Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ....................................................................... x
CÁC PHỤ LỤC KÈM THEO ........................................................................................... xii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 4
1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ............................................ 4
1.1.1. Cấu tạo .................................................................................................................... 4
1.1.2. Tính chất.................................................................................................................. 4
1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel ................................. 5
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan .................................... 7
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa................................................................. 7
1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan .............................................................................. 8
1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis .......... 9
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 11
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan .................................... 11
1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống ........................................................ 11
1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men ............................................. 11
1.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí .......................................... 14
1.2.1.4. Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan ......................... 15
1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men.......................................................... 18
1.2.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................................................. 20
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 21
1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây ......................................................... 21
1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm ..................................................................... 23
1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác ........................................................................ 25
1.4. VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN................................................................... 26

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 29
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ TRANG THIẾT BỊ .......................................................... 29
2.1.1. Chủng giống, nguyên liệu chuối ........................................................................... 29
2.1.2. Môi trường ............................................................................................................ 29
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 30
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................... 30

iii


2.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

......................................................................................... 31
2.2.1. Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl ..................................................... 31
2.2.2. Phân tích cấu trúc gellan và gellan khử acyl (phổ MNR) ..................................... 32
2.2.3. Xác định khối lượng phân tử của gellan ............................................................... 33
2.2.4. Xác định mức độ deacyl hóa (ĐĐA) của gellan khử acyl .................................... 34
2.2.5. Xác định độ bền gel của gellan khử acyl .............................................................. 35
2.2.6. Xác định khả năng tạo gel với các ion Ca+2 và Na+ .............................................. 35
2.2.7. Phân tích các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của gellan ................................................ 35
2.2.8. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn ........................................................................... 36

2.2.9. Xác định hàm lượng protein.............................................................................36
2.2.10. Xác định hàm lượng màu carotenoid................................................................36
2.2.11. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 36
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 36
2.3.1. Nhân giống và điều kiện bảo quản giống .............................................................. 36
2.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL4....................... 36
2.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng
S. paucimobilis GL12 ...................................................................................................... 37

2.3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................. 37
2.3.3.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung axit amin ........................................................... 37
2.3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 37
2.3.4. Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp gellan cho chủng S. paucimobilis GL12 .. 38
2.3.5. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 40
2.3.5.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 40
2.3.5.2. Xác định thời gian thu gellan ........................................................................... 40
2.3.6. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 40
2.3.6.1. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 40
2.3.6.2. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 41
2.3.7. Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột ............................... 41
2.3.7.1. Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ........................................... 41
2.3.7.2. Nghiên cứu lựa chọn bao bì ............................................................................. 42
2.3.7.3. Xác định chế độ bảo quản ................................................................................ 42
2.3.8. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl ................................................................... 42
2.3.8.1. Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ......... 42
2.3.8.2. Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl .................................. 43
2.3.8.3. Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl ........................................... 43
2.3.8.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ................................................................ 43
2.3.9. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối …………… 43
2.3.9.1. Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan............................................... 44
iv


2.3.9.2. Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan......................... 44
2.3.9.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng ............................................................ 47
2.3.10. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa .......................... 48
2.3.10.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch................. 48
2.3.10.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ........... 48
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 50

3.1. LỰA CHỌN CHỦNG CHO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GELLAN CAO ............................. 50
3.1.1. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4................. 50
3.1.2. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12 ...................................................................................................... 53
3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ CHỦNG S. PAUCIMOBILIS GL12 ............................54
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan ......... 54
3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ ......................................................................................... 54
3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin ..................................................... 55
3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 56
3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan ............................. 57
3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12 ..58
3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 61
3.2.3.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 61
3.2.3.2. Xác định thời gian thu hồi gellan..................................................................... 62
3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 63
3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối ............................................ 63
3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 65
3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 66
3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ............................................................. 68
3.2.6. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan ................................... 70
3.2.6.1. Nghiên cứu lựa chọn bao bì thích hợp cho chế phẩm...................................... 70
3.2.6.2. Xác định điều kiện bảo quản ........................................................................... 72
3.2.7. Đề xuất qui trình thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12..............................74
3.3. CHUYỂN HÓA GELLAN THÀNH GELLAN KHỬ ACYL .................................................. 76
3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................... 76
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan ............................................ 76
3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl .................................. 78
3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol .................................................................... 80
3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl .................................................................. 81
3.3.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ..................................................................... 82

3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .......................................... 83
3.4. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CÁC CHẾ PHẨM ................................................................... 85
3.4.1. Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis GL12 ........................... 85
v


3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan .................................................................................. 85
3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan ................................................................ 87
3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan ............. 88
3.4.2. Đánh giá chất lượng gellan khử acyl..................................................................... 90
3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl ................................................................... 90
3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl90
3.5. THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL .................... 91
3.5.1. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối .......................... 91
3.5.1.1. Xác định hàm lượng gellan thích hợp trong công thức dung dịch tạo màng ... 91
3.5.1.2. Xác định thông số kỹ thuật của màng bao gellan lựa chọn ............................. 93
3.5.1.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản chuối của màng bao gellan ................................. 93
3.5.2. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ............................ 97
3.5.2.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho trong công thức thạch .... 97
3.5.2.2. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan sản phẩm thạch.................................................... 98
3.5.2.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch ................................... 100
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 102
4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................................. 102
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 104

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký tự

Chú thích

ADN

Axit deoxyribonucleic

ADP

Adenosine diphosphate

AL/PE

Màng nhôm PE

Al-Foil

Lá nhôm mỏng

BOPP/PE

Màng Biaxial Oriented Polypropylene PE

Cp

Centipoazo đơn vị tính độ nhớt

CT

Công thức

ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm

ĐĐA

Mức độ deacyl

ĐVTN

Động vật thí nghiệm

GFC

Sắc ký lọc gel

HDPE

Polyethylene tỷ trọng cao

MDPE

Polyethylene tỷ trọng trung bình

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân

Ny/PE

Màng nylon PE

PE

Polyethylene

PET

Polyethylene terephthalate

PVDC

Polyvinylidende chloride

TSS

Chất rắn hòa tan tổng số

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm khác nhau giữa gellan và gellan khử acyl ............................................ 5

