Nghiên cứu sản xuất xylanase từ nấm mốc và ứng dụng trong sản xuất bánh mỳ

..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------

NGUYỄN THỊ MỸ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT XYLANASE
TỪ NẤM MỐC VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT BÁNH MÌ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà nội - 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------

NGUYỄN THỊ MỸ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT XYLANASE TỪ
NẤM MỐC VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN
XUẤT BÁNH MÌ
CHUN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. TRẦN LIÊN HÀ
Hà nội - 2013


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân
thành tới PGS.TS. TRẦN LIÊN HÀ - Bộ môn vi sinh - Sinh học phân tử - Viện
Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà
nội, đã tận tình định hướng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành
luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên,
sinh viên phịng thí nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học
- Công nghệ thực phẩm - Trường đại học bách Khoa Hà nội đã giúp đỡ tơi tận
tình trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực
phẩm, Viện Sau đại học - Trường đại học bách Khoa Hà Nội cùng các thầy cơ
giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và
người thân đã động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi vượt qua những khó khăn
trong suốt quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2013
Học viên

Nguyễn Thị Mỹ Hương


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu luận văn của tôi. Các kết quả

nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính tốn là hồn
tồn chính xác.
Các dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều
được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc.
Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2013

Nguyễn Thị Mỹ Hương


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APTS

: Hệ thống hai pha chứa nước

APS

: Ammonium persulphate

AX

: Arabinoxylan

BSA

: Bovine serum albumin

CF

: Lúa mì composit

CNSH-CNTP

: Viện công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm

CYA

: Môi trường thạch Czapek-cao nấm men

DEAE

: Diethylaminoethyl

DNS

: Dinitrosalicylic acid

DTT

: Dithithreitol

EDTA

: Ethylene diamine tetraacetic acid

GHF 10

: Glycosit hydrolase họ 10

GHF 11

: Glycosit hydrolase họ 11

kDa

: Kilo Dalton

PEG 6000

: Polyetylen glycol 16%

MEA

: Môi trường thạch malt

OD

: Optical density

SDS-PAGE

: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

XynB

: Xylanase B

v/v

: volume/volume

w/v

: Weight/volume

WE-AX

: Arabinoxylan tan hoặc có thể chiết trong nước

WF

: Bột lúa mì

WU-AX

: Arabinoxylan khơng tan hoặc khơng thể chiết trong nước

ĐC

: Đối chứng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Sơ lược về xylan...................................................................................................3
1.1.1. Khái niệm ......................................................................................................3
1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của xylan ......................................................................3
1.2. Xylanase và sự thủy phân sinh học xylan ............................................................7
1.2.1. Cấu tạo của xylanase .....................................................................................7
1.2.2. Phân loại xylanase .........................................................................................8
1.2.3. Tính chất của xylanase ..................................................................................9
1.3. Phương pháp sản xuất xylanase .........................................................................10
1.4. Phương pháp tinh sạch và mô tả đặc tính của xylanase .....................................11
1.5. Tính an tồn của xylanase ..................................................................................13
1.6. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp sản xuất bánh mì............................13
1.7. Cơng nghệ sản xuất bánh mì và vai trị của xylanase trong sản xuất bánh mì...16
1.7.1. Tình hình sản xuất bánh mì trên thế giới và Việt Nam hiện nay ................16
1.7.2. Quy trình sản xuất bánh mì .........................................................................16
1.7.3. Vai trị của xylanase trong sản xuất bánh mì...............................................22
1.8. Tổng quan về nấm Aspergillus niger .................................................................28
1.8.1. Đặc điểm hình thái của A. niger ..................................................................29
1.8.2. Đặc điểm sinh học của A. niger ...................................................................29
1.8.3. Đặc điểm sinh hóa .......................................................................................30
1.8.4. Đặc điểm của xylanase được tổng hợp từ nấm Asperillus niger .................30
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................32
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................32


2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................32
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................32
2.1.3. Mơi trường ...................................................................................................32

2.1.4. Thiết bị.........................................................................................................33
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................34
2.2.1. Ni cấy hoạt hóa vi sinh vật ......................................................................34
2.2.2. Tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase cao ...........................34
2.2.2.1. Phương pháp cấy chấm điểm ...................................................................34
2.2.2.2. Phương pháp đục lỗ thạch ........................................................................34
2.2.2.3. Phương pháp đo hoạt lực enzym ..............................................................35
2.2.3. Tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase có
hoạt lực cao .................................................................................................35
2.2.4. Dựng đường chuẩn đường Xylose ..............................................................36
2.2.5. Xác định hoạt độ Xylanase bằng DNS ........................................................37
2.2.6. Xác định protein tổng bằng phương pháp Bradford ....................................37
2.2.7. Tinh sạch xylanase bằng phương pháp kết tủa cồn .....................................38
2.2.8. Tinh sạch xylanase bằng phương pháp kết tủa muối ..................................39
2.2.9. Phương pháp tinh sạch xylanase bằng phương pháp màng lọc ...................39
2.2.10. Phương pháp điện di SDS-PAGE (gel polyacrylamide) ...........................40
2.2.11. Phương pháp tinh sạch enzym bằng phương pháp sắc ký lọc gel sephadex
G-100 ........................................................................................................40
2.2.12. Phương pháp khảo sát độ bền của enzym xylanase ..................................41
2.2.12.1. Khảo sát độ bền nhiệt .............................................................................41
2.2.12.2. Khảo sát độ bền pH ................................................................................41
2.2.13. Phương pháp ứng dụng trong sản xuất bánh mì ........................................41
2.2.13.1. Xác định thể tích bánh ............................................................................42
2.2.13.2. Xác định độ mềm của ruột bánh .............................................................42
2.2.13.3. Xác định độ axit của ruột bánh ...............................................................42
2.2.13.4. Xác định độ ẩm của ruột bánh ................................................................43


