Định danh và khảo sát sự sinh trưởng hệ sợ của nấm linh chi đen

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề: .............................................................................................................. 1
1.2 Tình hình nghiên cứu: ............................................................................................. 2
1.3 Mục đích nghiên cứu: ............................................................................................. 4
1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu:............................................................................................. 4
1.5 Phương pháp nghiên cứu: ....................................................................................... 4
1.6 Các kết quả đạt được của đề tài: ............................................................................. 5
1.7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: ................................................................................. 5
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 6
2.1. Nấm Linh chi ......................................................................................................... 6
2.1.1. Khái quát chung [1, 2, 8, 10] .......................................................................... 6
2.1.2. Vị trí phân loại ................................................................................................ 6
2.1.3. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi đen ......................... 7
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) ....... 7
2.1.3.2. Các giai đoạn phát triển của sợi nấm [3, 13] ................................................ 9
2.1.4. Điều kiện sống của nấm linh chi. ................................................................. 10
2.1.4.1 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm. ..................... 10
2.1.4.2 Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm. .................. 11

i


2.1.5 Các nghiên cứu về nấm linh chi đen: ............................................................. 13
2.2. Nguyên liệu trồng nấm ........................................................................................ 14
2.3

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................... 16

2.3.1

Tổng quan các phương pháp ly trích DNA ................................................ 16

2.3.1.1 Nguyên tắc ................................................................................................. 16
2.3.1.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật trong mơi trường tự nhiên............ 16
2.3.2

Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong q trình phát hiện lồi ........................ 18

2.3.2.1 Kỹ thuật PCR ............................................................................................. 18
2.3.2.2 Gen rDNA .................................................................................................. 18
2.3.2.3 Ứng dụng của PCR trong q trình phát hiện lồi vi sinh vật ................... 20
2.3.3

Điện di........................................................................................................ 21

2.3.3.1 Nguyên tắc ................................................................................................. 21
2.3.3.2 Các loại gel và công dụng của từng loại. ................................................... 22
2.3.4 Xây dựng cây phát sinh loài ........................................................................... 22
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 24
3.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu ....................................................... 24
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: .................................................................................... 24
3.1.2. Thiết bị và dụng cụ tiến hành ........................................................................ 24
3.1.3. Hóa chất: ........................................................................................................ 24
3.2 Nội dung và phương pháp bố trí thí nghiệm......................................................... 26
3.2.1 Sử dụng phương pháp phịng ẩm để định danh hình thái: .............................. 26
3.2.2. Sử dụng sinh học phân tử để định danh: ....................................................... 27

ii


3.2.2.1 Tách chiết DNA: ......................................................................................... 27
3.2.2.2 Chạy phản ứng PCR: ................................................................................... 27
3.2.3 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen trên môi trường thạch ở
các nhiệt độ khác nhau: ........................................................................................... 29
3.2.4 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen ở các pH khác nhau: . 29
3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ carbon khác nhau lên sự sinh trưởng
của nấm Linh chi đen: ............................................................................................. 29
3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ nitrogen khác nhau lên sự sinh trưởng
của nấm Linh chi đen: ............................................................................................. 30
3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên sự sinh trưởng của
nấm Linh chi đen: .................................................................................................... 30
3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên sự sinh trưởng của
nấm Linh chi đen: .................................................................................................... 31
3.2.9 Khảo sát sự sinh trưởng của sợ nấm Linh chi đen trên các môi trường nuôi
cấy tổng hợp khác nhau: .......................................................................................... 31
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 32
4.1 Kết quả quan sát hình thái học nấm sợi: ............................................................... 32
4.1.1 Kết quả quan sát khuẩn lạc: ............................................................................ 32
4.1.2 Kết quả quan sát sợi nấm................................................................................ 33
4.2 Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm Linh chi đen.
.................................................................................................................................... 34
4.2.1 Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm Linh chi đen: ........................... 34
4.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA ............................................. 34

