Nghiên cứu nồng độ một số hormon tuyến giáp trong máu người phơi nhiễm chất da cam dioxin

B ộ Y TẾ
Đ Ạ I HỌC Đ IỀU D Ư Ỡ N G N A M ĐỊNH

BÁ O C Á O K ẾT QUẢ N G H IÊN

cứu Đ È TÀI CÁP c o SỎ

NGHIÊN CỨU NỒNG Đ ộ MỘT SÓ HORMON
TUYẾN GIÁP TRONG MÁU NGƯỜI PH OI
NHIỄM CHẤT DA CAM/DIOXIN
[

«

Oại học đ;ểù dưỡng

_____ NĂM ĐỊNH

Chủ nhiệm đề tài: Phạm Văn Sơn
Cấp quản lý: Trường Đại học Điều dưỡng Nam Định
Thời gian thực hiện: Từ tháng 03 năm 2015 đến tháng 10 năm 2015
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 10 triệu đồng
Trong đó: kinh phí SNKH: 10 triệu đồng

N ăm 2015


BÁO CÁO KÉT QUẢ NGHIÊN

cửu ĐÊ TÀI CÁP c ơ

SỎ

1. Tên đề tài: “Nghiên cứu nồng độ một số hormon tuyến giáp ở người phơi
nhiễm chất da cam/dioxin ”
2. Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Văn Sơn, BM Hóa Sinh
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Điều dưỡng Nam Định
4. Cơ quan quản lý đề tài: Trường Đại học Điều dưỡng Nam Định
5. Phó chủ nhiệm đề tài: Ths Trần Thị Hương, BM Hóa Sinh
6. Danh sách nghiên cửu viên:
-

CN. Đàm Dương Mỹ Ngọc, BM Hóa Sinh

-

Mai Lệ Quyên, BM Hóa Sinh

7. Thư ký đề tài: CN. Đàm Dương Mỹ Ngọc
8. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03 năm 2015 đến tháng 10 năm 2015


MỤC LỤC
Trang
\

Trang phụ bìa
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ

Danh mục hình
PHẦN A
1. Kết quả nổi bật của đề tài................................................................................................1
1.1. Đóng góp mới của đề tài.............................................................................................. 1
1.2. Kết quả cụ thể.............................................................................................................. 1
1.3. Hiệu quả về xã hội....................................................................................................... 2
2. Đánh giá thực hiện đề tài đổi chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt. 2
2.1.Tiến độ.......................................................................................................................... 2
2.2. Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra....................................................................2
2.3. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cuơng............................................ 2
2.4. Đánh giá việc sử dụng kinh phí....................................................................................2
2.5. Các ý kiến đề xuất: Chủ yểu tập trung vào đề xuất về quản lý....................................3
PHÀNB
1. ĐẶT VẨN ĐÈ...................................................................................... .-.........................4
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................. ............................................ 6
2.1. Tình hình nghiên cứu trên thể giới về ảnh hường dioxin với tuyến giáp....................6
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước về ảnh hường dioxin với tuyến giáp...................... 7
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

cứu..................................................9

3.1. Thiết kể nghiên cứu.................................................................................................... 9


3.2. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 9
3.3. Phương pháp chọn m ẫu.............................................................................................. 10
3.4. Phương pháp thu thập số liệu........................................................v.......................... 10
3.5. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu........................................................................ 10
3.5.1. Trang thiết bị, vật liệu nghiên cứu..................................... .................................... 10
3.5.2. Địa điểm, thời gian nghiên cửu...............................................................................11

3.5.3. Xác định chỉ số nhân trắc và khám lâm sàng........................................................ 11
3.5.4. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu..................................................... 12
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu......................................................................................16
3.6. Y Đ ức.......................................................................................................................... 16
3.7. Mơ hình nghiên cứu.................................................................................................... 17
4. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ........................................................................................18
4.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu.........................................................................................18
4.1.1. Đặc điểm về tuổi đời của các đối tượng nghiên cứu.............................................. 18
4.1.2. Nghề nghiệp của các đối tượng nghiên cứu...........................................................18
4.1.3. Các đặc điểm nhân ừắc học của đối tượng nghiên cứu......................................... 19
4.1.4. Huyết áp động mạch...............................................................................................20
4.2. Một số chỉ số hóa sinh và huyết học.......................................................................21
4.2.1. Các chỉ số hóa sinh huyết tương.............................................................................21
4.2.2. Các chỉ số huyết học............................................................................................... 21
4.3. Nồng độ dioxin trong máu của đối tượng nghiên cứu...................................... ........22
4.3.1. Nồng độ dioxin toàn phần (phương pháp DR. CALUX)...................................... 22
4.3.2. Nồng độ các đồng đẳng dioxin (phương pháp GCMS)......................................... 23
4.4. Nồng độ và mói tương quan nồng độ giữa TSH, các hormon tuyến giáp với dioxin
trong máu đối tượng nghiên cứu........................................................................................25
4.4.1. Nồng độ TSH và các hormon tuyến giáp của đối tượng nghiên cứu......................25
4.4.2. Nồng độ TSH và hoimon tuyến giáp theo phân nhóm nồng độ dioxin................. 26


4.4.3. Tương quan nồng độ giữa TSH, hormon tuyển giáp với dioxin............................ 26
4.4.4. Tương quan giữa nồng độ TSH, hormon tuyến giáp với nồng độ các đồng đẳng
dioxin ờ 51 đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 27
5. BÀN LUẬN...........................................................................................

