Nghiên cứu thu nhận gellan từ sphigomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ
Sphigomonas paucimobilis ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG
CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ
Sphigomonas paucimobilis ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG
CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1.PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm
2.TS. Trần Thị Mai
Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự chân thành và biết ơn nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn
Thị Xuân Sâm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Trần Thị Mai - Viện Cơ điện
Nông nghiệp và Cơng nghệ Sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần cho tôi
trong suốt thời gian làm luận án; cảm ơn các Cô đã trang bị thêm cho em cách tiếp cận với
các phương pháp khoa học để em tự tin hơn trên con đường phía trước.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh học - Công
nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền tải cho em thêm nhiều kiến
thức chuyên môn sâu cũng như cho những góp ý q báu trong q trình học tập và hoàn
thiện các nghiên cứu của luận án.
Nhân dịp này, xin bày tỏ niềm tri ân tới Ban lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và
Công nghệ Sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học Sau thu hoạch và các
bạn bè, đồng nghiệp, đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi yên tâm học tập
và nghiên cứu.
Lúc này đây, với tư cách là người con, người vợ và người mẹ, tôi muốn gửi thật
nhiều lời cảm ơn sâu sắc, tình cảm u thương vơ bờ của tơi đến gia đình - nơi ln là điểm
tựa tinh thần vững chắc và tiếp sức cho tôi trong suốt sự nghiệp phấn đấu.

Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2018

Nguyễn Thị Hồng Hà

i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả
luận án là trung thực và chưa được tác giả khác cơng bố. Trong luận án có sử dụng một
phần kết quả của đề tài ĐT.04.13/CNSHCB - Bộ Công thương và đã được sự đồng ý của
các thành viên trong nhóm nghiên cứu. Việc tham khảo nguồn tài liệu đã được thực hiện
trích dẫn theo đúng yêu cầu.

Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2018
T/M tập thể hướng dẫn

Tác giả

PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm

ii

Nguyễn Thị Hồng Hà


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ....................................................................... x
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 4
1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ............................................ 4
1.1.1. Cấu tạo .................................................................................................................... 4

1.1.2. Tính chất.................................................................................................................. 4
1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel ................................. 5
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan .................................... 7
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa................................................................. 7
1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan .............................................................................. 8
1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis .......... 9
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 11

1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan .................................... 11
1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống ........................................................ 11
1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men ............................................. 11
1.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí .......................................... 14
1.2.1.4. Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan ......................... 15
1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men.......................................................... 18
1.2.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................................................. 20
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 21
1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây ......................................................... 21
1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm ..................................................................... 23
1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác ........................................................................ 25
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU .................... 26
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 29
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ TRANG THIẾT BỊ .......................................................... 29
2.1.1. Chủng giống, ngun liệu chuối ........................................................................... 29
2.1.2. Mơi trường ............................................................................................................ 29
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 30
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................... 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................................................... 31
iii

2.2.1. Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl ..................................................... 31
2.2.2. Phân tích cấu trúc gellan và gellan khử acyl (phổ MNR) ..................................... 32
2.2.3. Xác định khối lượng phân tử của gellan ............................................................... 33
2.2.4. Xác định mức độ deacyl hóa (ĐĐA) của gellan khử acyl .................................... 34
2.2.5. Xác định độ bền gel của gellan khử acyl .............................................................. 35
2.2.6. Xác định khả năng tạo gel với các ion Ca+2 và Na+ .............................................. 35
2.2.7. Phân tích các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của gellan ................................................ 35
2.2.8. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn........................................................................... 36
2.2.9. Xác định hàm lượng protein...................................................................................36
2.2.10. Xác định hàm lượng màu carotenoid...................................................................36
2.2.11. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 36
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 36
2.3.1. Nhân giống và điều kiện bảo quản giống .............................................................. 36
2.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL4....................... 36
2.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng
S. paucimobilis GL12 ...................................................................................................... 37
2.3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................. 37
2.3.3.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung axit amin ........................................................... 37
2.3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 37
2.3.4. Tối ưu hóa mơi trường sinh tổng hợp gellan cho S. paucimobilis GL12 .. ........... 38
2.3.5. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 40
2.3.5.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 40
2.3.5.2. Xác định thời gian thu gellan ........................................................................... 40
2.3.6. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 40
2.3.6.1. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 40
2.3.6.2. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 41
2.3.7. Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột ............................... 41
2.3.7.1. Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ........................................... 41
2.3.7.2. Nghiên cứu lựa chọn bao bì ............................................................................. 42
2.3.7.3. Xác định chế độ bảo quản ................................................................................ 42