iii

4.3 Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm Linh chi đen trên ngân
hàng gen NCBI và thiết lập cây phân loài: ................................................................. 35
4.3.1 Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của mẫu nấm LC1: ..................... 35
4.4 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen ở các điều kiện nhiệt độ
khác nhau: ................................................................................................................... 36
4.5 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen ở các điều kiện pH khác
nhau:............................................................................................................................ 37
4.6 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ carbon khác nhau lên sự phát triển của sợi
nấm Linh chi đen: ....................................................................................................... 39
4.7 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ nitrogen khác nhau lên sự phát triển của sợi
nấm Linh chi đen: ....................................................................................................... 40
4.8 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên sự sinh trưởng hệ sợi
của nấm Linh chi đen: ................................................................................................. 41
4.9 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên sự sinh trưởng của sợi
nấm Linh chi đen: ....................................................................................................... 42
4.10 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen được nuôi cây ở các loại
môi trường khác nhau: ................................................................................................ 44
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 46
5.1 Kết luận: ................................................................................................................ 46
5.2. Đề nghị:................................................................................................................ 47
CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 48
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 1

iv


v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

o

C

:

Degree Celsius

𝜇m

:

micromet

bp

:

base pairs

ANOVA

:

Analysis Of Variation

ATP

:

Adenosin Triphosphate

BLAST

:

Basic Local Alignment Tool

CTAB

:

Cetyl – Trimetyl – Amoniumbromide

DNA

:

Deoxyribonucleotide Acid

EDTA

:

Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

PCR

:

Polymerase chain reation

P:C:I

:

Phenol : Chloroform : Isoamyl alchol

PDA

:

Potato Dextrose Agar

SDS

:

Sodium dodecyl sulfate

RNA

:

Ribonucleic acid

rDNA

:

Ribosomal Deoxyribonucleotide Acid

TAE

:

Tris – Acetic – EDTA

UV

:

Ultra violet

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển nấm Linh chi ................... 11
Bảng 2.2 Nồng độ một số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng ................................ 13
Bảng 2.3 Hàm lượng các chất có trong mùn cưa........................................................... 14
Bảng 2.4 Thành phần dinh dưỡng trong cám ............................................................... 15
Bảng 2.5 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) ..... 19

vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Thể quả tự nhiên Amauroderma subresinosum ............................................... 8
Hình 2.2 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum ................................... 8
Hình 2.3 Chu trình phát triển của nấm Linh chi .............................................................. 9
Hình 2.4 Bảng đồ primer ITS ........................................................................................ 20
Hình 4.1 Khuẩn lạc mẫu nấm LC1 ................................................................................ 32
Hình 4.2 Hình thái sợi nấm được quan sát ở tiêu cự X40/0.65 ..................................... 33
Hình 4.3 Hình thái sợi nấm được quan sát ở tiêu cự X100/1.25 ................................... 33
Hình 4.4 Kết quả ly trích bộ gen của 2 mẫu nấm Linh chi đen ..................................... 34
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS ....................................................... 35
Hình 4.6 Kết quả dựng cây phát sinh lồi ..................................................................... 36
Hình 4.7 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng hệ sợi của nấm linh chi đen ở các nhiệt độ
khác nhau........................................................................................................................ 37
Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng hệ sợi của nấm linh
chi đen ............................................................................................................................ 38
Hình 4.9 Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy hệ sợi của nấm linh chi đen ở các pH khác nhau
........................................................................................................................................ 38
Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ carbon đến sự sinh trưởng hệ sợi
của nấm linh chi đen ...................................................................................................... 39
Hình 4.11 Kết quả sau 7 ngày ni cấy hệ sợi của nấm linh chi đen ở các nồng độ
carbon khác nhau............................................................................................................ 40
Hình 4.12 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ nitrogen lên sự sinh trưởng của
nấm linh chi đen ............................................................................................................. 40
Hình 4.13 Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy hệ sợi của nấm linh chi đen ở các nồng độ
nitrogen khác nhau. ........................................................................................................ 41

