Đồ án tốt nghiệp nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai lớp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ
THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN
Q TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY
SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Trịnh Thị Lan Anh
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1411100609

: Nguyễn Thị Kim Ngân
Lớp: 14DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố và hệ thống

LED lên q trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro của cây sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới
sự hướng dẫn của TS. Trịnh Thị Lan Anh. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề
tài này là trung thực chưa được ai cơng bố dưới bất kỳ hình thức nào và không trùng lặp
với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề
tài này đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong đề tài đã được ghi rõ nguồn gốc.
Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này.
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Ngân


ii

LỜI CẢM ƠN
Warren Buffett cũng đã từng nói rằng: “Nếu muốn đi nhanh hãy đi một mình, nếu
muốn đi xa hãy đi cùng nhau”. Câu nói ấy quả thật khơng sai, trong suốt q trình hồn
thành đề tài của mình, em đã được sự quan tâm chăm sóc và dạy dỗ từ Cô TS. Trịnh Thị
Lan Anh. Em xin chân thành và trân trọng cảm ơn sự ân cần dạy bảo và những yêu
thương mà cô dành cho em, cũng như là các thế hệ sinh viên. Cảm ơn cô vì cơ khơng
chỉ là người giảng viên đầy tâm huyết đã cho em hành trang kiến thức vững vàng để
vững bước trên con đường nghiên cứu khoa học, mà cô cịn u thương em như người
thân trong một gia đình, luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em để em sống trọn vẹn với
cái tuổi đôi mươi tại giảng đường đại học.
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô, các Anh Chị nhân viên phịng thí
nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Thành Phố
Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em trong suốt q trình hồn thành đề tài
này. Có người từng nói: “Đời cho ta bao lần đơi mươi”. Tuổi đôi mươi là lứa tuổi đẹp
nhất của mỗi người trong chúng ta. Tuổi đôi mươi của em thật đẹp khi là sinh viên
ngành Công nghệ sinh học của Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học

Công nghệ HUTECH. Trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại giảng đường đại học
dưới sự chỉ dạy tận tình và được sự hỗ trợ nhiệt tình từ các thầy cơ, em đã được học tập
và cháy hết mình với lứa tuổi đơi mươi của mình trog các hoạt động tại Viện, tại
Trường.
Em xin chân thành cảm ơn bạn Thảo và em Hải đã hỗ trợ tận tình và giúp đỡ em
như người thân trong gia đình.
Và để có được thành cơng của ngày hơm nay, có em của ngày hơm nay thì khơng
thể khơng nhắc đến tình u thương và sự ủng hộ từ phía gia đình. Gia đình đã là hậu
phương vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn, thử thách trong cuộc sống và tiếp
thêm nghị lực cho con. Con cảm ơn Ông Bà ngoại, Ba Mẹ và Cậu đã dạy dỗ, dìu dắt con
từ khi chập chững bước đi cho đến khi lớn khôn thành người, luôn cho con những điều
tốt nhất. Công ơn trời biển và tình u thương vơ bờ bến của gia đình là món quà lớn
nhất và quý giá nhất mà con được nhận. Con xin biết ơn gia đình vì đã luôn bên cạnh,
ủng hộ và động viên con trên mỗi bước đường mà con đã chọn.


iii

Vì kiến thức bản thân cịn hạn chế, trong q trình thực tập, hồn thiện đề tài này
em khơng tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ
q thầy cơ.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 07 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Ngân


iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN....................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................ ii
MỤC LỤC .................................................................................................................................. iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................................. xii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1
1.2. Tầm quan trọng của đề tài .................................................................................................... 1
1.3. Ý nghĩa của đề tài ................................................................................................................. 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................................... 3
1.4. Lý do chọn đề tài .................................................................................................................. 4
2. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................................ 4
3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................................. 6
4. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................................ 7
5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 8
6. Các kết quả đạt được của đề tài ........................................................................................... 8
7. Kết cấu của đề tài................................................................................................................... 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 10
1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor ........................................................................... 10
1.1.1. Khái niệm vi nhân giống ................................................................................................... 10
1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor .............................................................................................. 10
1.1.2.1. Than hoạt tính ................................................................................................................. 11
1.1.2.2. Saccharose ...................................................................................................................... 12
1.1.2.3. Bạc nitrate ....................................................................................................................... 13
1.1.3. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc ......................................................................................... 13
1.1.4. Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống .......................................................................... 15
1.1.4.1. Vai trị của ánh sáng đối với q trình quang hợp ở thực vật......................................... 15