33

5.1 . Một số đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu................................................... 33
5.2. Một sổ đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của đối tượng nghiên cửu........................34
5.3. Nồng độ dioxin máu ờ đối tượng nghiên cứu...........................................................37
5.3.1. Nồng độ dioxin toàn (phương pháp DR CALUX)................................................ 37
5.3.2. Định lượng nồng độ dioxin (phương pháp GCMS)................................................38
5.4. Nồng độ và mối tương quan giữa nồng độ TSH, các hormon tuyển giáp vói nồng độ
dioxin ờ đối tượng nghiên cứu............................................................. :........................... 40
5.4.1. Nồng độ TSH và các hormon tuyến giáp................................................................40
5.4.2. Tương quan giữa nồng độ TSH và các hormon tuyển giáp với nồng độ dioxin ờ đối
tượng nghiên cứu............................................................................................................... 44
KẾT LUẬN....................................................................................................................... 45
1. Nồng độ dioxin và các hormon tuyến giáp trong máu người phơi nhiễm chất da
cam/dioxin......................................................................................................................... 45
2. Tương quan giữa nồng độ TSH và các hormon tuyến giáp với nồng độ dioxin........ 45
KIẾN NGHỊ...................................................................................................................... 46
TÀI L Ệ U THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT

AhR

Aryl Hydrocarbon Receptor

Arnt

Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator

BEQ

Biology Equivalents (Đưomg lượng sinh học) .

B-TSH

Blood Thyroid-stimulating Hormon (hormon hướng giáp)

BMI

Body mass index (chi số khối)

CCB

Cựu chiến binh

CDC

Chất diệt cỏ

DRE

Dioxin Responsive Element

DR CALUX

Dioxin Response Chemically Activated Luciferase gene Expression

FT3

Free Triiodothyroxine

FT4

Free Thyroxine

GC-MS

Gas Chromatography Mass Spectometry (Sắc kí khí kết hợp khối phổ)

HAIT

Huyết áp tâm thu

HATTr

Huyết áp tâm trưorng

PCB

Polychlorinated Biphenyls

PCDD

Policlodibenzo-p-dioxin

PCDF

Policlodibenzofuran

POP

Persistent Organic Pollutants (Chất hữu cơ bền vững)

TEF

Toxic equivalency factor (hệ số độc)

TEQ

Toxic Equivalents (Dượng lượng độc)

T3

Triiodothyronine

T4

Tetraiodothyronine

TBG

Thyroxine Binding Globuline

TBA

Thyroxine Binding Albumine

TBPA

Thyroxine Binding Prealbumine

TCDD

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin

WHO

World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 4.1: Số lượng, giới và các nhóm tuổi ở đối tượng nghiên cứu...............................18
Bảng 4.2: Phân bố nghề nghiệp hiện tại của các đối tượng............................................... 18
Bảng 4.3: Chiều cao, cân nặng theo nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứ u...................... 19
Bảng 4.4: Chỉ số khối theo nhóm tuổi của các đối tượng nghiên cứu.............................. 20
Bảng 4.5: Huyết áp động mạch theo nhóm tuổi của các đổi tượng nghiên cứu...............20
Bảng 4.6: Chỉ số glucose và sắt huyết tương theo nhóm tuổi.......................................... 21
Bảng 4.7: Các chỉ số huyết học của đổi tượng ngiên cứu................................................ 21
Bảng 4.8: Nồng độ dioxin tồn phần theo giới, nhóm tuổi.............................................. 22
Bảng 4.9: Nồng độ các đồng đẳng PCDD máu của 51 đối tượng nghiên cứu................ 23
Bảng 4.10: Nồng độ các đồng đẳng PCDF máu của 51 đối tượng nghiên cứu............... 24
Bảng 4.11: Nồng độ TSH, hormon tuyến giáp của đối tượng nghiên cứu...................... 25
Bảng 4.12: Nồng độ hormon tuyến giáp theo phân nhóm nồng độ dioxin.......................26
Bảng 4.13: Tương quan nồng độ TSH, hormon tuyến giáp với nồng độ dioxin............. 26

Bảng 4.14. Tương quan giữa nồng độ TSH, hormon tuyến giáp với nồng độ các đồng
đẳng PCDD........................................................................................................................27
Bảng 4.15. Tương quan giữa nồng độ TSH, hormon tuyến giáp với nồng độ các đồng
đẳng PCDF......................................................................................................................... 31


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

>
Hình 3.1: Hình ảnh máy miễn dịch tự động Immulite 2000XPÌ......................................10
Hình 3.2: Hình ảnh máy đo tín hiệu quang học Cenừo LB 960, Berthold...................... 10
Hình 3.3: Nguyên lý kỹ thuật DR CALUX..................................................................... 12
Hình 3.4: Hình ảnh tế bào H4n sau khi cho tiếp xúc với mẫu dỉoxin.............................13
Hình 3.5: Nguyên lý phương pháp miễn dịch hóa phát quang........................................ 15
Hình 4.1: Tương quan giữa nồng độ T3 tồn phần với nồng độ dioxin toàn phần (pg
BEQ/g mỡ) ở nữ............................................................................................................... 27
Hỉnh 4.2 A: Tương quan nồng độ TSH với nồng độ 1,2,3,4,7,8-HexaCDD ờ nữ............... 28
Hình 4.2 B: Tương quan nồng độ TSH với nồng độ 1,2,3,6,7,8-HexaCDD ở n ữ ............... 28
Hình 4.2 C: Tương quan nồng độ TSH với nồng độ 1,2,3,7,8,9-HexaCDD ở nữ............... 29
Hình 4.2 D: Tương quan nồng độ TSH với nồng độ 1,2,3,4,6,7,8-HexaCDD ở nữ............ 29
Hình 4.2 E: Tương quan nồng độ TSH với độ độc tổng số ờ nữ........................................30
Hình 4.3: Tương quan nồng độ giữa nồng độ FT3 với 1,23,7,8,9-HexaCDD ờ n ữ ............. 30
Hỉnh 4.4 A: Tương quan giữa nồng độ TSH vói nồng độ 2,3,4,7,8 PentaCDF ờ n ữ ............ 31
Hình 4.4 B: Tương quan nồng độ giữa 1,2 3 ,4,7,8 PentaCDF vói nồng độ FT3 ở nữ............. 32

\


1 .

