Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase, nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và một số đặc tính của laccase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC
CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP LACCASE,
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY
VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ:

LÊ HỒNG NGA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS. TS. ĐẶNG THỊ THU

HÀ NỘI 2007


1

MỤC LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... 4
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 5
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ........................................................................ 6
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 9
1.1. Laccase ................................................................................................... 9
1.2. Các nguồn thu laccase (EC 1.10.3.2) ..................................................... 9
1.2.1. Laccase vi sinh vật .......................................................................... 9
1.2.2. Laccase từ thực vật........................................................................ 10

1.3. Cấu tạo của laccase .............................................................................. 11
1.3.1. Khối lượng phân tử. ...................................................................... 11
1.3.2. Cấu trúc khơng gian ...................................................................... 12
1.4. Đặc tính của laccase ............................................................................. 14
1.4.1. Các chất ức chế hoạt tính laccase.................................................. 14
1.4.2. Tính đặc hiệu cơ chất .................................................................... 15
1.4.3. Nhiệt độ và pH tối ưu.................................................................... 15
1.4.4. Điểm đẳng điện (pI) ...................................................................... 16
1.4.5. Km và Vmax ..................................................................................... 16
1.4.6. Các isozym .................................................................................... 19
1.5. Cơ chế xúc tác của laccase................................................................... 20
1.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến khả năng sinh tổng hợp laccase 23
1.6.1. Nguồn cacbon................................................................................ 23
1.6.2. Nguồn nitơ..................................................................................... 24
1.6.3. Nguồn khoáng ............................................................................... 24
1.6.4. Chất cảm ứng ................................................................................ 26
1.6.5. Chất kìm hãm ................................................................................ 27


2
1.6.6. Nhiệt độ ......................................................................................... 27
1.6.7. pH .................................................................................................. 28
1.7. Ứng dụng của laccase........................................................................... 28
1.7.1. Ứng dụng của laccase trong chất tẩy trắng sinh học.................... 28
1.7.2. Ứng dụng của laccase trong việc làm giảm thiểu ô nhiễm môi
trường bằng phương pháp sinh học......................................................... 30
1.7.3. Ứng dụng tạo nguồn nguyên liệu mới .......................................... 32
1.7.4. Những ứng dụng trong một số lĩnh vực khác ............................... 33
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................... 34
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu......................................................... 34

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 34
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................ 34
2.1.3. Thiết bị sử dụng ............................................................................ 34
2.1.4. Môi trường. ................................................................................... 35
2.2. Phương pháp......................................................................................... 36
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật................................................................ 36
2.2.2. Phương pháp hóa sinh – phương pháp xác định hoạt tính laccase38
2.2.3. Phương pháp định tên nấm mốc.................................................... 38
2.2.4. Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm..................................................................................................... 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 45
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính laccase ........... 45
3.1.1. Phân lập các chủng nấm mốc bằng phương pháp tách khuẩn lạc. 45
3.1.2. Tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính laccase bằng phương pháp
sàng lọc trên đĩa thạch............................................................................. 45
3.1.3. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase bằng phương
pháp ni cấy chìm ................................................................................. 50


3
3.2. Định tên chủng BB19_3....................................................................... 52
3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy sinh tổng hợp
laccase ......................................................................................................... 55
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống. ...................................... 55
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon. ....................................... 56
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose..................................... 57
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ.............................................. 58
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nitơ .......................................... 59
3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng ......................................... 59
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng ........................... 60

3.3.8. Khảo sát ảnh hưởng của CuSO4 ................................................... 61
3.3.9. Khảo sát ảnh hưởng của pH đầu ................................................... 62
3.3.10. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi........................................ 63
3.4. Tối ưu hố mơi trường ni cấy sinh tổng hợp laccase từ BB19_3 .... 64
3.5. Khảo sát động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp laccase từ
chủng BB19_3 trên môi trường nuôi cấy với điều kiện tối ưu ................... 68
3.6. Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4, ethanol kết tủa laccase......................... 70
3.7. Xác định một số đặc tính của laccase từ BB19_3................................ 72
3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính laccase............................... 72
3.7.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính laccase ....................................... 73
3.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của laccase ......................... 74
3.7.4. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của laccase ................................. 75
KẾT LUẬN .................................................................................................... 76
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 78
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 83


4

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2’-azino-bis (3-etylthiazolin-6 sunfonat)