Bảng 1.2. Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh tổng hợp gellan............................................................................................................. 17
Bảng 1.3. Đặc điểm và hiệu quả gellan ............................................................................... 24
Bảng 2.1. Đặc tính của gellan và gellan khử acyl dùng làm mẫu chuẩn ............................ 30
Bảng 2.2. Thời gian và liều lượng H2O2 khảo sát ............................................................... 38
Bảng 2.3. Các yếu tố và các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng
hợp gellan từ chủng S. pausimobilis GL12 .......................................................................... 38
Bảng 2.4. Ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 39
Bảng 2.5. Chỉ số màu chuẩn cho chuối ............................................................................... 44
Bảng 2.6. Tỷ lệ thành phần trong các công thức tạo dung dịch màng gellan ..................... 44
Bảng 2.7. Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan chuối ................................................................ 46
Bảng 2.8. Phiếu cho điểm của phép thử cảm quan.............................................................. 47
Bảng 2.9. Bảng điểm cảm quan của sản phẩm thạch dứa ................................................... 48
Bảng 2.10. Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của thành viên
trong hội đồng cảm quan ..................................................................................................... 49
Bảng 3.1. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12 ........................................................................................................... 53
Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan
của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 54
Bảng 3.3. Ảnh hưởng củ các xit min đến khả năng sinh tổng hợp gellan ..................... 56
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan ..... 57
Bảng 3.5. Kết quả ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 59
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phư ng s i Anov của mô hình ............................................ 60
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào
vi khuẩn ................................................................................................................................ 64
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch tới khả năng loại protein khỏi dịch lên men 65
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng
loại màu ............................................................................................................................... 67

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hiệu suất và chất lượng gellan thành phẩm .. 68
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian sấy đến hiệu suất thu hồi gellan ............................... 69
Bảng 3.12. Ảnh hưởng củ độ dày lớp vật liệu sấy đến hiệu suất thu hồi gellan ................ 70
Bảng 3.13. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis
GL12 .................................................................................................................................... 70

viii


Bảng 3.14. Sự th y đổi độ ẩm và độ nhớt của gellan sau 06 tháng bảo quản .................... 72
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sản phẩm gellan ................ 73
Bảng 3.16. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gell n trước và sau khi
bảo quản 06 tháng ............................................................................................................... 73
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan .................................... 78
Bảng 3.18. Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl ................................................ 81
Bảng 3.19. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S.
paucimobilis GL12 ............................................................................................................... 82
Bảng 3.20. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gellan khử cyl trước và
sau khi bảo quản 06 tháng ................................................................................................... 82
Bảng 3.21. Kết quả phân tích chất lượng và ATTP của chế phẩm gellan ........................... 89
Bảng 3.22. Kết quả phân tích chất lượng của sản phẩm gellan khử acyl ........................... 91
Bảng 3.23. Ảnh hưởng củ hàm lượng gellan trong công thức tạo màng đến hiệu quả bảo
quản chuối............................................................................................................................ 92
Bảng 3.24. Một số chỉ tiêu và đặc tính hóa lý của dung dịch tạo màng gellan ................... 93
Bảng 3.25. Ảnh hưởng củ màng b o đến các chỉ tiêu sinh lý của chuối trong quá trình
bảo quản .............................................................................................................................. 94
Bảng 3.26. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan chuối sau 18 ngày bảo quản .............. 96
Bảng 3.27. Xác định tỉ lệ gellan khử acyl bổ sung thích hợp trong thành phần thạch........ 98
Bảng 3.28. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan thạch dứa có bổ sung gellan ................................ 99
Bảng 3.29. Chỉ tiêu ATTP và các tính chất cảm quan của thạch ...................................... 101

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của gellan (A) và gellan khử acyl (B) ....................................... 4
Hình 1.2. C chế tạo gel của gellan ..................................................................................... 6
Hình 1.3. C chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation ................................................... 6
Hình 1.4. C chế sinh tổng hợp gellan .................................................................................. 9
Hình 1.5. Động học quá trình STH gellan từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461........... 10
Hình 1.6. S đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men ...................................................... 19
Hình 1.7. S đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan ................................................. 20
Hình 2.1. Khuẩn lạc của S. paucimobilis GL12 (A) và S. paucimobilis GL4 (B)................ 29
Hình 2.2. Đường chuẩn gellan ........................................................................................... 32
Hình 2.3. Đường chuẩn gellan khử acyl .............................................................................. 32
Hình 2.4. Phư ng pháp xác định độ nhớt thực .................................................................... 34
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nguồn nit

tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S.

paucimobilis GL4 ................................................................................................................. 50
Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S.
paucimobilis GL4 ................................................................................................................. 51
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis GL4 ........................................................................................................ 52
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới khả năng sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis GL4 ....................................................................................................... 52
Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 ......... 53
Hình 3.6. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan
của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 55

Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ -threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan ................. 56
Hình 3.8. Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gell n của chủng S. paucimobilis
GL12 .................................................................................................................................... 58
Hình 3.9. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng gellan ............... 60
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới khả năng tạo gellan ....................................... 62
Hình 3.11. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12 trên
hệ thống bình lên men sục khí .............................................................................................. 63
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hiệu suất thu hồi gellan ......................... 65
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/eth nol đến hiệu suất thu hồi gellan ........... 66
Hình 3.14. Sự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại .................. 67
x


