Tách dòng biểu hiện gene xyna từ bacillus subtilis CN2 trên e coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của xylase tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

DƯƠNG THỊ LƯƠNG LIÊN

TÁCH DÒNG, BIỂU HIỆN GENE XYNA TỪ BACILLUS
SUBTILIS CN2 TRÊN E. COLI BL21 VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC
TÍNH CỦA XYLANASE TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRẦN LIÊN HÀ

Hà Nội – 2011


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Dương Thị Lương Liên xin cam đoan nội dung trong quyển luận văn
này với đề tài “Tách dòng, biểu hiện gene xynA từ B. subtilis CN2 trên E. coli BL21
và nghiên cứu đặc tính của enzyme xylanaseA tái tổ hợp” là cơng trình nghiên cứu
và sáng tạo do chính tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Liên Hà Bộ mơn Vi sinh - Hố sinh và Sinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học và Thực
phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và sự giúp đỡ của TS. Ogasawara
Wataru Khoa Kỹ thuật Sinh học - Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản

Dương Thị Lương Liên CH09-11

i


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

LỜI CẢM ƠN
Trước hết cho tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Trần
Liên Hà Bộ môn Vi sinh - Hoá sinh và Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học
và Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Người đã hướng dẫn, định
hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu,
người đã mang lại cho tôi những khám phá mới về cuộc sống, nghị lực vươn lên
chính mình và khơi gợi sự say mê và tính sáng tạo trong tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Ogasawara Wataru và TS. Takanori
Furukawa người đã hướng dẫn và tận tình chỉ bảo cho tơi trong thời gian tơi học tập
và nghiên cứu tại phịng thí nghiệm của PGS. TS. Ogasawara, Khoa Kỹ thuật Sinh
học Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản. Nơi mà tôi đã thu được rất
nhiều kiến thức và kinh nghiệm thực tế, giúp tôi trưởng thành hơn trong nghiên cứu
và làm chủ được kiến thức của mình.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các bạn sinh viên và toàn
thể cán bộ phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học C4 – 401 và tồn thể các thầy cơ
và bạn bè trong viện, trong phịng thí nghiệm vi sinh C10, và các thành viên của
phịng thí nghiệm TS. Ogasawara đã giúp đỡ và tạo điều kiện rất nhiều cho tôi trong
quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng là lịng biết ơn tới bố, mẹ, anh, chị, em trong gia đình tơi, những
người bạn của tôi, những người luôn động viên và luôn ủng hộ tôi trong suốt thời

gian học.
Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011
Học viên

Dương Thị Lương Liên

Dương Thị Lương Liên CH09-11

ii


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ----------------------------------------------------------------------------- i
LỜI CẢM ƠN --------------------------------------------------------------------------------- ii
T
3
5

53T

T
3
5

53T

MỤC LỤC ------------------------------------------------------------------------------------- iii
T
3
5

53T

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ------------------------------------ vi
T
3
5

T
3
5

DANH MỤC CÁC BẢNG ---------------------------------------------------------------- viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ---------------------------------------------- ix
MỞ ĐẦU --------------------------------------------------------------------------------------- 1
T
3
5

53T

T
3
5

T

3
5

T
3
5

53T

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN ---------------------------------------------------------------- 4
1.1. Xylan ................................................................................................................ 4
T
3
5

T
3
5

53T

53T

1.2. Xylanase ........................................................................................................... 5
1.2.1. Tên gọi và đặc tính của xylanase ................................................................... 5
T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

1.2.2. Phân loại xylanase......................................................................................... 7
1.2.3. Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase ..................................................... 8
T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

1.2.4. Chức năng và cơ chế thủy phân của xylanase ................................................ 9
1.2.5. Ứng dụng của xylanase ................................................................................ 13
1.2.6. Dạng sản phẩm xylanase trên thị trường ..................................................... 16
1.3. Những thành tựu trong tách dòng và biểu hiện gene xynA mã hoá xylanase ... 17
1.3.1. Ở nước ta ..................................................................................................... 17

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

1.3.2. Trên thế giới ................................................................................................ 18
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP --------------------------------------- 21
2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 21
2.1.1. Chủng giống và vector cho tách dòng và biểu hiện. ..................................... 21
2.1.2. Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật ............................................... 21
2.1.3. Hóa chất, enzyme, kit, thiết bị sử dụng ......................................................... 21
2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 23
2.2.1. Tách dòng .................................................................................................... 23
2.2.1.1. Tách DNA tổng số..................................................................................... 23
2.2.1.2. Thiết kế mồi .............................................................................................. 24
2.2.1.3. Khuếch đại gene ....................................................................................... 25
2.2.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................................... 25
2.2.1.5. Kiểm tra sản phẩm bằng điện di gel agarose ............................................ 26
2.2.1.6. Phản ứng nối gốc phosphate ở đầu 5’ gene xynA đã khuếch đại ............... 26
2.2.1.7. Cắt sản phẩm PCR, pET22b(+) bằng enzyme giới hạn ............................. 27
T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T

3
5

53T

53T

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

Dương Thị Lương Liên CH09-11

T
3
5

T
3
5

iii


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

2.2.1.8. Loại bỏ nhóm phosphat ở đầu 5’ của vector tách dịng ............................. 28
2.2.1.9. Phản ứng nối ............................................................................................ 29
T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

2.2.1.10. Tạo tế bào khả biến E. coli DH5α và E. coli BL21(DE3) ........................ 30
2.2.1.11. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli............................. 31
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

2.2.1.12. Chọn lọc khuẩn lạc chứa gene ................................................................ 32
2.2.1.13. Tách chiết plasmid DNA ......................................................................... 33
2.2.2. Giải trình tự ................................................................................................. 34
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