v

1.1.4.2. Vai trị của ánh sáng đối với q trình sinh trưởng và phát triển của thực vật............... 16
1.1.4.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro .............................................................. 18
1.1.4.4. Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay ........................... 19
1.1.5. Đèn LED (Light Emitting Diode) ...................................................................................... 22
1.1.5.1. Giới thiệu đèn LED ........................................................................................................ 22
1.1.5.2. Ưu, nhược điểm của đèn LED ........................................................................................ 23
1.1.5.3. Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong
nuôi cấy in vitro .................................................................................................................. 24
1.1.5.4. Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam .............. 27
1.1.6. Ánh sáng đối với thực vật .................................................................................................. 28
1.1.6.1. Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật .................................... 28
1.1.6.2. Vai trò của ánh sáng đến quá trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật................ 30
1.2. Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 33
1.2.1. Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng
phương pháp Sắc ký lớp mỏng ........................................................................................... 33
1.2.2. Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................................ 34
1.3. Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................. 37
1.3.1. Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............. 37
1.3.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................................. 38
1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển ................................................................................... 39
1.3.4. Đặc điểm phân bố .............................................................................................................. 40
1.3.5. Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)............................. 40
1.3.5.1. Nhân giống từ hạt ........................................................................................................... 40
1.3.5.2. Nhân giống in vitro ......................................................................................................... 42

1.3.6. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 42
1.3.6.1. Thành phần hóa học........................................................................................................ 42
1.3.6.2. Tác dụng dược lý ............................................................................................................ 43


vi

1.3.7. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 45
1.3.7.1. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) trên thế giới .......................................................................... 45
1.3.7.2. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam ........................................................................... 46
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 50
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài .................................................................................. 50
2.1.1. Địa điểm ............................................................................................................................ 50
2.1.2. Thời gian ............................................................................................................................ 50
2.2. Vật liệu ................................................................................................................................. 50
2.2.1. Nguồn mẫu ........................................................................................................................ 50
2.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy...................................................................................... 50
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................................ 51
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 51
2.3.1. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn .......................................................... 53
2.3.2. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp ................................................... 54
2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................................... 55
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ...................................... 55
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 55

2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng
trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 56
2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng
trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 57
2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏvàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................................ 58


vii

2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của ni cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm
ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) in vitro ................................................................................................................. 59
2.4.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành
phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ................................................... 60
2.5. Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro......... 62
2.6. Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của q trình ni cấy in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp ............... 62
2.6.1. Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ................................ 62
2.6.2. Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) ............................................................. 63
2.7. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................................... 64
2.8. Thống kê và xử lý số liệu ..................................................................................................... 64
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 65
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 65
3.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................... 68
3.3. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................................ 71
3.4. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng,
tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................ 74
3.5. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng
trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 76
3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của ni cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến
khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .............. 80
3.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi
trường hai lớp) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................................ 82


viii

3.8. Hình thái Giải phẫu củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) .............................................................................................................................. 88
3.9. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng ............................................................................. 90
3.10. Định lượng saponin trong củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in
vitro sau 16 tuần nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................... 90
KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 94
PHỤ LỤC


ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AC

Than hoạt tính

BA

Benzyladenine

BAP

6-Benzyl Amino Purin

DNA

Deoxyribonucleic Acid

GA3

Acid gibberellic

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng cao áp

IAA

Acid b-Indolyacetic

IBA

Acid b-Indolybutyric

IFR

Cường độ ánh sáng đỏ xa

IR

Cường độ ánh sáng đỏ

KH2PO4

Monopotassium phosphate

KH&CN

Khoa học công nghệ

Kin

Kinetin

LED

Light-Emmitting Diode

MS

Murashige và Skoog, 1962

NAA

Acid a-naphtaleneacetic

NaClO

Sodium hypocloride

SH

Schenk và Hildebrandt (1972)

TDZ

Thidiazuron

TLC

Sắc ký lớp mỏng

UFLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao siêu nhanh

WPM

Woody Plant Medium

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid


x

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet) ............................................................... 15
Hình 1.2. A. Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang
hợp; B. Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn
Internet) ................................................................................................................... 17
Hình 1.3. Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED. a. Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70%
LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b. LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam,
2012) ........................................................................................................................ 22
Hình 1.4. Hệ thống ni cấy LED truyền điện khơng dây (Wireless power transfer – LED
uni-Pack (WPT - LP)). a. Thiết bị phát; b. Thiết bị thu; c.d. Hoạt động của hệ
thống (Nguyễn Bá Nam, 2012)................................................................................ 27
Hình 1.5. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng................................................................. 34
Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC................................................ 36
Hình 1.7. Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC ......................................................... 36
Hình 1.8. Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) ....... 37
Hình 1.9. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet).................. 38
Hình 2.1. Mơ hình thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn a. Hệ thống chiếu
sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu
sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ ........................... 53
Hình 2.2. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công. a. Hệ
thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ
thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ ....... 53
Hình 2.3. Mơ hình hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED kết hợp a. 100% LED đỏ (ĐC);
b. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED

xanh dương; d. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương ............................ 54
Hình 2.4. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp sau khi thiết kế và thi công. a.
Tỷ lệ chiếu sáng 100% LED đỏ (ĐC); b. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED
vàng; c. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. Tỷ lệ 50% LED
vàng kết hợp 50% LED xanh dương ....................................................................... 54
Hình 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. A0,


xi

A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là
0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 g/L ....................................................................... 67
Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi
cấy. B0, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 tương ứng với nồng độ saccharose lần
lượt là 30; 40; 50; 60; 70; 80 g/L........................................................................... 70
Hình 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy.
C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ AgNO 3 lần lượt là 0;
0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mg/L ...................................................................... 73
Hình 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi
cấy. D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với với nguồn sáng là đèn huỳnh quang;
LED trắng; LED vàng; LED xanh dương; LED đỏ .............................................. 75
Hình 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần
nuôi cấy. G0, G1, G2, G3 tương ứng với với các tỷ lệ 100% đỏ; 50% đỏ:50%
vàng; 50% đỏ:50% xanh dương và 50% vàng:50% xanh dương .......................... 79
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả

năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
sau 3 tuần nuôi cấy. L0, L1, L2 tương ứng với trạng thái nuôi cấy là rắn
(agar), lỏng tĩnh, lỏng lắc ...................................................................................... 81
Hình 3.7. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng
tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ............................................................................... 83
Hình 3.8. Ảnh chụp hiển vi soi nổi hình thái cây và củ Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy ................................... 87
Hình 3.9. Cấu tạo củ Sâm Ngọc Linh Ngọc in vitro sau 16 tuần ni cấy............................ 88
Hình 3.10. Ảnh chụp hình thái giải phẫu dưới kính hiển quang học củ Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy; a) Lát cắt dọc chồi
mọc từ củ; b) Lát cắt ngang củ; c1) Lát cắt ngang mô củ, c2) Hình thái tế bào


xii

mô củ, c3) Mô củ với tế bào nhân bắt màu hồng đậm (mũi tên), c4) Hình thái
bó mạch trong lát cắt dọc củ .................................................................................. 89
Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức ĐC (nuôi cấy trên
môi trường agar một lớp: không than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx
vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần ni cấy ................................................ 91
Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên
mơi trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx
vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ................................................ 91