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................45
3.1. Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính xylanase cao .....................................45

3.1.1. Phương pháp cấy chấm điểm ......................................................................45
3.1.2. Phương pháp đục lỗ thạch ...........................................................................46
3.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực xylanase ....................................................47
3.2. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp xylanase của chủng nấm mốc
A. niger B7 ........................................................................................................48
3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian sinh tổng hợp enzym ..........................................49
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ vòng lắc ...................................................................50
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ Saccarose .............................................................51
3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ Cao nấm men .......................................................52
3.2.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống....................................................................53
3.3. Tinh sạch enzym xylanase .................................................................................54
3.3.1. Tinh sạch enzym xylanase bằng phương pháp kết tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4 bão
hòa ...............................................................................................................54
3.3.2. Tinh sạch enzym bằng màng lọc .................................................................55
3.3.3. Tinh sạch xylanase bằng phương pháp kết tủa cồn .....................................56
3.3.4. Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100 và cột sắc ký trao đổi ion
DEAE ..........................................................................................................57
3.4. Khảo sát độ bền của enzym xylanase .................................................................62
3.4.1. Khảo sát độ bền nhiệt của enzym ................................................................62
3.4.2. Khảo sát độ bền pH của enzym ...................................................................63
3.5. Kiểm tra chất lượng và độc tố của enzym xylanase...........................................63
3.6. Ứng dụng enzym xylanase trong sản xuất bánh mì ...........................................64
3.6.1. Xác định ảnh hưởng của nồng độ xylanase đến thể tích và màu sắc bánh
mì .................................................................................................................65
3.6.2. Xác định ảnh hưởng của nồng độ xylanase đến độ axit của bánh mì .........66
3.6.3. Xác định ảnh hưởng của nồng độ xylanase đến độ ẩm của bánh mì ..........66
3.6.4. Xác định ảnh hưởng của nồng độ xylanase đến cấu trúc của ruột bánh .....67


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................71

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................73
PHỤ LỤC ..................................................................................................................80


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần chính của bột mì và chức năng của các enzym.....................25
Bảng 2.1. Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm ...................................33
Bảng 2.2. Thành phần gel điện di biến tính protein ..................................................40
Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch enzym bằng phương pháp kết tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4
80% ...........................................................................................................54
Bảng 3.2. Hiệu suất thu nhận enzym theo phương pháp dùng màng lọc ..................56
Bảng 3.3. Hiệu suất thu nhận enzym theo phương pháp kết tủa cồn ........................57
Bảng 3.4. Tóm tắt q trình tinh sạch xylanase từ A. niger B7 ................................59
Bảng 3.5. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật của chế phẩm enzym nghiên cứu ..64
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ enzym xylanase đối với thể tích và màu sắc bánh
mì ..............................................................................................................65
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ enzym xylanase đối với độ ẩm của bánh mì .....66
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ enzym xylanase đối với độ mềm của bánh mì ..67


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của xylan và sự thủy phân thành xylose .......................................4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của xylan và vị trí xúc tác của các enzym ......................4
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc thành tế bào thực vật ...........................................................5
Hình 1.4. Sơ đồ minh họa cấu tạo của hạt lúa mì và thành phần chính của nó ..........6
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của xylan ở gỗ cứng (A) và gỗ mềm (B) ........................7
Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể của xylanase... .................................................................9
Hình 1.7. Cơng nghệ sản xuất bánh mì .....................................................................17
Hình 1.8. Ảnh thể hiện sự thay đổi thể tích bánh mì giữa các mẫu ..........................24
Hình 1.9. Hình thái của nấm Aspergillus khi được quan sát dưới kính hiển vi điện

tử ...............................................................................................................29
Hình 2.1. Quy trình tinh sạch xylanase từ A. niger ...................................................41
Hình 3.1. Biểu đồ so sánh tỷ lệ đường kính thủy phân và đường kính khuẩn lạc ....45
Hình 3.2. Hình ảnh nhuộm Lugol của chủng B7 ......................................................46
Hình 3.3. Kết quả so sánh tỷ lệ đường kính thủy phân và đường kính khuẩn lạc ....47
Hình 3.4. Hình ảnh đục lỗ thạch ...............................................................................47
Hình 3.5. So sánh hoạt lực của các chủng nấm mốc bằng phương pháp DNS .........48
Hình 3.6. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp xylanase theo thời gian của chủng A.
niger B7 ....................................................................................................49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hoạt lực xylanase từ Aspergillus niger B7 50
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ saccarose tới khả năng sinh tổng hợp xylanase
của chủng Aspergillus niger B7 ...............................................................51
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men tới khả năng sinh tổng hợp
xylanase của chủng Aspergillus niger B7 ................................................52
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử cấp giống tới khả năng sinh tổng hợp
xylanase của chủng Aspergillus niger B7 ................................................54


