Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất ở Thái Nguyên

Đ Ạ I HỌC THÁI N G U Y Ê N
K H O A K H Ỏ A H Ọ C T ự N H I Ê N VÀ X Ã H Ộ I

TRƯƠNG PHÚC HƯNG

NGHIÊN CỨU Sự ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA
V I K H U Ẩ N Bacỉllus
M Ộ T

thuríngiensis

P H Â N LẬP

SỐ M Ẫ U ĐẤT Ở THÁI

N G U Y Ê N

L U Ậ N VĂN T Ố T NGHỆP Đ Ạ I H Ọ C
N G À N H C Ô N G N G H Ệ SINH H Ọ C
Chuyên ngành: Vi sinh

Giáo viên hướng dẫn: TS. V i Thị Đoan Chính

ĨL~Ỉ£_
ĐẠI HỌC THẢI NGUYỀN
KHOA KHOA HỌC Tự NHIÊN VÀ XẢ HỘI
THƯ

VIỆN

THÁI NGUYÊN-2007

T Ừ


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




L Ờ I C Ả M ƠN

&âỉ XÙI hủy tó lòng. bui ơn tâu tắe lởi
te

(thinh

<7rưénọ hộ mòn. Sinh ŨƠUM 3C3Ữ3QI - mTŨQQl & <x>?ù, đã tận tình dìu
dắt, giúp. đã tồi trong, tuất qua trinh họe. lập. ồ. hỗn thành luận. oản
này..
Qỗi cũng. xin nhãn thành cảm tín ?)@S.C7S QlạA Đìnk Hình r

^rưằng. phịng. <7)ì trtiụỉn (Vi tinh ối, (Viện ©ăng. Qlạhê Sinh họe. đã chi
bão- oà. tạo- điêu. kiên thuận lợi nhối chữ tối dượt nghiên, cứu ồ họe tập,.
Cĩrvnụ. á li ất q trình tíuỊe hiện đĩ tài này., tài cồn nhận. đứớe tự
giúp. của 3CẴ Qlạnụỉn C7hỊ &hanh JCanh ồ tồn thê. ếe cỗ- (liú. anh dụ.
trong, phàng, nữi trttụên (Ví tinh oặt eũnạ như ếe thầy cỗ- giáo- bỗ- mồn
linh DChtM 3C7ƠƯơi XÙI gửi tài câm. ổn chân thành lởi gia đinh, bạn. hè đã ln.
đặng. ữièỉi chìa iè những, khó- khăn. giúp, dữ lỗi hỗn. thành Luận nàn

nài/.
Mệt lần nữa. tho- tỏi đíiỢe tàm ơn. những. Lự giúp, đễ- quý báu. đẻ-.
\7hái ntỊẨiụin, ttạtìụ 24 tháng. 5 năm 2007
Sinh. niên
trường (phúe Tủưnụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN



-


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




MỤC LỤC
M Ở ĐẦU

Ì

_
^
CHƯƠNG Ì: TONG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

3

1.2.Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

5

â

1.3. Độc tố của Bacillus thuringiensis

12

1.4. Sự hoạt hoa và mối quan hệ cấu trúc chức năng

14

1.5. Đặc điểm của protein tinh thể độc

15

Ì .6. Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học

20

1.7. Đại cương về côn trùng thử nghiệm

22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

24

2.1. Vật liệu

24

2.2. Hoa chất và thiết bị

24

2.3. Môi trường và dung dịch

25

2.4. Phương pháp nghiên cứu

27

CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

32

3.1 Phân lập vi khuẩn Bacilỉus thuringiensis từ các mẫu đất

32

3.2. Sự phân bố vi khuẩn Baciỉỉus thuringiensis trong các mẫu đất

33

3.3. Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập

33

3.4. Hoạt tính sinh học của các chủng Bacillus thurìngiensis phân lập

36

3.5. Sự đa về thành phẩn lồi của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập tại
Thái nguyên

39

3.6. Sự đa dạng về thành phần gen của các chủng Bacillus thuringiensis phàn lập ...41
KẾT LUẬN VÀ K IẾN NGHỊ

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

P
Bt

Cặpbazơ

B

d

N

T

P

PT"YT' A
E t B r

k

D

a

Bacillus thuringiensis

Deoxynucleotide
Ethylendiamin tetraacetic acid
Ethidium Brommide
Kilodalton
P h ả n

