.11

43.0 ± 6.0

39.96± 3.36 4.63± 0.59

2

H

4-F

4-NH2SO2

81.6 ± 10.6

194.5±7.6

7.97±0.51

187.7±9.5

3

H

H

4-CN

116.83±7.7

256.7±22.1

8.20± 0.93

154.5±15.1

4

H

H

4-NO2

129.88±15.7

>261.1

9.67± 0.92

187.6±10.4

5

H

4-OH

4-NH2SO2

92.3 ± 7.2

75.8±2.6

8.90± 0.79

34.6±2.6

6

H

4-Br

4-NH2SO2

73.7 ± 2.6

>202.0

19.27±0.27

149.5±7.3

7

H

4-Br

4-CN

116.01±13.6

97.9±9.4

20.16± 1.83 70.1± 4.6

8

H

4-Br

4-NO2

91.58±7.8

111.2±8.7

21.30± 1.40 34.0±6.4

9

H

4-Br

4-OMe

21.01±4.3

>223.7

21.51± 1.48 >223.7


14

10

H

4-Br

4-CF3

> 233

80.0±6.3

21.65± 1.86 129.5±9.7

11

H

4-Cl

4-NH2SO2

122.2 ± 9.7

>220.7

23.79± 3.11 191.1±20.6

12

4-OMe 4-OMe

4-CF3

134.10±15.7

140.3±16.7

29.80± 2.71 136.0±8.4

4-Me

4-NH2SO2

83.59 ± 5.0

13

30.67±3.79

30.0±3.3

14

H

4,6- diOMe

4-NH2SO2

4.41±0.17

>208.7

39.93± 2.64 94.0±6.4

15

H

H

4-NH2SO2

> 233

>239.8

40.54±2.56

178.9±12.9

16

H

H

4-OMe

30.0±13.4

>271.7

43.19±4.86

209.3 ± 20.0

17

4-OMe 4-OMe

4-NO2

148.85±8.4

185.9±9.8

48.81± 2.62 31.8±3.7

18

4-OMe 4-OMe

4-CN

76.42±9.4

157.0±12.2

48.86± 3.13 83.0±10.3

19

4-OMe 4-OMe

4-OMe

67.06±3.7

145.7±15.2

49.32± 1.72 75.7±6.9

20

H

4-CF3

59.52±5.5

109.4±5.8

50.66± 4.46 203.8 ± 5.1

21

4-OMe 4-OMe

4-NH2SO2

103.4 ±10.5

>209

68.43± 7.05 150.0±14.7

22

H

4-NH2SO2

> 208.5

>222.0

83.60± 3.44 >222.0

L-NMMA

H

4,6-diOH

8.39±0.31
0.36± 0.04

Ellipticine

Ghi chú: * : Cột thống kê hoạt tính các chất este
**: Cột thống kê hoạt tính các chất axit
Các hợp chất lai 102, 96, 81, 82, 94 và celecoxib thể hiện hoạt tính vượt
trội tiếp tục được chuyển sang thử nghiệm về sản sinh PGE2 nhằm sàng lọc kỹ
hơn về hoạt tính kháng viêm lẫn kháng ung thư của hoạt chất.
3.3.2. Nghiên cứu cơ chế kháng viêm và kháng ung thư
3.3.2.1. Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2
Các hợp chất tiêu biểu là 102, 96, 81, 82, 94, celecoxib tiếp tục được thử
nghiệm về khả năng ức chế sản sinh PGE2.


15

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2
trong các đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS

PGE2 (pg/ml)
Nồng độ (µM)

102

96

81

82

94

Nồng độ (µM)

Celecoxib (43)