2.2.2.1. Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy ........................................... 34
2.2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid và tinh sạch bằng PEG 4000 ......... 34
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T

3
5

2.2.2.3. Giải trình tự bằng máy giải trình tự CEQ 2000 Dye Terminator Cycle
T
3
5

sequencing............................................................................................................. 35
2.2.3. Biểu hiện gene ............................................................................................. 36
2.2.3.1. Hệ thống biểu hiện pET ............................................................................ 36
2.2.3.2. Phương pháp bổ sung chất cảm ứng IPTG ................................................ 38
2.2.3.3. Phương pháp bổ sung chất cảm ứng α-lactose .......................................... 39
2.2.4. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE ..................................................... 39
2.2.5. Tinh sạch protein xylanase tái tổ hợp........................................................... 40
2.2.5.1. Phương pháp tách protein......................................................................... 40
2.2.5.2. Phương pháp tinh sạch protein dựa trên trình tự đi His-tag .................. 41
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ xylanase ...................................................... 43
53T

T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3

5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

2.2.6.1. Phương pháp Nelson-Somogyi .................................................................. 43
2.2.6.2. Phương pháp đục lỗ thạch xác định vòng phân giải .................................. 44
2.2.7. Phương pháp xác định nồng độ protein (Bradford) ...................................... 44
2.2.8. Khảo sát đặc tính của xylanase A................................................................. 45
2.2.8.1. Xác định độ bền pH .................................................................................. 45
2.2.8.2. Xác định pH tối ưu .................................................................................... 45
2.2.8.3. Xác định nhiệt độ tối ưu ............................................................................ 45
2.2.8.4. Xác định độ bền nhiệt độ........................................................................... 45
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ------------------------------------------- 46
3.1. Tách dòng ....................................................................................................... 46
3.1.1. Tách DNA tổng số........................................................................................ 46
3.1.2. Thiết kế mồi ................................................................................................. 47
3.1.3. Khuếch đại gene .......................................................................................... 49
3.1.4. Nối sản phẩm PCR với vector tách dòng ...................................................... 49
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

T
3
5

53T

T
3

5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

T
3

5

T
3
5

T
3
5

53T

53T

53T

T
3
5

Dương Thị Lương Liên CH09-11

T
3
5

iv


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

3.1.5. Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α.................................................. 50
3.1.6. Chọn lọc plasmid chứa gene đích. ............................................................... 52
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

3.2. Giải trình tự.................................................................................................... 54
3.2.1. Tinh sạch plasmid bằng PEG 4000 .............................................................. 54
T
3
5

53T

T

3
5

T
3
5

3.2.2. Kết quả giải trình tự..................................................................................... 55
3.3. Biểu hiện gene xynA từ Bacillus subtilis CN2.................................................. 59
3.3.1. Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) ......................................... 59
T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3

5

3.3.2. Sử dụng chất cảm ứng IPTG ........................................................................ 60
3.3.3. Sử dụng chất cảm ứng α-lactose .................................................................. 63
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

3.3.3.1. Tối ưu hố điều kiện ni cấy với chất cảm ứng α-lactose ........................ 63
T
3
5

T
3
5

3.3.3.2. Hoạt tính xylanase tái tổ hợp trên môi trường đặc 1% xylan ..................... 66

3.4. Tinh sạch protein xylanase A tái tổ hợp .......................................................... 66
3.4.1. Sử dụng nhựa Ni-NTA. ................................................................................. 67
3.4.2. Sử dụng nhựa TALON .................................................................................. 69
3.4.3. Đánh giá chất lượng quá trình tinh sạch ...................................................... 70
3.5. Khảo sát đặc tính của xylanase tái tổ hợp ....................................................... 70
3.5.1. Độ bền pH của xylanase tái tổ hợp .............................................................. 71
3.5.2. pH tối ưu của xylanase tái tổ hợp................................................................. 72
3.5.3. Nhiệt độ tối ưu của xylanase tái tổ hợp ........................................................ 73
3.5.4. Độ bền nhiệt độ của xylanase tái tổ hợp ...................................................... 74
T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

53T

T
3
5

53T

53T

53T

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

T
3
5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------- 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------ 78
PHỤ LỤC ------------------------------------------------------------------------------------- 84
T
3
5

53T

T
3
5

T
3
5

53T

53T

Dương Thị Lương Liên CH09-11

v


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

Tên đầy đủ

1 Amax

Optical density maximum (mật độ quang cực đại)

2 Amp

Ampicillin

3 APS

Ammonium persulfate

4 B. subtilis

Bacillus subtilis

5 BB

Bug Buster

6 bp

Base pair

7 BSA

Bovine Serum Albumin

8 C

Carbon

9 CI

Chloroform/isoamylalcohol

10 CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

11 ddH 2 O

Nước đề ion 2 lần

12 ddNTP

Dideoxyribonucleotide triphosphate

13 DMSO

Dimethyl sulfoxide

14 DNA

Deoxyribonucleic acid

15 dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

16 DTT

Dithiothreitol

17 E. coli

Escherichia coli

18 EDTA

Ethylen diamin tetra acetate

19 EtBr

Ethydium bromide

20 EtOH

Ethanol

21 IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

22 kDa

Kilo Dalton

23 kV

Kilo volt

24 LB

Luria-Bertani

25 mRNA

Messenger RNA (RNA thông tin)

26 MW

Molecular weight (khối lượng phân tử)

27 NTA

Nitriloacetic acid

R

R

Dương Thị Lương Liên CH09-11

vi


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

28 nu

Nucleotide

29 OD

Optical density (mật độ quang)