BB

Ba Bể

BV

Ba Vì

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

EPR

Electroparamagnetic resonance

ITS

Internal transcribed spacer

kDa

Kilodalton

MEA

Malt Extract Agar

MT

Môi trường

PCR

Polymease chain reaction

PDA

Potato Dextrose Agar

PSC

Pusamcap

RBBR

Remazol Brilliant Blue R

RCP

Rừng Cúc Phương

TE

Tris-EDTA

VA

Veratryl alcohol


5

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Khối lượng phân tử và số lượng isozym của laccase từ một số
chủng nấm mốc
Bảng 1.2. Một vài đặc tính của laccase từ một số chủng vi sinh vật
Bảng 2.1. Ma trận thực nghiệm
Bảng 2.2. Ma trận giả định thực hiện tối ưu
Bảng 3.1. Số lượng các mẫu và chủng nấm mốc thu được từ quá trình phân
lập
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc các chủng nấm mốc phân lập được trên các môi
trường khác nhau
Bảng 3.3. Số lượng các chủng có hoạt tính laccase qua các bước sàng lọc
Bảng 3.4. Hoạt độ laccase của các chủng nấm mốc phân lập được
Bảng 3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào của các chủng
nấm mốc
Bảng 3.6. Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp laccase
Bảng 3.7. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh tổng hợp laccase
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ nguồn nitơ đến khả sự tổng hợp laccase
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng khác nhau đến sự sinh tổng hợp
laccase
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng sinh tổng hợp laccase
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp laccase
Bảng 3.12. Các mức thí nghiệm
Bảng 3.13. Ma trận thực nghiệm và kết quả
Bảng 3.14. Kiểm tra sự tương ứng của mơ hình theo tiêu chuẩn Fisher

Bảng 3.15. Ma trận điều kiện tối ưu
Bảng 3.16. Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp thu chế phẩm laccase
Bảng 3.17. Khảo sát nồng độ ethanol thích hợp thu chế phẩm laccase


6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Chu trình xúc tác của laccase
Hình 1.2. Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces
Hình 1.3. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase
Hình 1.4. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần khơng có bản chất phenol (nonphenolic) của lignin bởi laccase và ABTS
Hình 1.5. Mơ hình oxy hóa trung gian các cơ chất của laccase
Hình 3.1. Kết quả sàng lọc trên mơi trường MEA có sử dụng axit tanic làm
chất chỉ thị
Hình 3.2. Kết quả sàng lọc trên mơi trường RBBR của chủng BB13_2
Hình 3.3. Kết quả sàng lọc lần 2 với cơ chất đặc hiệu là Syringaldazine và
ABTS
Hình 3.4. Kết quả chạy điện di kiểm tra sản phẩm DNA sau tinh sạch.
Hình 3.5. Đặc điểm hình thái hệ sợi của BB19_3 dưới kính hiển vi điện tử (độ
phóng đại 400 lần)
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp laccase.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến khả năng tổng hợp laccase
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng veratryl alcohol tới sự sinh
tổng hợp laccase
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến khả năng sinh tổng hợp laccase
Hình 3.10. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp laccase của chủng
BB19_3.
Hình 3.11. So sánh các tác nhân kết tủa laccase
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính laccase

Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính laccase
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của laccase
Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH tới tính bền laccase


7

MỞ ĐẦU
Laccase (EC 1.10.3.2) là một polyphenol oxidase chứa nguyên tử đồng
trong trung tâm xúc tác và thường được gọi là polyphenol oxydase đa đồng.
Laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các
gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon. Phản ứng oxy hóa gắn liền
với sự khử phân tử oxy tạo thành nước. Khả năng oxy hóa hợp chất phenol
của laccase đánh dấu bước phát triển của ngành công nghệ enzym [38, 40].
Trong tự nhiên, laccase thu được từ nhiều nguồn khác nhau như từ vi
khuẩn, nấm mốc, thực vật và các loại côn trùng, nhưng laccase được phân bố
chủ yếu ở thực vật bậc cao và nấm mốc như Trametes versicolor, Coprinus
cinereus, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus [31].
Laccase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bao gồm tẩy trắng
giấy, tẩy màu của thuốc nhuộm vải và loại bỏ hợp chất phenol trong rượu
[36]. Phổ ứng dụng của laccase được mở rộng bằng việc kết hợp laccase với
các chất trung gian (mediator) làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp
chất khơng có bản chất phenol (non-phenol). Ngồi ra, laccase cịn có một số
ứng dụng khác trong việc phát hiện và loại bỏ các hợp chất phenol gây ô
nhiễm môi trường, ứng dụng trong việc xử lý phụ phẩm của sản phẩm nơng
nghiệp để tạo ngun liệu cho các q trình khác.
Laccase có rất nhiều ứng dụng nên vấn đề đặt ra là cần phải tìm được
các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp laccase cao, góp phần làm
giảm giá thành trong các quá trình sản xuất liên quan đến laccase. Vì vậy,
chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc

có khả năng sinh tổng hợp laccase, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và một
số đặc tính của laccase”.