xiii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật (Trần Thị

Hồng Thúy, 2014) .................................................................................................. 18
Bảng 1.2. Thành phần hoá học chung của Sâm Ngọc Linh .................................................... 43
Bảng 1.3. So sánh thành phần và hàm lượng của saponin trong Sâm Ngọc Linh và các
lồi Sâm nhóm 1 .................................................................................................... 44
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 55
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 56
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 57
Bảng 2.4. Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 58
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED cải tiến hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏxanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 59
Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng)
đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) ................................................................................................................ 60
Bảng 2.7. Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường ni cấy đến
khả năng tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ........................................................ 61
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy .. 65
Bảng 3.2. Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi
cấy.......................................................................................................................... 68
Bảng 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy ......... 71
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần
nuôi cấy ................................................................................................................. 74

xiv

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần
nuôi cấy ................................................................................................................. 77
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả
năng tăng trưởng của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) sau 3 tuần nuôi cấy ................................................................................. 80
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường hai lớp đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và
tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau
16 tuần ni cấy..................................................................................................... 82
Bảng 3.8. Kết quả phân tích HPLC hàm lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong
củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần
nuôi cấy khi khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường
nuôi cấy ................................................................................................................. 78


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
1.1. Đặt vấn đề
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ
Nhân Sâm (Araliaceae). Chữ Panax xuất phát từ chữ Panacea trong tiếng Hy Lạp, có
nghĩa là thuốc trị bá bệnh, thần dược. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973. Tại hội nghị
quốc tế về Sâm, loài Sâm này được xếp vào nhóm Sâm quý trên thế giới cùng với Sâm
Triều Tiên (Panax ginseng), Sâm Mỹ (Panax quinquefolium),… (Phai et al., 2002).

Sâm Ngọc Linh là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn, có tên
trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [25]. Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin,
20 chất khoáng vi lượng và 0,1% tinh dầu. Sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin khung
dammaran cao nhất (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin triterpenoidoid nhiều nhất so
với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Le Thi Hong Van et al., 2015). Qua nhiều
nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đã thấy rằng Sâm Ngọc Linh
khơng chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà cịn có những tác dụng
dược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa, chống ung thư và
tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007). Với những đặc điểm
đó, Sâm Ngọc Linh khơng chỉ là lồi Sâm q của Việt Nam mà còn là của thế giới.
1.2. Tầm quan trọng của đề tài
Sâm Ngọc Linh là một cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao của Việt Nam (40
– 100 triệu VNĐ/kg). Từ đầu tháng 10/2017, Ủy Ban Nhân Dân huyện Nam Trà My
(Quảng Nam) đã chính thức mở phiên chợ Sâm Ngọc Linh nhằm góp phần tìm ra giải
pháp duy trì, bảo tồn và phát huy giá trị Sâm Ngọc Linh theo Chương trình phát triển sản
phẩm quốc gia đến năm 2020 do Thủ tướng Chính Phủ phê duyệt. Tại phiên chợ Sâm
Ngọc Linh lần thứ 6 được tổ chức vào đầu tháng 3/2018, Sâm Ngọc Linh có giá bán từ 85
triệu/kg [79]. Từ khi phát hiện năm 1973 đến 1995 thì lồi này đã bị khai thác cạn kiệt và
đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng mất nguồn gene quý hiếm (Trần Công Luận, 2003).
Đến nay, quần thể Sâm Ngọc Linh tự nhiên đang bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới nguy cơ
tận diệt do nhu cầu của thị trường dược liệu ngày càng tăng cao. Ngày 12/9/2015, Phó