Hình 3.15. Qui trình công nghệ thu nhận gellan dạng bột từ chủng S. paucimobilis GL12
trên hệ thống bình lên men 10 lít ......................................................................................... 75
Hình 3.16. Phổ IR của các mẫu gellan và gellan khử acyl .................................................. 77
Hình 3.17. Ảnh hưởng của thời gi n de cyl đến độ deacyl của gellan ............................... 79
Hình 3.18. Phổ IR của gellan khử acyl ( phản ứng pH = 10 / 10 phút) .................................. 80
Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch gellan khử cyl/eth nol đến hiệu suất thu hồi .......... 80
Hình 3.20. Kết tủa gellan khử acyl sau 1 lần kết tủa cồn .................................................... 81
Hình 3.21. Qui trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .................................................... 84
Hình 3.22. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR hai chiều của mẫu gellan chuẩn.............. 86
Hình 3.23. So sánh phổ proton của gellan chuẩn và gellan từ S. paucimobilis GL12 Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn mối tư ng qu n giữ độ nhớt rút gọn và nồng độ gellan ....... 88
Hình 3.25. So sánh phổ proton của gellan khử acyl chuẩn và gellan khử acyl từ S.
paucimobilis GL12 ............................................................................................................... 90
Hình 3.26. Sự biến đổi hàm lượng chất khô tổng số của chuối theo thời gian bảo quản ..... 96
Hình 3.27. Một số hình ảnh bảo quản chuối từ màng bao gellan ....................................... 97
Hình 3.28. Ứng dụng gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa......................................... 99

xi


CÁC PHỤ LỤC KÈM THEO
Phụ lục 1

Hồ sơ chủng S. paucimobilis GL2 và kết quả Đánh giá độc tính cấp trên
chuột

Phụ lục 2

Các bảng và số liệu về kết quả chạy tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp
gellan từ chủng S. paucimobilis GL12

xii


MỞ ĐẦU
Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu
khí Sphingomonas sp. Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm,
dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm
dày và chất tạo gel.
So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở
nhiệt độ cao (trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều
trong sản xuất nước giải khát. Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel
mềm, mọng nước và tăng được nhiệt độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản
phẩm. Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả
năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả.
Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội với sự trong suốt cao,

tạo gel giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm
lạnh, được ứng dụng nhiều trong sản xuất thạch.
Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi
trong chế biến và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng. Các công bố về
quá trình sinh tổng hợp, thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung các
thông tin về cải tạo chủng giống, điều kiện lên men, thu hồi nhằm nâng cao hiệu suất và chất
lượng cho chế phẩm.
Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được
sử dụng để bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, tuy nhiên giá của chúng vẫn
còn cao (khoảng 20-50 usd/kg tùy loại). Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của
đề tài chúng tôi đã phân lập được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao
(18-20 g/lit dịch nuôi). Đề tài cũng đã bước đầu khảo sát được các điều kiện lên men, thu hồi
gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng cần phải có các nghiên cứu cải tiến hơn nữa nhằm
nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp gellan và hoàn thiện hơn các đánh giá về đặc tính, chất
lượng cho các chế phẩm gellan, gellan khử acyl làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng
chúng. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định
hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã được lựa chọn trong khuôn khổ của
luận án này.

1


Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn.
- Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng
S. paucimobilis lựa chọn.
- Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm.

Nội dung nghiên cứu
1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4
- So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12.
2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn
- Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác
- Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men10 lít
- Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột
- Nghiên cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm
- Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn
3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S. paucimobilis
- Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
- Xác định điều kiện tách chiết và sấy kết tủa gellan khử acyl
- Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl
- Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl
4. Đánh giá chất lƣợng các chế phẩm gellan
- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis
- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl
5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl
- Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối
- Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa

Những kết quả mới của luận án
- Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 phân lập
tại Việt Nam. Sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan có giá thành rẻ hơn thay
thế cho nguồn trypton, kết hợp với việc bổ sung theo bậc H2O2 khắc phục độ nhớt dịch
2


lên men, cải thiện phương thức cấp ôxi đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp
gellan và đạt 32,8 g/lít.

- Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt 86%
đáp ứng yêu cầu cho việc tạo ra gel có độ giòn và độ trong cao.
- Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ chủng S.
paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Luận án đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm
có khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với đối
chứng chỉ đạt 9 ngày). Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định
trong môi trường pH thấp (pH<4) nên thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm có độ axit
cao như thạch dứa.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL
1.1.1. Cấu tạo
Gellan - một polysaccharit dị thể ngoại bào, được sản xuất bằng quá trình lên men
bởi vi khuẩn hiếu khí Sphingomonas paucimobilis.
Cấu trúc phân tử của gellan là một polyme lặp lại của các đơn phân, mỗi đơn phân
gồm bốn gốc đường: hai gốc glucose (Glc), một gốc acid glucurunic (GlcA) và một gốc
rhamnose (Rha). Chúng liên kết với nhau bởi các liên kết glucozit theo trật tự: [3)-β-DGlc-(14)-β-D-GlcA-(14)-β-D-Glc(14)-α-Rha-(1)]. Trong đó, ở gốc đường liên kết
(1 3)-β-D-Glc- thường gắn thêm nhóm O-5-acetyl và O-2- glyceryl (hình 1.1-A). Trong
phân tử của gellan khử acyl, nhóm acyl và glyceryl bị khử (hình 1.1- B) [68].

(A)

(B)

Hình 1.1. Cấu trúc hó học củ gellan (A) và gell n khử cyl (B) [68]

1.1.2. Tính chất
Gellan thương mại được sử dụng dưới dạng bột màu trắng, không mùi, hơi ngọt,
tan trong nước nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ (methanol, aceton, ethanol…),
dung dịch có độ nhớt cao, bền ở nhiệt độ sôi, ổn định ở phổ pH rộng (3,0 – 8,0). Gellan
khử acyl có độ bền gel 300-800 g/cm2 còn gellan có khả năng giữ nước tốt. Gellan có khối

4


lượng phân tử khoảng 1 - 2 x 106 Da và gellan khử acyl có khối lượng phân tử khoảng 2 - 3
x 105 Da [38, 96].
Gellan có chức năng như chất ổn định, tác nhân làm đặc, tác nhân tạo cấu trúc, tạo
nhũ tương, khả năng tương thích cao, giải phóng mùi vị, chất kết dính, màng bao, chất bôi
trơn, chất tạo độ dày và huyền phù, tác nhân tạo gel linh hoạt và có thể tạo kết cấu gel
mong muốn trong các dạng sản phẩm thực phẩm khác nhau từ cứng, giòn hay lỏng [51, 15, 34].
Gellan và gellan khử acyl có những tính chất giống nhau. Điều khác nhau căn bản
giữa hai loại gellan này là khả năng tạo gel. Gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ
cho ra những gel có tính chất khác nhau. Gellan tạo gel mềm, đàn hồi và thuận nghịch
nhiệt. Sự khử các gốc acyl trong phân tử gellan sẽ tạo ra gellan khử acyl cho gel chắc,
giòn. Phụ thuộc vào mức độ deacyl mà gellan khử acyl có độ deacyl hóa càng cao thì khối
lượng phân tử và độ nhớt càng giảm, gel thu được có độ chắc và độ giòn càng tăng. Có thể
tóm tắt sự khác nhau giữa hai loại gellan này về một số chỉ tiêu chính ở bảng 1.1.[15, 16,
29, 37, 65].
Bảng 1.1. Đặc điểm khác nh u giữ gell n và gellan khử cyl [15, 16, 29, 37, 65]