8
Nội dung của đề tài :
- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính laccase cao
- Tìm điều kiện thích hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp laccase
- Tối ưu hóa điều kiện ni cấy
- Khảo sát động thái quá trình lên men sinh tổng hợp laccase
- Khảo sát khả năng kết tủa và nghiên cứu một số đặc tính laccase


9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Laccase
Laccase (EC 1.10.3.2) là enzym chứa một hoặc nhiều nguyên tử đồng
có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol thành quinin
và sau đó oxy hóa tiếp thành quinon (Gimbert). Laccase xúc tác trong phản
ứng oxy hóa với thế oxy hóa khử có thể lên tới 0,8V. Số lượng đồng trong
laccase biến động từ hai đến bốn nguyên tử tùy thuộc vào từng loại laccase.
Tất cả laccase từ thực vật, vi sinh vật đều là glycoprotein (với mức độ
glycosyl hóa từ 22%- 45%) và có bốn nguyên tử đồng trong mỗi phân tử [25].
Laccase từ những nguồn khác nhau thì rất khác nhau ở mức độ glycosyl hóa,
khối lượng phân tử và đặc tính động học [41].
1.2. Các nguồn thu laccase (EC 1.10.3.2)
Laccase là một trong số ít những enzym được biết đến từ thế kỷ XIX.
Năm 1883, Yoshida (Nhật) lần đầu tiên phát hiện laccase khi ông chiết nó từ
dịch chiết của cây gỗ lacquer Rhus vernicifera và năm 1896 laccase đã được

Bertrand và Laborde tìm thấy từ nấm mốc [27, 38].
Phần lớn các nguồn thu laccase đều có trong các chủng nấm mốc có khả
năng phân hủy lignin, được biết đến nhiều nhất là trong các loài nấm đảm.
Ngoài ra, trong thực vật như là Rhus vernicifera cũng có khả năng sinh ra
laccase. Ở một số lồi vi khuẩn cũng có hoạt tính laccase [19].
1.2.1. Laccase vi sinh vật
* Laccase từ nấm mốc:
Laccase được phân lập từ Ascomyceteous, Deuteromycetous, và nấm
Basidiomeeteous nhưng các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào
Basidiomeeteous [7].


10
Hoạt tính của laccase thể hiện ở sự phân hủy lignin và chúng được tìm
thấy nhiều trong các chủng nấm đặc biệt là nấm mục trắng có khả năng phân
hủy lignin cao [24]. Đã có hơn 100 loại laccase được tinh chế từ nấm mốc và
xác định được các đặc tính xúc tác và các đặc tính sinh hóa đặc hiệu của
chúng. Các chủng nấm mốc có khả năng sinh laccase tốt nhất được biết đến
như là Botrytis cinerea, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus
Trametes versicolor, Coprinus cinereus và Melanocarpus albomyces. Vai trị
của laccase từ nấm mốc ngồi khả năng phân giải lignin, cịn có một số chức
năng liên quan đến sự hình thành sắc tố, sự hình thành bào tử, tính gây bệnh
và sự giải độc [28].
Laccase có vai trị quan trọng trong quá trình phát triển quả thể của
nấm. Năm 1999, Gianfreda cho rằng hoạt tính của laccase tăng trong suốt quá
trình hình thành quả thể. Đồng thời, laccase cũng xuất hiện trong quá trình
phát triển sợi nấm của Amillaria mellea, khi bổ sung chất ức chế laccase thì
quá trình phát triển của Amillaria mellea bị giảm hẳn [19].
* Laccase từ vi khuẩn:
Laccase từ vi khuẩn không phổ biến. Tuy nhiên, trong một số nghiên

cứu cũng cho thấy có một vài lồi vi khuẩn có khả năng sinh laccase như là:
Azospirillum lipoferum, Sinorhizobium meliloti, Bacillus subtilis [28].
1.2.2. Laccase từ thực vật
Laccase thực vật đầu tiên được tìm thấy từ Rhus vernicifera. Sau đó,
laccase được thu nhận từ bắp cải, củ cải, củ cải đường, táo, măng tây, khoai
tây, quả lê và các loại rau quả khác [27].
Laccase thực vật đóng vai trị trong sự hình thành thân gỗ. Ngồi ra nó
cịn có vai trị polyme hóa các monolignol hình thành các dimer và trimer
trong q trình lignin hóa (Bertrand và cộng sự, 2002). Vai trò này của


11
laccase cũng được Mayer và Staples năm 2002 đề cập đến trong
Anacardiaceae [10].
1.3. Cấu tạo của laccase
1.3.1. Khối lượng phân tử.
Laccase có khối lượng phân tử (MW) từ 60 kDa đến 80 kDa, tuy nhiên
vẫn có một vài ngoại lệ như laccase từ Monocillium indicum có khối lượng
phân tử là 100 kDa, từ Agaricus bisporus là 100 kDa và từ Aspergillus
nidulans có khối lượng phân tử là 110 kDa [37].
Có nhiều cơng bố chỉ ra rằng mỗi lồi nấm mốc riêng biệt có thể cho
nhiều loại isozym (bảng 1.1). Sự thay đổi điều kiện trong q trình ni cấy
sinh tổng hợp laccase có thể cho những isozym khác nhau của cùng một
chủng nấm mốc [11 ,16].
Bảng 1.1. Khối lượng phân tử và số lượng isozym laccase từ một số
chủng nấm mốc [31]