viii

Hình 4.14 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau đến sự sinh
trưởng hệ sợi của nấm linh chi đen ................................................................................ 42
Hình 4.15 Kết quả sau nuôi cấy nấm linh chi đen trên môi trường với các nguồn
carbon khác nhau............................................................................................................ 42
Hình 4.16 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các nguồn nitrogen đến sự sinh trưởng của
nấm linh chi đen ............................................................................................................. 43
Hình 4.17 Kết quả sau nuôi cấy hệ sợi của nấm linh chi đen trên mơi trường với các
nguồn nitrogen khác nhau .............................................................................................. 44
Hình 4.18 Biểu đồ sinh trưởng hệ sợi của chủng nấm linh chi đen được nuôi trên các
loại môi trường khác nhau ............................................................................................. 44
Hình 4.19 So sánh sự sinh trưởng hệ sợi của nấm linh chi đen được nuôi trên các loại
môi trường khác nhau..................................................................................................... 45

ix


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề:
Từ xưa đến nay, nhu cầu chữa trị bệnh để khắc phục bệnh tật, bảo toàn mạng sống
trước ngưỡng cửa cái chết và kéo dài tuổi thọ ln là điều thiết yếu của lồi người, vì
vậy họ đã khơng ngừng cố gắng tìm mọi cách để đạt được điều đó. Từ những kinh nghiệm
lưu truyền trong dân gian, loài người đã sử dụng nhiều loại thuốc, từ dạng sơ chế đến
tinh chế, cô đặc, hoặc trích xuất từ các loại thảo dược có sẵn trong tự nhiên để điều trị
bệnh.
Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ
biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo dược đã được tiến hành ở
nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, ….Trong
đó, nấm Linh chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước vùng

Châu Á, vì nó có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu. Ở Trung Quốc, nấm Linh chi đã
được nghiên cứu rất nhiều và sử dụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng
bổ dưỡng, điều hồ huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ,…Tác dụng của Linh chi
đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng dược” trị được bách bệnh. Những nghiên
cứu gần đây cho thấy Linh chi cịn có khả năng giải độc chì, điều hịa huyết áp, làm giảm
hàm lượng cholesterol trong máu….[11, 14]
Nấm Linh chi đen là một loại nấm quý, được biết đến với tên gọi Hắc chi, là một
trong sáu loại nấm linh chi quý hiếm (lục bảo linh chi). Nấm linh chi đen có nhiều công
dụng trong việc chữa bệnh, nâng cao sức khỏe cho con người, được ứng dụng rộng rãi
trong y học.
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đề tài “Định danh và khảo sát sự sinh trưởng
hệ sợi của nấm Linh chi đen” được thực hiện, nhằm giúp nâng cao, tối ưu hóa mơi

1


trường ni cấy, đồng thời định danh phân lồi của chủng nấm là khâu quan trọng và
cần thiết để tạo tiền đề cho quá trình nghiên cứu sâu về chủng nấm này được thuận lợi
hơn và giúp bảo tồn nguồn gen bản địa.
1.2 Tình hình nghiên cứu:
Trong nước:
Nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở trong nước cũng như xuất
khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm
dị các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm
Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein,
polysaccharide…[26]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho
nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [10].
Một số cơng trình nghiên cứu khoa học đã công bố như: “Bước đầu nghiên cứu tác
dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột”
“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum)

trên chuột gây suy gan thực nghiệm” (Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan) , “Nghiên
cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đối với cấu trúc mô tinh
hồn chuột nhắt trắng dịng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao” (Đoàn Suy Nghĩ), “Khảo
sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại
vùng núi Chứa Chan – Việt Nam” (Nguyễn Minh Khang),…
Nước ngoài:
Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm
lucidumol A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó kiểu Lanostane
triterpene có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả
thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào

2


nguồn giống, yếu tố mơi trường. Vai trị của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong
phịng chống căn bệnh HIV.[27]
He, Y. và ctv (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có
hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose)
và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside [14].
Hikino, H.và ctv (từ 1985 đến 1989) chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều
polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư. Các ganoderan B
có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và
giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái
tháo đường.Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng
tính miễn dịch [14].
Năm 1994, Kim Byong Kak tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp
Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương
(Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức
polysaccharide – protein lên đáng kể [14].
Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2

(Interleukine-2) và hoạt tính DNA polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng
soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi [14].
Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực
chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các lồi G.lucidum và
G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [10]
Có lẽ đa dạng

nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine,

triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trị của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng
histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp
Cholesterol và hạ huyết áp. [10,11, 26]
3