Đặc điểm
Chỉ tiêu
Gellan

Gellan khử acyl

1 - 2 x 106 Da

2 - 3 x 105 Da

70~80oC

30~50oC

Ổn định nhiệt

Ổn định nhiệt

3-8

3 - 10

Khả năng hòa tan trong nước

Tan trong nước ấm

Tan trong nước lạnh hoặc nóng

Cấu trúc gel

Gel mềm và đàn hồi

Gel cứng và giòn

Rất nhớt (+++)

Độ nhớt giảm mạnh (+)

Khối lượng phân tử
Nhiệt độ bắt đầu tạo gel
Khả năng chịu nhiệt
Ổn định pH

Độ nhớt 1% (Cp)

1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tạo gel
Gellan
Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan tồn tại trong dung dịch dưới
dạng sợi cuộn ngẫu nhiên. Khi hạ nhiệt độ của dung dịch xuống, các sợi duỗi ra và xoắn
với nhau tạo ra sợi kép. Các sợi kép này tiếp tục liên kết với nhau tạo nên mạng lưới gel 3
chiều (hình 1.2).

5


Hình 1.2. C chế tạo gel củ gell n [7, 27]

Gel gellan hình thành nhanh chóng khi nâng và hạ nhiệt độ của dung dịch gellan với sự
có mặt của các cation. Khi nhiệt độ thấp, các sợi kép của gellan hình thành những vòng xoắn
có trật tự, còn ở nhiệt độ cao xuất hiện các polysaccarit dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt của
dung dịch. Nhờ tính chất này, gellan sẽ được tách khỏi tế bào vi khuẩn khi xử lý ở nhiệt độ
cao. Nhiệt độ dưới 30 - 35oC, cấu trúc của dung dịch trở nên cứng dần và kết quả là hình
thành gel. Các sợi xoắn liên kết với nhau bằng các mối nối và hình thành nên mạng lưới
không gian ba chiều bằng cách tạo phức với các cation và liên kết hydro với nước. Việc bổ
sung các cation hóa trị một và hóa trị hai trong suốt quá trình làm lạnh làm tăng số cầu muối

tại các mối nối, nên đã cải thiện được tính chất tạo gel của gellan (hình 1.3). Các cation như
Na, K, Ca và Mg thúc đẩy sự tạo gel của gellan. Cation tetramethylammonium (TMA) lại kìm
hãm sự tạo gel. Gel hình thành bởi các ion hóa trị 2 như Ca2+ và Mg2+ mạnh hơn so với các ion
hóa trị 1như Na+ và K+. Nồng độ bổ sung cho sự tạo gel gellan với catrion hóa trị 1 thường là
100 mM còn với cation hóa trị 2 là 5 mM. Sự bổ sung các cation thúc đẩy quá trình tạo gel sẽ
dẫn đến sự tinh thể hóa những sợi này và hình thành gel bền [27, 36, 45].

Hình 1.3. C chế tạo gel củ gell n khi có mặt các c tion [7, 27]

6


Nhóm thế acyl có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của gel gellan. Các nhóm acetyl và
glyceryl cồng kềnh ngăn chặn liên kết chặt chẽ giữa các chuỗi polymer gellan trong dạng
xoắn lớn và cản trở cuộn lại của chuỗi xoắn kép. Vì vậy, gel của loại gôm này có tính mềm
dẻo và đàn hồi.
Gellan khử acyl
Gellan khử acyl có thể tạo gel mà không cần có các ion trên khi ở pH < 3.0. Trong
môi trường acid (pH 2.8 – 3.0) gel bền, trạng thái này cũng không bị ảnh hưởng bởi nồng
độ đường hay nồng độ ion. Bằng thực nghiệm cho thấy, gel trong acid sẽ chắc hơn gel
trong nước có bổ sung đường. Gel trong acid sẽ giảm độ chắc nếu có cho thêm các ion.
Nhiều trường hợp thì không cần bổ sung ion vì trong nước và các thành phần khác đã có
đủ lượng ion cần thiết cho việc tạo gel.
Nhiệt độ tạo gel là nhiệt độ bắt đầu có sự tạo gel. Quá trình tạo gel của gellan khử
acyl diễn ra nhanh khi nhiệt độ vừa đạt tới nhiệt độ tạo gel. Nhiệt độ nóng chảy gel và nhiệt
độ tạo gel sẽ càng tăng khi nồng độ các ion tăng. Với loại gel này, trong đa số trường hợp
gel sẽ không có tính thuận nghịch về nhiệt và nó sẽ nóng chảy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
bắt đầu tạo gel. Gellan khử acyl hình thành gel vững chắc, giòn và hồi biến nhiệt vì sự vắng
mặt của các nhóm acetyl và glyceryl. Gellan khử acyl có thể tạo gel ở nồng độ thấp khoảng
0.05%, gel tạo ra sẽ cứng và không bị tách lỏng nếu không cắt hoặc phá hủy gel.