t ổ n

g hợp dây chuyền nhờ polymerase

S

D

S

Sodium dodecyl sulphat

T

A

E

Tris - acid acetic EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




TÓM TẮT K Ế T QUẢ NGHIÊN

cứu

1. Tên đề tài
Nghiên cứu sự đa dạng sinh học cùa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân
lập từ một số mẫu đất thu thập ở Thái Nguyên.
2. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu sự phân bố và đánh giá sự đa dạng sinh học cùa vi khuẩn
Bacillus thuringiensis ở Thái Nguyên;
- Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis mang nguồn gen
quý, cố hoạt tính diệt sâu cao.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất thu thập ở các
vùng khác nhau cùa Thái Nguyên;
- Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao;
-

Phân loại các chùng Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết

thanh;
- Phát hiện một số gen độc tố thuộc nhóm gen cryl cùa các chủng Bacillus
thuringiensis đã tuyển chọn.
4. Kết quả

- Đã phân lập được 137 chủng B. thuringiensis có khả năng sinh tinh thể và
bào tử
- Hình thái tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập tại Thái
Ngun có các hình dạng sau: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương, hình
lưỡng tháp và hình lập phương, hình ovan và hình lưỡng tháp, hình lập phương và
hình ovan, hình khơng xác định.
- Đã thử nghiệm khả năng diệt sâu cùa 25 chùng B. thuringiensis phân lập
được với sâu tơ. K ết quả cho thấy ở nồng độ l o bào tử/ml hoạt tính diệt sâu là
5

khá cao Cịn ở nồng độ l o bào tử/ml thì hoạt tính diệt sâu là rất cao.
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




- Đã phân loại được 80 chủng B. thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên.
Các chủng phân lập thuộc về 17 dưới loài khác nhau.
- Đã tiến hành phát hiện gen cho 11 chủng B. thuringiensis phân lập kết
quả cho thấy có 10 chủng trong số 11 chủng tách gen có mang từ Ì đến 5 gen
cryl

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Xhéa luận tất nghiệp

^tBg

Giường, ipitúe TƠỊứta - &ÌĨ37ÕCK.1

M Ở ĐẦU
1. Đạt v ấ n đề
Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du
và miền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên là 3.562,82 k m . Với địa hình thấp
2

dần từ núi cao xuống núi thấp, rồi trung du, đồng bằng theo hướng Bắc - Nam
làm cho khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng
lanh, vùng lanh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khơ. Do ảnh
hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Ngun được chia thành ba loại chính,
trong đó, đất núi chiếm diện tích lớn nhất (48,4%) hình thành do sự phong hoa
trên các đá Macma, đá biến chất và trầm tích, độ cao trên 200 m, tạo điều kiện
cho phát triển lâm nghiệp, trồng rừng, cây đặc sản.... đất đồi chiêm 31,4%
chủ yếu hình thành trên cát kết, bột kết phiến sét và một phần phù sa cổ kiến
tạo, độ cao từ 150 - 200 m, phù hợp với cây ăn quả lâu năm, cây công nghiệp

và đất ruộng chỉ chiếm 14,4%. Thái Ngun cịn có một diện tích lớn đất chưa
sử dụng. K ết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra
cho Thái Nguyên sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh
vật
V i sinh vật là nhóm vi sinh vật đặc biệt quan trọng trong bất kỳ hệ sinh
thái nào, do những tính chất đặc thù như phân bố rộng, thành phần các loài rất
lớn, có nhiều lồi chưa được biết đến . . .
Trong những năm qua vi khuẩn Bacillus thuringiensis {B. thuringiensis)
là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây
bệnh cho côn trùng. B thuringiensis là trực khuẩn, gram dương, có khả năng di
động. Đặc trưng nổi bật của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng sản sinh
ra các protein tinh thể gây độc đối với nhiều loại côn trùng của các bộ khác
nhau như bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng . . . Trong quá trình hình thành
bào tử, B. thuringiensis có thể tồn tại trong nhiều mơi trường sống khác nhau
nhưng môi trường chủ yếu của vi khuẩn này là trong đất. Chính vì vậy, việc