Hình 3.11. Điện di đồ SDS-PAGE của A. niger B7 sau khi kết tủa bằng muối
(NH4) 2 SO 4 80% ....................................................................................55
Hình 3.12. Sắc ký đồ trên cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 ..................................57
Hình 3.13. Sắc ký đồ trên cột sắc ký trao đổi ion DEAE..........................................58
Hình 3.14. Điện di đồ SDS-PAGE của A. niger B7 sau khi qua cột Sephadex G100
và cột sắc ký trao đổi ion DEAE ...........................................................58
Hình 3.15. Kết quả điện di đồ SDS-PAGE tổng hợp các kết quả tinh sạch enzym
xylanase từ dịch nuôi cấy chủng A. niger B7 ........................................60
Hình 3.16. Quy trình tinh sạch xylanase từ A. niger B7 ...........................................61
Hình 3.17. Khảo sát độ bền nhiệt của enzym xylanase.............................................62
Hình 3.18. Khảo sát độ bền pH của enzym xylanase ................................................63
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ xylanase đối với thể tích bánh mì....................65

Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ xylanase đối với độ axit của bánh mì ..............66
Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ xylanase đối với độ ẩm của bánh mì ...............67
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ xylanase đối với độ mềm của bánh mì ............68
Hình 3.23. Ảnh chụp bánh mì sau khi bổ sung enzym xylanase ở nồng độ khác
nhau ........................................................................................................70


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Ngành cơng nghiệp sản xuất bánh mì trong một thời gian dài đã trải qua rất
nhiều cải tiến về công nghệ sinh học. Quy trình sản xuất bánh mì đã trở nên hiệu
quả hơn và đáp ứng được sự mong đợi của các nhà sản xuất để tạo ra được các sản
phẩm tốt nhất trong cơng nghiệp. Nói chung, các chất phụ gia hóa học được sử dụng
trong bột mì để cải thiện hiệu suất sản xuất bánh mì có thể có một vài tác dụng
khơng mong muốn. Người ta đã nhận thấy rằng chúng ngày càng ít được sử dụng.
Thay vào đó, ngày nay, trong thực phẩm người ta sử dụng các enzym thay thế các
chất phụ gia hóa học. Việc sử dụng enzym đã trở nên phổ biến, do chúng thúc đẩy
các tác dụng tương tự như tác dụng của các phụ gia hóa học và được xem là các
chất phụ gia tự nhiên an toàn [44].
Ở Việt Nam, bánh mì được sản xuất rộng rãi và phổ biến. Bánh mì là loại thực
phẩm rất khó bảo quản, tuổi thọ của bánh mì ngắn, thêm vào đó nước ta là một
nước nhiệt đới, khí hậu thường ẩm ướt, do đó bánh mì thường nhanh bị hỏng dẫn
đến sự lãng phí lớn về thực phẩm. Thêm vào đó, các sản phẩm có nguồn gốc tự
nhiên và an tồn ngày càng được ưa chuộng nên đòi hỏi nhà sản xuất phải luôn cải
tiến để phù hợp với thị trường. Việc ứng dụng các loại enzym vào quá trình sản xuất
bánh mì đã và đang được phát triển tại nhiều nước trên thế giới. Trong số đó phổ
biến nhất là các loại enzym như amylase và xylanase.

Enzym là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein, enzym tham gia xúc
tác các phản ứng hóa học chuyển đổi cơ chất thành các sản phẩm cụ thể. Chúng
mang tính đặc hiệu về chức năng và tăng tốc độ của phản ứng mà enzym không bị
mất đi. Đây là một trong những yếu tố cơ bản của các quá trình sinh học và ứng
dụng trong một số ngành công nghiệp chế biến thực phẩm.
Xylanase là một enzym ngoại bào thủy phân liên kết β-1,4 D-xylosidic được
polyme hóa ở mức độ cao và β-1,4 đã thế được liên kết với các D-xylobinose,