Tóm lại, gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra gel có tính chất
khác nhau. Gellan tự nhiên cho ra gel mềm, đàn hồi còn gellan khử acyl cho ra gel chắc,
giòn. Tùy thuộc vào cấu trúc và tính chất của mỗi loại gellan mà chúng sẽ được ứng dụng
cho các mục đích khác nhau. Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá cấu trúc và các đặc tính
công nghệ cho mỗi loại gellan mới sinh tổng hợp là công việc cần thiết của các nghiên cứu
thu nhận nguồn chế phẩm này.
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Năm 1993, Takeuchi và cộng sự đã chỉ ra Sphingomonas được chia thành 4 chi:
Sphingomonassensu stricto, Sphingobium, Novosphingobium và Sphingopyxis [77, 78]. Các
khảo sát đã cho thấy hầu hết các chủng Sphingomonas paucimobilis đều có khả năng sản
xuất gellan và chỉ có chủng vi khuẩn này mới có khả năng sinh tổng hợp gellan [15].
Sphingomonas sp. là vi khuẩn gram âm, hình que có kích thước 0,3-0,8 x 1,0-2,7
µm, khuẩn lạc có màu vàng, màu cam hoặc màu trắng không bào tử, bề mặt khuẩn lạc có
dạng nhầy, phản ứng oxidase dương tính, dị dưỡng, hiếu khí hoàn toàn và sinh sắc tố vàng.
7


Sphingomonas sp. có khả năng di động nhanh nhờ các lông roi và đa số có khả năng phát
quang dưới ánh sáng cực tím [21].
Vi khuẩn Sphingomonas được tìm thấy trong môi trường tự nhiên như trong nước,
trong đất và trong hệ thống rễ cây [76]. Nhiều tài liệu cho thấy, Sphingomonas sp. có thể
tồn tại trong nhiều môi trường sống khác nhau là do chúng có khả năng sử dụng đa dạng
nguồn cơ chất, phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 28 - 32oC và trong điều kiện thiếu dinh
dưỡng. Vi khuẩn này sử dụng glucose và một số loại đường khác cho sự sinh trưởng và
phát triển.
1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan
Con đường sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis là một quá trình khá phức
tạp, có thể chia ra làm 3 bước chính như sau: (a) sinh tổng hợp nội bào các tiền chất đường,
(b) lắp ráp các tiểu phần lặp lại tetrasaccharide, (c) quá trình polymer hóa và tiết gellan

thông qua màng ngoại bào (hình 1.4).
a/ Sinh tổng hợp tiền chất đường nucleotide: quá trình sinh tổng hợp gellan bắt đầu với
sự tổng hợp các tiền chất đường đơn như UDP-D-glucose, UDP-D-glucuronic acid và
dTDP-L-rhamnose. Các enzyme cần thiết cho quá trình này gồm phosphoglucomutase
(PgmG), UDP glucose pyrophosphorylase (UgpG), UDP-glucose dehydrogenase (UgdG),
TDP-glucose pyrophosphorylase (RmlA), dTDP-D-glucose-4,6-dehydratase (RmlB),
dTDP-6-deoxy-D-glucose-3,5-epimerase

(RmlC)

và

dTDP-6-deoxy-L-mannose

dehydrogenase (RmlD). Glucose-1-P giữ vai trò quan trọng, trung gian cho 2 con đường
sinh tổng hợp dTDP-L-rhamnose và UDP-D-glucuronic acid [29].
b/ Lắp ráp tiểu phần tetrasaccharide: sau quá trình hình thành các tiền chất đường là sự
hình thành các tiểu phần lặp lại. Các gen thuộc cụm gen khác nhau đã được tìm thấy tham
gia xúc tác vào quá trình hình thành gellan, vào quá trình sinh tổng hợp dTDP-L-Rha, các
glycosyltransferase, các protein có mặt trong quá trình polymer hóa và vận chuyển gellan.
Do gellan là polysaccarit ngoại bào được tổng hợp bên trong màng tế bào và sau đó được
tiết ra ngoài màng tế bào.
Các tiểu phần lặp lại tetrasaccharid được lắp ráp vào chất mang lipid nhờ sự xúc tác
của các glycosyltransferase đặc hiệu. Glycosyltransferase, vận chuyển glucose-1-phosphate
từ UDP-Glc đến chất mang lipid. Gốc đường thứ 2 thêm vào là glucuronic acid, từ UDPglucuronic acid. Các gốc đường thứ 3 và thứ 4 (glucose và rhamnose) được thêm vào các
tiểu phần lặp lại, sự xúc tác tương ứng nhờ các enzyme GelL và GelQ. Cuối cùng, việc lắp

8

ráp các đơn vị lặp lại được hoàn thành khi các nhóm acetate và glycerate gắn vào gốc
glucose đầu tiên nhờ enzyme acetyltransferase và glyceryltransferase, theo thứ tự [29].
c/ Quá trình polymer hóa và tiết gellan thông qua màng ngoại bào: bước tiếp theo trong
quá trình sinh tổng hợp gellan là quá trình polymer hóa những tiểu phần lặp lại để chúng
thành dạng chuỗi dài hơn. Độ dài của chuỗi gellan được quyết định bởi các enzyme thuộc
họ PCP (polysaccarit co-polymerase), được mã hóa bởi các gen gel C và gel E [63].
Bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp là sự tiết gellan ra ngoài màng tế bào.
Trong S. paucimobilis ATCC 31.461, quá trình này được thực hiện nhờ các protein trung
gian nằm ở lớp ngoài màng hay còn gọi là các protein phụ trợ, mã hóa bởi gen gelD. Các
protein này sẽ hình thành kênh protein nơi các chuỗi polysaccarit có thể tiếp cận với màng
tế bào [22].

Hình 1.4. C chế sinh tổng hợp gell n [22, 17]

1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis
Động học quá trình sinh trưởng của S. paucimobilis cũng tương tự như các vi sinh
vật khác đều trải qua lần lượt 4 giai đoạn: tiềm phát, logarit, cân bằng và suy vong. Chủng
S. paucimobilis đã được ghi nhận là loài có khả năng tiết ra một chất nhầy (gellan) bao

9


quanh tế bào như một tác nhân bảo vệ trong quá trình sinh trưởng và duy trì của chúng.
Lượng chất này sẽ thay đổi theo chu kỳ phát triển của vi khuẩn. Sau 6h lên men, tốc độ tạo
sinh khối diễn ra mạnh mẽ và đạt cực đại ở khoảng 24h. Năng suất gellan cũng tăng đáng
kể và đạt cao nhất ở giờ lên men thứ 60 và sau đó có xu hướng ổn định. Ở pha suy vong có
thể một lượng nhỏ polyme bị phân hủy do vi khuẩn sinh enzym zhamnose lyzae làm thủy
phân gellan. Kanar và cộng sự đã báo cáo rằng, 48h đầu là thời gian tối ưu cho sản xuất
gellan bởi S. paucimobilis. Wang và cộng sự đã quan sát thấy hàm lượng gellan đạt tối ưu
sau 56 giờ lên men. Jin và cộng sự cũng đã chỉ ra 50 giờ đầu là thời gian tối ưu cho việc

sản xuất gellan. Thời gian và tốc độ sinh trưởng và phát triển phụ thuộc vào đặc tính của
chủng giống khác nhau [28, 29, 101]. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan từ chủng S.