20

65.31

223.82

253.60

155.07

246.88

100

41.45

4

133.59

326.20

277.23

383.49

488.82

20

129.83

0.8

225.56

399.56

490.73

478.52

560.34

4

278.64

LPS

329.60

3.3.2.2. Phân tích chu kỳ tế bào
Hợp chất 96, 81, 82 và 94 gây ra sự tăng số lượng tế bào trong pha G0 /G1 và giảm số
lượng ở pha S và G2 /M tương tự như celecoxib. Celecoxib và các hợp chất liên quan cũng
được biết là có khả năng ức chế sự phát triển của khối u và tạo ra quá trình apoptosis. Sự bắt
giữ tế bào ở pha G0 /G1 của celecoxib cũng được xác định là khơng có sự tham gia của
COX2 cũng như của PGE2 [104]. Mặt khác, hợp chất 102 tạo ra sự bắt giữ tế bào tại pha
G2 M đồng thời giảm tế bào trong các pha S. Việc bắt giữ tế bào tại Pha G2 /M dẫn đến
ngăn cản tế bào thốt khỏi q trình ngun phân, tính năng này được thể hiện bởi các tác
nhân ức chế vi ống giống colchicin hoặc combretastatin [78]. Trong trường hợp hợp chất
102, thay thế liên kết đơi của CA4 với vịng pyrazol của celecoxib mà vẫn duy trì gốc
trimethoxybenzen của CA4 chỉ ra là rất quan trọng để thu được các tính năng gây độc tế
bào và kháng phân bào của chất gốc [98, 115].
Bảng 3.8. Phần trăm tế bào theo pha của các hợp chất được thử nghiệm với MCF7
STT
1
2
3
4
5
6
7

Hợp chất
Negative control
(DMSO 0,5%)
102 (10 µM)
96 (10 µM)
81 (10 µM)
82 (10 µM)
94 (10 µM)
Celecoxib (30 µM)

Phần trăm tế bào theo phase (%)
% G0/G1
%S
% G2/M
42.46

40.47

13.15

40.72
49.00
45.22
50.96
49.55
46.80

35.09
34.17

34.46
30.75
34.50
36.69

21.04
14.17
17.45
14.80
14.34
11.45


16

Đối chứng

102

96

81

82

94

Celecoxib (43)
Hình 3.3. Phân tích chu kỳ tế bào của các hợp chất được thử nghiệm bao
gồm 102, 96, 81, 82, 94 và Celecoxib (43) tại nồng độ 10 µM trên MCF-7

3.3.2.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hai chất 82 và 102
Vì hai hợp chất 102 và 82 là các chất ức chế hoạt động chống tăng sinh
tiềm năng, ức chế sản sinh PGE2 mạnh hơn celecoxib và ức chế chu kỳ tế bào
một cách có chọn lọc do vậy nó được chọn để đánh giá thêm khả năng gây
apoptosis.


17

Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế
bào với Hoechst 33342
Bảng 3. 9. Phần trăm sự ngưng tụ hoặc phân mảnh của nhân tế bào do hợp chất
102 và 82 gây ra
Tế bào Apoptosis (%)
82
(20 µM)

82
(10 µM)

82
(5 µM)

102
(20 µM)

102
(10 µM)

5.33 ± 0.34

2.69± 0.22

2.42±
0.27

5.18±
12.38± 0.96 0.33

102
(5 µM)
3.55±
0.39

Camptotheci
n
(5µM)

(-)
Đối
chứng

22.71± 2.01

2.71±
0.29

Các mẫu nghiên cứu thu được Hình ảnh tế bào MCF7 sau khi được nhuộm
Hoechst 33342 ở các nồng độ khác nhau:

Đối chứng âm

Camptothecin (5 µM)

102 (20 µM)

102 (10 µM)

82 (20 µM)

82 (10 µM)


18

Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 dưới tác động của các mẫu nghiên cứu
được nhuộm Hoechst 33342 ở các nồng độ khác nhau
Nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3
Bảng 3.10. Hoạt tính caspase - 3 của 102 và 82
% Tế bào Apoptosis
Hợp
chất

102
(20 µM)

102 (10 102
µM)
(5 µM)

82
(20µM)

82
(10 µM)

82
(5 µM)

Camptothecin
(5µM)

Giá trị

1.36*

1.21*

1.01

1.08

1.12

1.11

1.67**

(-)
Đối

chứng
1.00

Độ lệch

0.033

0.013

0.037

0.023

0.056

0.040

0.020

0.070

- * P<0.05 and ** P<0.01
Nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phƣơng pháp trắc lƣu tế bào nhuộm FITC-anexin
V và PI

Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào apoptosis
Mẫu thí nghiệm
ĐC âm
82 (20 µM)
82 (10 µM)

82 (5 µM)
102 (20 µM)
102 (10 µM)
102 (5 µM)
Camptothecin (5µM)

% tế bào %
tế
bào
hoại tử
apoptosis sớm
0.22
18.32
1.39
18.49
0.27
21.62
0.16
22.74
0.42
42.24
0.49
19.90
0.27
15.84
0.08
73.83