PHÀN A
1. Kết quả nổi bật của đề tài
1.1. Đóng góp mói của đề tài

\

TCDD là một chất rất độc và hậu quả gây ra đối với sức khỏe con người là rất
nghiêm trọng. Sự phơi nhiễm dỉoxin đã được chứng minh là nguyên nhân của nhiều
bệnh lý nguy hiểm như: ung thư tiểu đường gây rối loạn hệ thống miễn dịch hệ sinh
sản, hệ thần kinh và có nguy cơ rất cao sinh con dị tật.
Hiện nay, mặc dù nồng độ dioxin trong những vùng bị phơi nhiễm ờ Việt Nam đă
giảm rất nhiều do mưa, sói mịn và phân hủy hóa học sau hơn 40 năm, nhưng nồng độ
của chúng trong đất và trầm tích vẫn cao hơn những vùng không bị phơi nhiễm, Những
vùng nhiễm nặng nhất là những căn cứ không quân của Mỹ trước đây, nơi mà các chất
diệt cỏ được vận chuyển, lưu trữ. Sau mỗi đợt phun dải, các phương tiện lại được đưa
về sân bay để tẩy rửa. Đặc biệt, do sự cố kỹ thuật làm một lượng lớn CDC tại các bể
chứa ờ sân bay Biên Hòa và Sân bay Đà Nang trong chiến dịch Ranch Hand (RH) và
chiến dịch Pacer Ivy (PI) rị ri ra mơi trường. Điều đó gây nên tinh trạng ô nhiễm nặng
nề do các chất diệt cỏ có lẫn dioxin tại các căn cứ khơng quân này. Những khu vực này
gọi là “các điểm nóng” về ơ nhiễm dioxin, trong đó 3 điểm quan ứọng nhất là các sân
bay Biên Hòa, Phù Cát và Đà Nang.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã định lượng nồng độ dioxin máu của đối tượng
bằng phương pháp DR CALUX, đây là nghiên cứu Dịch tễ học đầu tiên đánh giá được
mức độ phơi nhiễm chất da cam/đioxin cho từng đối tượng là những người sống ở “điểm
nóng” ơ nhiễm từ đó có những đánh giá chính xác hơn về sự ảnh hường của dioxin đối

với sức khỏe con người.
1.2. Kết quả cụ thể
Bước đầu tìm ra mối tương quan giữa nồng độ dioxin và nồng độ các hormon tuyển giáp:
Nồng độ T3 ở nữ tương quan thuận với nồng độ dioxin tồn phần.
Nồng độ TSH ở nữ có tương quan thuận với các đồng đẳng của dioxin: 1,2,3,4,7,8HexaCDD, 1,2,3,6,7,8-HexaCDD, 1,2,3,7,8,9-HexaCDD, 1,2,3,4,6,7,8-HeptaCDD, 2,3,4,7,8 PentaCDF, độ độc tồng số (PCDD + PCDF) TEQ.


2
1.3. Hiệu quả về xã hội
Nghiên cứu tác hại của dioxin là chương trình nghiên cứu Quốc gia, để tìm ra các
bằng chứng khoa học về tác hại của nó đối với sức Idhỏe con người, sự ton lưu trong tự
nhiên, nguồn phơi nhiễm ...trên cơ sờ đó, xây dựng những giải pháp tích cực đê bao vẹ
sức khỏe nhân dân.
2. Đánh giá thực hiện đề tài đối chỉếu với đề cương nghiên cứu đã đưọc phê duyệt
2.1.Tiến độ
Đúng tiến độ
Rút ngắn thời gian nghiên cứu
Tổng số thời gian rút ngắn ... tháng
Kéo dài thời gian nghiên cứu
Tổng số tháng kéo d à i ... tháng
Lý do phải kéo d à i ...
2.2. Thực hiện các mục tiêu nghỉên cứu đề ra
- Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra
- Thực hiện được các mục tiêu đề ra nhưng khơng hồn chỉnh
- Chỉ thực hiện được một số mục tiêu đề ra
- Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)
2.3. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương
- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến ừong đề cưomg

X

- Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương

X

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạt
- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả các sản phẩm đều chưa đạt chất lượng.
- Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng
- Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)
2.4. Đánh giá việc sử dụng kinh phí
- Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 7 triệu đồng.
- Trong đó Kinh phí sự nghiệp khoa học:

...

- Kinh phí từ nguồn khác:

triệu đồng.

...

triệu đông.

- Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí của đê tài
Stt

Tên trang thiết bị

Kỹ thuật sử dụng

Sản phấm tạo ra

Toàn bộ kinh phí đã được thanh qul tốn ...
Chưa thanh quyết tốn xong ...
Kinh phí tồn đọng

triệu đồng.

Kinh phí


3
2.5. Các ý kiến đề xuất: Chủ yếu tập trung vào đề xuất về quản lý
2.5.1. Đ ề xuất về tài chính (nếu có).
c ầ n ghi rõ những ý kiến đề xuất cụ thể như kinh phí cấp phát chậm hoặc yêu cầu
về thanh quyết toán chứng từ ...
2.5.2. Đề xuất về quản lý khoa học công nghệ (nêu có).
Cần ghi rõ những ý kiến đề xuất cụ thể như: quyêt định phê duyẹt chạm, cơ che
quản lý cồng kềnh, nhiều văn bản giấy tờ v.v...
2.5.3. Đề xuất liên quan đến đề tài (nếu có).
Cần ghi rõ ỷ kiến đề xuất liên quan đến việc triển khai ứng dụng hoặc phát triên
tiếp các nghiên cứu và cần giải thích rõ lý do vì sao lại đê xuât như vậy.