30 PCR

Polymerase Chain Reaction

31 PDA

Potato Dextrose Agar

32 rpm

Revolutions per minute (vòng/phút)

33 SDS

Sodium dodecyl sulphate

34 SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel ectrophoresis
53T

T
3
5

35 SLS

Sample loading solution (dung dịch tra mẫu)

36 TAE

Tris-Acetate-EDTA

37 TB

Terrific broth

38 Tb

Teriffic Broth

39 TE

Tris-EDTA

40 TEMED

Tetramethylethylenediamine

41 TE-RNase

Tris-EDTA- Ribonuclease

42 Tm

Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy)

43 X-gal

5-bromo-4-chloro-indolyl-galactopyranoside

Dương Thị Lương Liên CH09-11

vii


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR ....................... 25
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của pET22b(+) .... 28
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của sản phẩm PCR
..................................................................................................................... 28

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng loại bỏ nhóm phosphat của vector ....... 29
Bảng 2.5: Nồng độ khuôn DNA cho phản ứng giải trình tự ...................... 35
Bảng 3.1: Bảng mô tả độ tương đồng gene xynA từ B. subtilis CN2 với các
trình tự khác từ ngân hàng Genbank ........................................................ 56
Bảng 3.2: Các đặc điểm của xylanase từ các chủng thuộc chi Bacillus khác
nhau ............................................................................................................ 67
Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ E. coli BL21 (DE3) .. 70
Bảng 4.1: Giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ xylose .................... 89
Bảng 4.2: Giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ BSA ....................... 89
Bảng 4.3: Thành phần Gel 15% cho 2 bản gel ........................................... 89
Bảng 4.4. Đệm sodium phosphate ............................................................. 90
Bảng 4.5: Đệm sử dụng để xác định độ bền pH.......................................... 90

Dương Thị Lương Liên CH09-11

viii


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Dạng đơn giản của xylan ......................................................................... 4
Hình 1.2: Dạng phức tạp của xylan ......................................................................... 4
Hình 1.3: Đơn vị cấu trúc của xylan từ cỏ [8] ......................................................... 5
Hinh 1.4: Cấu hình khơng gian của G11 xylanase từ Bacillus subtilis (XYNA) ........ 8
Hình 1.5: Họ 11 xylanase từ Bacillus circulans (1XNB) và Trichoderma harzianum
(1XND) .................................................................................................................... 9
Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của xylanse dạng đơn giản ........................................ 10

Hình 1.7: Vị trí tấn cơng của endo-1,4-β-xylanase trên mạch xylan....................... 11
Hình 1.8: Cơ chế thủy phân xylan của 1XNB ......................................................... 12
Hình 1.9: Cấu trúc của xylan và vị trí cắt các enzyme trong q trình sản xuất giấy
.............................................................................................................................. 15
Hình 1.10: Các dạng sản phẩm xylanase trên thị trường ....................................... 17
Hình 2.1: Phản ứng nối vector pUC118 và gene xynA ........................................... 29
Hình 2.2: Phản ứng chèn xynA gene vào pET22b(+) ............................................. 30
Hình 2.3: Vector biểu hiện pET22b(+) ................................................................. 37
Hình 2.4: Nguyên tắc phương pháp sắc ký ái lực sử dụng Ni2+ .............................. 42
Hình 3.1: Điện di DNA tổng số tách từ B. subtilis CN2 trên gel agarose 1% ......... 46
Hình 3.2: Trình tự mồi xi và mồi ngược ............................................................. 47
Hinh 3.3: Vị trí cắt enzyme giới hạn của xynA mang kí hiệu AF027868.1 .............. 48
Hình 3.4: Kết quả chạy PCR với cặp mồi đã thiết kế ............................................. 49
Hinh 3.5: Điện di đồ kết quả các thao tác thực hiện trước khi nối ......................... 50
P

P

Hình 3.6: Chọn lọc khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp pUC118-xynA trên môi trường
chứa X-gal-IPTG ................................................................................................... 51
Hình 3.7: Khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-xynA vào E. coli
DH5α .................................................................................................................... 51
Hình 3.8: Điện di đồ kết quả tách plasmid pET22b (+) tái tổ hợp và cắt bằng
enzyme giới hạn ..................................................................................................... 52
Hình 3.9: Điện di đồ kết quả tách plasmid pUC118 tái tổ hợp và cắt bằng enzyme
giới hạn ................................................................................................................. 53
Hình 3.10: Điện di đồ tinh sạch plasmid pET-xynA bằng PEG .............................. 54
Hình 3.11: Tinh sạch vector pUC-xynA bằng PEG và cắt bằng enzyme giới hạn ... 55
Hình 3.12: Trình tự nu của gene xynA từ B. subtilis CN2 ...................................... 56

