Nuôi cấy bacillus Subtilis thu nhận Amylase và ứng dụng trong sản xuất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NI CẤY BACILLUS SUBTILIS
THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN

Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2007 -


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS
THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN

Giáo viên hƣớng dẫn:
Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng
Nguyễn Nhƣ Nhứt

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2007 -

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thanh Thủy


iii

LỜI CẢM ƠN

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã luôn trăn trở, lo lắng và động
viên để tơi có đƣợc ngày hơm nay.
Xin tỏ lịng biết ơn đến tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tơi
trong suốt q trình học tại trƣờng.
Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến chị Trƣơng Phƣớc Thiên
Hoàng và anh Nguyễn Nhƣ Nhứt đã tận tình hƣớng dẫn, động viên tơi trong thời
gian thực hiện khóa luận.
Cảm ơn các anh và các bạn tại phịng sinh hóa ứng dụng của trƣờng Đại học
Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian thực
tập tốt nghiệp.
Cảm ơn Hồng Vy và Phƣơng Uyên, hai ngƣời bạn thân nhất của tôi đã chia
xẻ và giúp đỡ tôi trong 4 năm học tại trƣờng.


iv

TĨM TẮT
Nguyễn Thanh Thủy, Đại học Nơng Lâm TP. HCM

Đề tài nghiên cứu “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng
trong sản xuất dextrin”, thực hiện tại phòng sinh hóa và ứng dụng của trƣờng Đại
học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM từ 19/03/2007 – 19/07/2007.
GVHD: ThS. Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng
ThS. Nguyễn Nhƣ Nhứt
Đối tƣợng nghiên cứu là α-amylase của Bacillus subtilis
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hoà tan trong nƣớc,
phƣơng pháp Heinkel xác định hoạt độ α-amylase để khảo sát thời gian nuôi cấy, tỷ
lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% và (NH4)2SO4, khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng
đến khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Thời gian ni cấy Bacillus subtilis thích hợp để thu α-amylase là 48 giờ.
- Tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% tốt nhất là 1 thể tích dịch chiết enzyme
và 3 thể tích cồn. Thời gian tủa là 15 phút.
- pH và nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân của chế phẩm α-amylase là
6,0 và 55oC.
- Lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất từ sự thủy phân bột năng 10%.


v

ABSTRACT
NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city
Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state
fermentation and dextrin production application”. This thesis was carried out at
biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from
03/2007 to 09/2007.
We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein
concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, αamylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate. After
recovering α-amylase from fermented medium we examined starch hydrolysis

ability and dextrin production of α-amylase product.
Result experiments showed that:
-

α-amylase activity was hightest at 48h incubation.

-

Precipiating α-amylase by 96% ethanol was better than solid ammonium
sulfate and suitable volume ratio of extracted enzyme and ethanol for
precipitation was 1:3.

-

Optimum temperature and pH for hydrolysis of purified α-amylase were
respective 55 degree C and 6,0.

-

α-amylase had the most effective hydrolysis in 10% cassava starch fluid.


vi

MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii
Tóm tắt ....................................................................................................................... iv
Abstract ....................................................................................................................... v
Mục lục ....................................................................................................................... vi

Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix
Danh sách các hình...................................................................................................... x
Danh sách các bảng .................................................................................................... xi
Danh sách các sơ đồ ..................................................................................................xii
Danh sách các đồ thị .................................................................................................xii
Danh sách các biểu đồ ...............................................................................................xii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
1.2. MỤC ĐÍCH...................................................................................................... 2
1.3. YÊU CẦU ........................................................................................................ 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. BACILLUS SUBTILI ....................................................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn .................................................................................... 3
2.1.2. Phân loại ................................................................................................... 6
2.1.3. Bộ gen ....................................................................................................... 6
2.1.4. Ứng dụng .................................................................................................. 7
2.2. ALPHA-AMYLASE ....................................................................................... 8
2.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 8
2.2.2. Phân loại, danh pháp ................................................................................ 8
2.2.3. Cấu trúc phân tử ....................................................................................... 8
2.2.4. Tính chất ................................................................................................... 9
2.2.5. Cơ chế xúc tác ........................................................................................ 10
2.2.6. Ứng dụng ................................................................................................ 11
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT ..................................... 12


vii

2.3.1. Ni cấy bề mặt ...................................................................................... 12
2.3.2. Ni cấy chìm ........................................................................................ 12