2.3.8. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl ................................................................... 42
2.3.8.1. Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ......... 42
2.3.8.2. Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl .................................. 43
2.3.8.3. Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl ........................................... 43
2.3.8.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ................................................................ 43
2.3.9. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối ……..……… 43
2.3.9.1. Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan............................................... 44
2.3.9.2. Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan......................... 44
iv


2.3.9.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng ............................................................ 47
2.3.10. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa .......................... 48
2.3.10.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch................. 48
2.3.10.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ........... 48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 50
3.1. LỰA CHỌN CHỦNG CHO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GELLAN CAO ............................. 50
3.1.1. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4................. 50
3.1.2. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12 ...................................................................................................... 53
3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ CHỦNG S. PAUCIMOBILIS GL12 ............................54
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan ......... 54
3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ ......................................................................................... 54
3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin ..................................................... 55
3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 56
3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan ............................. 57
3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12 ....58
3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 61
3.2.3.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 61
3.2.3.2. Xác định thời gian thu hồi gellan..................................................................... 62

3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 63
3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối ............................................ 63
3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 65
3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 66
3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ............................................................. 68
3.2.6. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan ................................... 70
3.2.6.1. Nghiên cứu lựa chọn bao bì thích hợp cho chế phẩm...................................... 70
3.2.6.2. Xác định điều kiện bảo quản ........................................................................... 72
3.2.7. Đề xuất qui trình thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12..................................74
3.3. CHUYỂN HÓA GELLAN THÀNH GELLAN KHỬ ACYL .................................................. 76
3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................... 76
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan ............................................ 76
3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl .................................. 78
3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol .................................................................... 80
3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl .................................................................. 81
3.3.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ..................................................................... 82
3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .......................................... 83
3.4. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CÁC CHẾ PHẨM ................................................................... 85
3.4.1. Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis GL12 ........................... 85
3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan .................................................................................. 85
v


3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan ................................................................ 87
3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan ............. 88
3.4.2. Đánh giá chất lượng gellan khử acyl..................................................................... 90
3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl ................................................................... 90
3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl90
3.5. THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL .................... 91
3.5.1. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối .......................... 91

3.5.1.1. Xác định hàm lượng gellan thích hợp trong cơng thức dung dịch tạo màng ... 91
3.5.1.2. Xác định thông số kỹ thuật của màng bao gellan lựa chọn ............................. 93
3.5.1.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản chuối của màng bao gellan ................................. 93
3.5.2. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ............................ 97
3.5.2.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho trong cơng thức thạch .... 97
3.5.2.2. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan sản phẩm thạch.................................................... 98
3.5.2.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch ................................... 100
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 102
KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 102
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................................... 103
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 104
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………..105

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký tự

Chú thích

ADN

Axit deoxyribonucleic

ADP

Adenosine diphosphate

AL/PE

Màng nhơm PE

Al-Foil

Lá nhơm mỏng

BOPP/PE

Màng Biaxial Oriented Polypropylene PE

Cp

Centipoazo đơn vị tính độ nhớt

CT

Cơng thức

ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm

HDPE

Polyethylene tỷ trọng cao

MDPE

Polyethylene tỷ trọng trung bình

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân

Ny/PE

Màng nylon PE

PE

Polyethylene

PET

Polyethylene terephthalate

PVDC

Polyvinylidende chloride

TSS

Chất rắn hòa tan tổng số

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm khác nhau giữa gellan và gellan khử acyl ............................................ 5
Bảng 1.2. Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh tổng hợp gellan............................................................................................................. 17
Bảng 1.3. Đặc điểm và hiệu quả gellan ............................................................................... 24
Bảng 2.1. Đặc tính của gellan và gellan khử acyl dùng làm mẫu chuẩn ............................ 30
Bảng 2.2. Thời gian và liều lượng H2O2 khảo sát ............................................................... 38
Bảng 2.3. Các yếu tố và các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng
hợp gellan từ chủng S. pausimobilis GL12.......................................................................... 38
Bảng 2.4. Ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 39
Bảng 2.5. Chỉ số màu chuẩn cho chuối ............................................................................... 44
Bảng 2.6. Tỷ lệ thành phần trong các công thức tạo dung dịch màng gellan ..................... 44
Bảng 2.7. Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan chuối ................................................................ 46
Bảng 2.8. Phiếu cho điểm của phép thử cảm quan.............................................................. 47
Bảng 2.9. Bảng điểm cảm quan của sản phẩm thạch dứa ................................................... 48
Bảng 2.10. Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của thành viên
trong hội đồng cảm quan ..................................................................................................... 49
Bảng 3.1. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12........................................................................................................... 53
Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp gellan
của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 54
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các axit amin đến khả năng sinh tổng hợp gellan ..................... 56
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan ..... 57
Bảng 3.5. Kết quả ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 59
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai Anova của mơ hình ............................................ 60