Podospora anserina

3

Khối
lượng
phân tử
(Kda)
70/80/390

Neurospora crassa

1

65

Germann và cộng sự, 1988

Agaricus bisporus

2

65/100

Perry và cộng sự, 1993

Botrytis cinerea

2

72

Thurston, 1994

Phlebia radiata

1

64

Saloheimo và cộng sự, 1991

Armillaria mellea

1

80

Curir và cộng sự, 1997

Monocillium indicum

1

72

Thakker và cộng sự, 1992

Pleurotus ostreatus

3

54/59/57

Palmieri và cộng sự, 1997;

Phanerochaete

1

94

Perez và cộng sự, 1996

Chủng

flavido-albans

Số
lượng
isozym

Tài liệu tham khảo
Thurston, 1994


12
Rhizoctonia solani

4

50-100

Wahleitner và cộng sự, 1996

Pleurotus ostreatus

1

67

Giardina và cộng sự, 1999

2

71/68

Fukishima và Kirk, 1995

1

81

Eggert và cộng sự, 1996

Coriolus hirsutus

1

80

Shin và Kim, 1998

Pycnoporus

1

63

Schliephake và cộng sự, 2000

Trametes villosa

1

63

Yaver và cộng sự, 1996

Trichoderma

1

71

Assavanig và cộng sự, 1992

Marasmius

2

RK 36
Ceriporiopsis

subvermispora
Pycnoporus
cinnabarinus

cinnabarinus

Farnet và cộng sự, 2000

quercophilus
Pleurotus ostreatus

2

67/16-17

Giardina P và cộng sự, 2007

Pleurotus ostreatus

4

80-82

Mariana Mansur và cộng sự

1.3.2. Cấu trúc không gian
Tất cả các laccase đều là glycoprotein, enzym này có chứa 4 ion đồng
trên mỗi đơn phân tử, phân bố ở 3 vị trí liên kết khác nhau: 1 ion dạng 1(T1),
2 ion dạng 2(T2) và 1 ion dạng 3(T3). Mọi ion đồng đều đóng vai trị quan
trọng trong cơ chế xúc tác. T1 có vai trò là nơi nhận điện tử đầu tiên từ cơ

chất, sau đó điện tử được vận chuyển qua bộ ba axit amin (His-Cys-His) đến
vị trí T2/T3. Tại T2/T3 oxy nhận điện tử và bị khử tạo nước [33].
Một số enzym thiếu ngun tử đồng ở vị trí T1 vì vậy một số tác giả
khơng cơng nhận đó là laccase thực sự. Tuy nhiên một số tác giả khác gọi


13
chúng là yellow-laccase bởi vì những enzym thiếu điện tích hấp thụ mạnh ở
bước sóng 600nm.

Hình 1.1. Chu trình xúc tác của laccase [33]
Ba loại đồng ở trung tâm hoạt động của laccase có thể được nhận biết
qua phân tích phổ tia cực tím (UV) và phổ cộng hưởng thuận từ điện tử
(EPR). T1 hấp thụ mạnh ở bước sóng 600nm của đầu dị EPR, T2 khơng có
màu nhưng được phát hiện bằng đầu dị EPR, T3 chứa cặp đơi nguyên tử
đồng hấp thụ yếu ánh sáng yếu ở vùng UV nhưng khơng phát hiện được bằng
đầu dị EPR [38].
Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces chủ yếu là các
dải β. Chúng được phân ra ba vùng chính A, B và C. Cả ba vùng đều có vai
trị quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase. Vị trí liên kết cơ chất được
đặt ở giữa vùng B và vùng C. Trung tâm của ba nguyên tử đồng được đặt ở bề
mặt chung của vùng A và vùng C.


14

Hình 1.2. Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces [28].
Vùng A, B và C tương ứng là màu đỏ, màu xanh da trời và màu xanh lá cây.
Bốn nguyên tử đồng màu vàng và các carbohydrate là màu xám.
1.4. Đặc tính của laccase

1.4.1. Các chất ức chế hoạt tính laccase
Một số anion có tác dụng ức chế hoạt tính laccase như halogenua, azide,
xyanua và hydroxit, Các ion này bám vào ion đồng T2/T3 ở trung tâm hoạt
động của laccase, sẽ phá vỡ hệ thống vận chuyển điện tử và kìm hãm hoạt
tính laccase [19]. Trong mơi trường pH kiềm, các hidroxit sẽ kìm hãm tiếp
xúc của laccase và cơ chất, đồng thời ngăn ngừa sự tự oxy hóa của cơ chất
nên hoạt tính laccase sẽ bị giảm. Mức độ kìm hãm bởi halogenua thay đổi tuỳ
loại isozym của laccase bởi có thể do liên quan đến kích cỡ của cấu trúc bậc
ba [40]. Các chất ức chế khác có thể là các ion kim loại nặng như Hg2+ hay
axit béo, sulfhydral, hydroxyglycine và các cation ammonium [19]. Những