2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME .............................................................. 13
2.5. DEXTRIN ...................................................................................................... 13
2.5.1. Phân loại ................................................................................................. 14
2.5.2. Tính chất ................................................................................................. 14
2.5.2.1. Độ nhớt ........................................................................................ 15
2.5.2.2. Độ pH .......................................................................................... 16
2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin .......................................................... 16
2.5.2.4. Độ hòa tan.................................................................................... 16
2.5.2.5. Màu sắc ........................................................................................ 16
2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin ...................................................................... 17
2.5.4. Ứng dụng ................................................................................................ 18
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ......................................................................... 19
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 19
3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM................................................................... 20
3.3.1. Xác định mật độ tế bào ........................................................................... 20
3.3.2. Khảo sát thời gian ni cấy thích hợp .................................................... 20
3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% .............................................. 20
3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 ................................................................. 21
3.3.5. Khảo sát thời gian tủa enzyme bằng cồn 96% ....................................... 21
3.3.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân của
α-amylase.......................................................................................................... 22
3.3.6.1. Nhiệt độ ...................................................................................... 22
3.3.6.2. pH ............................................................................................... 22
3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin ................................................ 22
3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân của chế phẩm α-amylase với các
nguồn tinh bột. ..................................................................................................... 22
3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột ................. 22
3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp. ......................................... 23
3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .............................................................. 23

viii

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 24
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY ....................................... 24
4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ
(NH4)2SO4 ............................................................................................................ 25
4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% ................................................ 24
4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 ............................................ 27
4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% .. 28
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE.......................................................... 29
4.4.1. Nhiệt độ .................................................................................................. 29
4.4.2. pH ........................................................................................................... 30
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN ......... 31
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM
α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT .................................................. 32
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN
THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE ................. 32
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38
PHỤ LỤC


ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis

Bacillus subtilis

GH

Glycosidic Hydrolase

EC

Enzyme Commission

DAP

Diamoni Phosphate

MW

Molecular Weight

Da

Dalton

DE

Dextrose equivalent

CT

Canh trƣờng

dOD

Delta optical density

DCE

Dịch chiết enzyme

CPE

Chế phẩm enzyme (đã sấy khô)

CP tƣơi

Chế phẩm enzyme tƣơi

UI

Unit International


x

DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Hình thái Bacillus subtilis ........................................................................... 3
Hình 2.2. Bacillus subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử ........................................ 4

Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa............................................................. 4
Hình 2.4. Cấu trúc khơng gian của α-amylase ........................................................... 9
Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột ........................................... 11
Hình 2.5. Dextrin ....................................................................................................... 14
Hình 4.1. Mơi trƣờng bán rắn trƣớc khi ni cấy .................................................... 25
Hình 4.2. Canh trƣờng ni cấy sau 48 giờ .............................................................. 25
Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30
Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase ................................................................................. 36
Hình 4.5. Chế phẩm dextrin ...................................................................................... 36


xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis .................................................. 5
Bảng 2.2. phân loại của Bacillus subtilis ................................................................... 6
Bảng 2.3. Một số tính chất của dextrin ..................................................................... 15
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ....................... 24
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................. 26
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase ................................... 27
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ................ 28
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase................................. 29
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30
Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96% ........................................... 31
Bảng 4.8. Dextrin tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10% ......................... 32
Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin ................................................................................. 33

Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10% ................................ 33
Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15% ................................ 34
Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20% ................................ 35


xii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột .......................................... 17