%
tế

bào
apoptosis muộn
1.90
4.08
4.59
3.27
6.73
3.45
2.17
4.96

% tế bào
apoptosis
20.22
22.57
26.21
26.01
48.97*
23.35
18.01
78.79**

Ghi chú: * là P<0.05; ** là P<0.01

Tế bào ủ với mẫu 82 (20 Tế bào ủ với mẫu 82 Tế bào ủ với mẫu 82


19

µg/ml) trong 48h

(10 µg/ml) trong 48h

(5 µg/ml) trong 48h

Tế bào ủ với mẫu 102 Tế bào ủ với mẫu 102 Tế bào ủ với mẫu 102
(20 µg/ml) trong 48h
(10 µg/ml) trong 48h
(5 µg/ml) trong 48h

Tế bào ủ với 0.5% Tế bào ủ với 5 µM
DMSO trong 48h
Camptothecin trong
48h
Hình 3.5. Tác động của mẫu nghiên cứu đến quá trình apoptosis tế bào
thơng qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Các
mẫu thử được phân tích bằng hệ thống trắc lưu tế bào. Trục x thể hiện
mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu
PI theo đơn vị Log.
Phần kết luận xác định khả năng cảm ứng apoptosis của 2 mẫu nghiên cứu
Qua việc xác định cảm ứng apoptosis qua ba phương pháp phát hiện
apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, caspase - 3
và trắc lưu tế bào có thể tổng kết:


20

 Mẫu 82 ở các nồng độ thử nghiệm làm tăng nhẹ tỉ lệ tế bào ở giai đoạn
apoptosis sớm và apoptosis muộn so với đối chứng âm, đạt từ 22.5726.21%.
 Mẫu 102, ở nồng độ 20 µg/ml làm tăng cao tỉ lệ tế bào ở giai đoạn

apoptosis sớm và muộn so với đối chứng âm từ 18.3% đến 42.2% và
1.90% đến 6.7%, một cách tương ứng. Ở nồng độ thấp hơn làm tăng nhẹ
(10 µg/ml và 5µg/ml) tỉ lệ tế bào apoptosis so với đối chứng âm.
 Camptothecin - đối chứng dương tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, đạt từ
78.79%.
 Mẫu 82 chưa thể hiện rõ khả năng cảm ứng apoptosis với các nồng độ
nghiên cứu trong các thử nghiệm được thực hiện;
 Mẫu 102 ở nồng độ 10 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào
MCF7 thông qua cảm ứng sinh caspase 3 với hàm lượng tăng 1.21 lần so
với đối chứng âm (P<0.05);
 Mẫu 102 ở nồng độ 20 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào
MCF7 thông qua: gây ra sự cô đặc hoặc phân mảnh nhân tế bào với tỉ lệ
12.386%; cảm ứng sinh caspase -3 với hàm lượng tăng 1.36 lần so với đối
chứng âm (P<0.01); quần thể tế bào apoptosis tăng và đặc biệt là quần thể
apoptosis sớm tăng 42.24% thông qua kĩ thuật trắc lưu tế bào (P<0.05)
Qua đó, dựa trên kết quả thử hoạt tính độc tế bào, kháng viêm NO, PGE2 và
cảm ứng apoptosis đã khẳng định được cơ chế và đặc điểm về hoạt tính của các
hợp chất lai thu được. Kết quả chỉ ra phân tử lai cả về mặt cấu trúc phân tử lẫn
hoạt tính sinh học theo mơ hình mục tiêu thiết kế của phân tử lai ban đầu.
Chúng tôi đã tiếp tục lựa chọn phân tích docking phân tử để mơ phỏng tương
tác giữa chất lai thiết kế với các mục tiêu COX2 và tubulin.