Ì
Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Xhéa. tuệ*, ui nghiện

su Mí

&«ùfHg.
nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn B. thuringiensis phân lập được từ một số
mẫu đất tại Thái Nguyên để tìm kiếm các chủng B. thuringiensis bản địa có
hoạt tính cao là rất cần thiết đồng thời cũng để lưu giữ và bảo tồn các nguồn
gen quý của vi khuẩn B. thuringiensis ở đây.
Xuất phát từ thực tế đó chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên
cứu sự đ a dạng sinh học của vi khuẩn Baciilus thurỉngỉensis

phân lập từ

một số mẫu đ ấ t ở Thái Nguyên".
2. Mục tiêu của đề tài
1. Nghiên cứu sự phân bố và đánh giá được sự đa dạng sinh học của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis ờ Thái Nguyên;
2. Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis mang nguồn gen
q, có hoạt tính diệt sâu cao.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập vi khuẩn Bacilỉus thuringiensis từ các mẫu đất thu thập ở các
vùng khác nhau của Thái Nguyên;
2. Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao;
3. Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết
thanh;
4. Phát hiện một số gen độc tố thuộc nhóm gen cryl của các chủng
Bacỉllus thuringiensis đã tuyển chọn.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




•Ạ ca JSS

XtiÃa. luận ui nụhiỊp,

GNMMV


C H Ư Ơ N G 1: T Ổ N G Q U A N T À I L I Ệ U

1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng của vỉ khuẩn Bacỉllus thuringừnsis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis

trên t h ế giới

Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata đã phát hiện ra
một loại vi khuẩn gây bệnh sotto ở trên tằm và ông đặt tên là Bacillus sotto.
Năm 1911, nhà khoa học Đức Berline cũng đã phân lập được một loại vi
khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trang Hải, Anagasta
kaenniella. Mãi đến năm 1915, vi khuẩn này mới chính thức được mang tên
Bacillus thuringiensis

(B. thuringiensis) do vi khuẩn này được phân lập từ

vùng Thuringen của Đức. Đến năm 1930, B. thuringiensis đã được thử nghiệm
chống sâu đục thân ở Châu Âu. Năm 1938, chế phẩm B. thuringiensis đã được
sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp. Năm 1953, Hannay và
Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và cơng bố tinh thể có bản chất protein. Năm
1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào
và bào tử. Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất ra một số lượng
lớn thuốc trừ sâu Thuricide từ chủng B. thuringiensis var kurstaki. Đến năm
1962, de Barjac và Bonníịi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các
chủng B. thuringiensis

và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết

thanh. Vào những năm 1960 - 1976, nhiều chủng B. thuringiensis có hoạt tính
diệt sâu cao đã được phân lập và ứng dụng. Năm 1977, Goldberg và Margarit
đã phát hiện ra B. thuringiensis

vai isralensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc

bộ hai cánh. Năm 1981, Schnepf và Whiteley đã lần đầu tiên phân lập và tách
dòng gen độc tố mã hoa protein tinh thể diệt sâu của chủng B. thuringiensis
var kustaki HD-1 gọi là gen cry Ì và biểu hiện ở E. coli. Từ đó, một số lượng
lớn các gen đã được tách dịng và đọc trình tự. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã
phân lập ra loài phụ B. thuringiensis var tenebrionit diệt bọ cánh cứng hại lá

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Xhía. luận lất nghiệp

khoai tây vùng Colorado, Hoa K ỳ từ sâu tenebrio molitar. Sau đó, cơng ty
Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự B. thuringiensis var tenebrionit tên
là B. thuringiensis var sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gen độc tố của
chúng. Năm 1985, gen cry của B. thuringiensis đã được chuyển vào cây trồng
để diệt sâu. Năm 1987, phát hiện ra B. thuringiensis diệt giun tròn thực vật.
Năm 1991, phát hiện ra B. thuringiensis diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda.
Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên đã được đưa và sản xuất.
Năm 2003, Saikai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của B. thuringiensis
diệt tế bào ung thư. Năm 2005, Ohba đã phát hiện ra protein của 4 dưới loài
B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam có khả năng chống tế bào ung thư cổ tử
cung của người [3].