15
hợp chất này có thể ảnh hưởng đến laccase qua các nguyên tử đồng II, làm
thay cấu trúc không gian của laccase.
1.4.2. Tính đặc hiệu cơ chất
Tính đặc hiệu cơ chất của laccase thường rất thấp bởi laccase có phổ cơ
chất giống với tyrosinase. Nhưng laccase có hoạt tính ortho và para-diphenol
trong khi tyrosinase chỉ có hoạt tính o-diphenol. Chính vì vậy, chỉ có
tyrosinase có hoạt tính cresolase (oxy hóa L-tyrosine) và chỉ có laccase có khả
năng oxy hố syringaldazine [38].
Bên cạnh đó, tính đặc hiệu cơ chất thấp cịn thể hiện ở dải cơ chất rộng
của laccase. Năm 1994, Thuston cho rằng hydroquynon, catechol, guacicol và
2,6-dimethoxyphenol (DMP) đều là những cơ chất tốt cho laccase. Paraphenylenediamin là cơ chất thông dụng và syringaldazine là cơ chất duy nhất
chỉ dành cho laccase vì vậy laccase có thể oxy hố cả các polyphenol
methoxy và rất nhiều các hợp chất khác.
Laccase từ những loại vi sinh vật khác nhau thì cũng có dải cơ chất
khác nhau. Laccase từ Neuropora crassa chỉ oxy hoá hiệu quả para và orthodiphenol (Germann và cộng sự, 1988). Laccase từ Pyricularia oryzae thích
hợp với phloroglucinol như là một cơ chất oxy hóa monophenol (Alsubaey và
cộng sự, 1996). Những laccase từ Cerrena unicolor oxy hoá các hợp chất

phenol ở vị trí meta với quy mơ lớn nhất trong khi laccase từ Trametes
versicolor oxy hoá hiệu quả các hợp chất phenol ở vị trí ortho [31].
1.4.3. Nhiệt độ và pH tối ưu
pH tối ưu của laccase phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất. Khi sử dụng
ABTS là cơ chất thì pH tối ưu thường axit hơn và được xác định trong khoảng
pH 3-5. Với Syringaldazine, pH tối ưu thay đổi trong khoảng từ 4-7, nhưng
chủ yếu tập trung trong khoảng pH 6-7 [40]. Sự khác nhau về thế oxy hóa khử
giữa cơ chất và ion đồng T1 có thể làm tăng khả năng oxy hóa cơ chất và làm


16
tăng giá trị pH. Nhưng anion OH- kết hợp ở ion đồng T2/T3 cho kết quả kìm
hãm hoạt động của laccase. Cho đến khi có sự phá vỡ bởi sự trao đổi điện tử
bên trong giữa T1 và T2/T3 ở trung tâm hoạt động thì liên kết này bị phá vỡ.
Hai tác động trái ngược có thể là nguyên nhân quan trọng trong sự quyết định
pH tối ưu của laccase [40]. Vai trò của T1 với pH tối ưu của laccase đã được
Palmieri và cộng sự (1998) chứng minh, người ta đã phát hiện ra rằng sự vắng
mặt của T1 trong laccase sẽ đẩy pH tối ưu về vùng trung tính hơn [32].
Nhiệt độ tối ưu của laccase rất khác nhau từ tùy từng chủng. Tính bền
nhiệt của laccase thay đổi đáng kể tùy thuộc từng loài vi sinh vật. Thơng
thường, laccase bền ở nhiệt độ 30-50°C và nhanh chóng mất hoạt tính ở 60°C
[28]. Laccase chịu nhiệt cao nhất là từ vi khuẩn: laccase từ Streptomyces
lavendulae bền ở 70°C trong 100 phút và Bacillus subtilis CotA bền ở 80°C
trong 112 phút. Laccase từ nấm mốc thì kém bền hơn, chỉ bền ở 70°C trong
1h và 80°C trong 10 phút. Laccase từ Marasmius quercophilus bền ở nhiệt độ
60°C trong 1 giờ. Một phương pháp khác được sử dụng làm tăng độ bền của
laccase là cố định enzym lên bột thủy tinh [28].
1.4.4. Điểm đẳng điện (pI)
pI (isoelectric point) là pH mà tại đó phân tử protein trung hồ về điện
tích. Tại điểm đẳng điện, phân tử protein enzym kém bền nhất và dễ bị kết

tủa. Mỗi phân tử protein có một điểm đẳng điện riêng. Người ta thường lợi
dụng tính chất này để tách protein, enzym bằng phương pháp điện di hoặc kết
tủa tại điểm đẳng điện. Điểm đẳng điện của laccase là từ 2,6-6,7 trong đó pI
từ 3,3-4,0 là phổ biến nhất [33].
1.4.5. Km và Vmax
Phản ứng xúc tác của bất kỳ enzym nào đều được xác định qua động
học Michaelis Menten Km và Vmax. Những hằng số này được xác định trên
một số lượng lớn laccase khác nhau và với nhiều cơ chất khác nhau (bảng