1.3 Mục đích nghiên cứu:
Định danh chủng nấm linh chi đen bằng phương pháp hình thái học và sinh học
phân tử.
Khảo sát sự phát triển hệ sợi của chủng nấm linh chi đen ở một số điều kiện nuôi
cấy khác nhau (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nồng độ carbon, nồng độ
nitrogen, các môi trường nuôi cấy cơ bản).
1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu:
Đề tài tập trung vào các nghiên cứu cụ thể sau:
-

Định danh chủng nấm linh chi đen được lấy từ phịng thí nghiệm của phịng Vi sinh
ứng dụng của Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM

-

Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển hệ sợi của chủng nấm vừa được
định danh gồm các điều kiện sau:
Nhiệt độ: 20, 25, 30, 35 oC.
pH: 4, 5, 6, 7, 8.
Môi trường nuôi cấy: PDA, Czapek DOX, Hen, Hop.
Nguồn carbon: glucose, succrose, maltose, lactose
Nguồn nitrogen: urea, amonium nitrate, yeast extract, peptone.
Nồng độ carbon: 10, 20, 30, 40 (g/l).
Nồng độ nitrogen: 5, 10, 15, 20 (g/l).

1.5 Phương pháp nghiên cứu:
Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài bao gồm:
- Phương pháp nuôi cấy đặt thạch.
- Phương pháp ly trích DNA

4


- Phương pháp điện di.
- Kỹ thuật PCR.
- Định danh chủng nấm linh chi đen bằng phương pháp hình thái học và phương pháp
sinh học phân tử.
- Phương pháp xử lý thống kê: Số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê bằng Microsoft
Excel để tính giá trị trung bình. Ngồi ra cũng sử dụng ANOVA để tính tốn so sánh các
giá trị trung bình.
1.6 Các kết quả đạt được của đề tài:
Quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài đã đạt những kết quả sau đây:
- Định danh được chủng nấm LC1 của phòng Vi sinh ứng dụng thuộc Viện Sinh học
Nhiệt đới TP.HCM thuộc loài Amaroderma subresinosum.
- Hệ sợi của nấm sinh trưởng tốt ở các điều kiện nhiệt độ 30 oC, pH 5 – 6. Nguồn carbon

và nguồn nitrogen thích hợp cho nấm sinh trưởng là glucose với nồng độ 20 g/l và yeast
extract với nồng độ 5 g/l.
- Ngồi ra, đối với các loại mơi trường nuôi cấy nấm tổng hợp, hệ sợi của nấm phát triển
tốt trên môi trường dịch chiết khoai tây (PDA).
1.7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm các phần:
- Tổng quan tài liệu.
- Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
- Kết quả và thảo luận.
- Kết luận và kiến nghị.
- Tài liệu tham khảo.

5


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm Linh chi
2.1.1. Khái quát chung [1, 2, 8, 10]
Nấm Linh chi được xếp vào “Thượng Dược“, trong sách “Thần nông bản thảo”
cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung
Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát
công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590).
Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:
 Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)
 Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)
 Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)
 Bạch chi (Linh chi trắng cịn gọi Ngọc chi)
 Hồng chi (Linh chi vàng cịn gọi Kim chi)
 Tử chi (Linh chi tím)
Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) có nhiều tên gọi khác nhau như Bất lão

thảo, Vạn niên thảo, Thần tiên thảo, Chi linh, Đoạn thảo, Nấm lim,… Tên gọi Linh chi
bắt nguồn từ Trung Quốc, hay theo tiếng Nhật gọi là Reishi hoặc Mannentake.
Ở các nước Châu Á, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc
nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được cơng nghiệp hóa với quy mô lớn
về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên
cứu hóa dược các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.
2.1.2. Vị trí phân loại
Vị trí phân loại của Nấm Linh chi hiện nay [1, 3]:

6


Ngành:
Ngành phụ:
Lớp:
Lớp phụ:
Bộ:
Họ:
Họ phụ:
Chi:

Eumycota
Basidiomycotina
Hymenomycetes
Hymenomycetidae
Aphyllophorales
Ganodermataceae
Ganodermoidae
Ganoderma
Amauroderma