Dương Thị Lương Liên CH09-11

ix


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 3.13: So sánh trình tự gene xynA chủng B. subtilis CN2 với đoạn gene mã hố
xylanse được cơng bố trên cơ sở dữ liệu NCBI với số hiệu AJ536759.1 ................. 57
Hình 3.14: Trình tự acid amin của xylanase A của B. subtilis CN2 ........................ 58
Hình 3.15: Cấu trúc domain và phân loại xylanase từ B. subtilis CN2................... 58
Hình 3.16: So sánh trình tự tương đồng các acid amin của xylanase từ B. subtilis
CN2 với trình tự chuỗi acid amin đã được cơng bố mã hiệu ACP87391.1 ............. 59
Hình 3.17: Hình ảnh khuẩn lạc E. coli BL21 sau khi biến nạp với pET22b(+) chứa
gene xynA .............................................................................................................. 60
Hình 3.18: Điện di đồ protein tan và không tan ở 37°C và nồng độ IPTG khác nhau
.............................................................................................................................. 61
Hình 3.19: Đồ thị hoạt tính xylanase tái tổ hợp đạt được với cảm ứng IPTG khi thay
đổi điều kiện ni cấy ............................................................................................ 61
Hình 3.20: Điện di đồ protein tan với nhiệt độ và nồng độ IPTG khác nhau .......... 62
Hình 3.21: Điện di đồ protein khơng tan với nhiệt độ và nồng độ IPTG khác nhau 62
Hình 3.22: Điện di đồ enzyme tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau khi
dùng α-lactose làm chất cảm ứng .......................................................................... 64
Hình 3.23: Đồ thị hoạt tính xylanase tái tổ hợp đạt được với cảm ứng α- lactose khi
thay đổi điều kiện ni cấy .................................................................................... 65
Hình 3.24: Vịng thuỷ phân của xylanase tái tổ hợp trên môi trường đặc chứa xylan
.............................................................................................................................. 66
Hình 3.25: Độ bền pH của enzyme thơ trước khi tinh sạch .................................... 67

Hình 3.26: Điện di đồ protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng Ni2+ .................... 69
Hình 3.27: Điện di đồ protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng nhựa TALON ...... 69
Hình 3.28: Độ bền pH của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với Co2+. .................. 72
Hình 3.29: pH tối ưu của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với Co2+ ....................... 73
Hình 3.30: Nhiệt độ tối ưu của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với Co2+ .............. 74
Hình 3.31: Độ bền nhiệt của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với Co2+ .................. 75
Hình 3.32: Độ bền nhiệt của enzyme sử dụng nước đề ion ủ trước phản ứng ......... 76
Hình 4.1: Đường chuẩn xylose .............................................................................. 89
Hình 4.2: Đường chuẩn Bradford .......................................................................... 89
P

P

P

P

P

P

Dương Thị Lương Liên CH09-11

P

P

x

Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

MỞ ĐẦU
Ngày nay nhiên liệu như xăng, dầu, chất đốt, … là một thuật ngữ quen
thuộc và phổ biến trong mọi tầng lớp cư dân, nó vơ cùng quan trọng và cần thiết
trong sinh hoạt cũng như các hoạt động công nghiệp, nó tạo ra nguồn năng lượng
cung cấp cho máy móc hoạt động, tạo ra điện, … Nếu khơng có nhiên liệu thì nền
kinh tế khơng thể phát triển, đời sống con người không thể nâng cao, cuộc sống của
con người gặp nhiều khó khăn. Từ xưa đến nay con người chủ yếu sử dụng nguồn
nhiên liệu khai thác từ tự nhiên hay ngun liệu hố thạch từ lịng đất. Nhưng do sự
khai thác quá mức của con người, hơn nữa sự tạo thành nhiên liệu hố thạch này địi
hỏi sự vắng mặt của oxy, áp suất, nhiệt độ (chu trình C) và mất từ hàng chục triệu
đến hàng trăm triệu năm. Theo ước tính của liên hợp quốc và các quốc gia giàu trữ
lượng về dầu mỏ thì hàng năm tổng lượng khai thác của con người hàng tỷ tấn dầu
thơ, và hàng tỷ tỷ m3 khí gas. Sự chênh lệch quá lớn giữa sự hình thành và khai thác
P

P

dẫn đến lượng nhiên liệu hoá thạch ngày càng cạn kiệt, giá nhiên liệu tăng cao dẫn
đến rất nhiều vấn đề tranh chấp, chiến tranh bùng nổ xảy ra giữa các nước, đời sống
con người khó khăn, và tất nhiên lượng nhiên liệu khai thác khó có thể đáp ứng đủ
nhu cầu của con người. Từ đây địi hỏi phải có sự thay thế nguồn nhiên liệu hoá
thạch bằng một nguồn nhiên liệu khác. Nhiên liệu sinh học được các nhà khoa học
và các nước đặc biệt quan tâm nhờ nguồn sinh khối sinh vật sẵn có trên trái đất với
khối lượng lớn, giá thành rẻ có thể phục hồi nhanh chóng, đồng thời giảm thiểu
được ơ nhiễm mơi trường.
Hiện tại có một thách thức đặt ra là giá thành của nhiên liệu sinh học còn cao

chưa thể cạnh tranh với nhiên liệu hoá thạch. Do chúng ta vẫn đang trong giai đoạn
tìm kiếm và nghiên cứu cơng nghệ sản xuất tối ưu và phù hợp với thực tiễn. Trữ
lượng lớn về số lượng C cố định trong tự nhiên là sinh khối tế bào thực vật, nó gồm
có ba thành phần polymer chính: cellulose chiếm 35-50% , hemicellulose chiếm 2335%, và lignin chiếm 10-20% sinh khối. Vì vậy sự sử dụng một cách có hiệu quả
nguồn sinh khối tự nhiên đóng vai trị hết sức quan trọng nên việc nghiên cứu hệ
enzyme phân huỷ lignocelluloses là vô cùng cần thiết. Cellulase là enzyme phân