2

Thủ tướng Chính phủ Vũ Đức Đam đã phê duyệt Đề án bảo tồn và phát triển cây Sâm
Ngọc Linh (Sâm Việt Nam) đến năm 2030 trị giá 9.500 tỷ đồng nhằm bảo vệ nguồn gene
quý, kết hợp bảo vệ và phát triển nguồn nguyên liệu Sâm góp phần xóa đói giảm nghèo,
phát triển kinh tế - xã hội (nguồn Internet).
Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) đã báo cáo rằng Sâm Việt Nam ni cấy mơ cũng

có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd,
G-Re, N-R1 và M-R2. Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Nam
ni cấy mơ chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Việt Nam thiên nhiên).
Việc nghiên cứu hồn chỉnh quy trình ni cấy mơ cây Sâm Ngọc Linh cung cấp
nguồn cây Sâm giống cho trồng trọt và sử dụng để thay thế Sâm thiên nhiên, đã mở ra
một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu cây Sâm Ngọc Linh: chủ động được nguồn
nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và
các sản phẩm thực phẩm chức năng.
Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô ở đối tượng cây Sâm
Ngọc Linh chưa nhiều vì đây là lồi Sâm đặc hữu của Việt Nam. Các nghiên cứu chủ yếu
tập trung vào việc cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, chuyển
gene, chủ yếu là nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh phơi, ni cấy rễ tóc, thu sinh khối
trong bioreactor, các kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn. Đặc điểm
của Sâm Ngọc Linh là tăng trưởng rất chậm, yêu cầu sinh thái khắt khe, việc nghiên cứu
về tạo củ in vitro vẫn chưa nhiều, chưa có nghiên cứu nào báo cáo về kiểu bổ sung các
thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp lỏng-rắn) lên sự tăng trưởng, tạo củ
và tích lũy saponin ở cây Sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn
sắc đến quá trình sinh trưởng của Sâm Ngọc Linh chỉ có một vài báo cáo được công bố,
các nghiên cứu cũng đã cho thấy rằng Sâm Ngọc Linh được nuôi cấy in vitro có thành
phần hóa học tương tự như Sâm Ngọc Linh tự nhiên tuy nhiên với hàm lượng thấp, thậm
chí một số chất chỉ được phát hiện ở dạng vết, một số chất chưa được phát hiện trong Sâm
nuôi cấy in vitro. Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng các elicitor có tác động tích cực đến
sự tăng trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Tuy
nhiên, đối với từng loại thực vật và mục đích ni cấy, việc lựa chọn loại và nồng độ các
elicitor phải được xem xét kỹ lưỡng. Đây là một lồi dược liệu vơ cùng q giá, việc hoàn


3

thiện quy trình nhân giống và gia tăng hàm lượng dược chất quý hiếm là điều mà nhiều

nhà nghiên cứu quan tâm và được Chính phủ chú trọng phát triển nguồn cây trồng quốc
gia. Trong đó, nghiên cứu tạo củ in vitro, kích thích tăng trưởng, rút ngắn thời gian nhân
giống, tăng sức sống của cây con nhằm tạo được số lượng lớn cây giống khỏe mạnh, tăng
tỷ lệ sống sót khi chuyển ra vườn ươm là điều vơ cùng cấp thiết.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài sẽ giúp hồn thiện quy trình ni cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống
in vitro cây trồng nói chung và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
nói riêng. Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen cây Sâm Ngọc Linh là một
trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay.
Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro của Sâm Ngọc Linh cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED
đến nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Góp phần định hướng cho những nghiên cứu
tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh in vitro.
Đề tài sẽ cung cấp những tài liệu khoa học về Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.), thuộc chi Panax. Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Các kết quả nghiên cứu sẽ
bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu khoa học về loài Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xây dựng quy trình nhân nhanh Sâm Ngọc Linh thông qua khảo sát các chất yếu tố
ảnh hưởng đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm nhân
nhanh với số lượng lớn, hạ giá thành cây giống, góp phần bảo tồn nguồn gene cây thuốc
quý.
Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh là
cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro cây trồng nói
chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đèn
huỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong nuôi cấy Sâm Ngọc Linh hiện nay, là cơ sở