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào
vi khuẩn ................................................................................................................................ 64
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch tới khả năng loại protein khỏi dịch lên men 65
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng
loại màu ............................................................................................................................... 67
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hiệu suất và chất lượng gellan thành phẩm .. 68
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian sấy đến hiệu suất thu hồi gellan ............................... 69
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của độ dày lớp vật liệu sấy đến hiệu suất thu hồi gellan................ 70
Bảng 3.13. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis
GL12 .................................................................................................................................... 70

viii


Bảng 3.14. Sự thay đổi độ ẩm và độ nhớt của gellan sau 06 tháng bảo quản .................... 72
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sản phẩm gellan ................ 73
Bảng 3.16. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gellan trước và sau khi
bảo quản 06 tháng ............................................................................................................... 73
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan .................................... 78
Bảng 3.18. Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl ................................................ 81
Bảng 3.19. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S.
paucimobilis GL12............................................................................................................... 82
Bảng 3.20. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gellan khử acyl trước và
sau khi bảo quản 06 tháng ................................................................................................... 82
Bảng 3.21. Kết quả phân tích chất lượng và ATTP của chế phẩm gellan ........................... 89
Bảng 3.22. Kết quả phân tích chất lượng của sản phẩm gellan khử acyl ........................... 91
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của hàm lượng gellan trong công thức tạo màng đến hiệu quả bảo
quản chuối............................................................................................................................ 92
Bảng 3.24. Một số chỉ tiêu và đặc tính hóa lý của dung dịch tạo màng gellan ................... 93
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của màng bao đến các chỉ tiêu sinh lý của chuối trong quá trình

bảo quản .............................................................................................................................. 94
Bảng 3.26. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan chuối sau 18 ngày bảo quản .............. 96
Bảng 3.27. Xác định tỉ lệ gellan khử acyl bổ sung thích hợp trong thành phần thạch........ 98
Bảng 3.28. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan thạch dứa có bổ sung gellan ................................ 99
Bảng 3.29. Chỉ tiêu ATTP và các tính chất cảm quan của thạch ...................................... 101

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của gellan (A) và gellan khử acyl (B) ....................................... 4
Hình 1.2. Cơ chế tạo gel của gellan ..................................................................................... 6
Hình 1.3. Cơ chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation ................................................... 6
Hình 1.4. Cơ chế sinh tổng hợp gellan .................................................................................. 9
Hình 1.5. Động học quá trình STH gellan từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461........... 10
Hình 1.6. Sơ đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men ...................................................... 19
Hình 1.7. Sơ đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan ................................................. 20
Hình 2.1. Khuẩn lạc của S. paucimobilis GL12 (A) và S. paucimobilis GL4 (B)................ 29
Hình 2.2. Đường chuẩn gellan ........................................................................................... 32
Hình 2.3. Đường chuẩn gellan khử acyl .............................................................................. 32
Hình 2.4. Phương pháp xác định độ nhớt thực .................................................................... 34
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S.
paucimobilis GL4................................................................................................................. 50
Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S.
paucimobilis GL4................................................................................................................. 51
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis GL4 ........................................................................................................ 52
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới khả năng sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis GL4 ....................................................................................................... 52
Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 ......... 53

Hình 3.6. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tương đến khả năng sinh tổng hợp gellan
của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 55
Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan ................. 56
Hình 3.8. Động học q trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S. paucimobilis
GL12 .................................................................................................................................... 58
Hình 3.9. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng gellan ............... 60
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới khả năng tạo gellan ....................................... 62
Hình 3.11. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12 trên
hệ thống bình lên men sục khí .............................................................................................. 63
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hiệu suất thu hồi gellan ......................... 65
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi gellan ........... 66
Hình 3.14. Sự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại .................. 67
x