Tomophagus

2.1.3. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi đen
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)
Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ
Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 lồi: trong đó nổi bật là Ganoderma (trên 100
loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài). [11]
Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám trên thân cây gỗ.
Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống hoặc khơng. Khi theo dõi
q trình phát sinh hình thái ở các lồi Amauroderma, tán nấm hình thành, liền tán và
tạo kiểu đính tâm rất tương đồng với các loài Ganoderma mọc tự do dưới đất. Cho nên
có thể xem chi Amauroderma đã phát sinh trực tiếp từ Ganoderma và đây là nhánh phân
hoá lớn nhất trong họ Ganodermataceae (Lê Xuân Thám, 1996) [10].
Mặt trên quả thể nấm Amauroderma subresinosum có màu đen bóng, nhiều nếp gấp
đồng tâm, mép mũ nấm dày và uốn lượng nhấp nhô. Mô nấm là chất gỗ cứng màu nâu
quế, đơi khi ở các mẫu già mơ có các đốm chất màu đen, dày 6 – 15 mm. Bào tầng gồm
các ống nấm trịn, có màu trắng đục, dày cỡ 3 – 6(- 10) ống/mm. Phần thịt mô nấm
(context) được cấu tạo bởi 3 loại sợi: sợi dinh dưỡng trong suốt, có vách mỏng, đường
kính cỡ 3 – 5 µm; sợi bện khơng màu, vách mỏng, đường kính cỡ 1,5 – 2 µm và sợi cứng
màu nâu nhạt, vách dày hóa cứng, đường kính cỡ 3 – 4 µm. [20]
7


Hình 2.1 Thể quả tự nhiên Amauroderma subresinosum [ 30 ]
d

Hình 2.2 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum (Corner, 1983)
a: Hệ sợi dinh dưỡng; b: Hệ sợi cứng trong thịt
nấm
c: Hệ sợi bện trong thịt nấm; d: Bào tử đảm

Các báo cáo của Teng (1963) ghi nhận bào tử nấm Amauroderma subresinosum
có kích thước tương đối nhỏ 3 – 6 x 2 – 4,5 µm, Steyaert (1972) ghi nhận kích thước
bào tử 12,5 – 16 – 20 x 8 – 10,5 – 11,75 µm. Đến 1983, Corner mơ tả bào tử loài này
8


có hình dạng trứng, màu nâu, kích thước bào tử lớn 14 – 16 x 10 – 11 µm. Corner dựa
vào kích thước, hình dạng bào tử nấm và khẳng định chi Amauroderma thuộc họ
Ganodermataceae [19, 20], quan điểm này cũng được Ryvarden (1991) thừa nhận [10].
2.1.3.2. Các giai đoạn phát triển của sợi nấm [3, 13]
Quả thể
Sợi nấm song nhân

Đảm

Sợi nấm đơn nhân

Đảm và bào tử
đảm

-

Phối nhân trong
đảm

Hình 2.3 Chu trình phát triển của nấm Linh chi [1]
Giai đoạn sinh trưởng
Giai đoạn này thường dài, nấm ở giai đoạn này chủ yếu là dạng sợi. Sợi nấm (hypha)

mỏng manh và gồm 2 nhân, có nguồn gốc từ 2 bào tử khác nhau nẩy mầm và phối hợp

lại. Hệ sợi nấm (mycelium), còn gọi là hệ sợi dinh dưỡng (vegetative mycelium), len lỏi
trong cơ chất để rút lấy thức ăn. Thức ăn muốn vào tế bào sợi nấm phải thông qua màng
tế bào. Khi khối sợi đạt đến mức độ nhất định về số lượng, gặp điều kiện thích hợp, sẽ
bện kết lại tạo thành quả thể nấm. Trong trường hợp bất lợi, sẽ hình thành các bào tử
tiềm sinh hay hậu bào tử (chlamydospore).