Dương Thị Lương Liên CH09-11

1


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

huỷ cellulose đã được nghiên cứu từ khá lâu và cũng đã đạt được những thành công
nhất định. Enzyme phân huỷ hemicellulose và lignin cũng đang được các nhà
nghiên cứu quan tâm. Sự phổ biến của xylan trong hemicellulose cho chúng ta thấy
rằng enzyme tổng hợp có hoạt tính phân huỷ xylan đóng vai trị quan trọng trong sự
biến đổi sinh học. Các sản phẩm thủy phân từ lignocellulose tạo thành đường đơn
và những mạch polymer ngắn từ đó dễ dàng biến đổi thành nhiên liệu lỏng, protein
đơn bào, dung môi và các sản phẩm khác bằng việc sử dụng vi sinh vật lên men đã
được chọn lọc.
Các quá trình biến đổi sinh học và loại trừ các phần thừa và phần khơng sử
dụng sinh ra từ nơng nghiệp, lâm nghiệp có sự hấp dẫn đặc biệt giúp tận dụng
nguồn thải và giảm ô nhiễm môi trường. Không chỉ vậy xylanase cũng có nhiều tính
chất đặc biệt hữu ích có thể ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và thương
mại như công nghiệp giấy, bột giấy, thức ăn gia súc, công nghiệp bánh mỳ. Những
ứng dụng khác trong lĩnh vực bia rượu, nước giải khát, ... [20]. Do vậy trong những

thập niên gần đây các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về enzyme này.
Sử dụng enzyme vi sinh vật cho q trình thủy phân cơng nghiệp của
lignocellulose có nhiều ưu điểm vì tính ơn hịa của điều kiện phản ứng, tuy nhiên
hoạt tính và khả năng xúc tác q trình phân huỷ cơ chất thì rất cao. Hiện nay
enzyme nói chung và xylanase nói riêng có giá thành cịn rất cao nên đòi hỏi chúng
ta cố gắng khai thác các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme với số lượng lớn, hoạt
tính cao đáp ứng cho q trình phân hủy sinh học. Hơn nữa ngày nay enzyme ứng
dụng trong các q trình cơng nghiệp địi hỏi thực hiện phản ứng ở các điều kiện
khắc nghiệt hơn về nhiệt độ, pH và thời gian dài. Nên việc tìm kiếm những vi sinh
vật có khả năng tạo ra những enzyme có đặc điểm đáp ứng nhu cầu thực tiễn luôn
luôn được đặt ra.
Một câu hỏi lớn được quan tâm là những vi sinh vật có chứa gene có khả
năng sinh enzyme cao, song chỉ những trường hợp thiếu chất dinh dưỡng thì nó mới
biểu hiện, hoặc nó khơng chỉ tạo ra một loại enzyme ta cần với nồng độ cao mà cịn
nhiều loại enzyme khác có thể gây ức chế enzyme ta cần, hoặc những vi sinh vật đó
gây độc cho những sản phẩm quá trình lên men,... Vì vậy làm thế nào để chúng ta
Dương Thị Lương Liên CH09-11

2


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

có thể ứng dụng chủng đó vào sản xuất hay tạo chủng sản xuất enzyme mà ta muốn
có nồng độ cao mà vẫn đảm bảo an toàn cho các sản phẩm sử dụng cho mục đích
tiêu dùng hay những mục đích khác. Và chính việc giải quyết những câu hỏi tương
tự như vậy đã khiến cho các nhà khoa học quan tâm đến việc tách dòng và biểu hiện
gene xylanase từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau lên các vi sinh vật có sức chịu

đựng tốt, phát triển nhanh và không gây độc (loại bỏ các gene gây độc) chủ yếu là
E. coli, B. subtilis, P. pastoris, S. serevisia, ...
Xuất phát từ những thách thức đặt ra, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Tách dòng, biểu hiện gene xynA từ B. subtilis CN2 trên E. coli BL21 và nghiên
cứu đặc tính của xylanase tái tổ hợp” với những nội dung sau:
1. Tách dòng gene xynA từ B. subtilis CN2
2. Giải trình tự gene xynA từ B. subtilis CN2
3. Biểu hiện gene xynA từ B. subtilis CN2 lên E. coli BL21 (DE3)
4. Tinh sạch enzyme xylanaseA bằng sắc ký ái lực
5. Khảo sát một số đặc tính của xylanase tái tổ hợp để đề xuất phương
hướng ứng dụng phù hợp đối với enzyme này trong thực tế.
Cùng với sự nghiên cứu không mệt mỏi của các nhà khoa học, sự trao đổi
kinh nghiệm và kết quả, cùng nhau giải quyết những khó khăn. Chúng ta đều có thể
khẳng định chắc chắn rằng trong tương lai gần thì nhiên liệu sinh học sẽ là nguồn
nhiên liệu phổ biến, hữu dụng và thay thế được nguồn nhiên liệu hoá thạch chúng ta
đang sử dụng và lệ thuộc vào nó. Góp phần xây dựng thế giới hồ bình, trong lành
và giàu mạnh.

Dương Thị Lương Liên CH09-11

3


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. Xylan
Xylan là thành phần chính của hemicellulose. β-1,4-xylan là các

polysaccharide của đường xylose được tìm thấy trong thành tế bào trong tất cả các
loại thực vật trên cạn và trong hầu hết các phần của cây. Để thủy phân các thành
phần khung xương của chúng đòi hỏi sự hợp tác của nhiều loại enzyme khác nhau
chủ yếu là β-1,4-xylanase (1,4-β-D-xylan xylanohydrolase; EC3.2.1.1) và
xylosidase (1,4- β-D-xylan xylohydrolase; (EC3.2.1.37) [32,59].
Cấu trúc của xylan

Hình 1.1: Dạng đơn giản của xylan
Xylan là một ví dụ của một pentosan bao gồm các đơn vị D-xylose liên kết
với nhau bởi liên kết β 1→4.
Trong thành tế bào xylan được cấu thành từ các liên kết 1,4-β-D-xylosyl
ngắn thành một khung xương với các α-D-glucosyluronic acid (GlcA), 4-methyl-Oα-D-glucosyluronic acid (MeGlcA), α-L-arabinosyl, O-acetyl, feruloyl, hoặc các
chuỗi bên coumaroyl. Mức độ polymer hoá của xylan trong gỗ cứng là 150-200 gốc
β-xylopyranose, gỗ mềm là 70 đến 130 gốc β-xylopyranose.