Hình 3.15. Qui trình cơng nghệ thu nhận gellan dạng bột từ chủng S. paucimobilis GL12
trên hệ thống bình lên men 10 lít ......................................................................................... 75
Hình 3.16. Phổ IR của các mẫu gellan và gellan khử acyl .................................................. 77
Hình 3.17. Ảnh hưởng của thời gian deacyl đến độ deacyl của gellan ............................... 79
Hình 3.18. Phổ IR của gellan khử acyl ( phản ứng pH = 10/10 phút) .................................... 80
Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch gellan khử acyl/ethanol đến hiệu suất thu hồi .......... 80
Hình 3.20. Kết tủa gellan khử acyl sau 1 lần kết tủa cồn .................................................... 81
Hình 3.21. Qui trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .................................................... 84
Hình 3.22. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR hai chiều của mẫu gellan chuẩn.............. 86
Hình 3.23. So sánh phổ proton của gellan chuẩn và gellan từ S. paucimobilis GL12….87
Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ nhớt rút gọn và nồng độ gellan ....... 88
Hình 3.25. So sánh phổ proton của gellan khử acyl chuẩn và gellan khử acyl từ S.
paucimobilis GL12............................................................................................................... 90
Hình 3.26. Sự biến đổi hàm lượng chất khô tổng số của chuối theo thời gian bảo quản ..... 96
Hình 3.27. Một số hình ảnh bảo quản chuối từ màng bao gellan ....................................... 97

Hình 3.28. Ứng dụng gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa......................................... 99

xi


xii


MỞ ĐẦU
Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu
khí Sphingomonas sp. Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm,
dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm
dày và chất tạo gel.
So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở
nhiệt độ cao (trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều
trong sản xuất nước giải khát. Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel
mềm, mọng nước và tăng được nhiệt độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản
phẩm. Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả
năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả.
Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội với sự trong suốt cao,
tạo gel giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm
lạnh, được ứng dụng nhiều trong sản xuất thạch.
Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi
trong chế biến và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng. Các cơng bố về
q trình sinh tổng hợp, thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung các
thông tin về cải tạo chủng giống, điều kiện lên men, thu hồi nhằm nâng cao hiệu suất và chất
lượng cho chế phẩm.
Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được
sử dụng để bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, tuy nhiên giá của chúng vẫn
còn cao (khoảng 20-50 usd/kg tùy loại). Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của

đề tài chúng tơi đã phân lập được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao
(18-20 g/lít dịch ni). Đề tài cũng đã bước đầu khảo sát được các điều kiện lên men, thu hồi
gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng cần phải có các nghiên cứu cải tiến hơn nữa nhằm
nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp gellan và hồn thiện hơn các đánh giá về đặc tính, chất
lượng cho các chế phẩm gellan, gellan khử acyl làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng
chúng. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định
hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã được lựa chọn trong khuôn khổ của
luận án này.

1


Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis sp. lựa chọn.
- Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng
S. paucimobilis sp. lựa chọn.
- Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm.

Nội dung nghiên cứu
1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao
- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4
- So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12.
2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis sp. lựa chọn
- Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác
- Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men10 lít
- Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột
- Nghiên cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm
- Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis sp. lựa chọn
3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men chủng S. paucimobilis sp.

- Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
- Xác định điều kiện tách chiết và sấy kết tủa gellan khử acyl
- Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl
- Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl
4. Đánh giá chất lượng các chế phẩm gellan
- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis sp.
- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl
5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl
- Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối
- Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa

Những kết quả mới của luận án
- Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 phân lập
tại Việt Nam. Sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan có giá thành rẻ hơn thay
thế cho nguồn trypton, kết hợp với việc bổ sung theo bậc H2O2 khắc phục độ nhớt dịch
2


lên men, cải thiện phương thức cấp ôxi đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp
gellan và đạt 32,8 g/lít.
- Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt 86%
đáp ứng u cầu cho việc tạo ra gel có độ giịn và độ trong cao.
- Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ chủng S.
paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Luận án đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm
có khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với đối
chứng chỉ đạt 9 ngày). Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định
trong mơi trường pH thấp (pH<4) nên thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm có độ axit
cao như thạch dứa.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL
1.1.1. Cấu tạo
Gellan - một polysaccharit dị thể ngoại bào, được sản xuất bằng quá trình lên men
bởi vi khuẩn hiếu khí Sphingomonas paucimobilis.
Cấu trúc phân tử của gellan là một polyme lặp lại của các đơn phân, mỗi đơn phân
gồm bốn gốc đường: hai gốc glucose (Glc), một gốc acid glucurunic (GlcA) và một gốc
rhamnose (Rha). Chúng liên kết với nhau bởi các liên kết glucozit theo trật tự: [3)-β-DGlc-(14)-β-D-GlcA-(14)-β-D-Glc(14)-α-Rha-(1)]. Trong đó, ở gốc đường liên kết
(1 3)-β-D-Glc- thường gắn thêm nhóm O-5-acetyl và O-2- glyceryl (hình 1.1-A). Trong
phân tử của gellan khử acyl, nhóm acyl và glyceryl bị khử (hình 1.1- B) [64].