17
1.2). Giá trị Km trung bình thường là 2500 µM tùy vào từng nguồn enzym và
cơ chất. Giá trị Km thấp nhất khi sử dụng cơ chất là Syringaldazine. Sự so
sánh các giá trị Km chỉ ra rằng laccase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có
tính đặc hiệu với cơ chất [40]. Giá trị Vmax cũng rất khác nhau với từng loại
enzym. Có thể thấy rõ sự khác nhau của Vmax ở những laccase khác nhau khi
sử dụng cùng một cơ chất (bảng 1.2). Trong thực tế, Km là hằng số đặc trưng
cho ái lực giữa cơ chất và enzym. Km nhỏ thì ái lực lớn và vận tốc phản ứng
cũng lớn. Vmax là giá trị thể hiện tốc độ vận chuyển điện tử vào trong enzym
sau khi gặp cơ chất.
Bảng 1.2. Một vài đặc tính của laccase từ một số chủng vi sinh vật [28,33]
Cơ chất
ABTS

Vmax
Km
(µM) (phút-1)
41400
14

pI

Chủng

2,6 Trametes pubescens
LAP2
4,0 Coprinus cinereus
Lcc1
3,3; Trametes trogii
3,6 POXL3
- Panaeolus
sphinctrinus
3,5 Coprinus friesii

23

1090

30

198

32

-

41

-

45

620

-

50,6

-

-

52

-

-

55

-

3,7

58
90

2700
350000

3,5
6,7

106

1000

-

120

-

4,0

Trichophyton
rubrum
Panaeolus
papilionaceus
Rhizoctonia solani
Lcc4
Pycnoporus
cinnabarinus Lac1
Trametes villosa
Lcc1
Pleurotus ostreatus
POXA1
Bacillus subtilis

Tài liệu tham

khảo
Galhaup và
cộng sự, 2002
Schneider và
cộng sự, 1999
Garzillo và
cộng sự, 1998
Heinzkill và
cộng sự, 1998
Heinzkill và
cộng sự, 1998
Jung và cộng
sự, 2002
Heinzkill và
cộng sự, 1998
Xu và cộng sự,
1996
Record và cộng
sự, 2002
Xu cộng sự,
1996
Palmieri cộng
sự, 1997
Martins cộng
sự, 2002


18
CotA
190

2,6-DMP

Guaiacol

-

5,1

280

57000

2,9

290

790

-

380
2500

74000

3,6

25

-

72

24000

96

-

100

-

120

58000

410

109

230

430

740

-

2100

21000

66

6800

36

10800

400

-

510

-

1200

150

Pleurotus ostreatus
POXA2
Chaetomium
thermophilum
Pleurotus ostreatus
POXC

Myceliophthora
thermophila Lcc1
Streptomyces
cyaneus
Pleurotus sajor-caju
Lac4
Gaeumannomyces
graminis LAC2
Trametes pubescens
LAP2
Chaetomium
thermophilum
Botrytis cinerea

Palmieri cộng
sự, 1997
Chefetz cộng
sự, 1998
Palmieri cộng
sự, 1997
Bulter cộng sự,
2003
Arias cộng sự,
2003
Soden cộng sự,
2002

Edens cộng sự,
1999
Galhaup cộng

2,6
sự, 2002
Chefetz cộng
5,1
sự, 1998
Slomczynski
4,0
cộng sự, 1995
3,6 Pleurotus sajor-caju Soden cộng sự,
Lac4
2002
3,3; Trametes trogii
Garzillo cộng
3,6 POXL3
sự, 1998
2,9 Pleurotus ostreatus Palmieri cộng
POXC
sự, 1997
4,0 Pleurotus ostreatus Palmieri cộng
POXA2
sự, 1997
6,7 Pleurotus ostreatus Palmieri cộng
POXA1
sự, 1997
3,6 Pleurotus sajor-caju Soden cộng sự,
2002
Lac4
2,6 Trametes pubescens Galhaup cộng
sự, 2002
LAP2

Chefetz cộng
5,1 Chaetomium
sự, 1998
thermophilum
Edens cộng sự,
5,6 Gaeumannomyces
1999
graminis LAC2
2,9 Pleurotus ostreatus Palmieri cộng
5,6