4

PHẦN B
1. ĐẶT VÁN ĐÈ
Trong chiến tranh Việt Nam từ 1961 đển 1971, quân đội Mỹ đã sử dụng khoảng
72 triệu lít hóa chất diệt cỏ để tàn phá mơi sinh, rừng và phá hủy mùa màng ờ các tỉnh

niền Nam[15], diện tích rải chất độc hóa học xấp xỉ 10 - 12% diện tích của miền nam
Việt Nam . Đặc biệt là chất diệt cỏ được sử dụng từ những năm 1965 và 1970 là chất da
cam, một hỗn hợp 50/50 của 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T). Phần 2,4,5-T của hỗn họp chất da cam bị tạp
nhiễm một chất hóa học cực độc gọi là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) [8].
Đây là đồng đẳng độc nhất trong số 17 đồng đẳng dioxin/furan.
TCDD là một chất rất độc và hậu quả gây ra đối với sức khỏe con người là rất
nghiêm trọng. Sự phơi nhiễm dioxin đã được chứng minh là nguyên nhân cùa nhiều
bệnh lý nguy hiểm như: ung thư [10], tiểu đường [12], gây rối loạn hệ thống miền dịch
[18], hệ sinh sản, hệ thần kinh và có nguy cơ rất cao sinh con dị tậ t
Hiện nay, mặc dù nồng độ dioxin trong những vùng bị phơi nhiễm ở Việt Nam đã
giảm rất nhiều do mưa, sói mịn và phân hủy hóa học sau hơn 40 năm, nhưng nồng độ
của chúng trong đất và trầm tích vẫn cao hơn những vùng không bị phơi nhiễm [11].
Những vùng nhiễm nặng nhất là những căn cứ không quân của Mỹ trước đây, nơi mà
các chất diệt cỏ được vận chuyển, lưu trữ. Sau mỗi đợt phun dải, các phương tiện lại
được đưa về sân bay để tẩy rửa. Đặc biệt, do sự cố kỹ thuật làm một lượng lớn CDC tại
các bể chứa ờ sân bay Biên Hòa và Sân bay Đà Nang trong chiến dịch Ranch Hand (RH)
và chiến dịch Pacer Ivy (PI) rị rỉ ra mơi trường. Điều đó gây nên tinh ừạng ơ nhiễm
nặng nề do các chất diệt cỏ có lẫn dioxin tại các căn cứ không quân này. Những khu vực
này gọi là “các điềm nóng” [16], về ơ nhiễm dioxin, trong đó 3 điểm quan trọng nhất là
các sân bay Biên Hòa, Phù Cát và Đà Nang.
Sự ô nhiễm các chất chứa dioxin hiện nay đang là vấn đề toàn càu, ảnh hưởng trực
tiếp đến sự phát triển bền vững quốc gia. Do vậy, nghiên cứu cáb tác hại của chúng là
một trong các chương trình nghiên cứu quốc gia của nhiều nước, trong đó có Việt Nam.
Trên thế giới, cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu gợi ý sự tác động của


5
dioxin đối với các tuyển nội tiết ữong cơ thể. Song nhìn chung, mặc dù tình trạng ơ
nhiêm dioxin ở Việt Nam hết sức nặng nề, nhưng các nghiên cửu về tác hại của dioxin
đối với sức khỏe những người sống trong khu vực phơi nhiễm còn nhiều hạn chể, đặc

V

biệt chưa có nghiên cứu Dịch tễ học nào định lượng nồng độ dioxin cho từng đối tượng,
để đánh giá mức độ phơi nhiễm chất da cam/dioxin cũng như tác động của nỏ đối với
tuyến giáp.
Để góp phần làm sáng tỏ thêm sự tồn lưu dioxin ứong máu và ảnh hưởng của nó đối
với tuyển giáp ở những người sống ữong khu vực “đỉểm nóng” ơ nhiễm chất da
cam/dioxin. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cửa nồng độ một số hormon
tuyến giáp trong máu người phơi nhiễm chất da caitưdioxin ”
1. Định lượng nồng độ dioxin, TSH và hormon tuyến giáp trong máu những ngirời
cư trú tại phường Bửu Long và phường Trung Dũng thành phố Biên Hịa, nơi được coi là
khu vực “điểm nóng” ơ nhiễm chất da cam/dioxin.
2. Phân tích mối liên quan nồng độ giữa TSH và hormon tuyến giáp với nồng độ
dỉoxin trong máu người phơi nhiễm chất da cam/dioxin.


6

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về ảnh hưởng dỉoxỉn vói tuyến giáp
Hormon tuyến giáp có đặc điểm cấu trúc hố học vịng thơĩĩt giống với dioxin,
do đó sự ảnh hường của dioxin lên chức năng tuyến giáp hoặc chuyển hoá của hormon
tuyến giáp ở những đối tượng có nguy cơ phơi nhiễm là vấn đề cần được nghiên cứu.
Các hợp chất clo hữu cơ được phân phối rộng rãi trên thể giới và có thể tồn tại
trong mơi trường và sinh vật sống. Chúng là những hợp chất tan trong chất béo và những
người thường tiếp xúc với chúng thông qua thực phẩm, hít phải hoặc tiếp xúc qua da.
Chúng được phân loạỉ như POP (persistent organic pollutants: chất gây ô nhiễm hữu cơ
bền vững) [22], vì chúng tồn tại ừong mơi trường trong một thời gian dài và di chuyển
lên thông qua chuỗi thức ăn. PCDD, PCDF và PCBs là một trong những POPs khuếch
tán nhất trên toàn thế giới. Nghiên cửu thực nghiệm cho thấy rằng một số các hóa chất