(A)

(B)

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của gellan (A) và gellan khử acyl (B) [64]

1.1.2. Tính chất
Gellan thương mại được sử dụng dưới dạng bột màu trắng, khơng mùi, hơi ngọt,
tan trong nước nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ (methanol, aceton, ethanol…),
dung dịch có độ nhớt cao, bền ở nhiệt độ sôi, ổn định ở phổ pH rộng (3,0 – 8,0). Gellan
khử acyl có độ bền gel 300-800 g/cm2 cịn gellan có khả năng giữ nước tốt. Gellan có khối

4


lượng phân tử khoảng 1 - 2 x 106 Da và gellan khử acyl có khối lượng phân tử khoảng 2 - 3

x 105 Da [36, 91].
Gellan có chức năng như chất ổn định, tác nhân làm đặc, tác nhân tạo cấu trúc, tạo
nhũ tương, khả năng tương thích cao, giải phóng mùi vị, chất kết dính, màng bao, chất bôi
trơn, chất tạo độ dày và huyền phù, tác nhân tạo gel linh hoạt và có thể tạo kết cấu gel
mong muốn trong các dạng sản phẩm thực phẩm khác nhau từ cứng, giòn hay lỏng [14, 32, 48].
Gellan và gellan khử acyl có những tính chất giống nhau. Điều khác nhau căn bản
giữa hai loại gellan này là khả năng tạo gel. Gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ
cho ra những gel có tính chất khác nhau. Gellan tạo gel mềm, đàn hồi và thuận nghịch
nhiệt. Sự khử các gốc acyl trong phân tử gellan sẽ tạo ra gellan khử acyl cho gel chắc,
giòn. Phụ thuộc vào mức độ deacyl mà gellan khử acyl có độ deacyl hóa càng cao thì khối
lượng phân tử và độ nhớt càng giảm, gel thu được có độ chắc và độ giịn càng tăng. Có thể
tóm tắt sự khác nhau giữa hai loại gellan này về một số chỉ tiêu chính ở bảng 1.1.[14, 15,
27, 35, 61].
Bảng 1.1. Đặc điểm khác nhau giữa gellan và gellan khử acyl [14, 15, 27, 35, 61]

Đặc điểm

Chỉ tiêu
Gellan

Gellan khử acyl

1 - 2 x 106 Da

2 - 3 x 105 Da

70~80oC

30~50oC

Ổn định nhiệt

Ổn định nhiệt

3-8

3 - 10

Khả năng hòa tan trong nước

Tan trong nước ấm

Tan trong nước lạnh hoặc nóng

Cấu trúc gel

Gel mềm và đàn hồi

Gel cứng và giòn

Rất nhớt (+++)

Độ nhớt giảm mạnh (+)

Khối lượng phân tử
Nhiệt độ bắt đầu tạo gel
Khả năng chịu nhiệt
Ổn định pH

Độ nhớt 1% (Cp)

1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel
Gellan
Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan tồn tại trong dung dịch dưới
dạng sợi cuộn ngẫu nhiên. Khi hạ nhiệt độ của dung dịch xuống, các sợi duỗi ra và xoắn
với nhau tạo ra sợi kép. Các sợi kép này tiếp tục liên kết với nhau tạo nên mạng lưới gel 3
chiều (hình 1.2).

5


Hình 1.2. Cơ chế tạo gel của gellan [6, 25]

Gel gellan hình thành nhanh chóng khi nâng và hạ nhiệt độ của dung dịch gellan với sự
có mặt của các cation. Khi nhiệt độ thấp, các sợi kép của gellan hình thành những vịng xoắn
có trật tự, cịn ở nhiệt độ cao xuất hiện các polysaccarit dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt của
dung dịch. Nhờ tính chất này, gellan sẽ được tách khỏi tế bào vi khuẩn khi xử lý ở nhiệt độ
cao. Nhiệt độ dưới 30 - 35oC, cấu trúc của dung dịch trở nên cứng dần và kết quả là hình
thành gel. Các sợi xoắn liên kết với nhau bằng các mối nối và hình thành nên mạng lưới
không gian ba chiều bằng cách tạo phức với các cation và liên kết hydro với nước. Việc bổ
sung các cation hóa trị một và hóa trị hai trong suốt quá trình làm lạnh làm tăng số cầu muối
tại các mối nối, nên đã cải thiện được tính chất tạo gel của gellan (hình 1.3). Các cation như
Na, K, Ca và Mg thúc đẩy sự tạo gel của gellan. Cation tetramethylammonium (TMA) lại kìm
hãm sự tạo gel. Gel hình thành bởi các ion hóa trị 2 như Ca2+ và Mg2+ mạnh hơn so với các ion
hóa trị 1như Na+ và K+. Nồng độ bổ sung cho sự tạo gel gellan với catrion hóa trị 1 thường là
100 mM cịn với cation hóa trị 2 là 5 mM. Sự bổ sung các cation thúc đẩy quá trình tạo gel sẽ
dẫn đến sự tinh thể hóa những sợi này và hình thành gel bền [25, 34, 43].