Nguyễn Thị Mỹ Hương

1


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

xylotriose và glucucoronosyl. Enzym có hiệu lực lớn để phân hủy các vật liệu thành
tế bào thực vật.
Xylanase được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau. Nấm là nguồn
hemixenlulase có hiệu lực nhất. Trong nhiều năm, một số lượng lớn các sinh vật
gồm các chủng Penicillium sp., Trichoderma reesei, Aspergillus nidulans,
Aspergillus Kawachii, Streptomyces và Bacilus pumilus đã được phát hiện để sản
xuất xylanase. Tuy nhiên, hiện nay, Aspergillus niger đã được đánh giá là chủng có
hiệu lực nhất để sinh tổng hợp xylanase. Giống Aspergillus là một nhóm nấm sợi
bao gồm một số lượng lớn các loài. Aspergillus niger thường phát triển trên hầu hết
các loại thực phẩm và vật liệu thải như lá úa, ngũ cốc được bảo quản, phân trộn, các
vật liệu phân hủy khác và biểu hiện theo kiểu hoại sinh.
Xylanase vi sinh vật (β-1,4 D-xylan xylanohydrolase, EC 3.2.1.8) đang được
sử dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau bao gồm chế biến thực phẩm, thức

ăn chăn nuôi, dệt may và công nghiệp giấy. Xylanase là một hướng nghiên cứu tiềm
năng cho việc áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất bánh mì, các cơng trình
ứng dụng xylanase trong chế biến bánh mì được thực hiện thành cơng tại nhiều nơi
trên thế giới [37].
Chính vì tầm quan trọng và khả năng ứng dụng hiệu quả trên của xylanase,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất xylanase từ nấm
mốc và ứng dụng trong sản xuất bánh mì”.
Nội dung nghiên cứu gồm:
- Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính xylanase cao
- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng lựa chọn để sản sinh xylanase ở mức
cao nhất
- Tinh sạch enzym xylanase
- Xác định đặc tính của xylanase
- Ứng dụng của enzym xylanase trong cơng nghiệp sản xuất bánh mì.

Nguyễn Thị Mỹ Hương

2


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về Xylan
1.1.1. Khái niệm
Xylan là một polysacarit chủ yếu trong thành tế bào thực vật, đứng thứ hai sau
xenlulose chiếm gần một phần ba cacbon hữu cơ có thể phục hồi trên trái đất. Xylan
có D-xylose là những tiểu đơn vị chính và một phần là L-arabinose. Sau xenlulose,

xylan là polysacarit phong phú nhất trong tự nhiên. Xylan và xenlulose là hai
polysacarit được tìm thấy nhiều nhất trong thành tế bào của thực vật trên cạn [3].
1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của xylan
Xylan có thể chiếm từ 15-30% trọng lượng khô ở gỗ cứng từ thực vật hạt kín,
từ 7-10% trong gỗ mềm từ thực vật hạt trần và dưới 30% trong cây hàng năm. Thực
vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl được nối với nhau bằng liên kết β-1,4, tảo
biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác là D-xylose nối với nhau bằng
liên kết β-1,3. Ở một vài lớp Chlorophycaea khơng có sự hiện diện của xenlulose,
xylan tạo nên vật liệu hình sợi trong suốt.
Cấu trúc hóa học của xylan có mối quan hệ với nguồn gốc cũng như vị trí
trong tế bào của chúng. Mối quan hệ này dẫn đến một mức độ nhất định các phức
hợp chứa xylan có cấu trúc liên quan với nhau nhưng khác nhau một số tính chất
đặc biệt. Xylan của thực vật trên cạn có mặt ở rất nhiều vị trí của thành tế bào trên
các mơ bị lignin hóa, chúng cũng được tìm thấy ở một số lồi thực vật khác như rêu,
dương xỉ. Ở vị trí phía trong của thành tế bào, xylan liên kết với những thành phần
cấu trúc khác, đặc biệt với vi sợi xenlulose, với những polyme không phải xenlulose
khác, và trong hầu hết các trường hợp là lignin. Xylan liên kết với lignin bằng liên
kết hydro và axit phenol bằng liên kết hóa trị.

Nguyễn Thị Mỹ Hương

3


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Cơng nghệ sinh học

Hình 1.1. Cấu trúc của xylan và sự thủy phân thành xylose [29]

Xylan là một loại hemixenlulose chính và sự thủy phân nó phụ thuộc vào hai
lớp enzym. Endoxylanase (EC 3.2.1.8) phân cắt khung xylan thành các phần nhỏ
hơn như oligosacarit được rút ngắn thành xylose bởi xylosidase (EC 3.2.1.37).
Trong một vài thập kỷ gần đây, xylan và phức chất enzym thủy phân được ứng
dụng rộng rãi trong sản xuất bánh mì, bổ sung vào thức ăn gia súc, chế phẩm đồ
uống, nguyên liệu dệt, tẩy trắng bột giấy xenlulose, sản xuất ethanol và xylitol.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của xylan và vị trí xúc tác của các enzym [18]

Thành tế bào thực vật là một vật liệu composit trong đó xenlulose,
hemixenlulose (chủ yếu là xylan) và lignin được kết hợp chặt chẽ với nhau. Xylan
là một polysacarit phong phú thứ hai trong tự nhiên và là thành phần chính trong
thành tế bào thực vật gồm có các xylopyranosyl được liên kết tại vị trí β-1,4. Cấu

Nguyễn Thị Mỹ Hương

4


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

trúc của xylan đã được nhận thấy trong các thành tế bào thực vật có khác biệt lớn
phụ thuộc vào nguồn gốc và các cấu trúc khác nhau của chúng được gắn vào khung
xylan. Mặc dù hầu hết các xylan có cấu trúc mạch nhánh, tuy nhiên một vài
polysacarit mạch thẳng cũng được phân lập [17]. Lignin được liên kết với xylan bởi
mối liên kết este với axit 4-O-metyl-D-glucoronic. Các mối liên kết này trong
lignoxenlulose có thể bị phá vỡ bằng cách sử dụng các phương pháp tiền xử lý khác
nhau tạo ra hầu hết các thành phần của polysacarit do sự thủy phân enzym.