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ

TRANG

Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ...................... 25
Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................ 26
Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase ................................. 27
Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase .............. 28
Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase ............................... 29
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ....................................... 31

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96% ...................................... 31
Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10% .............. 32
Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10% ............. 34
Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15% ............. 34
Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20% ............. 35


1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đốn
bệnh…Trong cơng nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trị đặc biệt quan trọng.
Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh
dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose…
Trƣớc đây, ngƣời ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với
nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc
áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với
lƣợng lớn α-amylase là rất cần thiết.
Dextrin là sản phẩm do sự thủy phân tinh bột của α-amylase. Ngoài giá trị
dinh dƣỡng, dextrin còn là một trong những yếu tố cải thiện tính chất, cảm quan của
thực phẩm. Vì vậy, dextrin ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong chế biến thực
phẩm và công nghiệp bánh kẹo.
Sản xuất dextrin từ tinh bột có thể dùng acid hay enzyme. Tuy nhiên, sản
xuất dextrin bằng acid có rất nhiều hạn chế là khó định hƣớng sản phẩm do tác dụng
khơng đặc hiệu của acid lên nguyên liệu, độc hại nên đòi hỏi phải có trang thiết bị
đắt tiền, lƣợng acid dƣ gây hƣ hỏng thiết bị và làm ô nhiễm môi trƣờng. Mặc khác,

dextrin thành phẩm có màu và vị đắng.
Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất
dextrin sẽ khắc phục đƣợc những hạn chế trên.


2

Dextrin thu đƣợc nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung
tính, ít ngọt, sạch khuẩn, khống và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong
nhiều ngành công nghiệp và trong y dƣợc.
Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu
nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”.
1.2. MỤC ĐÍCH
Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân của αamylase và tinh bột để thu nhận dextrin.
1.3. YÊU CẦU
- Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng bán rắn ở
điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trƣớc.
- Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy B.subtilis.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo
dextrin của chế phẩm α-amylase.


3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu
khí hay kỵ khí tùy ý. Thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất.

Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dƣỡng có dạng hình que,
kích thƣớc chiều rộng từ 0,7 – 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 μm. Không kết thành
chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, khơng tạo bao nang.

Hình 2.1. Bacillus subtilis
(URL: />Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thƣớc chiều rộng 0,6 –
0,9 μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối
tế bào, phần lớn đƣợc tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có
khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (Trần Đỗ Quyên, 2004).


4

Hình 2.2. B. subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử. Cấu trúc hình oval
ở trung tâm là bào tử (URL: ec.europa.eu/research/success/images/0291b.jpg).
Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa khuẩn lạc trịn, khơng đều hay phân
tán. Đƣờng kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cƣa. Sau 1
– 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).

Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa
Trong mơi trƣờng lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử
chiu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hƣ hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị
khó chịu.
Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhƣng khơng
tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium).
Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí,
khơng sinh khí từ mơi trƣờng lỏng chứa nitrate.
Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy
gelatine nhanh chóng.

5

Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis
Phản ứng sinh hố

Kết quả

Hoạt tính Catalase

+

Sinh Indol

–

MR

+

VP

+

Sử dụng Citrate

+

Khử Nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Manitol

+

Glucose

+

Lactose

–

Maltose

+

(Theo Holt, 1992)
Nhiệt độ tối thích của B. subtilis vào khoảng 36 - 50oC. Nhiều loài vẫn phát
triển đƣợc ở 60oC. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển là 10 – 15% (Lƣơng Đức
Phẩm, 2000).
Ngƣời ta đã chứng minh B. subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism).
Chúng dùng cách này nhƣ một phƣơng pháp đơn giản để thoát khỏi những trƣờng
hợp điều kiện sống giới hạn.
B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau
nhƣ: subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins,
bacillanene, difficidin…(theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).