này có hoạt động gián đoạn nội tiết và đặc biệt là chúng có thể làm thay đổi chức năng
tuyến giáp [7].
Trên thể giới, cũng đã có một số cơng trình nghiên cứu về tác động của dioxin lên
tuyến giáp ờ động vật thực nghiệm, trẻ em, người làm việc ữong nhà máy sản xuất hoá
chất, cựu chiến binh trong chiến dịch Ranch Hand [19] và người sống trong vùng bị phơi
nhiễm đã được công bố, [3], [7].
Koopman - Esseboom và các cộng sự, nghiên cứu ảnh hường của dioxin và các
đồng loại PCBs đối với hormon tuyến giáp ờ phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh của họ
[14] đã chứng minh rằng lượng PCDD, PCDF và PCB có thể thay đổi trạng thái cân
bằng nội tiết tố tuyến giáp.
Andrea Baccarelli và các cộng sự (2008), nghiên cứu về chức năng tuyến giáp của
ứẻ sơ sinh được sinh ra từ các bà mẹ phơi nhiễm với dioxin, do tai nạn ờ Seveso, những
ứẻ này được theo dõi 25 năm sau. Kết quả cho thấy những người được sinh ra từ các bà
mẹ phơi nhiễm dioxin do tai nạn xảy ra khoảng 25 năm trước đó, có nồng độ b-TSH cao
hơn so với nồng độ b-TSH của trẻ sơ sinh ở phụ nữ không bị phơi nhiễm [9].
Trên thế giới, những người bị phơi nhiễm dioxin là các công nhân trực tiếp sản
xuất các hóa chất có tạp nhiễm dioxin, những nhân viên ừong chiến dịch RH, chiến dịch


7

PI trong chiến tranh Việt Nam, các nạn nhân vụ tai nạn ở Seveso (Ý ).... ữên cơ sờ các
đối tượng này cũng đã được một số cơng trình nghiên cứu về tác động của dioxin lên
tuyến giáp và tuyến tụy đã được công bố, [3], [7].
\

Koopman - Esseboom và các cộng sự nghiên cứu ảnh hường của dioxin và các
đồng loại PCBs đối với hòrmon tuyến giáp ờ phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh của họ
[14] đã chứng minh rằng lượng PCDD, PCDF và PCB có thể thay đổi trạng thái cân
bằng nội tiết tố tuyến giáp.

M ột nghiên cứu của Zober và ,cs (1994) tiến hành theo dõi các công nhân phơi
nhiễm 2,3,7,8 - TCDD trong tai nạn BASF ừong thời gian 3-5 năm cho thấy tỳ lệ mới
mắc bệnh tuyến giáp tăng hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng.
Đánh giá theo dõi từ tai nạn Seveso, người ta thấy tỷ lệ tử vong do đái tháo đường
ở phụ nữ vùng bị ơ nhiễm 2,3,7,8 - TCDD tăng một cách có ý nghĩa thống kê (Pasatori

v à c s. 1998).
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước về ảnh hưởng dioxin vói tuyến giáp
Trong chiến tranh Việt Nam, quần đội Mỹ đã rải một lượng lớn các chất diệt cỏ cỏ
chứa dioxin xuống nhiều vùng ờ miền Nam Việt Nam. Cho đến nay, hậu quả của cuộc
chiến tranh vẫn còn ảnh hưởng nặng nề tới môi trường và sức khỏe con người Việt Nam.
N gay từ những năm 70 của thế kỷ vừa qua, khi chiến tranh Việt Nam còn chưa kết
thúc, từ thực tiễn chiến trường miền Nam, các nhà y học Việt Nam là Tơn Thất Tùng và
Hồng Đình c ầ u đã quan tâm nghiên cứu tác hại của dioxin đối với sức khoẻ con người.
W ayne Dwenychuuk, Hoàng Đình c ầ u và các cộng sự (2002), sự tồn lưu dioxin

trong ao hồ, đất, trầm tích ... ở Miền nam Việt Nam cịn rất lớn, do đó nỏ có thể phơi
nhiễm sang các chuỗi thức ăn như cá, rau, gia cầm, gia sức...từ đó, nó sẽ là nguồn ô
nhiễm rất lớn với con người [21].
Trong một nghiên cứu cắt ngang mô tả nhằm đánh giá ảnh hường của chất da
cam/dioxin đối với sự thay đổi có thể của hormon giáp trạng và hướng giáp trạng trong
huyết thanh ờ 318 người dân đang sổng tại vùng bị phơi nhiễm. Nồng độ T3, FT4 và
TSH huyết thanh được xác định bằng kỹ thuật RIA và IMA. Kết quả nghiên cứu về nồng
độ hormon FT4, T3 TSH huyết thanh ở những người dân sống liên tục tại vùng phơi
nhiễm chất da cam/dioxin cho thấy ờ hai nhóm nguy cơ phơi nhiễm cao và thấp: nồng


9

3. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả cắt ngang, thu thập số liệu.

%

3.2. Đối tưọng nghiên cứu
Đề tài này là nhánh của đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cỉcu biến đổi nồng độ một sỗ
hormon ở người phơi nhiễm chất da cam/dioxin”rm: KHCN-33.11/11-15. Do đó, các đối
tượng nghiên cứu được lựa chọn theo tiêu chí của đề tài.
Đối tượng nghiên cứu gồm 207 người tuổi từ 18 - 70 tuổi, cư trú tại phường Bửu
Long và phường Trung Dũng thành phố Biên Hòa hơn 5 năm, nơi được coi là khu vực
“điểm nóng” ơ nhiễm chất da cam/dioxin.
Cỡ mẫu: Áp dụng cơng thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu điều tra dịch tễ khảo sát
tiền sử phơi nhiễm với chất da cam/dioxin:
n = Z 2(i-0/2).

d*
Trong đó:
n: cỡ mẫu cần biết.
Z(i-o/2): (hệ số tin cậy với xác suất 95%) = 1,96.
p: tỷ lệ nhiễm 16% (p = 16 %). Dựa trên số liệu nghiên cứu của Lê Ke Sơn
d: (mức độ chính xác kỳ vọng) = 0,05; Nên cỡ mẫu tính được xấp xỉ là 207.
* Tiêu chuẩn chọn nhóm nghiên cứu:
Những người được xếp vào nhóm phơi nhiễm khi có tiền sử phơi nhiễm mạn tính
với dioxin: phơi nhiễm qua đường tiêu hóa, hơ hấp, tiếp xúc ...
+ Độ tuổi 18-70 tuổi.
+ Có tiền sử bị phơi nhiễm rõ ràng (trực tiếp hay gián tiếp).
+ Đang sống tại các điểm nóng (thời gian sống > 5 năm).
+ Điều tra phả hệ, xác định các bệnh liên quan đến dioxin của đối tượng nghiên
cứu. Đối tượng phơi nhiễm hoặc thành viên gia đinh bị một trong các bệnh đặc trưng do

dioxin hoặc bị dị tật bẩm sinh.
* Tiêu chuẩn loại trừ:
+ Đối tượng khơng hợp tác trong q trình nghiên cứu.