Hình 1.3. Cơ chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation [6, 25]

6


Nhóm thế acyl có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của gel gellan. Các nhóm acetyl và
glyceryl cồng kềnh ngăn chặn liên kết chặt chẽ giữa các chuỗi polymer gellan trong dạng
xoắn lớn và cản trở cuộn lại của chuỗi xoắn kép. Vì vậy, gel của loại gơm này có tính mềm
dẻo và đàn hồi.
Gellan khử acyl
Gellan khử acyl có thể tạo gel mà khơng cần có các ion trên khi ở pH < 3.0. Trong
môi trường acid (pH 2.8 – 3.0) gel bền, trạng thái này cũng không bị ảnh hưởng bởi nồng
độ đường hay nồng độ ion. Bằng thực nghiệm cho thấy, gel trong acid sẽ chắc hơn gel
trong nước có bổ sung đường. Gel trong acid sẽ giảm độ chắc nếu có cho thêm các ion.
Nhiều trường hợp thì khơng cần bổ sung ion vì trong nước và các thành phần khác đã có
đủ lượng ion cần thiết cho việc tạo gel.
Nhiệt độ tạo gel là nhiệt độ bắt đầu có sự tạo gel. Q trình tạo gel của gellan khử
acyl diễn ra nhanh khi nhiệt độ vừa đạt tới nhiệt độ tạo gel. Nhiệt độ nóng chảy gel và nhiệt
độ tạo gel sẽ càng tăng khi nồng độ các ion tăng. Với loại gel này, trong đa số trường hợp
gel sẽ khơng có tính thuận nghịch về nhiệt và nó sẽ nóng chảy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
bắt đầu tạo gel. Gellan khử acyl hình thành gel vững chắc, giịn và hồi biến nhiệt vì sự vắng
mặt của các nhóm acetyl và glyceryl. Gellan khử acyl có thể tạo gel ở nồng độ thấp khoảng
0.05%, gel tạo ra sẽ cứng và không bị tách lỏng nếu khơng cắt hoặc phá hủy gel.
Tóm lại, gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra gel có tính chất
khác nhau. Gellan tự nhiên cho ra gel mềm, đàn hồi còn gellan khử acyl cho ra gel chắc,
giịn. Tùy thuộc vào cấu trúc và tính chất của mỗi loại gellan mà chúng sẽ được ứng dụng
cho các mục đích khác nhau. Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá cấu trúc và các đặc tính
cơng nghệ cho mỗi loại gellan mới sinh tổng hợp là công việc cần thiết của các nghiên cứu
thu nhận nguồn chế phẩm này.
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Năm 1993, Takeuchi và cộng sự đã chỉ ra Sphingomonas được chia thành 4 chi:

Sphingomonassensu stricto, Sphingobium, Novosphingobium và Sphingopyxis [73, 74]. Các
khảo sát đã cho thấy hầu hết các chủng S. paucimobilis sp. đều có khả năng sản xuất gellan
và chỉ có vi khuẩn này mới có khả năng sinh tổng hợp gellan [14].
Sphingomonas sp. là vi khuẩn gram âm, hình que có kích thước 0,3-0,8 x 1,0-2,7
µm, khuẩn lạc có màu vàng, màu cam hoặc màu trắng không bào tử, bề mặt khuẩn lạc có
dạng nhầy, phản ứng oxidase dương tính, dị dưỡng, hiếu khí hồn tồn và sinh sắc tố vàng.
7


Sphingomonas sp. có khả năng di động nhanh nhờ các lơng roi và đa số có khả năng phát
quang dưới ánh sáng cực tím [20].
Vi khuẩn Sphingomonas sp. được tìm thấy trong môi trường tự nhiên như trong
nước, trong đất và trong hệ thống rễ cây [72]. Nhiều tài liệu cho thấy, Sphingomonas sp. có
thể tồn tại trong nhiều mơi trường sống khác nhau là do chúng có khả năng sử dụng đa
dạng nguồn cơ chất, phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 28 - 32oC và trong điều kiện thiếu dinh
dưỡng. Vi khuẩn này sử dụng glucose và một số loại đường khác cho sự sinh trưởng và
phát triển.
1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan
Con đường sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis là một quá trình khá phức tạp, có
thể chia ra làm 3 bước chính như sau: (a) sinh tổng hợp nội bào các tiền chất đường, (b) lắp
ráp các tiểu phần lặp lại tetrasaccharide, (c) q trình polymer hóa và tiết gellan thơng qua
màng ngoại bào (hình 1.4).
a/ Sinh tổng hợp tiền chất đường nucleotide: quá trình sinh tổng hợp gellan bắt đầu với
sự tổng hợp các tiền chất đường đơn như UDP-D-glucose, UDP-D-glucuronic acid và
dTDP-L-rhamnose. Các enzyme cần thiết cho quá trình này gồm phosphoglucomutase
(PgmG), UDP glucose pyrophosphorylase (UgpG), UDP-glucose dehydrogenase (UgdG),
TDP-glucose pyrophosphorylase (RmlA), dTDP-D-glucose-4,6-dehydratase (RmlB),
dTDP-6-deoxy-D-glucose-3,5-epimerase