6

Phân bố trong đất và các chất hữu cơ bị phân hủy và là một đối tƣợng dùng
trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phịng thí nghiệm (Trần Đỗ Quyên,
2004).
B. subtilis không đƣợc xem là mầm bệnh gây bệnh cho ngƣời. Chúng
thƣờng có trong thực phẩm nhƣng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm.
2.1.2. Phân loại
Bảng 2.2. Bảng phân loại của Bacillus subtilis
Phân loại khoa học

Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài:

subtilis
Tên kép

Bacillus subtilis

(Ehrenberg 1835
Cohn 1872)

2.1.3. Bộ gen
Năm 1997, ngƣời ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B.
subtilis và lần đầu tiên cơng bố trình tự gen của vi khuẩn.
Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4100 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen
khơng thể thiếu đƣợc, 79 gen đƣợc dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều
có liên quan với q trình trao đổi chất của tế bào.


7

2.1.4. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là
một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lƣợng khá lớn (15-20%)
từ tinh bột.
Trong y dƣợc, Bacillus subtilis đƣợc đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml
trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dƣờng ruột do lị
trực trùng, đắp các vết thƣơng lở loét ngoài da (Trần Đỗ Quyên, 2004).
Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây
bệnh nhƣ nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,... Ngƣời ta thấy
rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các
peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium). Khả năng này đƣợc ứng
dụng trong kiểm soát sinh học.
Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức
ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trƣởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia
súc; bổ sung vào ao ni nhằm duy trì chất lƣợng nƣớc ao, hạn chế bệnh cho thủy
sản nuôi.
Hệ enzyme của B. subtilis đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa.

Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại
của nitrogen, carbon dioxide, và nƣớc.
Một chủng Bacillus subtilis đƣợc biết trƣớc đây là Bacillus natto đƣợc dùng
trong sản xuất thực phẩm thƣơng mại của Nhật tƣơng tự nhƣ thực phẩm
cheonggukjang của Hàn Quốc.
B. subtilis tái tổ hợp đƣợc sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates
(PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải nhƣ là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí
sản xuất PHA giảm.


8

2.2. ALPHA-AMYLASE

2.2.1. Khái niệm
α-amylase là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside nằm
bên trong phân tử tinh bột và glycogen.
Là một enzyme kim loại. Nếu khơng có sự hiện diện của ion Canxi trong
phân tử enzyme sẽ không hoạt động đƣợc.
α-amylase phân cắt cacbonhydrate chuỗi dài tạo maltotriose và maltose từ
amylose hay tạo maltose, glucose và dextrin từ amylopectin.
Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động
phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase. Ở động vật, α-amylase là enzyme
tiêu hóa chính.
2.2.2. Phân loại, danh pháp α-amylase
α-amylase: (1,4-α-D-glucan glucanhydrolase) thuộc nhóm enzyme thủy
phân (hydrolase), họ 13 (GH 13), mã số EC 3.2.1.1.
Xúc tác phản ứng nội thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucosidic trong chuỗi
đƣờng đa có chứa 3 hoặc nhiều hơn những đơn vị D-glucose liên kết với nhau ở vị
trí α-1,4.

Tên khác: glycogenase; endoamylase; Taka-amylase A.
Tên hệ thống: 1,4-α-D-glucan glucanhydrolase.
2.2.3. Cấu trúc phân tử
Gồm 3 tiểu đơn vị A, B, C. A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trƣng helix
(α/β)8 – barrel, đƣợc nối với tiểu đơn vị C (C-terminal) có cấu trúc 8 đoạn β–sheet
song song. Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β–sheet đƣợc lồng vào giữa đoạn β–sheet thứ
ba và đoạn β–helix thứ hai của tiểu đơn vị A. Tiểu đơn vị B quyết định độ bền và
liên kết enzyme và cơ chất. Một ion Canxi nối giữa hai tiểu đơn vị A và B.
Tùy thuộc vào dạng enzyme mà có thể có một số tiểu đơn vị khác đƣợc gắn
vào đầu C- hay đầu N- của phân tử protein.
Trung tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhóm –COOH và -NH2 (Trần
Đỗ Quyên, 2004).