1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thurìngiensis tại Việt Nam
Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu vi sinh B. thuringiensis đã được ứng dụng
đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm từ 1971. Năm 1973, Ngun Cơng
Bình và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm B. thuringiensis
tại Viện sinh vật với môi trường đặc, giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu sử
dụng các nguyên liệu rẻ tiền sẵn có như bã khơ lạc, bột đậu tương . . . Các
chủng giống được sử dụng để tiến hành lên men có nguồn gốc từ Trung Quốc
thuộc dưới loài B. thuringiensis var thuringiensis, B. thuringiensis var kustaki.
Các chế phẩm B. thuringiensis

sản xuất được sử dụng cho vùng rau ngoại

thành Hà N ộ i và đạt được những kết quả đáng quan tâm. Chính vì vậy, sau khi
đất nước hồn tồn giải phóng, tại phịng Sinh học Thực nghiệm thuộc phân
viện Viện Khoa học Việt Nam đóng tại Hồ Chí Minh đã sản xuất với quy mơ
nồi lên men dung tích 3m . Năm 1982, ban Khoa học K ỹ thuật Hà Nội và
3

Chương trình Sinh học phục vụ Nông nghiệp và Uy ban Khoa học và K ỹ thuật
nhà nước (nay là bộ Khoa học và Công nghiệp) đã cho đề tài triển khai tại

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




xttéa. iuậtt tất Mựỉúệp.

Viện Công nghiệp Thực phẩm trên nồi lên men chìm với dung tích là 5m . Các
3

chế phẩm Bt đã được tiến hành thử nghiệm phòng trừ sâu hại tại các vùng rau
ngoại thành Hà N ộ i . Từ năm 1984 - 1994, các chế phẩm Bt sản xuất theo

phương pháp dịch thể được sử dụng rộng rãi, có hiệu quả phịng trừ sâu hại rõ
rệt và giá thành không cao. Cuối năm 1993 - 1994, chế phẩm Bt kém chất
lượng không tiêu thụ được. Trong những năm trở lại đây thì việc nghiên cứu
B. thuringiensis đã được tiến hành tại nhiều nơi như Viện Công nghệ sinh học,
Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ sau thu
hoạch . . . chủ yếu là phân lập, phân loại để tìm ra các chủng mới có phổ hoạt
tính rộng cũng như nghiên cứu các chủng B. thuringiensis ở mức độ phân
tử[3].

1.2. Đại cương về vi khuẩn Bacillus thurìngiensìs
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Theo các tài liệu về phân loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng của Sneath
(1986) Wistreich
B. thuringiensis

và Lechtman (1988), Syahly (1991) thì vi

khuẩn

được xếp vào nhóm ì, chi Bacillus, họ Bacillaceae,

ngành

Firmicutes [1].
B. thurỉngiensis

thuộc chi Bacillus là vi khuẩn đất, hình que, gram

dương, hơ hấp hiếu khí hoặc kỵ khí khơng bắt buộc, kích thước tế bào từ 3 - 6
|xm, có phủ tiêm mao khơng dày, chuyển động được. Các lồi thuộc chi

Bacillus có khả năng hình thành bào tử khi gặp những điều kiện bất lợi của
môi trường, bào tử có dạng hình trứng với kích thước từ 1,5 - 2 um và có thể
nảy mầm thành t ế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi. Bào tử là dạng
sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hoa chất, áp suất
thẩm thấu cao. Màng ngồi nằm ở ngồi cùng đó là phần sót lại của tế bào mẹ,
chiếm khoảng 2 - 1 0 %

khối lượng khô của bào tử. Thành phần chủ yếu là

lipoprotein, cũng có một lượng nhỏ axit amin, có tính thẩm thấu kém. Lớp áo

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




JCJtóa luân tứ nựhiif,

ta.