Hình 1.2: Dạng phức tạp của xylan
84T

Dương Thị Lương Liên CH09-11

4


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 1.3: Đơn vị cấu trúc của xylan từ cỏ [8]
Trong mô hình mạch của tế bào thực vật β-1,4-xylan chủ yếu tìm thấy trong
lớp thành tế bào thứ hai, là thành phần chính của tế bào trưởng thành trong mơ gỗ,

trong hemicellulose ở các lớp tế bào đầu tiên của cây một lá mầm, xylan là một
thành phần thứ yếu của lớp thành tế bào đầu tiên cây hai lá mầm. Điều quan trọng
xylan được coi như một nguồn cung cấp C chính trong brichwood với 35% khối
lượng khơ. Nhìn chung, xylan là một hemicellulose quan trọng trong gỗ của cây hạt
kín 15-30% và ít phổ biến trong cây hạt trần từ 7-12% trong lượng khô [1].

1.2. Xylanase
1.2.1. Tên gọi và đặc tính của xylanase
Xylanase được mơ tả bởi hiệp hội quốc tế hóa sinh và cơng nghệ sinh học
phân tử (IUBMB)) như sau:
- Số đăng ký: EC 3.2.1.8.
- Số đăng ký sở lý thuyết hóa học của xylanase: 9025-57-4.
- Tên hệ thống: 1,4-D-xylanohidrolase.
- Tên thường : Endo-1,4- xylanase.
Các Tên khác: β-xylanase; β-1,4-xylanase; β-1,4-xylan xylanohidrolase;
β-D-xylanase;

endo-1,4-xylanase;

endo-β-1,4-xylanase;

endo-β-1,4-D-

xylanase; endo β-1,4-xylan-D-xylanohidrolase; (từ vi khuẩn) endo-xylanase; β-

Dương Thị Lương Liên CH09-11

5

Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

xylanase, pentosanase, xynA protein, xylanase, xylanase j, xylanase y, xylanase z,
xylanase III
Thuộc loại: Hydrolase (enzyme thủy phân).
Cơ chất:

Xylan.

Sản phẩm: Xylose.
Nguồn gốc [59]:
- Vi khuẩn: B. polymyxa, Cryptococcus albidus, Cellulomonas fimi, ....
- Nấm: Aspergillus spp (nudulans, ochraceus, fumigatus), Penicillium,
Fuarium, Chaetomium, Aureo bacidium, Rhizomucor, A. Ozyrae,
Clostridium stercorarium, ....
- Nấm men: S. thermomonospora, S. Lividans¸ S. Exfoliatus, ...
- Xạ khuẩn: Trichoderma spp, ...
Đặc tính của xylanase [59]
Dải pH:
- Vi khuẩn (Bacillus spp): 4 - 10 (thường 6 - 7).
- Nấm (Aspergillus spp): 3,5 - 6,5 (thường 3,5 - 4,5).
- Nấm men (Streptomyces spp): acid 5 - 7,5 (thường 5,5 - 6).
- Xạ khuẩn (Trichoderma spp): 3,5 - 6,5.
Dải nhiệt độ :
- Vi khuẩn (Bacillus): 37 - 80oC.
P

P

- Nấm (Aspergillus spp, Trichoderma spp): 40 - 80 oC.
P

P

- Nấm men (Streptomyces spp): 50- 65 oC.
P

P

- Xạ khuẩn (Trichoderma spp): 45- 65 oC.
P

P

Dải pI:
- Vi khuẩn (chi Bacillus) : 3,6- 10
- Nấm (Aspergillus spp, Trichoderma spp) : 3,6- 9
- Nấm men (Streptomyces spp) : 5,2- 10,3.
- Xạ khuẩn (Trichoderma spp) : 5- 10,3.

Dương Thị Lương Liên CH09-11

6


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

Khối lượng phân tử
- Vi khuẩn (chi Bacillus) : 9,5- 56 kDa
- Nấm (Aspergillus spp, Trichoderma spp) : 8- 53 kDa
- Nấm men (Streptomyces spp) : 24 - 50 kDa
- Xạ khuẩn (Trichoderma spp): 8,5 - 53 kDa.
1.2.2. Phân loại xylanase
Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng
được phân chia thành rất nhiều họ dựa vào nguồn gốc, cơ chất, hoạt động, trình tự,
cấu trúc domain, đặc điểm hoá lý và chức năng của chúng, sự quan trọng trong cơng
nghiệp, sự thích nghi với các điều kiện mơi trường khác nhau. Nhưng có 2 họ rất
phổ biến và được quan tâm đặc biệt là:
- Endo-xylanase họ 10 gồm các enzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc
và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (họ F)
- Endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi
khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao (họ G).
Sự khác biệt về đặc tính xúc tác của họ 10 là có khả năng thủy phân các liên
kết glycoside cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu khơng khử. Trong khi đó họ 11
khơng có khả năng đó [5]. Endo-xylanase họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl khơng
thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl
liên tiếp khơng thay thế. Do đó, các endo-xylanase của họ 10 hoạt động linh động
hơn họ 11. Điều này cũng có nghĩa là họ 11 hoạt tính xúc tác chọn lọc hơn.
Ngồi việc phân loại xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng đã
tiến hành nghiên cứu, phân chia xylanase thành những nhóm nhỏ hơn. Sapag [50]
chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các
enzyme của nấm mốc. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba
nhóm là A, B và C. Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ
Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram
dương. Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram
dương, những loài thường sống trong dạ cỏ.