19

Syringaldazine

3100

-

4,0

5120

115

1,6

2100

3,3;
3,6
-

3,9
6

3000
16800

3,5
2,6

26

180

4,0

26

200

-

28

-

-

34

-

20

23000

130

28000

140

-

280

35000

POXC
Pleurotus ostreatus
POXA2
Trametes trogii
POXL3
Myceliophthora
thermophila Lcc1
Trametes villosa
Lcc1

Trametes pubescens
LAP2
Coprinus cinereus
Lcc1
Bacillus subtilis
CotA

5,1 Rhizoctonia solani
Lcc4
2,9 Chaetomium
thermophilum
6,7 Pleurotus ostreatus
POXC
4,0 Pleurotus ostreatus
POXA1
3,6 Pleurotus ostreatus
POXA2
Pleurotus sajor-caju
Lac4

sự, 1997
Palmieri cộng
sự, 1997
Garzillo cộng
sự, 1998
Bulter cộng sự,
2003
Xu cộng sự,
1996
Galhaup cộng

sự, 2002
Schneider cộng
sự, 1999
Martins cộng
sự, 2002
Xu cộng sự,
1996
Chefetz cộng
sự, 1998
Palmieri cộng
sự, 1997
Palmieri cộng
sự, 1997
Palmieri cộng
sự, 1997
Soden cộng sự,
2002

- : không xác định
1.4.6. Các isozym
Mỗi laccase từ các chủng khác nhau đều có những isozym riêng.
Isozym của chúng mã hóa những chuỗi gen giống hoặc khác nhau của laccase
(Archibald và cộng sự, 1997) [5]. Số lượng của isozym là khác nhau giữa các
loài và ngaycả trong cùng một lồi. Chúng có thể khác nhau rõ rệt về độ bền
pH, bền nhiệt độ, pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu, và ái lực với cơ chất [7]. Ngồi
ra, giữa các isozym có thể khác nhau về tính chất vật lý. Sự mã hóa các chuỗi


20
gen của laccase khác nhau đều được tìm thấy từ một lồi nấm phân giải

lignin. Chuỗi gen mã hóa protein thường từ 515- 619 amino axit.
Ở nấm mốc, một chủng có thể có một hoặc nhiều isozym của laccase.
Các isozym khác nhau ở trình tự amino acid và động thái với các cơ chất
chuẩn của laccase. Laccase từ Rhizoctonia solani và laccase từ Fusarium
proliferatum đều có bốn isozym [23]. Các isozym của laccase khác nhau về
mức độ glycosyl hoá và loại carbohydrate. Ví dụ, Trametes versicolor có năm
loại isozym chỉ khác nhau về thành phần carbohydrate [10]. Thành phần
carbohydrate của laccases có thể chiếm 10 đến 45% trọng lượng phân tử so
với protein [41], và khoảng 15 đến 20% trọng lượng phân tử so với nấm mốc
[38].
1.5. Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là phenoloxidase thực thụ, có tính đặc hiệu rộng với các hợp
chất thơm và amin. Enzym này oxy hóa hợp chất có bản chất phenol cũng như
các tiểu phần của lignin có cấu trúc phenol bằng cách tách một điện tử hình
thành gốc tự do. Các gốc tự do sau đó có thể tái trùng hợp tạo thành polyme
hoặc tiếp tục depolyme hóa.
Laccase chỉ tác dụng vào tiểu phần phenol của lignin dẫn đến sự oxy
hóa của Cα, cắt liên kết Cα-Cβ và liên kết aryl-alkyl. Laccase có khả năng
khử một phân tử oxy tạo thành hai phân tử nước trong khi thực hiện sự oxy
hóa các hợp chất thơm như polyphenol, methoxyl- substituted và các amin
thơm [5]. Q trình oxy hóa một điện tử này dẫn đến việc hình thành gốc tự
do ở vị trí oxy trung tâm, sau đó tiếp tục được chuyển hóa thành quinon dưới
sự xúc tác của laccase. Quinon và các gốc tự do có thể tiếp tục q trình
polyme hóa (hình 1.3).


21

Hình 1.3. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase [5].
Cho đến năm 1990, laccase mới chỉ được biết đến với vai trò phân giải

các hợp chất phenol của lignin. Nhưng hiện nay các nhà khoa học đã nhận
thấy dải cơ chất của laccase có thể mở rộng đối với các tiểu phần khác khơng
có bản chất phenol của lignin (non-phenolic) khi có mặt chất trung gian
(mediator) thích hợp (hình 1.4). Các chất trung gian thường là chất màu 2,2’azino-bis 3-etylthiazolin-6 sunfonat (ABTS). ABTS đóng vai trị là chất vận
chuyển điện tử trung gian và nó có khả năng oxy hóa các tiểu phần khơng có
bản chất phenol (non-phenolic).