21

4. Docking phân tử
Theo tiêu chí xếp hạng của AutoDock 4.2.6, giá trị càng âm của năng
lượng thì khả năng liên kết của hợp chất với thụ thể nhắm mục tiêu càng tốt.
Hợp chất 102 và 82 được chứng minh là hai ứng cử viên tiềm năng với năng
lượng kết nối tốt cho cả hai mục tiêu và có thể được coi là chất ức chế kép

COX2 /tubulin tiềm năng, các tương tác của chúng được phân tích thêm bằng
cách sử dụng mơ hình Studio Visualizer. Tính tốn thu được kết quả có thể
được sử dụng để dự đốn chất ức chế tốt hơn cho mơ hình protein dựa trên độ
lệch (Δ) giữa giá trị tương tác của COX2 và tubulin (Phương trình 1–2).
Docking của hợp chất 102 với COX2 cho thấy ba tương tác liên kết hydro
giữa nhóm sulfonamid (NH2) và Gln178, Leu338, Phe504 (khoảng cách = 2.71;
2.93; 3.33 Å, tương ứng), trong khi vị trí liên kết của tubulin chỉ ra rằng nhóm
này tạo ra ba liên kết hydro với Asn258, Met259, Lys352 (khoảng cách = 2.91;
3.20; Tương ứng là 2.86 Å). Ngoài ra, sự tương tác giữa hợp chất 102 và
tubulin được tăng cường hơn nữa thông qua hai liên kết hydro do
trimethoxybenzen với Asn101, Ala250. Phân tích liên kết của hợp chất 82 cũng
chỉ ra các liên kết hydro được hình thành bởi nhóm etyl este (CO2C2H5) với
Arg106 của COX2 và Ala250 của tubulin (khoảng cách = 2.99; 3.18 Å, tương
ứng); đặc biệt là NO2 của 82 đã liên kết với Phe504 của COX2. Liên kết này hỗ
trợ giả định rằng nhóm sulfonamit và etyl este đóng vai trị quan trọng đối với
hoạt động kép của các hợp chất 102 và 82. Mặt khác, trimethoxybenzen và các
nhóm thế aryl được giả định là đặc trưng cho đặc điểm liên kết của mỗi hợp
chất với mục tiêu protein.


22

Bảng 3.12. Tập hợp các hợp chất được thiết kế với điểm kết nối tương ứng trên
hai mơ hình protein (kcal/mol)

102
82
Combretastatin A4
Colchicin

Năng lƣợng (kcal/mol)
COX2 (3LN1)
Tubulin (1Z2B)
-11.90
-8.06
-11.92
-9.37
-9.63
-7.75
-8.06

Celecoxib

-11.50

Hợp chất

Docking 82 -Cox2

Docking 102 - COX2

-

Docking 82 – tubulin

Docking 102 -tubulin


23

Bảng 3.13. Tương tác bộ hợp chất, phối tử trên COX2 (ID: 3LN1) và mơ hình
protein tubulin (ID: 1Z2B)
Năng lượng liên kết (LE)
Hợp chất thiết kế

COX2
- 0.38

102

ΔLE

Tubulin
- 0.26

-0.12

82

- 0.38

- 0.30

-0.08

Combretatin A4

- 0.42

- 0.34

-0.08

Colchicin

-

- 0.28

-

Celecoxib

- 0.44

-

-

KẾT LUẬN
Luận án đã đạt đƣợc những kết quả chính nhƣ sau:
1. Đã thiết kế và tiến hành tổng hợp thành công 41 hợp chất lai mới. Trong đó
có 20 chất lai coxib - combretastatin dạng este, 20 hợp chất lai coxib combretastatin dạng axit, 01 hợp chất lai coxib – combretastatin chứa nhóm
CF3
2. Đã đánh giá hoạt tính sinh học 22 chất trên các dịng tế bào ung thư ở người
HT-29, Hep-G2, MCF-7 và ức chế sản sinh NO. Trong đó có 12 chất 102, 96,
81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hiện hoạt tính nổi trội so với chất gốc
celecoxib, 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 có hoạt tính IC50 < 10 µM
3. Đã đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO và ung thư vú MCF-7 đối với các
chất lai coxib – combretastatin dạng gốc axit và tiến hành so sánh hoạt tính với

các chất lai coxib – combretastatin dạng gốc este. Tuy nhiên, kết quả cho thấy
chỉ có 02 chất 118 và 114 thể hiện độc tính tế bào trên các dịng MCF-7 mạnh
hơn celecoxib và 02 chất 116 và 111 là tương đương với hoạt tính ức chế sản
sinh NO của celecoxib.
4. Đã đánh giá hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm 05 chất 102, 96, 81, 82,
94 và celecoxib thông qua xác định khả năng ức chế sản sinh PEG2, phân tích
chu kỳ tế bào và hoạt tính gây apotosis thơng qua xác định khả năng gây