Xylan

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc thành tế bào thực vật [50]

Trong tất cả các trường hợp này, khơng thể loại bỏ được hồn tồn các xyloxyl
khỏi các kết cấu sợi. Các xylosyl cịn lại khó có thể tiếp cận được các enzym thuộc
xylanase do sự có mặt của các phần thay thế; sự biến đổi tổng hợp sợi và sự xuất
hiện xylan cùng với các polysacarit khác. Có rất nhiều các nghiên cứu đề xuất rằng
xenlulose được bảo vệ khỏi các xenlulase do xylan và mannan. Khi xylan và
mannan được loại bỏ một cách chọn lọc khỏi sợi được kiềm hóa, thì xenlulose cịn
lại khó có thể tiếp cận được với sự thủy phân xenlulase. Tuy nhiên, sự thủy phân sơ
bộ tương tự với xenlulose hoặc mannan khơng cải thiện được tính có thể tiếp cận
của xylan với xylanase. Sự loại bỏ chọn lọc của xylan làm tăng tính tiếp cận của các
polysacarit khác do độ xốp của sợi tăng có tương quan dương với sự thủy phân
xenlulose trong các sợi đã tiền xử lý [25].

Nguyễn Thị Mỹ Hương

5


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

Trong ngũ cốc, arabinoxylan là các polysacarit phi tinh bột chính. Chúng tạo
thành 4-8% phần của hạt lúa mạch và chiếm 25 và 70% polysacarit trong thành tế
bào của lớp nội nhũ và hạt alơron. Các arabinoxylan phần lớn hòa tan trong nước và
làm cho dung dịch chứa nước có độ nhớt lớn. Xylan của ngũ cốc chứa một lượng

lớn L-arabinose và do đó, thường được đề cập đến dưới dạng arabinoxylan trong
khi, các xylan trong gỗ cứng thường được đề cập đến dưới dạng glucoronoxylan do
một lượng lớn axit D-glucoronic được gắn vào khung. Arabinose được nối với
khung của xylan thông qua mối liên kết α-1,2 hoặc α-1,3 hoặc là các chuỗi đơn hoặc
là các chuỗi phụ ngắn. Các chuỗi phụ cũng chứa xylose được liên kết tại vị trí α-1,2
với arabinose, và galactose, có thể được liên kết tại vị trí β-1,5 với arabinose hoặc
được liên kết tại vị trí α-1,4 với xylose [17].
Thành phần chính của các polysacarit phi tinh bột trong bột lúa mì là pentosan
(chủ yếu là arabinoxylan, AX). Arabinoxylan xuất hiện dưới dạng thành phần phụ
của hạt lúa mì (2-3%), có thể được chia thành arabinoxylan tan hoặc có thể chiết
trong nước (WE-AX) và arabinoxylan khơng tan hoặc không thể chiết trong nước
(WU-AX). Tuy nhiên, chúng đóng một vai trị quan trọng đối với tính lưu biến học
của bột nhào và chất lượng của bánh mì [14]. Rất nhiều các nghiên cứu dựa trên vai
trò chức năng của pentosan đối với sự nở của bột nhào đã được tiến hành để nghiên
cứu tác dụng của chúng đối với các đặc tính của bánh mì [6].
Thành phần chính của lúa mì:

Hình 1.4. Sơ đồ minh họa cấu tạo của hạt lúa mì và thành phần chính của nó (Danisco,
11/2006)

Nguyễn Thị Mỹ Hương

6


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

1.2. Xylanase và sự thủy phân sinh học xylan

1.2.1. Cấu tạo của xylanase
Xylanase là một nhóm enzym xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β-1,4D-xylosidic trong xylan. Trong đó quan trọng nhất là endo-1,4-β-D-xylanase (EC
3.2.1.8).
Xylanase về mặt di truyền là một chuỗi đơn glycoprotein, có kích thước từ 6
đến 80kDa, hoạt động ở pH nằm trong khoảng từ 4,5 đến 6,5, ở nhiệt độ nằm trong
khoảng từ 40 đến 60oC. Xylanase từ các nguồn khác nhau có các đặc điểm khác
nhau về điều kiện phản ứng như nhiệt độ. Enzym thủy phân hồn tồn xylan thành
monosacarit cấu thành của nó địi hỏi sự tác động đồng thời của một nhóm các
enzym thuộc xylanase. Enzym quan trọng nhất là endo-1,4-xylanase (EC 3.2.1.8)
bắt đầu biến đổi xylan thành xylo-oligosacarit. β-xylosidase, enzym cắt nhánh (Larabinofuranosidase và glucuronidase) và esterase (axetyl xylan esterase, feruloyl
esterase) cho phép phân hóa xylo-oligosacarit thành các thành phần monome của
chúng [4, 33].