4

giúp hạ giá thành sản phẩm cây Sâm Ngọc Linh giống. Hoặc định hướng cho các nghiên
cứu tiếp theo về ứng dụng của đèn LED đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha
et Grushv.)
1.4. Lý do chọn đề tài
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là loài Sâm đặc hữu của Việt
Nam đã được nghiên cứu về thực vật học, dược tính, thành phần hóa học. Các kết quả
nghiên cứu đã cho thấy đây là loài dược liệu quý giá và được xem là một trong những
phát hiện quan trọng bậc nhất trong lĩnh vực y dược. Việc nhân giống Sâm Ngọc Linh cịn
gặp nhiều khó khăn do đây là loài đặc hữu của Việt Nam, yêu cầu sinh thái rất khắt khe,
tăng trưởng rất chậm và chỉ trồng được ở các khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh (thuộc
địa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam). Thời gian trồng trọt phải kéo dài từ 6 đến 7
năm mới có thể thu hoạch (do củ cần nhiều thời gian để tích lũy các hợp chất sinh học
quý giá). Các nghiên cứu về loài Sâm này chưa nhiều, chưa có một quy trình nhân giống
hồn chỉnh phổ biến được chuyển giao cơng nghệ. Đây là lồi dược liệu đắt tiền bậc nhất,
nhu cầu thị trường rất cao, khai thác cạn kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng.
Đang được Chính phủ quan tâm và chú trọng đầu tư phát triển. Xuất phát từ những yêu
cầu cấp thiết đó chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ
thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy
saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” được thực
hiện tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa học Ứng dụng
HUTECH, trường Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh nhằm mục đích cải tiến mơi
trường, điều kiện ni cấy, hệ thống nuôi cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (mơi
trường hai lớp lỏng-rắn) và hồn thiện quy trình nhân nhanh lồi Sâm q này góp phần
bảo tồn và nhân nhanh giống lồi Sâm đặc hữu của Việt Nam.
2. Tình hình nghiên cứu
Hiện nay, cây Sâm Ngọc Linh là đối tượng đang rất được quan tâm và chú ý nghiên
cứu nhằm xây dựng quy trình nhân giống nhanh, rút ngắn được thời gian sinh trưởng so

với cây Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên mà vẫn đảm bảo được hàm lượng các dược chất
quý giá vốn có như saponin triterpenoid, ginsenoside để đảm bảo được nhu cầu tiêu dùng
của thị trường. Trong đó phải kể đến các cơng trình nghiên cứu như Hoàng Văn Cương


5

(2012) đã chứng minh ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng
tích lũy saponin thơng qua q trình ni cấy mơ sẹo và cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro.
Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) đã tạo được rễ bất định của Sâm Ngọc Linh
trong nuôi cấy in vitro.
Hà Thị Loan (2014) đã sử dụng Agrotobacterium rizogenes chứa gene rol cảm ứng
tạo rễ tóc. Kết quả cho thấy rễ tóc được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc sinh trưởng tốt
và có sự hiện diện của 3 hoại chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh. Ni cấy rễ
tóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định là sinh trưởng mạnh, không hướng
đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, bền vững về mặt
di truyền và có khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc
bằng cây mẹ giúp giảm được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe người
tiêu dùng và nâng cao tính an toàn của sản phẩm, mở ra giải pháp mới cho sản xuất
saponin ở quy mô công nghiệp.
Mai Trường và cộng sự (2014) đã thành công trong việc tạo và nhân phôi soma Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng.
Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong
nghiên cứu quá trình cứu hình thái của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.). Trước nhu cầu rất lớn về Sâm Ngọc Linh dùng để làm thuốc, thực phẩm chức
năng của các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng
nghiên cứu nhân nhanh giống Sâm Ngọc Linh in vitro.
Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và
thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của thực vật. Tổng

lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt q trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên
quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất của cây. Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến
trong nhân giống in vitro hiện nay là đèn huỳnh quang. Mặc dù một số đèn huỳnh quang
thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại
phải tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này gây ra.
Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắp
sáng trong phịng ni cây và khoảng 25% để làm mát phịng ni. Do đó, sự phát triển