(RmlC)

và

dTDP-6-deoxy-L-mannose

dehydrogenase (RmlD). Glucose-1-P giữ vai trò quan trọng, trung gian cho 2 con đường
sinh tổng hợp dTDP-L-rhamnose và UDP-D-glucuronic acid [27].
b/ Lắp ráp tiểu phần tetrasaccharide: sau quá trình hình thành các tiền chất đường là sự
hình thành các tiểu phần lặp lại. Các gen thuộc cụm gen khác nhau đã được tìm thấy tham
gia xúc tác vào quá trình hình thành gellan, vào quá trình sinh tổng hợp dTDP-L-Rha, các
glycosyltransferase, các protein có mặt trong q trình polymer hóa và vận chuyển gellan.
Do gellan là polysaccarit ngoại bào được tổng hợp bên trong màng tế bào và sau đó được
tiết ra ngồi màng tế bào.
Các tiểu phần lặp lại tetrasaccharid được lắp ráp vào chất mang lipid nhờ sự xúc tác
của các glycosyltransferase đặc hiệu. Glycosyltransferase, vận chuyển glucose-1-phosphate
từ UDP-Glc đến chất mang lipid. Gốc đường thứ 2 thêm vào là glucuronic acid, từ UDPglucuronic acid. Các gốc đường thứ 3 và thứ 4 (glucose và rhamnose) được thêm vào các
tiểu phần lặp lại, sự xúc tác tương ứng nhờ các enzyme GelL và GelQ. Cuối cùng, việc lắp

8


ráp các đơn vị lặp lại được hoàn thành khi các nhóm acetate và glycerate gắn vào gốc
glucose đầu tiên nhờ enzyme acetyltransferase và glyceryltransferase, theo thứ tự [27].
c/ Quá trình polymer hóa và tiết gellan thơng qua màng ngoại bào: bước tiếp theo trong
quá trình sinh tổng hợp gellan là q trình polymer hóa những tiểu phần lặp lại để chúng
thành dạng chuỗi dài hơn. Độ dài của chuỗi gellan được quyết định bởi các enzyme thuộc
họ PCP (polysaccarit co-polymerase), được mã hóa bởi các gen gel C và gel E [59].
Bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp là sự tiết gellan ra ngoài màng tế bào.
Trong S. paucimobilis ATCC 31.461, quá trình này được thực hiện nhờ các protein trung
gian nằm ở lớp ngoài màng hay cịn gọi là các protein phụ trợ, mã hóa bởi gen gelD. Các

protein này sẽ hình thành kênh protein nơi các chuỗi polysaccarit có thể tiếp cận với màng
tế bào [21].

Hình 1.4. Cơ chế sinh tổng hợp gellan [16, 21]

1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis
Động học quá trình sinh trưởng của S. paucimobilis sp. cũng tương tự như các vi
sinh vật khác đều trải qua lần lượt 4 giai đoạn: tiềm phát, logarit, cân bằng và suy vong.
Chủng S. paucimobilis sp. đã được ghi nhận là lồi có khả năng tiết ra một chất nhầy

9


(gellan) bao quanh tế bào như một tác nhân bảo vệ trong quá trình sinh trưởng và duy trì
của chúng. Lượng chất này sẽ thay đổi theo chu kỳ phát triển của vi khuẩn. Sau 6h lên
men, tốc độ tạo sinh khối diễn ra mạnh mẽ và đạt cực đại ở khoảng 24h. Năng suất gellan
cũng tăng đáng kể và đạt cao nhất ở giờ lên men thứ 60 và sau đó có xu hướng ổn định. Ở
pha suy vong có thể một lượng nhỏ polyme bị phân hủy do vi khuẩn sinh enzym zhamnose
lyzae làm thủy phân gellan. Kanar và cộng sự đã báo cáo rằng, 48h đầu là thời gian tối ưu
cho sản xuất gellan bởi S. paucimobilis sp. Wang và cộng sự đã quan sát thấy hàm lượng
gellan đạt tối ưu sau 56 giờ lên men. Jin và cộng sự cũng đã chỉ ra 50 giờ đầu là thời gian
tối ưu cho việc sản xuất gellan. Thời gian và tốc độ sinh trưởng và phát triển phụ thuộc vào
đặc tính của chủng giống khác nhau [26, 27, 95]. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan

Sinh khối (g/l)

Hàm lượng gellan (g/l)

từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 được cho ở hình 1.5. [95].