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của xylan ở gỗ cứng (A) và gỗ mềm (B). Các mũi tên chỉ ra
các vị trí tác dụng của các enzym phân hủy xylan [38]

Nguyễn Thị Mỹ Hương

7


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

1.2.2. Phân loại xylanase
Tính khơng đồng nhất và phức tạp của xylan đã dẫn đến tính đa dạng của
xylanase với các đặc trưng khác nhau, đầu tiên là về trình tự và cấu trúc. Xylanase
được phân thành hai nhóm dựa trên các đặc tính lý hóa của chúng: nhóm 1 có khối
lượng phân tử nhỏ hơn 30kDa và pI bazơ, và nhóm 2 có khối lượng phân tử lớn hơn

30kDa và pI axit. Tuy nhiên, rất nhiều loại xylanase, đặc biệt là xylanase từ nấm,
không thể được phân loại theo hệ thống này [30].
Một hệ thống phân loại hoàn chỉnh hơn đã được đưa ra cho phép phân loại
không chỉ xylanase mà cịn cả glycosidase nói chung. Hệ thống này đã trở thành
phương tiện tiêu chuẩn để phân loại các enzym này. Nó dựa trên việc so sánh cấu
trúc chính của miền xúc tác và phân loại các enzym trong các họ có trình tự liên
quan.
Sự phân tách hồn tồn các liên kết glycosit trong xylan cần rất nhiều loại
enzym phân cắt chuỗi chính và các nhóm bên. Những enzym phân cắt nhóm
glycosyl trên mạch chính bao gồm endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanohydrolase,
exoxylanase (β-1,4-D-xylan xylohydrolase). Chúng được chia thành hai nhóm dựa
trên sự tương đồng trong trình tự axit amin của chúng: Họ 10 hay cịn gọi là họ F10,
bao gồm những protein có trọng lượng phân tử cao và có điểm đẳng điện thấp, họ
11 cịn gọi là G11 bao gồm những protein có trọng lượng phân tử thấp và 11 là khả
năng có thể tấn công các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu
không khử. Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không
thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl
liên tiếp không thay thế. Các endo-xylanase của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl
ở đầu tận cùng gắn với motọ gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể
hiện hoạt độ aryl-β-D-xylosidase [4].

Nguyễn Thị Mỹ Hương

8


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Cơng nghệ sinh học

A

B

Hình 1.6. A: Cấu trúc tinh thể của xylanase Họ 10 từ Streptomyces lividans; B: Cấu trúc
tinh thể của xylanase Họ 11 từ Aspergillus niger

Glycosit hydrolase họ 10 (GHF 10) gồm endoxylanase (EC 3.2.1.8), endo-1,3β-xylanase (EC 3.2.1.32) và cellobihydrolase (EC 3.2.1.91). Enzym chính của họ
này là endoxylanase xúc tác thủy phân đoạn xylo-oligosacarit. Tuy nhiên, nghiên
cứu về tính đặc hiệu cơ chất cho thấy rằng GHF 10 khơng hồn tồn đặc hiệu với
xylan. Chúng cũng hoạt động trên cơ chất xenlulose có trọng lượng phân tử thấp
[40].
Endoxylanase GHF 11 là xylanase hoạt động trên cơ chất chứa D-xylose, giải
phóng các đoạn oligosacarit dài, sản phẩm có thể được thủy phân bởi các enzym
của GHF 10. Các GHF 11 có trọng lượng phân tử thấp (xấp xỉ 20KDa), pI cao và
thủy phân các liên kết glycosit với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần, hai phân tử
glutamat hoạt động như những chất xúc tác và pH tối ưu trong phạm vi từ 2 đến 9
[12].

1.2.3. Tính chất của xylanase
Các enzym khác nhau có thể có hiệu quả hơn đối với sự thủy phân xylobiose,
xylo-oligosacarit được thế, các phần thay thế xylosyl hoặc oligosacarit chứa xylosyl
và các chuỗi khác. Các dạng khác nhau cũng có thể làm thay đổi khả năng tương tác
với các xylanase khi thủy phân xylan. Ba xylosidase có thể được phân loại thành