Sinh khối (g/l)

Hàm lượng gellan (g/l)

paucimobilis ATCC 31.461 được cho ở hình 1.5. [101].

Hàm lượng gellan
Sinh khối

Hình 1.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gell n từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 [101]

Từ con đường sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis cho thấy vai trò của nguồn
tiền chất cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp gellan. Nó ảnh hưởng
xuyên suốt đến quá trình hình thành gellan. Sự tiết nhiều polysaccarit ngoại bào này cũng
được nhận thấy khi vi khuẩn được cung cấp nhiều cacbon và nồng độ nitơ tối thiểu [100].
Điều này có thể do nguồn đường là thành phần cấu tạo nên gellan còn nguồn nitơ chỉ cần
cấp một lượng vừa đủ để tạo sinh khối, khi môi trường cạn nguồn nitơ, vi khuẩn chuyển
sang pha cân bằng, quá trình sinh tổng hợp gellan sẽ được kích thích nhằm bảo vệ chúng.
Một điều nữa, với các chủng S. paucimobilis sp khi tăng sinh khối sẽ đồng thời tăng
khả năng tích lũy gellan, do vậy trong những điều kiện nhất định về thành phần môi
10


trường, pH, nhiệt độ nuôi thì yếu tố không thuận lợi cho tạo gellan là việc cấp thiếu oxy.
Lượng oxy cấp không đủ sẽ ức chế sự sinh trưởng của chủng, dẫn tới giảm sản lượng gellan.
Quá trình polymer hóa gellan cũng cần hoạt hóa tiền chất trước khi lắp ráp đơn vị
lặp lại. Năng lượng cần thiết đó là UDP và ADP có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan.

Trong nghiên cứu của Bajaj và cộng sự 2006, khi sử dụng tinh bột tan trong môi trường
nghiên cứu thì nồng độ ADP và UDP được tối ưu hóa cho sản xuất gellan ở mức 1 mM đã
cho năng suất gellan cao nhất là 32,15 g/1 [15,63].
Tóm lại, gellan được tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn S. paucimobilis sp. Khả
năng sinh tổng hợp gellan mạnh hay yếu tùy thuộc khá nhiều vào đặc điểm và các tính chất
sinh lý, sinh hóa của từng chủng. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn hay cải biến các chủng
có khả năng sinh gell n c o luôn giành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.
Mặt khác, là sản phẩm tr o đổi bậc h i và được tích lũy ng y từ pha logarit và kéo dài qua
pha cân bằng. Đây là điểm cần lưu ý khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng
sinh tổng hợp gellan, vừ tìm các điều kiện thích hợp cho việc tăng sinh khối vừ đảm bảo
các điều kiện tối thiểu cho duy trì chủng.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL
1.2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan
1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống
Chiều dài của pha logarit thường bị ảnh hưởng bởi lượng giống và tuổi giống. Do đó,
chất lượng giống (tuổi giống cấp, tỷ lệ giống) là một thông số cần quan tâm khi nghiên cứu
sinh tổng hợp gellan.
Nghiên cứu của Ashok Pandey và cộng sự [65] đã khảo sát thời gian lên men từ 12
giờ - 96 giờ cho sản xuất gellan và xác định được lượng gellan đạt cao nhất sau 48 giờ lên
men. Theo tác giả, gellan được hình thành ở pha sinh trưởng và tiếp tục được tạo ra nhiều ở
pha cân bằng, sự tăng trưởng tế bào đồng thời sinh tổng hợp gellan cũng được hình thành.
Để lựa chọn giống khỏe mạnh, Nampoothiri và cộng sự tiến hành tiếp giống ở các
tuổi giống (8, 12, 16, 20 và 24 giờ). Kết quả đã thu lượng gellan tối đa là 22,3 g/l khi cấp giống
ở tuổi giống 20 giờ. Cũng với kết quả nghiên cứu về các tỷ lệ tiếp giống (1, 2, 4, 6, 8 và 10%),
lượng gellan cao nhất đã thu được ở tỉ lệ giống 10%. Nhìn chung các nghiên cứu thường sử dụng
6 -10% giống và tuổi giống ở 18 - 24 giờ là thích hợp cho lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng
S. paucimobilis sp. [14, 15, 17, 37, 65].
1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
Nguồn cacbon

11


Nhiều công trình nghiên cứu nâng cao sản lượng gellan từ chủng vi khuẩn
Sphingomonas sp trên các nguồn cacbon khác nhau đã được công bố. Giavasis, Lobas và
West đã cho thấy, vi khuẩn này có khả năng tổng hợp gellan trên các nguồn cacbon khá đa
dạng như glucose, sucrose, lactose, mannose, galactose, fructose, maltose, rỉ đường, xiro
ngô, tinh bột tan...Hàm lượng sử dụng khác nhau tùy chủng và điều kiện lên men khác
nhau, thường dao động trong khoảng 2 - 4% [30, 55, 94].
Banik và cộng sự năm 2007 đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung khác
nhau vào môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng vi khuẩn S.
paucimobilis ATCC 31461. Trong số 20 chất thử nghiệm, rỉ đường, trypton, casamino
acid, disodium hydrogen orthophosphate và manganese chloride có ảnh hưởng lớn đến khả
năng sinh tổng hợp gellan. Khi nuôi cấy chủng này trên môi trường có thành phần rỉ đường
112.5 g/l, trypton: 1 g/l, axit casamino: 1 g/l, disodium hydrogen orthophosphate: 1 g/l và
manganese chloride: 0.947 g/l đã cho sản lượng gellan cao nhất đạt 13,81 g/l [17].
Cũng với chủng trên (S. paucimobilis ATCC 31461), Nampoothiri và Bajaj đã thử
nghiệm bổ sung riêng lẻ 2% các nguồn cacbon như tinh bột tan, lactose, glucose, sucrose
và maltose vào môi trường lên men lại tìm được tinh bột tan là nguồn cacbon tốt nhất cho
sản lượng gellan đạt tới 24 -28 g/l [14, 65].
Bajaj và cộng sự năm 2006 đã chứng minh, cacbon không chỉ đóng vai trò như một
thành phần chính cho việc xây dựng tế bào, mà còn được sử dụng trong quá trình tổng hợp
polysaccharit. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau đến sản
xuất gellan đã cho thấy, ở nguồn carbon thích hợp không những hỗ trợ trong sản xuất tối
đa sinh khối mà còn trong sản xuất gellan và ngược lại. Sau 48 giờ lên men, môi trường tối
ưu thu được khi sử dụng tinh bột hòa tan đã cho hàm lượng sinh khối và gellan cao nhất
lần lượt là 0,46 g/l và 19,32 g/l [14].
Nhóm nghiên cứu của Zhang (2015) khi thử nghiệm với chủng S. paucimobilis
QHZJUJW CGMCC2428 lại chỉ ra sucrose là nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh tổng
hợp gellan đạt 19,89 g/l sau 72 giờ lên men. Theo đó, môi trường tối ưu được sử dụng với