22

Hình 1.4. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần khơng có bản chất phenol
(non-phenolic) của lignin bởi laccase và ABTS [5]
Cơ chế xúc tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc
laccase oxy hóa chất trung gian chuyển chất trung gian về dạng oxy hóa; sau
đó các hợp chất trung gian đã được oxy hóa tiếp tục thực hiện phản ứng oxy
hóa khử với cơ chất tạo sản phẩm (hình 1.5). Hiện nay, có hơn 200 mediator
đã được tìm thấy trong đó ABTS, HBT (1-hydroxybenzotriazole), guaiacol,
syringaldazine là các mediator được sử dụng rộng rãi nhất.

Hình 1.5. Mơ hình oxy hóa trung gian các cơ chất của laccase [15]


23
Nói chung laccase thường hoạt động phối hợp với các enzym khác, làm
tăng hiệu quả của quá trình phân giải. Các nghiên cứu vẫn đang được tiếp tục
tiến hành để làm sáng tỏ vai trị của laccase trong q trình phân giải này, đặc
biệt là trong quá trình phân giải lignin.
1.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
laccase
Laccase thường được tạo ra trong suốt pha sau của quá trình trao đổi

chất của nấm mốc trên cơ chất tự nhiên hay trong môi trường nuôi cấy chìm
[18]. Rất nhiều thơng số của mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến quá trình
sinh tổng hợp laccase đã được nghiên cứu. Những thông số này bao gồm
nguồn Cacbon, nguồn Nitơ và các nguyên tố vi lượng. Gayazov &
Rodakiewicz-Nowak (1996) cho rằng quá trình sinh tổng hợp laccase diễn ra
nhanh hơn trong điều kiện ni cấy hiếu khí. Xavier và cộng sự (2001) cho
rằng quá trình sinh tổng hợp laccase nhiều hay ít khơng phụ thuộc vào lượng
sinh khối [39]. Việc tổng hợp và những tác động của laccase phải được kiểm
sốt trong suốt q trình sinh trưởng bởi vì nó đóng vai trị quan trọng trong
việc hình thành các thể vùi và thể màu. Năm 2001, Nüske và cộng sự đã thành
công trong việc nuôi cấy các chủng nấm mục trắng Nematoloma frowardii,
Clitocybula dusenii sinh tổng hợp laccase trong các thiết bị lên men có cánh
khuấy 5 lít, 30 lít và 300 lít [38].
1.6.1. Nguồn cacbon
Mỗi chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp laccase với các nguồn
cacbon thích hợp rất khác nhau.
Nguồn cacbon có thể sử dụng như: monosaccharid, oligosaccharid,
polysaccharid (tinh bột hay cellulose). Ví dụ Peniophora sp sử dụng tốt
nguồn cacbon là saccarose [23]. Pycnoporus sanguineus lại có thể sử dụng
nguồn cacbon thích hợp là 4% rỉ đường và 2% saccarose [22].


24
1.6.2. Nguồn nitơ
Hệ enzym phân hủy lignin ở nấm mốc được bắt đầu tổng hợp chủ yếu ở
pha sau của quá trình trao đổi chất khi nguồn nitơ cạn kiệt (Keyser và cộng
sự, 1978), nhưng Leatham & Kirk (1983) lại cho rằng ở một số chủng nấm
mốc nồng độ nitơ khơng có ảnh hưởng đến hoạt tính của ligninotic. Năm
1998, Monteiro and De Carvalho đã cơng bố hoạt tính laccase cao trong điều
kiện lên men bán liên tục ở bình tam giác có lắc (shake- flasks) sử dụng

nguồn cacbon và nitơ thấp. Năm 1995 Buswell và cộng sự lại thấy rằng
laccase được tổng hợp trong nồng độ nitơ cao. Những quan sát trái ngược này
được nhận biết ở chủng Phanerochaete chrysosporium (Burdsal) và Lentinus
edodes (Berk). Tuy vậy, người ta cho rằng tỷ lệ cacbon và nitơ cao là cần thiết
cho q trình sinh tổng hợp laccase. Laccase cũng có thể được tạo ra sớm hơn
khi các chủng nấm mốc được ni cấy trong mơi trường có bổ sung cơ chất
và nồng độ nitơ cao và những thay đổi này không ảnh hưởng đến hàm lượng
sinh khối [22].
Như vậy, nguồn nitơ rõ ràng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
laccase tuy nhiên tùy thuộc vào từng chủng mà khả năng sinh tổng hợp
laccase cao ở nồng độ nitơ nhiều hay ít. Vì vậy, với mỗi chủng vi sinh vật
khác nhau cần có nghiên cứu để tìm ra nồng độ nitơ thích hợp cho q trình
sinh tổng hợp laccase.
1.6.3. Nguồn khống
Trong q trình ni cấy sinh tổng hợp enzym, nguồn khống là một
trong những thành phần rất quan trọng, khơng thể thiếu. Nó giúp nấm mốc có
thể sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra enzym cần thiết. Tùy vào loại enzym
mà sử dụng những nguồn khoáng khác nhau.