Nguyễn Thị Mỹ Hương

9

Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

‘exoxylanase’ do chúng có tác dụng đối với xylan. Hai trong số các enzym này
khơng có hoạt tính transferase và một enzym gây ra sự biến đổi về cấu hình (ban
đầu thu được α-D-xylose trong khi thủy phân), là một đặc tính được sử dụng để
phân biệt giữa β-glucosidase và exoglucanase [47]. Hơn nữa, exoglucanase từ
Trichoderma viride đã được chỉ ra để tấn công xylan theo kiểu đầu dựng ngược để
ban đầu thu được xylobiose. Exoxylanase làm tăng tốc độ thủy phân xylan bằng
cách tấn cơng các xylo-oligosacarit có khối lượng phân tử lớn, được giải phóng bởi
endoxylanase và được thủy phân không hiệu quả bởi β-xylosidase. Điều này không
được mong đợi để làm tăng tốc độ thủy phân trừ khi cần có các yếu tố khác ví dụ
tính tiếp cận các mối liên kết xylosidic trong các xylo-oligosacarit ngắn và/hoặc
mạch nhánh, làm giảm sự ức chế các sản phẩm, hoặc lượng β-xylosidase ngoại bào.
Xylan thường được phân cắt tại các vùng không được thế để thu được hỗn hợp của
các xylo-oligome không được thế, cũng như các xylo-oligome được thế chuỗi dài.
Sự loại bỏ các nhóm thay thế bằng các enzym hỗ trợ tạo ra các cơ chất mới cho hoạt
động của endoxylanase (EC 3.2.1.8) [53].
1.3. Phương pháp sản xuất xylanase
Các kỹ thuật công nghệ sinh học khác nhau như lên men chìm và lên men bán
rắn được sử dụng để sinh tổng hợp xylanase [9]. Lên men chìm có hiệu quả nhất khi
được so sánh với các kỹ thuật khác do tính sẵn có của các chất dinh dưỡng, sự cung
cấp đủ oxy và cần ít thời gian lên men hơn. Việc sản xuất các xylanase vi khuẩn
được ưu tiên đối với các nguồn thực vật và động vật do đặc tính của chúng, độ ổn
định về cấu trúc và điều khiển di truyền dễ dàng [5].
Trong những năm gần đây, số lượng các sinh vật gồm các chủng Penicillium
spp, Trichoderma reesei, Aspergillus nidulans, Aspergillus Kawachii, Streptomyces
và Bacilus pumilus đã được sử dụng để sinh tổng hợp xylanase. Tuy nhiên
Aspergillus niger được mơ tả là sinh vật có hiệu lực cao nhất để sinh tổng hợp

xylanase [56].

Nguyễn Thị Mỹ Hương

10


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

Aspergillus niger đã được nghiên cứu để tổng hợp xylanase và có hoạt độ
xylanase lớn nhất (26,7 U/ml) sau 48 giờ nuôi cấy [22]. Trong khi đó Chen et al
(1999) đã thu enzym tối đa (357,2 U/ml) ở nhiệt độ 28-32oC sau 60 giờ nuôi cấy.
Tuy nhiên trong một nghiên cứu khác Aspergillus niger A-20 sinh tổng hợp enzym
có hoạt tính cao trong bình ni cấy có lắc khi lên men trong khoảng thời gian 5
ngày [32].
Trong các nghiên cứu về sinh tổng hợp xylanase từ Aspergillus niger bằng
cách sử dụng polyme xylan tinh khiết, cám lúa mì, bã mía và rơm rạ, đã phát hiện ra
rằng cám lúa mì cung cấp cho hoạt động tối ưu của xylanase nhiều hơn so với các
cơ chất khác [21].
Chủng đột biến Aspergillus niger NCIM 1207 khi thử nghiệm sản xuất
xylanase, CMCase và β-glucosidase, nó tiết ra rất ít các enzym trong mơi trường
ni cấy. Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân đột biến UV-10 và UVIII-39 cho thấy
năng suất sinh xylanase tăng cao gấp hai lần so với các chủng dại ni trong bình
lắc [23].
Một nghiên cứu về xylanase được sản xuất từ Aspergillus ochraceus sử dụng
cả hai phương pháp lên men: lên men môi trường lỏng và lên men bán rắn. Enzym
được tinh sạch bằng cách sử dụng kết tủa amoni sulfat và lọc gel. PH tối ưu cho
enzym là 6,0 [7].

Một nghiên cứu khác về sàng lọc chủng Aspergillus niger C-2 từ đất và được
xử lý bằng UV và EMS để thu các khuẩn lạc đột biến và nghiên cứu các điều kiện
để lên men chìm. Enzym được sản xuất có độ ổn định nhiệt kém và khi được ủ ở
nhiệt độ 55oC trong khoảng thời gian một giờ, nó bị mất đi 60% độ ổn định [11].
A. niger CCMI 850 đã được nghiên cứu để sản xuất enzym thuộc xylanase
trong canh trường theo mẻ với xylan 4% làm nguồn cacbon. Hoạt lực tối đa của βxylanase bằng 65 U/ml được quan sát trong thử nghiệm [13].
1.4. Phương pháp tinh sạch và mơ tả đặc tính của xylanase