:


10

+ Những người tạm trú trong khu vực không phải người địa phương, có chỗ ờ
khơng ổn định hoặc khơng thường xuyên ờ nơi cư trú.
+ Đối tượng ngoài độ tuổi nghiên cứu.
+ Đơi tượng là phụ nữ có thai hoặc cho con bú.
+ Đang dùng các thuốc chống ung thư, corticoid...
3.3. Phương pháp chọn mẫu
- Các đối tượng nghiên cứu được sàng lọc theo bộ cơng cụ phịng vấn, để đánh
giá các nguy cơ phơi nhiễm chất da cam/dioxin (phụ
3.4. Phương pháp thu thập số liệu
Nơi thu thập mẫu: phường Bửu Long và phường Trung Dũng thành phố Biên Hịa
- tỉnh Đồng Nai.

(Đềtài này chúng tơi kế thừa từ đề tài cấp Nhà nước, nên

sử dụng một số thông tin đã được thu thập).
- Các đối tượng được khám lâm sàng
- Phỏng vấn
- Lấy máu để xét nghiệm
3.5. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu
3.5.1. Trang thiết bị, vật liệu nghiên cứu
+ Máy miễn dịch tự động Immulite 2000Xpi của hãng Siemens (Đức).

+ Máy đo tín hiệu quang sau tiếp xúc tế bào Centro x s 3LB 960 hãng Berthold.

Hình 3.1: Hình ảnh máy miễn dịch tự
động Immulite 2000XPÌ

Hình 3.2: Hình ảnh máy đo tín hiệu
quang học Centro LB 960, Berthold

tơi có


11

+ Bộ hóa chất sử dụng làm tinh sạch dioxin ừong huyết thanh: sử dụng bộ hóa chất
của hãng Sigma.
+ Tế bào gan chuột hãng BDF.
+ Hóa chất xét ngiệm - dung dịch kiểm tra (QC) các hormon:
- Bộ kít hóa chất của Siemens (Đức).
- QC cùa Randox.
3.5.2. Địa điểm, thòi gian nghiên cứu.
+ Địa điểm tiến hành xét nghiệm các chỉ tiêu nghiên cứu:
- Định lượng các chi tiêu hormon tuyển giáp và tuyến tụy tại Phịng xét nghiệm
Hóa sinh - Đại học Điều dưỡng Nam Định.
- Xét nghiệm định lượng dioxin bằng phưomg pháp DR CALUX tại Trung tâm
NC ứng dụng Sinh - Y - Dược quân sự - Học viện Quân y.
- Xét nghiệm định lượng các đồng đẳng dioxin bằng phương pháp GCMS tại
phòng xét nghiệm của Đại học Y khoa Kanazawa - Nhật Bản.
+Thời gian nghiên cứu: Từ 03/2015 đến 10/2015
+ Cách lấy, xử lý và bảo quản mẫu bệnh phẩm xét nghiệm:
- Lấy 20ml máu tĩnh mạch lúc đói vào buổi sáng sớm, tuyp có chổng đơng làm

xét nghiệm huyết học, cịn lại li tâm và tách thành nhiều tuýp để bào quản.
- Vận chuyển: do địa điểm nghiên cứu xa trung tâm xét nghiệm nên phải bảo quản
trong tủ đá, khi vận chuyển bảo quản trong thùng xốp chứa gel đá khô bọc kín, vận chuyển
về Trung tâm Nghiên cứu và ứng dụng Sinh - Y - Dược quân sự, Học viện Quân y.
- Bào quản: khi về Trung tâm Nghiên cứu Sinh - Y - Dược học Quân sự, Học
viện Quân y, bảo quản trong tủ chuyên dụng (- 80°C).
3.5.3. Xác định chỉ sế nhân trắc và khám lâm sàng
+ Các đối tượng đều được đo chiều cao, cân nặng.
+ Đo huyết áp động mạch.
+ Phỏng vấn các yểu tố liên quqn.
+ Các mục khám lâm sàng được kê khai qua bộ công cụ (phụ lục).


12

3.5.4.

Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

* Các chỉ tiêu xét nghiệm:
+ Chi tiêu dioxin.

\

- 207 mẫu được định lượng dioxin bằng phương pháp DR CALƯX.
- 51 mẫu được định lượng các đồng đẳng dioxin theo phương pháp GCMS.
+ Các chi tiêu tuyến giáp: 207 mẫu được định lượng nồng độ các hormon:
- TSH (Thyroid-stimulating hormon).
- T3 (Triiodothyronin) và FT3 (Free Triiodothyronin).
- T4 (Tetraiodothyronin) và FT4 (Free Teừaiodothyronin).

* Định lượng dioxin:
+

Định lượng dioxin bằng phương pháp DR CALUX: Là một kỹ thuật dùng tế bào

cảm biển sinh học để định lượng dioxin và PCB ưong mẫu vật phẩm.
- Nguyên lý: Do các chất dioxin, PCB và các chất giống dioxin có khả năng gắn
đặc hiệu vào Aryl Hydrocacbon Receptor (AhR) trên bề mặt tế bào, nên các nhà nghiên
cứu đã phát triển dòng tế bào đặc trưng (H4II) để phát hiện dioxin và PCB.