nguồn sucrose 40g/l, peptone 3g/l, MgSO4 3,2 g/l, Na2HPO4 7,5 g/l, KH2PO4 9,2 g/l,
K2SO4 4,3 g/l, với pH 7 [100].
Qua các nghiên cứu cho thấy, tùy vào đặc tính chủng cũng như thông số và điều
kiện lên men cụ thể mà mỗi thực nghiệm sẽ có thông số lên men tối ưu khác nhau. Tuy
nhiên, các nguồn cacbon từ glucose, tinh bột tan, maltose, saccarose, lactose là nguồn
cacbon thông dụng, an toàn cho hiệu quả tốt trong sinh tổng hợp gellan.

12


Nguồn nitơ
Nhìn chung nguồn nitơ, nồng độ nitơ và tỉ lệ C/N đều có ảnh hưởng tới sự phát
triển sinh khối và sự tạo thành sản phẩm. Dreveton và cộng sự (1996) cho rằng nguồn nitơ
thúc đẩy sự phát triển tế bào và sinh tổng hợp gellan là nguồn nitơ hữu cơ như nước chiết
ngô và các nguồn nitơ vô cơ như ammonium nitrate và potassium nitrate. Nampoothiri và
cộng sự (2003) đã so sánh các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau cho sản xuất gellan
từ chủng vi khuẩn S.paucimobilis ATCC 31461, sản lượng gellan đạt cao nhất khi bổ sung
trypton vào môi trường lên men (là 32,1 g/l). Cũng với chủng trên, Bajaj và cộng sự (2006
và 2007) đã chỉ ra, nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho hỗ trợ sinh tổng hợp gellan còn các
nguồn nitơ vô cơ chỉ hỗ trợ sản xuất sinh khối, nhưng không thể tăng sản lượng gellan. Vì
các nguồn nitơ hữu cơ còn chứa các axit amin và vitamin, nên có thể giả định rằng các
thành phần này có thể chịu trách nhiệm cải thiện năng suất của gellan. Trong số các nguồn
nitơ khác nhau được sử dụng, chỉ có chiết xuất men và peptone được tìm thấy là hữu ích.
Chiết xuất nấm men đã hỗ trợ sản xuất gellan tối đa (19,82 g/1), trong khi peptone cho
năng suất gellan đạt 18,18 g/1 vào cuối 48 giờ lên men [15, 26, 65].
Thử nghiệm của West và Strohfus (1998) lại cho thấy ngô, đậu tương có thể được sử
dụng như là nguồn nitơ để sản xuất gellan góp phần giảm giá thành của sản phẩm [94].
Tương tự Hyuck và cộng sự (2003) đã sử dụng bactopeptone và chất chiết đậu tương cho
sản xuất gellan từ vi khuẩn S.paucimobilis NK 2000, sản lượng gellan đạt 3,27 và 7,33 g/l [37].
Ngoài nguồn cacbon và nitơ thông thường, môi trường sản xuất gellan thường được

bổ sung thêm một số vitamin và axit amin để kích thích tăng sự phát triển của tế bào và
sinh tổng hợp gellan. Theo nghiên cứu của Bajaj và cộng sự năm 2006, trong số các axit
amin được nghiên cứu: L- valine, L- tryptophan, L- isolucine, L- threonine, L- glutamine,
L- leucine, L- lysine, L- cystine hoặc L- arginine thì tryptophan và threonine đã được tìm
thấy là có khả năng tăng sản lượng gellan nhất, năng suất gellan thu được tương ứng là
39,5 g/l và 36,4 g/l khi bổ sung ở nồng độ 0,05%. Tác giả cho rằng, threonine và
tryptophan đã ảnh hưởng đến chuyển hóa của các nguồn carbon trong sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis ATCC 31461. Khẳng định này, dựa trên kết quả thí nghiệm về cân bằng
nguồn carbon trong sinh tổng hợp gellan sử dụng tinh bột làm chất nền để sản xuất
polysaccharit. Môi trường lên men không bổ sung axit amin (Đối chứng), hàm lượng
gellan thu được 28,55 g/l và hiệu suất chuyển hóa cacbon chỉ đạt 67%. Với môi trường
được bổ sung axit amin đã làm tăng hiệu suất chuyển hóa cacbon lên 88%. Điều đó là do
sự giảm đáng kể lượng carbon tiêu hao để tạo carbon dioxide ở các phản ứng dị hóa trong