6

nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các phịng ni cấy mơ sẽ mang lại nguồn
lợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống.
Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vào
nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh
trưởng và phát triển của thực vật mà chưa đi sâu tìm hiểu vai trị của ánh sáng trong nhân
giống in vitro, đặc biệt là nguồn chiếu sáng từ đèn LED (Light Emitting Diode). Hiện
nay, đèn LED là thiết bị chiếu sáng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao
khả năng tăng trưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an tồn và tuổi thọ
cao. LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn sáng khác như: đèn huỳnh quang,
đèn sợi đốt, đèn natri cao áp. Bước sóng của nó phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch
quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu
về quang sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và quang phát sinh hình
thái.
3. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3) ảnh
hưởng đến q trình sinh trưởng và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của các elicitor trên bổ sung
vào môi trường nuôi cấy giúp mẫu cấy tăng trưởng và tích lũy saponin tối ưu.
Sau khi xác định được nồng độ các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3)

thích hợp, tiến hành thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến sử dụng đèn LED bóng trịn
được sản xuất sẵn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220V để lắp đặt và thi công trong
thiết kế hệ thống LED đơn và LED kết hợp để khảo sát ảnh hưởng của các bước sóng ánh
sáng LED riêng lẻ (đỏ, xanh dương, vàng và trắng) và LED kết hợp (đỏ-vàng; đỏ-xanh
dương, vàng-xanh dương với tỷ lệ kết hợp là 50:50) đến q trình q trình sinh trưởng,
tạo củ và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
Sau khi xác định được nguồn chiếu sáng thích hợp, để đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng
của mẫu cấy, tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc) nhằm tìm ra điều kiện ni
cấy thích hợp (lỏng lắc-giai đoạn cảm ứng) giúp thúc đẩy mẫu cấy tăng trưởng nhanh. Sau
giai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy sẽ được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy
hai lớp nhằm tìm ra kiểu bổ sung các thành phần mơi trường ni cấy thích hợp (mơi


7

trường hai lớp) cho sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Mục đích nghiên cứu giúp rút ngắn thời gian nhân
giống, tăng số lượng và chất lượng cây giống, giúp hạ giá thành sản phẩm, góp phần bảo
tồn và cung cấp nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) quý giá.
Cung cấp cây giống chất lượng cao với số lượng lớn không giới hạn cho các nhà vườn,
doanh nghiệp trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức năng, từ đó có thể cải thiện
đời sống nhân dân, tiến dần đến thương mại hóa sản phẩm Sâm Ngọc Linh, tạo thương
hiệu cho sản phẩm đặc hiệu của Việt Nam.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng – elicitor đến quá trình sinh trưởng
và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.):
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến q trình sinh trưởng và tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của saccharose đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrate đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
 Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống LED cải tiến đến quá trình sinh trưởng và
tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.):
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến quá trình sinh trưởng và
tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ-xanh
dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.).

 Nghiên cứu ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến
khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in
vitro.
 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro.


8

 Giải phẫu hình thái củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in
vitro.
 Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của q trình ni cấy in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp:
+ Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
+ Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
Performance Liquid Chrotomatography – HPLC)
5. Phương pháp nghiên cứu
Tùy vào mục đích thí nghiệm mà chúng tôi thay đổi các yếu tố khảo sát để bố trí thí
nghiệm (các elicitor, nguồn chiếu sáng cải tiến LED đơn hay LED hỗn hợp, hệ thống nuôi

cấy lỏng tĩnh, lỏng lắc, kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy – môi trường
hai lớp). Mỗi thí nghiệm có nhiều nghiệm thức khác nhau. Thiết kế và thi công hệ thống
đèn LED cải tiến sử dụng các bóng LED trịn được sản xuất sẵn tỏa nhiệt thấp sử dụng
trực tiếp nguồn điện 220V tiết kiệm chi phí cho bộ chuyển đổi điện một chiều 110V sang
220V dễ dàng thi cơng lắp đặt. Định tính saponin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng,
định lượng saponin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Các thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần lặp lại (30
bình ni cấy/lần). Các số liệu thu được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 và
chương trình MicroSoft Excel 2013. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ
tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a, b,
c,…thì khơng có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự
sai khác thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
 Xác định được nồng độ các elicitor như than hoạt tính, saccharose, AgNO3, thích hợp
cho nhân giống, tăng trưởng, và tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.), cụ thể như sau:
+ Môi trường SH bổ sung 1 g/L than hoạt tính là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nghiệm thức A2).
+ Tùy vào mục đích nghiên cứu mà nồng độ saccharose thay đổi (tạo cây hoàn chỉnh
30 m/L; nhân nhanh sinh khối mô sẹo: 70 g/L).