Dương Thị Lương Liên CH09-11

7


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

1.2.3. Cấu trúc khơng gian 3 chiều của xylanase
Có một sự biến đối khá lớn giữa các enzyme phân hủy xylan sinh tổng hợp
từ nấm và vi khuẩn, enzyme được tiết ra trong mơi trường chứa cơ chất xylan và
phân hủy nó thành những oligosaccharide ngắn hơn và những phần này có thể sử
dụng như một nguồn năng lượng cho vi sinh vật. Xylanase được phân thành hai họ
F10 và G11 dựa trên sự tương đồng trình tự chuỗi amino acid và sự phân tích cấu
trúc khơng gian 3 chiều.

a

b

Hinh 1.4: Cấu hình khơng gian của G11 xylanase từ Bacillus subtilis (XYNA)
Phần cấu trúc điển hình nhất của G11 xylanase là chứa 2 vòng xoắn gấp nếp
β được gọi là gấp “jellyroll” (thạch trịn) giống như một bàn tay phải hình 1.4a.
Trong đó những mạch β riêng biệt đan vào và ra tạo thành các vùng ngón tay và
lịng bàn tay như trong hình 1.4b vùng P và F. phần khe nối các phần còn lại được
tạo thành giữa 2 vùng này tạo thành trung tâm hoạt động và gắn cơ chất của protein.
Vịng trịn mở rộng tạo thành vùng dạng ngón cái (vùng T), cái này có thể điều
khiển vị trí đóng mở của trung tâm hoạt động (chứa glutamic ở vị trí 75 và 78) đóng

vai trị điều hịa sự gắn của cơ chất với vùng xúc tác của enzyme [44].
Các amino acid cấu thành xylanase họ 11:

Dương Thị Lương Liên CH09-11

8


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 1.5: Họ 11 xylanase từ Bacillus circulans (1XNB) và Trichoderma harzianum
(1XND)
Từ hình 1.5 ta thấy cấu trúc khơng gian và các amino acid cấu thành hình
dáng của của họ 11 xylanase từ Bacillus circulans và Trichoderma harzianum rất
giống nhau mặc dù nó có khoảng cách di truyền rất lớn một enzyme từ vi khuẩn cịn
một enzyme từ nấm mốc. Vị trí của nhiều amino acid bảo vệ thì được giữ rất gần
nhau. Màu xám thể hiện tờ gấp nếp β hình thành vùng lõm 2 lớp xung quanh vị trí
hoạt động. Màu xám đen thể hiện một vòng xoắn và nén α [56].
1.2.4. Chức năng và cơ chế thủy phân của xylanase
a) Chức năng của xylanase
Xylanase là một enzyme xúc tác thủy phân liên kết 1,4-beta-D-xylose trong
xylan thành phần của hemicellulose, là một trong những thành phần cấu trúc lên
thành tế bào thực vật, làm phá vỡ cấu trúc của thành tế bào giải phóng đường xylose
và giúp các enzyme khác hoạt động thuận lợi và hiệu quả hơn trong quá trình sản
xuất. Arabinoxylan cũng được biết đến như một pentonsan là những xylan phân
nhánh cao trong bột lúa mỳ và bột lúa mạnh đen có hàm lượng xylan cao. Xylanase
thuộc nhóm pentosanase, một nhóm của enzyme phá hủy các thành phần của thành

Dương Thị Lương Liên CH09-11

9


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

tế bào chất nền của thực vật (sợi), bẻ gãy hợp chất đặc biệt trong thành tế bào thực
vật.
Tạo điều kiện để các enzyme tiêu hóa phía sau làm việc hiệu quả do hạn
chế bởi tính nhầy của dịch vùng dạ dày và kích thích tiêu hóa giúp hấp thu chất dinh
dưỡng tốt hơn. Chống lại sự tăng số lượng của vi khuẩn kị khí và giảm tỷ lệ mắc
bệnh đường ruột.
b) Cơ chế hoạt động
Hàng loạt các mơ hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của
xylanase. Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan.
Ở dạng đơn giản (hình 1.6) khi xylan chỉ ở dạng polyme của β-1,4-Dxylopyranosyl thì endo β-1,4-xylanase phân hủy liên kết β-1,4-xylose trong đoạn
polysaccharide thành xylose.

Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của xylanse dạng đơn giản
Do cấu trúc của xylan ở dạng liên kết trong thành tế bào rất phức tạp nên để
phân huỷ hoàn toàn mạch xylan thành các mạch ngắn đơn giản hơn thì xylanase
khơng thể hoạt động một mình mà phải hoạt động cùng với nhiều enzyme khác
(hình 1.7). Endo-1,4-β-D-xylanase phân cắt ngẫu nhiên khung xylan, β-Dxylosidase (EC 3.3.1.37) phân cắt các xylose một cấu tử thành các xylooligosaccharide đầu không khử . Trong khi loại bỏ các nhóm bên của xylobiose thì
được xúc tác bởi α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), α-D-glucuronidase (EC

Dương Thị Lương Liên CH09-11

10


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

3.2.1.139), acetylxylan esterase (EC 3.1.1.72), ferulic acid esterase (EC 3.1.1.73) và
p-coumaric acid esterase.