ca si

&rư<*ny 'Phút VCưnạ - &KS76X1

bào tử có cấu tạo bởi 3 - 15 lớp, chủ yếu là protein sừng. Áo bào tử có sức đề
kháng cao với lizozim, proteinase, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm
thấu kém đối với các cation. Dưới áo bào tử là vỏ bào tử. v ỏ bào tử chứa một
lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngồi ra cịn có 7 - 10%
(tính theo khối lượng khơ của bào tử) chất dipicolinat canxi (DPA- Ca) không
chứa axit teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng
chứa nước là 70%. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên
sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng
nhân.
Đặc biệt trong quá trình hình thành bào tử
vi khuẩn B. thuringiensis

có thể sinh ra những

tinh thể mang tính độc đối với cơn trùng. Tinh thể
là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 X
0,02 um có thể chiếm 25% trọng lượng khơ của
tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp,
hình ovan, hình láp phương hốc có hình dang
„
„
• "
• * Hình 1.1: Protein tinh thể của
khơng xác đinh Khi ở trong tế bào sinh
.
vi khuân B. thuringiensỉs
dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm
(cp: tinh thế hình lưỡng
kề nhau, khi t ế bào tan thì bào tử và tinh
tháp; cc: tinh thế hình lập

thể cùng thốt ra ngồi [3].
phương; ép: bào tử)
B. thuringỉensis có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoa rất giống với
1

W

F

6

các nhóm trực khuẩn sinh bào tử B. cereus, B. mycoides và B. anthracis tuy
nhiên B. thuringiensis có khả năng sinh tinh thể cịn lồi khác thì khơng [3].

1.2.2. Đặc điểm sinh hoa
B. thuringiensis

không lên men sinh axit với arabinoza, xiloza và

manitol nhưng tạo axít trong mơi trường có glucoza, có khả năng thúy phân

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

Xítáa luận lối mihiỉp

m ca ai

Qnùtng. <T>húe Tốựnạ - &H&XCK.1

tinh bột, khử nitrat thành nitrit, có phản ứng với lịng đỏ trứng gà, phát triển
được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizồm. B. thuringiensis có
khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ 15-45°c, nhiệt độ tối ưu là 2830°c, pH = 7. B. thuringiensis không có khả năng khử amin của phenilalanin,
khơng sử dụng axít axetic, khơng khử muối suntìt.
1.2.3. Tính chất ni cấy
Tính chất ni cấy là đặc tính vốn có của vi sinh vật, là một trong
những tiêu chuẩn để định loại vi sinh vật. Tính chất ni cấy của các dưới lồi
B. thuringiensis khác nhau là khác nhau, đồng thời phụ thuộc vào thành phần
môi trường, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy.
Khuẩn lạc của dưới lồi B. thuringiensis var kurstaki ni cấy trên môi
trường MPA ở 30°c trong 72 giờ đa số có hình trịn, màu trắng sữa có mép
nhăn đường kính có thể đạt tới 8 - l o mm. Trong khi đó khuẩn lạc lồi phụ
berlinner có dạng thảm, với các sợi hình phóng xạ, đường kính khoảng 10
mm; màu vàng nhạt và trơn ướt, viền nhăn thành hình vải thô mở rộng ra xung
quanh nên được gọi là dạng phóng xạ nhăn. Nếu ni cấy có bổ sung 2%
glucose, ni ở 30°c trong 24 giị có thể thấy các điểm khuẩn lạc nhỏ màu
vàng trên bề mặt, sau 42 giờ thành hình vành khăn trịn dày, đường lánh
3 mm, giữa có một vành trịn tương đối sâu, bề mặt trắng tối, hơi ánh quang,
dạng hạt thô khô, sau 72 giờ đường kính có thể đạt 2 em. Một số chủng
B. thuringiensis

xuất hiện khuẩn lạc trơn nhẵn [4].

1.2.4. Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis
Có nhiều phương pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau. Khóa phân
loại đầu tiên được thiết lập dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoa
[Heimpel và Angus, 1958]. Tuy nhiên phân loại theo phương pháp này không
phân biệt được các chủng B thuringiensis.

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN

một cách rõ ràng bởi vì