9

Khối lƣợng phân tử α-amylase khác nhau ở các loài Bacillus.
α-amylase vi khuẩn công nghiệp chủ yếu đƣợc sản xuất từ B. subtilis var.
amyloliquefaciens và var. amylosacchariticus có trọng lƣợng phân tử (MW) là
49.000 dalton (Da) (theo Fisher và Stein, 1960) và 60.000 Da (Geranum, 1979). Khi
có mặt Zn, enzyme sẽ liên kết tạo dạng dimer có MW 100.000 Da.
α-amylase khơng chứa co-enzyme, tuy nhiên nó cũng cần 1 ngun tử gam
Ca2+ cho 1 mol enzyme để ổn định cấu trúc và ngăn không cho protease phân hủy
enzyme (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).

Hình 2.4. Cấu trúc khơng gian của α-amylase.
(URL: plaza.snu.ac.kr/~sewonsuh/home/structures.html)
2.2.4. Tính chất α-amylase
Tính chấy đặc trƣng của α-amylase là khả năng dextrin hóa cao nên làm cho
phản ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Kết quả tác động của αamylase thƣờng làm giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột do đó ngƣời ta gọi αamylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.

α-amylase dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối, dung dịch đệm
và rƣợu lỗng.
α-amylase hoạt động khơng cần chất hoạt hóa và cần Ca với vai trò là
một đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột. Canxi có tác dụng ổn định tốt αamylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng độ bền của α-amylase


10

trƣớc các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy của protease (Lƣơng Đức
Phẩm, 1998).
pH tối ƣu của α-amylase vi khuẩn trong khoảng 6,0 – 7,0. α-amylase
bị bất hoạt nhanh ở pH thấp 4,5 – 4,7 và khi có mặt các tác nhân tạo phức với Canxi
nhƣ EDTA, polyphosphate, oxalate, chlorine tự do và các chất oxy hóa (Nguyễn
Tiến Thắng, 2005).
α-amylase của vi khuẩn thƣờng bền nhiệt hơn α-amylase từ các loài vi
sinh vật khác và cây trồng, chúng vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ mà α-amylase của
nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt . Nhiệt độ tối ƣu của α-amylase trong khoảng 54 63oC (Hopek, 2006). Đối với α-amylase của Bacillus subtilis nhiệt độ tối ƣu có thể
đạt đến 70 - 80oC.
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần các amino acid khác
nhau, mỗi loại α-amylase đƣợc cấu tạo từ một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng.
Tuy nhiên, hàm lƣợng tryptophan, tyrosine thƣờng chiếm ƣu thế. Các glutamic acid
và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lƣợng amino acid cấu thành phân tử enzyme
(Trần Đỗ Quyên, 2004).
2.2.5. Cơ chế xúc tác
Phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase thƣờng xảy ra qua hai giai đoạn


Giai đoạn đầu là giai đoạn dịch hóa: chỉ một số liên kết trong phân tử

bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.



Giai đoạn tiếp theo là sự thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo

thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose và các dextrin phân tử
thấp. Tuy nhiên, thƣờng α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin
phân tử thấp, khơng cho màu với Iod và một ít maltose (Trần Đỗ Quyên, 2004).