Hàm lượng gellan
Sinh khối

Hình 1.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 [95]

Từ con đường sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis sp. cho thấy vai trò của
nguồn tiền chất cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp gellan. Nó ảnh
hưởng xuyên suốt đến quá trình hình thành gellan. Sự tiết nhiều polysaccarit ngoại bào này
cũng được nhận thấy khi vi khuẩn được cung cấp nhiều cacbon và nồng độ nitơ tối thiểu
[94]. Điều này có thể do nguồn đường là thành phần cấu tạo nên gellan còn nguồn nitơ chỉ
cần cấp một lượng vừa đủ để tạo sinh khối, khi môi trường cạn nguồn nitơ, vi khuẩn
chuyển sang pha cân bằng, quá trình sinh tổng hợp gellan sẽ được kích thích nhằm bảo vệ chúng.
Một điều nữa, với các chủng S. paucimobilis sp. khi tăng sinh khối sẽ đồng thời
tăng khả năng tích lũy gellan, do vậy trong những điều kiện nhất định về thành phần môi
10


trường, pH, nhiệt độ ni thì yếu tố khơng thuận lợi cho tạo gellan là việc cấp thiếu oxy.
Lượng oxy cấp không đủ sẽ ức chế sự sinh trưởng của chủng, dẫn tới giảm sản lượng gellan.
Q trình polymer hóa gellan cũng cần hoạt hóa tiền chất trước khi lắp ráp đơn vị
lặp lại. Năng lượng cần thiết đó là UDP và ADP có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan.
Trong nghiên cứu của Bajaj và cộng sự 2006, khi sử dụng tinh bột tan trong mơi trường
nghiên cứu thì nồng độ ADP và UDP được tối ưu hóa cho sản xuất gellan ở mức 1 mM đã
cho năng suất gellan cao nhất là 32,15 g/1 [14,59].
Tóm lại, gellan được tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn S. paucimobilis sp. Khả
năng sinh tổng hợp gellan mạnh hay yếu tùy thuộc khá nhiều vào đặc điểm và các tính chất
sinh lý, sinh hóa của từng chủng. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn hay cải biến các chủng
có khả năng sinh gellan cao luôn giành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.
Mặt khác, là sản phẩm trao đổi bậc hai và được tích lũy ngay từ pha logarit và kéo dài qua
pha cân bằng. Đây là điểm cần lưu ý khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng

sinh tổng hợp gellan, vừa tìm các điều kiện thích hợp cho việc tăng sinh khối vừa đảm bảo
các điều kiện tối thiểu cho duy trì chủng.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan
1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống
Chiều dài của pha logarit thường bị ảnh hưởng bởi lượng giống và tuổi giống. Do đó,
chất lượng giống (tuổi giống cấp, tỷ lệ giống) là một thông số cần quan tâm khi nghiên cứu
sinh tổng hợp gellan.
Nghiên cứu của Ashok Pandey và cộng sự đã khảo sát thời gian lên men từ 12 giờ 96 giờ cho sản xuất gellan và xác định được lượng gellan đạt cao nhất sau 48 giờ lên men.
Theo tác giả, gellan được hình thành ở pha sinh trưởng và tiếp tục được tạo ra nhiều ở pha
cân bằng, sự tăng trưởng tế bào đồng thời sinh tổng hợp gellan cũng được hình thành. Để
lựa chọn giống khỏe mạnh, Nampoothiri và cộng sự tiến hành tiếp giống ở các tuổi giống
(8, 12, 16, 20 và 24 giờ). Kết quả đã thu lượng gellan tối đa là 22,3 g/l khi cấp giống ở tuổi giống
20 giờ. Cũng với kết quả nghiên cứu về các tỷ lệ tiếp giống (1, 2, 4, 6, 8 và 10%), lượng gellan
cao nhất đã thu được ở tỉ lệ giống 10%. Nhìn chung các nghiên cứu thường sử dụng 6 -10%
giống và tuổi giống ở 18 - 24 giờ là thích hợp cho lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
paucimobilis sp. [13, 14, 16, 35, 61].
1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
Nguồn cacbon
11