Hình 3.3: Nguyên lý kỹ thuật DR CALUX
Khi dioxin và PCB tiếp xúc vói tế bào này, thụ cảm thể AhR ừên bề mặt tế bào sẽ
gắn với chúng. Phức hợp di chuyện vào trong nhân, gắn đặc hiệu với protein ARNT.
Phức hợp mới AhR-ARNT tiếp tục gắn đặc hiệu với vùng Dioxin Responsive
Element (DRE) nằm trên chuỗi DNA. Đây là vùng nằm ờ phía trên, tại vùng khởi động
cùa rất nhiều gen, ừong đó có gen mã hóa cho q trình tổng hợp Enzym Luciferase.


13

Enzym luciferase sẽ chuyển hóa cơ chất luciferin. Phản ứng chuyển hóa cơ chất này
phát ra ánh sáng. Cường độ ánh sáng sẽ tương ứng với lượng dioxin và PCB tiếp xúc với
tế bào cảm biến.

Hình 3.4: Hình ảnh tế bào H4II sau khi cho tiếp xúc vói mẫu dioxin
Giá trị cường độ ánh sáng được đo và dùng để tính tốn nồng độ dioxin và PCB có
trong mẫu, dựa ừên đường chuẩn xây dựng từ việc cho tế bào tiếp xúc với TCDD ờ các
nồng độ đã biết trước khác nhau.
Các bước tiến hành:
Xác định nồng độ dioxin toàn phần theo phương pháp DR - CALUX:

s Tách chiết dioxin từ mẫu máu.
s Làm sạch dịch chiết qua cột silica.
s Chuyển dịch chiết đã làm sạch vào DMSO.
s Nuôi cấy tể bào H4IIE.
s Đánh thức tế bào từ hạng thái bảo quản trong nitơ lỏng.
s Cấy chuyển tế bào.
s Giữ giống tế bào.
s Phân tích hàm lượng dioxin.
s Cho tể bào tiếp xúc với TCDD chuẩn và mẫu cần đo.
Chuẩn bị môi trường chứa chất độc được thực hiện theo các bước sau:
s Đo nồng độ TCDD trong mẫu.
s Phân tích kết quả hghiên cứu.
Sử dụng chương trình tính tốn trên Excel file DR CALUX7 - 4.XỈS do BDS c u n g
cấp xây dựng đường cong nồng độ chuẩn và tính tốn hàm lượng dioxin và các chất
tương tự ừên gram mỡ (g mỡ).


14

ng độ

các đồng đẳng của dioxin bằng phương pháp GCMS:
(Gas Chromatography Mass Spectometry)
- Nguyên lý: GCMS (Gas Chromatography Mass Spectometry - sắc kí khí kết
hợp khối phổ): Mầu được đưa vào ừong máy, dẫn đến buồng phân tích, thường là buồng
ion hóa, nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300°c để mẫu trờ thành dạng khí, 17
đồng phân PCDDs/PCDFs trong mẫu sẽ được phân tách với tốc độ khác nhau, tùy thuộc
tính chất bay hơi của chất.
Trong buồng ion hoá các điện tử phát ra từ cathode, bay về anode với vận tốc lớn,
các phân từ chất nghiên cứu ở trạng thái hod sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hố,

có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hố, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa
học độc nhất của nó, cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu
trúc của các chất đã biết.
Các chất đã được phân tích sẽ được chuyển đến đầu dị và sau đó thơng tin sẽ
được chuyển đến máy tính.
Định lượng một chất bằng cách so sánh vói mẫu chuẩn, là chất biết trước và đã
được định lượng chuẩn bằng GC - MS. Mức phát hiện của phương pháp: 0,01ppt.
- Kỹ thuật định lượng:
s Tách mỡ: Qua một loạt các bước sử dụng dung môi hữu cơ như: ethanol,
hexan, petroleum, ether, diethyl ether, và các hỏa chất như ammonium sulfate, NaCl,
Na2SC>4, mỡ sẽ được tách ra và được cân đo.
'S Tinh sạch mẫu: Sau khi xà phịng hóa bằng dung dịch KOH, mỗi mẫu sẽ đi
qua m ột cột.
Tinh sạch được thiết kế bao gồm nhiều lớp Silicagel.
Dung dịch thu được gồm dioxin và PCB đã được tinh sạch, để phân tách 2 thành
phần dioxin và PCB mẫu được đưa qua cột than hoạt tính và dùng các dung mơi khác
nhau để phần tách 2 thành phần trên.
s

Định lượng dioxin bằng hệ thống GCMS

Trước khi được đưa vào hệ thống GCMS, mẫu được cô đặc xuống 20 micro lit.
Các chất dioxin/PCB chuẩn nồng độ khác nhau được đo cùng để tạo dữ liệu xây dựng
đường chuẩn, phần mềm đặc thù dùng để phân tích kết quả sẽ đưa ra giá trị nồng độ
từng đồng đẳng/ đồng phân của dioxin và PCB.


15

Sau khi đã định lượng được nồng độ của các đồng đẳng dioxin và PCB trong

mẫu, độc tính qui đổi của mẫu được tính theo cơng thức:

TEQ = £TEFi * Ci
Trong đó:
TEQ: (Toxic Equivalents): tổng độ độc.

TEFi :(Toxic Equivalency factor): hệ số độc qui đổi của đồng đẳng i.
Ci là nồng độ của đồng đẳng i.
Định lượng nồng độ các hormon tuyến giáp trong huyết tương:

+

-Nguyên lý phương pháp miễn dịch hóa phát quang.

Hình 3.5: Ngun lý phưomg pháp miễn dịch hóa phát quang
- Triiodothyronin (T3): định lượng theo phương pháp miễn dịch hóa phát quang:
kháng thể đơn dịng chuột kháng T3 người và en2ym alkalin phosphatase được liên hợp
kháng thể đơn dòng chuột kháng T3 người trong dung dịch đệm.
Mầu sẽ được ủ với thuổc thử cùng với hạt bead trong 30 phút. Trong thời gian này
T3 có trong mẫu sẽ tạo phức theo kiểu kẹp sandwich với kháng thể đơn dòng chuột trên
pha rắn và kháng thể được gắn enzym là kháng thể đơn dòng chuột ừên pha lịng. Những
phần cịn lại khơng liên quan phản ứng sẽ được loại bỏ bằng cách ly tâm và rửa. Cuối
cùng, các tín hiệu phát quang của enzym alkalin phosphatase sẽ được phát hiện sau khi
cho cơ chất.
- Free Triiodothyronin (FT3): được định lượng theo phương pháp miễn dịch hóa
phát quang: sử dụng kháng thể đơn dòng chuột kháng T3 người và enzym alkalin
phosphatase được liên hợp T3 trong dung dịch đệm.