α- amylase
Tinh bột
H2O

α-Dextrin + Maltose + Glucose


11

Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột
2.2.6. Ứng dụng của α-amylase
Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay do ứng dụng của nó trong
nhiều lĩnh vực nhƣ thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghiệp dệt, chăn nuôi…


Trong công nghiệp thực phẩm:
- Sản xuất rƣợu, bia, nƣớc trái cây.
- Sản xuất bánh, bánh mì: trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ

cốc nhƣng hàm lƣợng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải
thiện tính chất của bánh nhƣ làm tăng độ nở xốp và mùi vị của bánh.
- Chế biến tinh bột, sản xuất đƣờng maltose, syro glucose, syro

fructose. Dịch giàu glucose đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, công
nghiệp lên men, sản xuất nƣớc trái cây, làm mứt. Glucose tinh thể đƣợc sử dụng
trong y tế, trong khẩu phần dinh dƣỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền. Syro
fructose đƣợc dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lƣợng, bánh kẹo, nƣớc quả
và sản phẩm sữa…


Làm mềm vải trong công nghiệp dệt:

Trong sản xuất vải có giai đoạn hồ hóa làm vải chắc hơn, ngƣời ta hồ hóa
bằng tinh bột. Sau khi dệt ngƣời ta phải loại bỏ chất tham gia hồ hóa bằng cách xử
lý với α-amylase.


Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa:

Bổ sung hỗn hợp α-amylase, cellulase, β-glucanase… vào sinh khối cỏ ủ
chua nhằm tăng năng suất tiêu hóa của vật nuôi.


12

Bổ sung α-amylase, protease vào khẩu phần thức ăn cho heo con dƣới 5
tuần tuổi nhằm gia tăng tốc độ phát triển của heo con, ngăn phát sinh bệnh tiêu chảy
phổ biến ở heo con (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).


Trong y học: chẩn đốn bệnh lâm sàng các bệnh thơng thƣờng và các

bệnh thiếu enzyme.

2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT SẢN XUẤT ENZYME
Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phƣơng
pháp: nuôi cấy bề mặt và ni cấy chìm.
Phƣơng pháp ni cấy vi sinh vật trên mơi trƣờng rắn (bề mặt) có một số ƣu
việt hơn so với phƣơng pháp chìm. Do lƣợng nƣớc trong cơ chất thấp nên enzyme
và những sản phẩm khác ở trạng thái cơ đặc vì vậy dễ tinh sạch. Ni cấy bề mặt dễ
sấy khơ và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme. Khơng cần trang thiết bị phức tạp, chủ
yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp (Lƣơng Đức
Phẩm, 1998).
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo môi trƣờng cho vi sinh
vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng lỏng hoặc
sử dụng môi trƣờng đặc (môi trƣờng bán rắn).
Ở môi trƣờng lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trƣờng tạo thành
váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng
từ dung dịch môi trƣờng, oxy khơng khí, tiến hành q trình tổng hợp enzyme.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3.2. Ni cấy chìm
Phƣơng pháp này ngƣời ta sử dụng môi trƣờng lỏng và đƣợc thực hiện
trong những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH.
Phƣơng pháp ni cấy chìm có ƣu điểm chiếm ít diện tích nhƣng có nhƣợc
điểm là dễ bị nhiễm tồn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao.


13

2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME
Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hịa tan trong nƣớc nên có thể tách chiết
enzyme từ canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm.
Để tinh sạch enzyme ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn

bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự,
2000).
Phƣơng pháp tinh sạch enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là
phƣơng pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton).
Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung
môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự,
2005). Thông thƣờng ngƣời ta thêm 3 – 4 thể tích dung mơi vào 1 thể tích nƣớc

chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải đƣợc
làm lạnh xuống 3 – 5oC. Phƣơng pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hƣởng đến hoạt
tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung
môi bằng chƣng cất.
Phƣơng pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để
kết tủa. Muối trung tính thƣờng dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 – 60 % so với dịch
chiết enzyme (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
2.5. DEXTRIN (theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Xuân Thủy, 2001)
Dextrin là sản phẩm đƣợc tạo thành do sự thủy phân tinh bột mà giá trị
tƣơng đƣơng dextrose (DE) đạt đƣợc nhỏ hơn 20. Dextrin có cơng thức tổng quát
giống với cacbonhydrate nhƣng chiều dài chuỗi ngắn hơn và mức độ phức tạp cũng
thấp hơn.