Nguyễn Thị Mỹ Hương

11


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

Trong quá trình sản xuất enzym, mơi trường phát triển có một vài quy trình
chuyển hóa khơng mong muốn của các vi sinh vật dẫn đến hoạt tính enzym thấp
hơn. Các enzym được tinh chế có hoạt tính cao, mức độ nguy hiểm của các cơ chất
có hại ít hơn và ứng dụng tốt hơn cho sản phẩm đặc biệt. Hơn nữa, sự mơ tả đặc
tính enzym là rất quan trọng để đạt được hiệu suất tốt hơn trong các ứng dụng cụ
thể; vì nó cung cấp các thơng tin có liên quan đến điều kiện thích hợp để enzym
hoạt động.
Một nghiên cứu đã sử dụng A. niger BRFM281 trong bình lên men lắc để sản
xuất một lượng lớn XynB và được đưa ra có hiệu suất bằng 900mg/L. Enzym tái tổ
hợp được tinh sạch gấp 1,5 lần bằng phương pháp sắc ký ái lực kim loại cố định với
hiệu suất thu hồi enzym bằng 71%. Trong khi mơ tả đặc tính enzym, phát hiện ra
rằng enzym có trọng lượng phân tử bằng 23kDa, pH tối ưu bằng 5,5 và nhiệt độ tối
ưu bằng 50oC. Enzym ổn định với pH nằm trong khoảng từ 4,0 đến 7,0 và nhiệt độ

lớn hơn 50oC [2].
Xylanase kiềm được tinh sạch từ môi trường lên men xylanase thô được chiết
trong hệ thống hai pha chứa nước (ATPS) gồm có polyetylen glycol 16% (PEG
6000) và muối phosphat 6,0%. Hiệu suất tinh sạch bằng 57 và 41% hoạt tính enzym
được tính cho hệ thống chứa PEG 6000 16%, K 2 HPO 4 8% và NaCl 12% [19].
Xylanase đã được tách ra từ dịch lọc canh trường thô của Aspergillus spp. 5 và
Aspergillus spp 44 sử dụng kết tủa ái lực. Hiệu suất thu enzym bằng 83,5 và 82,7%
theo thứ tự bởi Aspergillus sp 5 và Aspergillus sp 44 [20].
Một nghiên cứu đã chỉ ra khi tiến hành các bước tinh sạch khác nhau, hàm
lượng protein tổng bị giảm trong mỗi bước tinh sạch trong khi hoạt tính đặc trưng
tương ứng với mỗi bước tinh sạch trong dịch chiết thô là 33,79 U/mg [10].
Trong một nghiên cứu khác, phần lọc thô được tiết ra bởi Aspergillus sp được
tinh sạch bằng cách kết tủa amoni sulfat, nó làm tăng hiệu suất tinh sạch, hoạt tính
đặc trưng và hiệu suất tinh sạch tăng lên là 62%, 51,89 và 2,15 [22].

Nguyễn Thị Mỹ Hương

12


Luận văn thạc sỹ kỹ thuật

Công nghệ sinh học

Một nghiên cứu khác đưa ra rằng khi xylanase được tinh sạch bằng lọc gel sử
dụng sephadex G-75, thu được protein tổng, hoạt tính đặc trưng và hiệu suất tinh
sạch bằng 2,0mg, 635 và 18,8 [10].
Xylanase có hoạt tính trong phổ pH và nhiệt độ rộng, tuy nhiên pH và nhiệt độ
tối ưu được phát hiện là 6,0 và 75oC [16].
1.5. Tính an toàn của xylanase

Các chế phẩm enzym được sử dụng cho mục đích cuối cùng là dành cho con
người, do đó nó phải khơng chứa các chất gây nguy hiểm cho sức khỏe; thường
chúng phụ thuộc vào các thử nghiệm trên động vật thử nghiệm về các vấn đề có liên
quan đến tính an tồn của chúng. Cùng với các enzym khác, xylanase được ứng
dụng trong lĩnh vực thức ăn gia súc để cải thiện năng suất chăn nuôi và chất lượng
thịt.
Hiệu quả của hỗn hợp các enzym tinh khiết (CMCase, hemixenlulase và
pectinase) và enzym thương mại Energex đối với hiệu suất tăng trưởng và quá trình
trao đổi chất của gà giị, đưa ra chế độ ăn ngơ-đậu tương. Gà được ni với chế độ
có bổ sung enzym có trọng lượng tăng so với đối chứng là kết quả của sự cải thiện
tỷ lệ biến đổi thức ăn. Nhóm enzym được trộn chỉ ra có sự cải thiện hơn về trọng
lượng của thịt và cơ bắp, sự chuyển hóa chất hữu cơ và protein thô. Việc xử lý
enzym dẫn đến trọng lượng chất béo ở bụng giảm [51].
Chế độ giàu dinh dưỡng, có hoặc khơng bổ sung Avizyme 1500 0,1%
(xylanase, protease, và amylase) được áp dụng cho gia cầm. Chim được cho ăn theo
chế độ được bổ sung Avizyme có thể trọng cao hơn đáng kể, tỷ lệ chết giảm và
lượng lớn hơn năng lượng thực từ các chế độ ăn của chúng khi so sánh với nhóm
đối chứng [8].
1.6. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp sản xuất bánh mì

Nguyễn Thị Mỹ Hương

13