Thực tập kỹ thuật cơ bản trong CNSH

CHƯƠNG TRÌNH THỰC TẬP MƠN KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG
CƠNG NGHỆ SINH HỌC
(Dành cho sinh viên năm thứ 4, ngành CNSH)
Mục tiêu: tinh sạch enzyme catalase có trong dịch chiết của gan bằng phương
pháp sắc ký trao đổi ion, xác định hàm lượng protein, hoạt tính của enzyme, tính khối
lượng phân tử và kiểm tra độ tinh sạch của catalase bằng điện di trên gel polyacrylamide
có SDS (SDS-PAGE).
1. Chuẩn bị dịch chiết gan
Nguyên liệu
-

Gan: 1 - 3 g

-

Đệm Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 có 50 mM NaCl (Đệm A) (khoảng 200 ml)

Các bước tiến hành
Nghiền gan trong đệm A đến khi đồng nhất (tỷ lệ đệm nghiền chiết 1 g gan : 3 ml
đệm), sử dụng chày và cối sứ đã để sẵn trong lạnh, bổ sung nitơ lỏng, đệm và gan lạnh
nhằm đảm bảo hoạt tính của enzyme. Ly tâm 13.000 vòng/phút, 4 oC trong 20 phút, thu
dịch chiết trong (ghi lại tổng thể tích), lặp lại bước ly tâm nếu dịch còn lẫn cặn.
Tủa protein trong dịch chiết gan bằng ethanol 70%, trộn đều, để lạnh tại 4 oC trong
15 phút, thu tủa bằng ly tâm tại 4oC trong 20 phút; hoà tủa bằng 5 ml đệm A (Nếu tủa
khơng tan hết có thể bổ sung thêm đệm A đến tối đa 10 ml). Thêm bước ly tâm để loại bỏ
tủa chưa tan hết.
2. Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch chiết bằng quang phổ kế đo ở
bước sóng 280 nm
(Lưu ý pha protein ở nồng độ thích hợp để số đọc A280 nằm trong khoảng 0,1 - 1,0).
3. Xác định hoạt tính catalase bằng quang phổ kế
Nguyên tắc: Catalase phân giải H202 theo phương trình:

Cho catalase phân giải H 202, H202 hấp thụ cực đại, đặc hiệu tại bước sóng 240 nm,
khi có hoạt tính của catalase sẽ cho độ hấp thụ giảm dần tại bước sóng này.

1


Một đơn vị hoạt độ catalase được định nghĩa là lượng enzyme phân giải được
1 µmol H202 trên phút tại 25oC, với lượng H202 ban đầu là 3,05 µmol.
Các bước tiến hành: tổng thể tích phản ứng là 300 µl bao gồm nồng độ cuối cùng và thể
tích của các chất sau:
-

Dùng pipet hút 290 µl của H202 0,036% (w/v) pha trong đệm kaliphosphate 50 mM
pH 7,0.

-

Đặt cuvet vào máy quang phổ và đo tại bước sóng 240 nm đến khi số đọc ổn định
(nồng dộ H202 phù hợp cho xác định hoạt tính catalase sẽ có số đọc tại A 240 nm
trong khoảng 0,52 đến 0,55; ghi lại số đọc).

-

Bổ sung 10 µl mẫu có hoạt tính của catalase và đo ngay lập tức số đọc của máy
quang phổ tại 240 nm tại hai thời điểm 0 phút và 3 phút. Nồng độ enzyme phù hợp
sẽ cho denta (A240 nm 0 phút - A240 nm 3 phút) dao động khoảng 0,05.

-

Hoạt độ riêng của catalase được tính theo cơng thức:

U/ml enzyme = [denta (A 240 nm 0 phút - A240 nm 3 phút)* độ pha loãng của
mẫu*3,05] / (A240 nm của cơ chất*3*0,01)
U/mg = [U/ml enzyme] / [nồng độ protein (mg/ml)]
4. Tinh sạch catalase từ dịch chiết gan bằng sắc ký trao đổi anion Q-sepharose
Hoá chất
-

Dịch chiết từ gan (bước 1)

-

Gel Q-sepharose 5 ml

Các bước tiến hành
-

Nhồi gel Q sepharose lên cột

-

Cân bằng cột bằng 5 lần thể tích đệm A, tốc độ 40-60 ml/h

-

Gắn mẫu lên cột với tốc độ 20-30 ml/h, tải của gel 20 mg protein/ml gel

-

Rửa cột bằng đệm A với tốc độ 30-50ml/h. Rửa cho đến khi OD280<0,05

-

Rửa chiết protein gắn trên cột bằng theo phương thức gradien với đệm A có NaCl
từ 50 mM đến 800 mM

-

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính của các phân đoạn trước và sau khi lên
cột cũng như các phân đoạn không gắn cột

-

Vẽ sắc ký đồ và lập bảng tổng kết tinh sạch

-

Xác định độ tinh sạch của catalase bằng SDS-PAGE; trên cơ sở đó tính khối lượng
phân tử chính xác của catalase.

2


5. Kiểm tra độ tinh sạch của các phân đoạn bằng điên di trên gel SDS-PAGE
Hoá chất
-

Polyacrylamide 40%

-

Tris-HCl pH 8,8 và pH 6,8

-

APS 10%

-

SDS 10%

-

TEMED

-

Đệm chạy điện di SDS

-

CBB 0,5 %

-

Đệm mẫu

Các bước tiến hành
-

Bản gel SDS-PAGE 10% gồm 2 lớp: gel cô và gel tách với thành phần như sau:
Thành phần
H2O
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Tris-HCl 1,0 M pH 6,8
Polyacrylamide 40%
SDS 10%
Ammonium persulfate (APS) 10%
TEMED
Tổng thể tích

Gel tách 10%
2,85 ml
1,5 ml
X
1,5 ml
60 l
60 l
6 l
5,976 ml

Gel cô 4%
1,24 ml
X
500 l
200 l
20 l
20 l
2 l

1,981 ml

-

Tra mẫu theo thứ tự: marker, dịch chiết gan, các phân đoạn không gắn cột (FT và
W), các phân đoạn gắn cột (E).

-

Sau khi chạy điện di, quan sát và phân tích kết quả.

3