9


-

Giai đoạn phát triển
Giai đoạn này thường ngắn, lúc bấy giờ sợi nấm đan vào nhau, hình thành 1 dạng

đặc biệt, gọi là quả thể nấm hay tai nấm (fruit body). Quả thể thường có kích thước lớn
và là cơ quan sinh sản của nấm. Trên quả thể có 1 cấu trúc, nơi tập trung các đầu ngọn
sợi nấm, đó là thụ tầng (hymenium). Chính ở đây 2 nhân của tế bào sẽ nhập lại thành 1.
Sau đó sẽ chia thành 4 nhân con hình thành các bào tử hữu tính (sexual spore), đảm bào
tử (basidiospore) hoặc nang bào tử (ascospore). Khi tai nấm trưởng thành, bào tử được
phóng thích, chúng nẩy mầm và chu trình lại tiếp tục .
2.1.4. Điều kiện sống của nấm linh chi.
2.1.4.1 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm.
Các yếu tố vật lý tác động lên sợi nấm khác với tác động lên sự hình thành quả thể
nấm. Tác nhân vật lý ảnh hưởng trực tiếp lên sợi nấm với mức độ khác nhau: mức độ tác
động thấp nhất, mức độ tác động tối ưu, mức độ tác động lớn nhất. Những yếu tố tác
động trực tiếp lên sự sinh trưởng sợi nấm là nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và độ thơng
khí:[13]
Nhiệt độ: Ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào, kích
thích hoạt động các chất sinh trưởng, các enzym và chi phối toàn bộ các hoạt động sống
của nấm. Mỗi lồi nấm có nhu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển khác nhau.

Nhiệt độ nuôi ủ hệ sợi bao giờ cũng cao hơn so với khi nấm ra quả thể vài độ. Nhiệt độ
cao hoặc thấp hơn nhiệt độ thích hợp sẽ làm cho hệ sợi nấm sinh trưởng chậm lại hoặc
chết hẳn. [2, 13]
Ánh sáng: Không cần cho quá trình sinh trưởng của nấm. Cường độ ánh sáng mạnh
kiềm chế sự sinh trưởng của sợi nấm, có trường hợp giết chết sợi nấm. Ánh sáng có thể
phá vỡ một số vitamin và enzym cần thiết, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường
của sợi nấm. Phịng ủ nấm không nên quá tối, sẽ gây trở ngại cho việc phát hiện bệnh và
10


nhất là tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, côn trùng phát triển. Trong giai đoạn nuôi
hệ sợi tạo quả thể, ánh sáng có tác dụng kích thích hệ sợi nấm kết hạch (nụ nấm). [2, 13]
Độ ẩm: Hầu hết các loài nấm cần độ ẩm cao. Một số lồi thuộc nấm đảm cần độ
ẩm thích hợp cho sự sinh trưởng tối ưu của sợi nấm (80 – 90%). Nhưng hầu hết các loài
nấm cần độ ẩm để sinh trưởng hệ sợi là 50 – 60% (Flegg, 1962) [13].
Độ thơng khí: Hàm lượng O2 và CO2 ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của
sợi nấm. Oxy cần thiết cho việc hơ hấp của hệ sợi nấm. Cịn nồng độ CO2 tăng cao trong
khơng khí sẽ ức chế q trình hình thành quả thể nấm.[13]
Ảnh hưởng của pH: Hầu hết các nhóm nấm mọc trên thực vật hay ký sinh thì thích
hợp đối với mơi trường pH thấp. Các lồi nấm mọc trên mùn bã hay trên đất thì thích
hợp với mơi trường pH trung tính hay mơi trường kiềm. Nhưng một số loại nấm có khả
năng mọc được ở biên độ pH khá rộng. Một số loài nấm có khả năng tự điều chỉnh pH
mơi trường về pH thích hợp cho sự sinh trưởng chính chúng.[1, 13]
Bảng 2.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển nấm Linh chi [1]
Yếu tố
Nuôi tơ
Ra quả thể
o
Nhiệt độ
20 – 35 C

25 – 30oC
Ẩm độ
55 – 60%
90 – 95%
pH
4,5 – 6
4,5 - 6
Cần ánh sáng tán xạ từ
Ánh sáng
Không cần
mọi phía
Nhiệt độ khơng nên thay đổi q lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triểnthành
tán mà ở dạng sừng hươu, đuôi gà (Trịnh Tam Kiệt, 1983) [1].
2.1.4.2 Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm.
Nguồn cacbon: Nguồn cacbon được cung cấp từ mơi trường ngồi để tổng hợp
nên các chất như: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát
triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn

11


cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Đối với các lồi nấm khác nhau
thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau, nhưng hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản
là glucose, với nồng độ đường là 2%. [1]
Trong tự nhiên, cacbon được cung cấp chủ yếu từ các nguồn polysaccharide như:
cellulose, hemicellulose, lignin, pectin,… Các chất này có kích thước lớn hơn kích thước
của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn tiêu hóa được cơ chất này, nấm tiết ra
emzyme ngoại bào phân hủy cơ chất thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể
xâm nhập được vào trong thành và màng tế bào. [6, 13]
Nguồn đạm (N): Đạm là nguồn cần thiết cho tất cả các môi trường nuôi cấy, cần

cho sự phát triển hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm sử dụng nguồn đạm để tổng hợp các chất hữu
cơ như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào. Nguồn đạm sử dụng
trong các môi trường ở dạng muối: muối nitrat, muối amon. Trong tế bào, ion NH4+
thường gắn với cetoglutamic và những amin khác được hình thành từ những phản ứng
chuyển hóa amin. Sự hiện diện của NH4+ trong mơi trường ảnh hưởng đến tỷ số C/N ,
chúng đánh giá mức độ hoạt động của vi sinh vật.[1, 13]
Khoáng: Cần cho sự phát triển và tăng trưởng của nấm [13]
-

Nguồn sufur: Được cung cấp vào môi trường từ nguồn sulfat và cần thiết để tổng
hợp một số loại acid amin.

-

Nguồn phosphat: Tham gia tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng.
Nguồn cung cấp phospho thường là từ muối phosphat.

-

Nguồn kali: Đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym
hoạt động. Đồng thời đóng vai trị cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong và
ngoài tế bào.

-

Magiê: Cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, nguồn magiê được cung
cấp từ sulfat magiê.

12

Vitamin: Những phân tử hữu cơ này được dùng với lượng rất ít, chúng khơng phải
là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào. Vitamin cần thiết và giữ chức năng đặc biệt
trong hoạt động của enzym. Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần
một lượng rất ít nhưng khơng thể thiếu. Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là biotin
(vitamin H) và thiamin (vitamin B1).
Bảng 2.2 Nồng độ một số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng [13]

2.1.5 Các nghiên cứu về nấm linh chi đen:
Hiện nay trên thế giới, các cơng trình nghiên cứu về nấm linh chi đen vẫn chưa
được công bố rộng rãi. Tại Việt Nam, các cơng trình nghiên cứu về nấm linh chi đen
được cơng bố cịn ít, điển hình là những nghiên cứu sau:
- Năm 2006, Lê Xuân Thám và công sư đã phát hiện và định danh loài Linh chi
đen Amauroderma subresinosum đầu tiên của Việt Nam ở Vườn Quốc gia Cát Tiên
- Năm 2010, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt chất kháng tế bào ung
thư từ ba loài nấm Linh chi đen, Linh chi đỏ và Linh chi vàng từ vườn Quốc gia Cát
Tiên, Lâm Đồng. Kết quả tác giả đã tinh sạch được 12 hợp chất ergosterol peroxide có
khả năng kháng 4 dịng tế bào ung thư biểu mơ, gan, phổi và vú.

13


- Năm 2011, Đăng Ngọc Quang và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học
của nấm Linh chi đen Việt Nam A.subresinosum. Kết quả xác định được 14 loại acid béo
thiết yếu từ nấm Linh chi đen.
- Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa
của các Polysaccharides thơ chiết xuất từ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum.
2.2. Nguyên liệu trồng nấm
Linh chi là lồi nấm phá gỗ mạnh, có khả năng sử dụng trực tiếp nguồn cellulose.
Do đó, nguyên liệu nào có cellulose thì nấm Linh chi có thể sống và phát triển.Tại Đài