16

Mầu sẽ được ủ với thuốc thử cùng với hạt bead trong 30 phút. Trong thời gian này
FT3 có trong mẫu sẽ cạnh tranh với T3 (do một số tương tác với kháng thể kháng T3 trên
bead), để liên họp với enzym alkalin phosphatase của thuốc thử. Tất cả những chất cịn
lại khơng liên quan phản ứng sẽ được loại bỏ bằng cách ly tâm và rửa. Cuối cùng, các tín
hiệu phát quang của enzym alkalin phosphatase sẽ được phát hiện sau khi cho cơ chất.
- Thyroxin (T4): tương tự T3, sử dụng khẩng thể đơn dòng chuột kháng T4
- Free thyroxin (FT4): tương tự FT3, sử dụng kháng thể đơn dòng chuột kháng T4.
- Thyroid stimulating hormon (TSH): tương tự T3, sử dụng kháng thể đơn dòng
chuột kháng TSH.
- Qui trình xét nghiệm hormon trên máy Immulite 2000 XP cùa hãng Siemens:
Bật máy, khởi động phần mềm Immulite 2000XP
Cài đặt hóa chất vào máy và quét mã vạch trên hộp cho máy cập nhật các thơng số.
Chạy chương trình calibrator
Chạy chương trình QC để kiểm tra
Chạy mẫu thường qui theo mã bệnh nhân từ BH001 đến BH207.
Két quả sẽ in trực tiếp trên giấy A4.
3.5.5. Phưomg pháp xử lý số liệu
Được xử lý bằng phần mềm thống kê y học SPSS 20.0: các sổ liệu sẽ được nhập
vào excel 2013, sau đó sẽ được liên kểt và mở trong chương trình SPSS 20.0.
+ Trong SPSS 20.0 số liệu sẽ được tạo biến cho phù hợp, tính giá trị trung bình (
X ), giá trị lớn nhất (Max)), giá trị nhỏ nhất (Mũi), độ lệch chuẩn (SD).
+ So sánh 2 giá trị trung binh của các nhóm đối tượng bằng thuật tốn IndependentSamples T test.
+ Phân tích mối tương quan giữa nồng độ các hoimon với nồng độ dioxin trong máu
đối tượng bằng thuật toán thống kê hai chiều (2-tailed)- Spearman's rho.
3.6. Y Đức
+ Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích khoa học, hồn tồn khơng có mục
đích gì khác, đã được hội đồng đạo đức y khoa của Học viện Qn Y thơng qua.
+ Các qui trình kỹ thuật, phương pháp nghiên cứu được tiến hành đúng quy định
nhằm đảm bảo kết quả chính xác và trung thực.

+ Đối tượng tự nguyện, có thể ngừng tham gia nểu không muốn tiếp tục.


17

+ Tránh tối đa các tai biến có thể xảy ra, nếu có tai biến xảy ra đối tượng được
điều trị tích cực và miễn phí hồn tồn.
+ Các số liệu cá nhân được bảo mật tuyệt đối.
3.7. Mơ hình nghiên cứu

LựA CHỌN ĐỔI TƯỢNG NGHIÊN CỬƯ (N = 207)
¡531

____________________r_ __________ N

_________________vị__________________

XỐNG Đ ộ

NÒNG Đ ộ HORMON

KẾTLUẬN

KIẾN NGHỊ

73ƯÒNG ÕẬỈHỘC điẽũ Dường
______ NAM ĐINH

THỰ VIỄN
S ỏ r/.I.V ằ O J

\


18

4.

KẾT

QUẢNGHIÊN cứu

Qua điều ừa phỏng vấn và kiểm ữa sức khỏe của các đối tượng nghiên cứu ở phường
Bửu Long và phường Trung Dũng thành phố Biên Hòa. Kết quả được trình bày như sau:
4.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu
4.1.1. Đặc điểm về tuổi đòi của các đối tượng nghiên cứu.
r

X

Ẩ

Bảng 4.1: Sơ lượng, giói và các nhóm tuoi ở đôi tưọng nghiên cứu
N .

Chỉ số

Chung (n = 207)

Nam (n =46)

Tỳ lệ

%

Số
lượng

9

19,57

25

15,53

45,89

20

43,48

75

46,58

78

37,68

17

36,96

61

37,89

207

100

46

100

161

100

Số lượng

Tỷ lệ
%

số
lượng

Tỷ lệ

18-30

34

16,43

31-45

95

>46

Nhóm tuổi

Chung .

Nữ (n = 161)

%

X ±SD
Min - Max

41,25 ±9,36
18-66

Nhận xét: Từ số liệu thống kê trong bảng 4.1 cho thấy
Tuổi trung bình: 41,25 ± 9,36 (tuổi)
Tuổi thấp nhất là 18 tuổi, cao nhất là 66 tuổi.
4.1.2. Nghề nghiệp của các đối tượng nghiên cứu

Bảng 4.2: Phân bố nghề nghiệp hiện tại của các đối tượng
Nghề nghiệp hiện tại

Nữ

Nam
n

(%)

n

(%)

Nội trợ

6

12,10

46

28,50

Lao động phổ thông

13

29,60

21

13,20

10

22,00

32

19,70

Buôn bán

6

13,20

37

22,90

Kỹ sư/Viên chức

8

16,50

18

11,30

Sinh viên

2

5,50

5

3,10

Nghỉ hưu

1

1,10

2

1,30

Tổng số

46

100

161

100

Cơng nhân

•