Hình 1.7: Vị trí tấn cơng của endo-1,4-β-xylanase trên mạch xylan
Sự thủy phân của các enzyme thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase
và xylanase có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm
anomeric của các monomer đường khử của carbonhydrat [10]. Đề xuất này bao gồm
một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học. Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn
đến sự thay đổi tính ái nhân ở C bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự
duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric. Có sự liên quan của cơ chế dịch
chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm.
Cơ chế dịch chuyển kép bao gồm các đặc điểm:
- Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất.
- Một nhóm carboxyl của enzyme ở trạng thái hoạt động

Dương Thị Lương Liên CH09-11

11


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

- Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzyme với
cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên
kết này đối lập với đường của cơ chất.
Các tương tác khơng phải cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [3].

Hình 1.8: Cơ chế thủy phân xylan của 1XNB
a) Cơ chất xylan được gắn vào vị trí lõm tạo thành giữa tyr65 và tyr69.
glu172 là chất xúc tác acid/base, glu78 là tác nhân. b) Glycone được gắn với glu78,
liên kết này được giữ trong suốt phản ứng chuyển glycosyl. c) Nước thay thế tác
nhân. d) Phá bỏ liên kết và làm yếu glycone cho phép enzyme di chuyển đến một vị
trí mới trên cơ chất. Bởi vì aglycone được giải phóng trong (b) và glycone được giải
phóng trong (d). Nhiều xylanase của họ 11 thể hiện một cơ chế cắt trong mạch ngẫu
nhiên hơn là theo một quy luật nhất định [56].
Leggio và các cộng sự (2000) [23] đề xuất cơ chế xúc tác của xylanase qua
3 giai đoạn :
- Xylanase nhận biết và gắn vào xylan.

Dương Thị Lương Liên CH09-11

12


Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

- Gốc xylosyl ở vị trí -1 bị làm biến dạng và bị làm lỏng lẻo hướng về phía
gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên
kết cộng hóa trị enzyme-cơ chất trung gian.

- Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó
cơ chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải
phóng.
1.2.5. Ứng dụng của xylanase
Những enzyme có hoạt tính xylanase là hemicellulase mà xúc tác phản ứng
thủy phân xylan, thường liên kết với các thành phần cellulose và lignin của tế bào
cây. Vì vậy mà các enzyme phân hủy xylan được sản xuất nhờ vi khuẩn Bacillus
macerans. Cơ chất có thể sử dụng như một nguồn cơ chất C dạng rắn lignocellulose
như:
- Ngũ cốc trong bữa ăn
- Lõi ngô
- Cám lúa mỳ
- Cellulose
- Mùn cưa
- Rác thải.
Ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ
- Công nghệ giấy
- Công nghệ enzyme/ kỹ thuật protein/q trình lên men
- Kỹ thuật gene
- Cơng nghệ vi sinh
- Công nghệ thực phẩm
- Công nghệ vi sinh thực phẩm /cơng nghệ chất độc / kiểm sốt chất lượng
- Kĩ thuật mơi trường
- Xử lý sinh học /phân bón /biến đổi sinh học.
Ứng dụng thương mại:
- Ứng dụng kỹ thuật gene công nghiệp

Dương Thị Lương Liên CH09-11

13

Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN

Luận văn thạc sỹ khoa học

- Rượu vang và các loại rượu
- Nước ngọt và thực phẩm tự nhiên
- Thực phẩm cho sức khỏe
- Sản phẩm thực phẩm nói chung
- Cơng nghiệp dệt, giấy và các ngành công nghiệp khác.
Xylanase thường được sử dụng kết hợp với nhiều enzyme khác như
cellulase, mananase, … [20].
Sử dụng trong làm bánh mỳ để cải thiện tính nhão của bột nhào (khả năng
làm việc, tính bền) và để tối ưu quá trình sản xuất quá trình lên men ở điều kiện ôn
hòa hơn. Cải thiện hương vị và mùi vị, tăng cường sự ổn định cho bột nhào, ruột
mềm và mịn, cải thiện cơ cấu ruột bánh, tăng thể tích vỏ giịn, thay thế các hóa chất
phụ gia là do liên quan đến sự tương tác giữa lúa mì và gluten protein arabinoxylan
dẫn đến tăng cường thêm sự co giãn của gluten.
Xylanase có thể sử dụng để trộn vào bánh. Trong sản xuất rượu vang và
nước quả sử dụng xylanase tăng cường khả năng trích ly của quả. Trong cơng nghệ
sản xuất cồn xylanase giải phóng chất nhầy trong hạt ngũ cốc để sử dụng trong quá
trình lên men..
Những ứng dụng khác:
Chất phụ gia cho thức ăn gia súc: thêm vào thức ăn gia súc để tăng khả
năng hấp thụ dinh dưỡng từ thức ăn gia súc để cải thiện khối lượng gia súc, gia cầm
lấy trứng, thịt sữa. Những enzyme này góp phần giúp q trình tiêu hóa thức ăn từ
thực vật thơng qua q trình giải phóng các xylanase trong thực vật. Chúng có thể
cũng được sử dụng trong các q trình tách hạt lúa mỳ.
Trong cơng nghệ in báo xylanase cùng với cellulose tỉ lệ 50:50 sẽ làm cho

giấy báo sau in sáng hơn, nét hơn, chống bẩn tốt hơn, năng suất cũng cao hơn so với
sử dụng chất hóa học.
Trong sản xuất rượu vang xylanase được sử dụng để phân hủy xylan,
pectin và hemicellulose có mặt trong hoa quả thành các phân tử đơn giản như
xylose và glucose. Bằng sự phá hủy thành tế bào, nó giúp chiết các chất trong nước
quả tốt hơn.
Dương Thị Lương Liên CH09-11

14