Loan, Linh chi được trồng trên gỗ họ Long não để điều trị ung thư, khối u. Nhiều nơi
khác đã dùng mùn cưa tươi, mùn cưa khơ của các loại gỗ mềm, khơng có tinh dầu và
độc tố. Ngồi ra có thể trồng Linh chi trên rơm, rạ, bã mía,…Việt Nam nằm trong vùng
khí hậu nhiệt đới gió mùa, giàu phế liệu cellulose đặc biệt là mùn cưa cây cao su, tạo
điều kiện cho nghề trồng nấm phát triển mạnh [10]. Hàm lượng các chất có trong mùn
cưa được thể hiện ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Hàm lượng các chất có trong mùn cưa [1]
Thành phần
Hàm lượng (%)
Protein thơ

1,5

Lipid thơ

1,1

Celulose và lignin

71,2

Hydrat cacbon hịa tan

25,4

Các loại bột cám ngũ cốc, bột bánh dầu được xem là nguồn dinh dưỡng cơ bản cho
nấm, hàm lượng bổ sung của chúng khá cao, từ 15 – 20% so với tổng lượng cơ chất [10].
Đây là nguồn cung cấp vitamine và đạm hữu cơ quan trọng cho nấm Linh chi – loại nấm
đòi hỏi tỷ lệ C/N nhỏ, nhất là trong những giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng (Trịnh
Tam Kiệt, 1983; Lý Kiện, 1992) [1].

14


Trong sản xuất người ta bổ sung thêm vào cơ chất chủ yếu là đạm và khoáng. Tùy
từng loại nấm, đạm cho vào phải cân đối với cacbon thì nấm mới phát triển tốt. Mối liên
hệ giữa nguồn đạm (N) và cacbon (C) được biểu thị bằng tỷ lệ C/N. Thường tỷ lệ C/N
trong giai đoạn nuôi tơ là 25/1 và trong thời kỳ ra quả thể là 30/1 – 40/1.[8]
Khuynh hướng hiện nay người ta thích sử dụng phân hóa học, do hàm lượng đạm
cao. [1]
 Urê (CO(NH2)2), có chứa 42 – 46% nitơ
 Ammơn sunphat ((NH4)2SO4), có chứa 20 – 21% nitơ
Việc sử dụng phân bón hóa học làm tăng lượng đạm đáng kể nhờ sử dụng các amon
có chứa nitơ. Khi nitơ được nấm biến dưỡng thì thành phần còn lại của hợp chất bị biến
đổi và làm thay đổi pH của cơ chất [2]. Ngoài ra, người ta còn trộn cám gạo hoặc cám
bắp chứa 1,18% nitơ [8]. Thành phần dinh dưỡng trong cám được thể hiện ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4 Thành phần dinh dưỡng trong cám [1]

Khống chất là thành phần khơng thể thiếu trong môi trường nuôi cấy: P, K Na,
Mg, Ca, Mo, Zn,... Việc bổ sung muối khoáng sẽ làm thay đổi pH hoặc gây các tác dụng
ngược khác và làm tăng giá thành sản phẩm [2]. Các muối khoáng được sử dụng:[1]
Supe lân (Ca(H2PO4)2.H2O + CaSO4), có chứa 14 – 20% P2O5

15


Canxi cacbonat (CaCO3)
Magiê sunphat (MgSO4.7H2O)
2.3 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của những

kỹ thuật gen hiện đại và có độ chính xác cao. Đó là những kỹ thuật hiện đại có sự kết
hợp của nhiều ngành khoa học như sinh học, hóa học, tin học và cơ khí tự động. Để định
danh một lồi nào đó thì người ta phải tiến hành các phản ứng như PCR và kỹ thuật giải
trình tự, sau đó xử lý số liệu với ngân hàng gen.
2.3.1 Tổng quan các phương pháp ly trích DNA
2.3.1.1Nguyên tắc
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận
một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mối
quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử
này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử
bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào
giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết
trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào
(desoxyribonuclease- DNase và ribonuclease- RNase) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008)
[15].
2.3.1.2Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật trong mơi trường tự nhiên
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi
theo từng mơi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là
những tập đoàn vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được
đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ
gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh
vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Q trình ly trích DNA cần

16