9

+ Môi trường SH bổ sung 2,0 mg/L AgNO3 (C4) là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
+ Hệ thống chiếu sáng cải tiến LED đỏ thích hợp cho việc thay thế các nguồn sáng
huỳnh quang truyền thống nhằm kích thích sự phát triển và tạo củ in vitro Sâm Ngọc
Linh mang lại hiệu suất kinh tế cao hơn do tiết kiệm năng lượng chiếu sáng và năng
lượng làm mát khơng gian phịng ni mẫu.

+ Hệ thống chiếu sáng cải tiến LED xanh dương và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ
50:50 thích hợp cho sự phát triển và tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh.
 Nuôi cấy lỏng lắc (nghiệm thức L2) cho kết qủa mẫu cấy Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) tăng trưởng tốt nhất sau 3 tuần nuôi cấy.
 Môi trường nuôi cấy 2 lớp dạng lỏng-rắn (lỏng-agar) (E8), lớp trên lỏng có than hoạt
tính, lớp dưới đặc có than hoạt tính thích hợp nhất cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro.
Sau 16 tuần nuôi cấy, mẫu cấy tăng trưởng khỏe mạnh, tạo củ in vitro với kích thước lớn,
hình thái củ tương tự với củ Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên.
 Kết quả phân tích sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy, sắc đồ sắc ký lớp mỏng của củ
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi xuất cấy
hiện các vết tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, các vết saponin tương ứng với các vết
của saponin chuẩn. Kết quả phân tích cho thấy củ Sâm Ngọc Linh in vitro có sự hiện diện
của các saponin Rg1, Rb1, MR2.
 Kết quả phân tích định lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ Sâm Ngọc
Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần ni cấy in vitro cho thấy có sự
hiện diện của 2 loại saponin với hàm lượng cao (G-Rg1: 1,314 mg/g và G-Rb1: 1,425
mg/g).
7. Kết cấu của đồ án
Đồ án gồm những chương sau:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị


10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor
1.1.1. Khái niệm vi nhân giống

Vi nhân giống (micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro
propagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân
giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ,
sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình ni cấy
khác.
Nhân giống in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ
thuật hữu hiệu nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyển
chọn hoặc các nguồn gene thực vật quý hiếm.
1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor
Hợp chất thứ cấp của thực vật không chỉ giúp thực vật tự vệ, chống chịu lại sâu bệnh
và điều kiện môi trường khắc nghiệt mà cịn hữu ích cho con người khi có khả năng ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực: y dược, hóa học, mỹ phẩm và nơng nghiệp. Saponin
triterpenoid là hợp chất quý hơn cả vàng có trong chi Nhân Sâm nói chung và Sâm Ngọc
Linh nói riêng. Để thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp, theo phương pháp truyền thống
đòi hỏi hao tốn rất nhiều sinh khối thực vật. Do đó, khoa học hiện đại đã nghiên cứu ứng
dụng các chất cảm ứng (elicitor) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thu được lượng lớn
hợp chất đích như mong muốn. Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa
với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì kích thích sự sinh tổng hợp các hợp chất
thứ cấp trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là q trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh
tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor
(Namdeo, 2007). Đối với lồi có thời gian tăng trưởng kéo dài và khó nhân giống trong tự
nhiên như Sâm Ngọc Linh, việc bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy vừa
giúp nhân nhanh sinh khối, rút ngắn thời gian tăng trưởng và thu được lượng lớn hợp chất
thứ cấp.
Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực
vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh). Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor
có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.