13


con đường sinh tổng hợp gellan, cũng đồng nghĩa là làm tăng lượng carbon tham gia vào
hình thành các phân tử đường đơn [14, 15].
1.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí
Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH
Ảnh hưởng của nhiệt độ trong sản xuất gellan từ vi khuẩn S. paucimobilis đã được
một số tác giả công bố. Dreveton và cộng sự (1996) cho rằng yếu tố nhiệt độ lên men đã
ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và sinh tổng hợp gellan, khi nhiệt độ lên men duy trì
ở 25oC sản lượng gellan chỉ được 16,2 g/l, còn khi nhiệt độ lên men là 30oC sản lượng
gellan đạt 24 g/l ở chủng S. paucimobilis [26]. Với nghiên cứu của West (2003) cũng đã
chứng minh, chủng S.paucimobilis ATCC 31461 đã cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao
nhất ở dải nhiệt độ 30 và 31oC sau 72 giờ lên men [92].
Mỗi chủng vi sinh vật có thể phát triển ở dải các giá trị pH khác nhau, khi thay đổi
pH môi trường, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật cũng bị thay đổi. Tại giá trị pH môi

trường tối ưu, vi sinh vật sẽ có tốc độ sinh trưởng và phát triển lớn nhất. Nhìn chung, giá trị
pH tối ưu cho sản xuất polysaccarit ngoại bào từ vi khuẩn thường cao hơn so với từ nấm. Giá
trị pH thích hợp cho sản xuất gellan nằm trong khoảng 6,5 - 7,0 [26, 28, 42]. Môi trường
nhiều axit hoặc kiềm sẽ làm giảm sự phát triển tế bào và sản lượng gellan.
Ảnh hưởng của điều kiện cấp khí
Nhiều nghiên cứu cho thấy S. paucimobilis sinh tổng hợp gellan cùng với quá trình
sinh trưởng và phát triển của chúng. Nếu kiểm soát tốc độ cấp khí tốt sẽ thúc đẩy quá trình
tăng trưởng diễn ra mạnh mẽ và sẽ kéo theo quá trình sinh tổng hợp gellan cũng được tăng
cường. Do vậy, việc cấp khí cho môi trường lên men được đặc biệt quan tâm trong quá trình
sinh tổng hợp gellan.
Dreveton và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sản
lượng của gellan. Quá trình lên men được tiến hành trên hệ thống 14 lít ở nhiệt độ nuôi cấy
duy trì 30oC và pH 6,5. Ở tốc độ khuấy 250 vòng/phút là thích hợp cho quá trình lên men,
ở tốc độ khuấy thấp hơn lượng sinh khối tạo thành ít và gellan tạo được cũng không nhiều.
Giavasis và cộng sự (2006) cũng đã chứng minh ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thông khí
đến khối lượng phân tử và sinh tổng hợp gellan từ vi khuẩn S. paucimobilis cho rằng: với
tốc độ thông khí cao và khuấy mạnh sẽ làm tăng sự phát triển của vi khuẩn S.paucimobilis.
Nồng độ gellan cao nhất có thể thu được ở tốc độ khuấy 500 vòng/phút với độ thông khí 1-2
v/v/ph (12,4 g/l gellan) [26, 30].

14


Kiểm soát tốc độ khuấy và oxy hòa tan là quan trọng trong quá trình lên men hiếu
khí, đặc biệt trong sản xuất polysaccarit. Mức độ oxy hòa tan trên 10% cho thấy không ảnh
hưởng nhiều đến sinh trưởng của vi khuẩn S. paucimobilis. Ở mức độ 10%, giới hạn oxy
đã dẫn đến lượng sinh khối tạo thành thấp (3.2 g/l). Ở tốc độ lắc tối đa, mức độ oxy hòa tan
hoạt động như một lực đẩy để tăng tỉ lệ hấp thu oxy của các tế bào, dẫn đến tăng sản xuất
gellan. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Dreventon và cộng sự (1996), các điều kiện
vận chuyển oxy cao thuận lợi cho sản xuất gellan. Phân tích thành phần hóa học của gellan

ở mức độ oxy hòa tan cao cũng cho thấy sự giảm hàm lượng acetyl và tăng hàm lượng
glyceryl của polymer, không thấy sự thay đổi đáng kể về hàm lượng glucose, rhamnose và
axit glucuronic trong phân tử gellan.
Sinh trưởng của vi khuẩn S. paucimobilis liên quan mật thiết với tốc độ lắc. Sinh
khối cao nhất 4.5 g/l đạt được ở 1000 vòng/phút, trong khi đó sinh khối không quá 3.4 g/l
quan sát được ở 500 vòng/phút và độ thông khí 1 v/v/ph. Khi tốc độ lắc giảm (250
vòng/phút, 1 v/v/ph) sự tích lũy sinh khối cũng giảm.
Trong những năm gần đây, để nâng cao sản lượng gellan từ lên men vi sinh vật
trong những thiết bị khó cung cấp oxy thông qua cánh khuấy hay sục khí, các nhà khoa học
đã quan tâm đến việc bổ sung hydrogen peroxide (H2O2) vào quá trình sản xuất gellan.
Tăng cường hiệu quả cấp oxi cho khối dịch lên men nhờ H2O2 khắc phục hiện tượng dính
nhớt do chính gellan gây ra. Zhu và cộng sự năm 2014 đã báo cáo H2O2 có khả năng cải
thiện việc sinh tổng hợp các polysaccarit. Đây là biện pháp tăng cường oxy cung cấp cho
vi khuẩn dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2 trong dịch lên men. Tuy nhiên, nồng độ
H2O2 quá mức lại là một trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến
việc ức chế sự phát triển của tế bào cũng như sinh tổng hợp gellan. Thí nghiệm được thiết
kế dựa trên đường cong sinh trưởng chủng nghiên cứu, kết hợp việc sử dụng một dải nồng
độ H2O2 khác nhau. Kết quả cho thấy năng suất sản xuất gellan đạt tối đa (22,52 g/l) ở các
nồng độ H2O2 : 2, 2, 3, 4 mM được bổ sung tương ứng ở các mốc thời gian 6, 12, 18, 24 giờ
trong pha logarit và hiệu suất sinh tổng hợp gellan cũng được tăng lên 35,58%. Bên cạnh đó,
tác giả cũng đã chỉ ra việc bổ sung H2O2 ở chế độ này đã làm tăng hoạt tính của các enzyme
UDP-glucose pyrophosphorylase và glucosyltransferase là những enzyme tham gia quá trình
sinh tổng hợp gellan [101].
1.2.1.4. Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan
Bản chất của quá trình sinh tổng hợp gellan từ Sphingomonas sp. đã được làm sáng
tỏ [22, 15]. Quá trình tổng hợp này gồm nhiều giai đoạn và nhiều thành phần tham gia, do

15